KR100748248B1 - 백두옹으로부터 분리된 트리터펜 사포닌 및 이를 포함하는항-고형암 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 백두옹으로부터 분리된 신규 사포닌 P-5, P-7, P-9, P-13, P-15 또는 P-17, 상기 P-17을 함유하는 항-고형암 조성물, 및 백두옹으로부터 분리된 사포닌 P-1 내지 P-17 중 2종 이상의 성분을 포함하는 항-고형암 조성물에 관한 것이다.

Description

백두옹으로부터 분리된 트리터펜 사포닌 및 이를 포함하는 항-고형암 조성물{Triterpene saponins isolated from Pulsatillae radix and anti-solid tumor compositions comprising the same}

도 1은 세파덱스(Sephadex) 칼럼 분획의 실리카겔 박막 크로마토그램이고;

도 2는 분획 1-1'의 HPLC 크로마토그램이며;

도 3은 분획 2-2'의 HPLC 크로마토그램이고;

도 4는 분획 3-1'의 HPLC 크로마토그램이며;

도 5는 분획-3-2'의 HPLC 크로마토그램이고;

도 6은 분획-3-3'의 HPLC 크로마토그램이며;

도 7은 분획-4의 HPLC 크로마토그램이다.

본 발명은 백두옹으로부터 분리된 트리터펜 사포닌(triterpene saponins) 및 이를 포함하는 항-고형암(anti-solid tumor) 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, 백두옹으로부터 분리된 하기 P-5, P-7, P-9, P-13, P-15 및 P-17이라 칭하는 6종의 신규 사포닌, 및 이들을 비롯한 17종의 사포닌(P-1 내지 P-17이라 칭함)을 포함하는 항-고형암 조성물에 관한 것이다.

백두옹을 주제로 하고 인삼, 감초가 가미된 항암제제인 SB31®은 동물암 모델에서 우수한 항암성을 보였고(Y. Kim et al.; Comparison of the antitumor activity of SB31-Injection with those of some clinically used antitumor agents. Archives of Pharmacol . Research. 2004. 1. 제출 중), 현재 2상 임상시험 중에 있다. 따라서 이 처방의 주 생약인 백두옹의 항암물질에 대한 연구의 필요성이 절실하였다.

백두옹(白頭翁; Pulsatillae radix)은 미나리아재비과(Ranunculaceae)에 속하는 할미꽃(Pulsatilla koreana)(배기환, 한국식물도감, 1999)의 뿌리를 건조한 것이다. 백두옹은 청열, 양혈, 해독의 효능이 있고 소염, 수렴, 지혈, 지사약으로서, 열독성 혈리, 말라리아, 비출혈, 치출혈, 인종(咽腫)의 치료에 사용된다. 꽃을 백두옹화(白頭翁花)라고 하며 학질, 두창(頭瘡)을 치료하는데 사용한다. 잎을 백두옹엽(白頭翁葉)이라고 하며 요슬통풍(腰膝風痛), 부종 및 심장통을 치료하는데 사용한다. 약리작용으로는 백두옹을 물로 달인 액은 아메바성 적리균에 대한 항균작용이 있고, 트리코모나스에 대해 살충작용이 있으며 사포닌 성분은 항암작용이 있는 것으로 보고되어 있다. 백두옹에는 약 9%의 사포닌이 함유되어 있으며 현재까지 분리된 성분은 프로토아네모닌(protoanemonin), 아네모닌(anemonin), 라눈쿨린(ranunculin), 헤데라제닌(hederagenin), 베툴린산(betulinic acid) 및 올레아놀산(oleanolic acid) 유도체와 그 배당체 등이 보고되어 있다. 이들 작용에 대한 많은 연구가 이루어지지는 않았으나, 그 중에서 프로토아네모닌은 유사분열독 성(mitotoxicity)을 갖는 것으로 보고되어 있다(Vonderbank, F., Pharmazie, 5, 210, 1950). Li 등 (Li, R. Z. 등, Yao Hsueh Hsueh Pao. 28, 326 31, 1993)은 라눈쿨린이 KB 세포 등에 세포독성을 갖는다고 보고하고 있으며, 세포독성 기전으로는 DNA 중합효소 저해라고 보고하였다.

본 발명자들은 이 생약으로부터 혈관신생과 암세포의 성장을 억제하는 물질을 이미 분리한 바 있다(DPT; 대한민국 특허 제0315200호, Y. Kim et al., Deoxypodophyllotoxin; The cytotoxic and antiangiogenic component from Pulsatilla koreana, Planta Medica, 68, 268-271, 2002). 또한 위의 물질을 추출하고 남은 수용분에서 항암성 사포닌을 분리한 바 있다. SB365®라고 명명한 이 물질은 LL/2암에 걸린 BDF1 마우스에 대하여 암성장 저지율 80%를 보여 강한 항암물질임이 증명되었다(대한민국 특허출원 제2002-43016호).

본 발명자들은 SB365® 이외의 사포닌에 대하여 관심을 갖고 이미 알려진 물질들은 물론 새로운 구조를 가진 물질들을 분리해내고 이들에 대한 항암성 연구를 수행하였다. 그 결과, 6종의 새로운 사포닌을 분리해냄과 아울러, 이들을 비롯한 17종의 사포닌을 포함하는, 항-고형암 활성이 상승된 조성물을 개발하고, 본 발명을 완성하였다.

첫째, 본 발명은 백두옹으로부터 분리된 신규 사포닌 P-5, P-7, P-9, P-13, P-15 또는 P-17을 제공한다.

둘째, 본 발명은 유효성분으로서 상기 P-17을 함유하는 항-고형암 조성물을 제공한다.

셋째, 본 발명은 유효성분으로서 백두옹으로부터 분리된 사포닌 P-1 내지 P-17 중 2종 이상의 성분을 포함하는 항-고형암 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 P-6를 포함하는 것이 바람직하며, 예를 들어 P-6, 및 P-5, P-10, P-14 및 P-17로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하거나, P-6, P-2, P-5 및 P-8을 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 있어서, 백두옹으로부터 분리한 17 종의 사포닌 구조는 아래 표 1에 나타낸 바와 같다.

백두옹으로부터 분리한 17종의 사포닌 구조

사포닌	아글리콘	R1	R2	R3	R4
P-1	(Ⅰ)	Glu	Rha	OH	S3
P-2	(Ⅱ)	Glu	Rha	OH	S3
P-3	(Ⅰ)	H	Rha	OH	S3
P-4	(Ⅱ)	H	Rha	OH	S3
P-5	(Ⅰ)	Glu	Rha	OH	H
P-6	(Ⅱ)	Glu	Rha	OH	H
P-7	(Ⅰ)	H	S1	OH	H
P-8	(Ⅱ)	H	S1	OH	H
P-9	(Ⅰ)	Glu	Rha	H	H
P-10	(Ⅱ)	Glu	Rha	H	H
P-11	(Ⅰ)	H	Rha	OH	H
P-12	(Ⅱ)	H	Rha	OH	H
P-13	(Ⅰ)	H	S1	H	H
P-14	(Ⅱ)	H	S1	H	H
P-15	(Ⅰ)	Glu	H	OH	H
P-16	(Ⅱ)	Glu	H	OH	H
P-17	(Ⅱ)	H	S2	OH	H

또한, 17 종 사포닌 P-1 내지 P-17의 학명은 다음과 같다.

P-1: 23-하이드록시-3β-[(O-α-L-람노피라노실-(1→2)-O-[O-β-D-글루코피라노실-(1→4)]-α-L-아라비노피라노실)옥시]루-20(29)-펜-오익산 28-O-α-L-람노피라노실-(1→4)-O-β-D-글루코피라노실-(1→6)-β-D-글루코피라노실 에스터(23-hydroxy-3β-[(O-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-O-[O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)]-α-L-arabinopyranosyl)oxy]lup-20(29)-en-oic acid 28-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl ester),

P-2: 3-O-[O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[O-β-D-글루코피라노실-(1→4)]-α-L-아라비노피라노실]헤데라제닌 28-O-α-L-람노피라노실-(1→4)-O-β-D-글루코피라노실-(1→6)-β-D-글루코피라노실 에스터(3-O-[O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)]-α-L-arabinopyranosyl]hederagenin 28-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl ester),

P-3: 23-하이드록시-3β-[(O-α-L-람노피라노실-(1→2)-α-L-아라비노피라노실)옥시]루-20(29)-펜-오익산 28-O-α-L-람노피라노실-(1→4)-O-β-D-글루코피라노실-(1→6)-β-D-글루코피라노실 에스터(23-hydroxy-3β-[(O-α-L-rhamnopyranosyl -(1→2)-α-L-arabinopyranosyl)oxy]lup-20(29)-en-oic acid 28-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl ester),

P-4: 3-O-[O-α-L-람노피라노실-(1→2)-α-L-아라비노피라노실]헤데라제닌 28-O-α-L-람노피라노실-(1→4)-O-β-D-글루코피라노실-(1→6)-β-D-글루코피라노실 에스터(3-O-[O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosyl] hederagenin 28-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl ester),

P-5: 23-하이드록시-3β-[(O-α-L-람노피라노실-(1→2)-O-[O-β-D-글루코피라노실-(1→4)]-α-L-아라비노피라노실)옥시]루-20(29)-펜-오익산(23-hydroxy-3β-[(O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-O-[O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)]-α-L-arabinopyranosyl)oxy]lup-20(29)-en-oic acid),

P-6: 3-O-[O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[O-β-D-글루코피라노실-(1→4)]-α-L-아라비노피라노실]헤데라제닌(3-O-[O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)]-α-L-arabinopyranosyl]hederagenin),

P-7: 23-하이드록시-3β-[(O-β-D-글루코피라노실-(1→3)-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-α-L-아라비노피라노실)옥시]루-20(29)-펜-오익산(23-hydroxy-3β-[(O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosyl)oxy]lup-20(29)-en-oic acid),

P-8: 3-O-[O-β-D-글루코피라노실-(1→3)-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-α-L-아라비노피라노실]헤데라제닌(3-O-[O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-[O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-α-L-arabinopyranosyl]hederagenin),

P-9: 3β-[(O-α-L-람노피라노실-(1→2)-O-[O-β-D-글루코피라노실-(1→4)]-α-L-아라비노피라노실)옥시]루-20(29)-펜-오익산(3β-[(O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-O-[O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)]-α-L-arabinopyranosyl)oxy]lup-20(29)-en-oic acid)

P-10: 3-O-[O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[O-β-D-글루코피라노실-(1→4)]-βα-L-아라비노피라노실]올레아놀릭산(3-O-[O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)]-α-L-arabinopyranosyl]oleanolic acid),

P-11: 23-하이드록시-3β-[(O-α-L-람노피라노실-(1→2)-α-L-아라비노피라노실)옥시]루-20(29)-펜-오익산(23-hydroxy-3β-[(O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosyl)oxy]lup-20(29)-en-oic acid),

P-12: 3-O-[O-α-L-람노피라노실-(1→2)-α-L-아라비노피라노실]헤데라제닌　(3-O-[O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosyl]hederagenin),

P-13: 3β-[(O-β-D-글루코피라노실-(1→3)-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-α-L-아라비노피라노실)옥시]루-20(29)-펜-오익산(3β-[(O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosyl)oxy]lup-20(29)-en-oic acid),

P-14: 3-O-[O-β-D-글루코피라노실-(1→3)-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-α-L-아라비노피라노실]올레아놀릭산(3-O-[O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-[O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-α-L-arabinopyranosyl]oleanolic acid),

P-15: 23-하이드록시-3β-[(O-β-D-글루코피라노실-(1→4)-α-L-아라비노피라노실)옥시]루-20(29)-펜-오익산(23-hydroxy-3β-[(O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-α-L-arabinopyranosyl)oxy]lup-20(29)-en-oic acid),

P-16: 3-O-[O-β-D-글루코피라노실-(1→4)-α-L-아라비노피라노실]헤데라제닌(3-O-[O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-α-L-arabinopyranosyl]hederagenin),

P-17: 3-O-[O-β-D-글루코피라노실-(1→4)-O-β-D-글루코피라노실-(1→3)-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-α-L-아라비노피라노실]헤데라제닌(3-O-[O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosyl]hederagenin)

상기 P-1 내지 P-17 중, P-5, P-7, P-9, P-13, P-15, P-17은 자연에서 처음으로 분리된 사포닌이며, 나머지는 공지의 사포닌이다.

P-6는 대한민국 특허출원 제2002-43016호와 미국 출원 제10/620,709호에 BDF-1에 이식한 LL/2암에 대하여 우수한 항암성을 보이는 것으로 기재되어 있다. 이 물질은 요시히로(Yoshihiro) 등, 강삼식 등이 백두옹으로부터, 오포냐(Oponya) 등이 세르자니아 살즈만니아나(Serjania salzmanniana)로부터 분리한 바 있다(Yoshihiro M., Akihito Y., Minpei K., Tomoki A., and Yutaka S., Triterpene saponins and lignans from the root Pulsatilla chinensis and their cytotoxic activity against HL-60 cells, J. Nat. Prod. 62, 1279-1283, 1999; Kang S. S., Saponins from the root of Pulsatilla koreana, Arch. Pharm . Res. 12(1), 42-47, 1989; Oponya A. Ekabo and Norman R. Farnsworth, antifungal and molluscicidal saponins from Serjania salzmanniana, J. Nat. Prod. 59, 431-435, 1996).

P-10은 대한민국 특허출원 제1999-17919호에서 몇 가지 암세포 주에 대한 세포독성이 평가되어 있으나, 고형암을 대상으로 한 것은 아니었다. 이 물질은 이미 요시히로 등에 의해 백두옹에서 분리된바 있다(Yoshihiro M., Akihito Y., Minpei K., Tomoki A., and Yutaka S., Triterpene saponins and lignans from the root Pulsatilla chinensis and their cytotoxic activity against HL-60 cells, J. Nat. Prod. 62, 1279-1283, 1999).

기타 P-1, P-2, P-3, P-4, P-8, P-11, P-12, P-14, P-16 등은 아래와 같이 이미 알려진 물질이다.

P-1, P-3, P-11: Yoshihiro M., Akihito Y., Minpei K., Mari H., Chiseko S., and Yutaka S., New bisdesmosidic triterpene saponins from the root of Pulsatilla chinensis, J. Nat. Prod. 64, 1226-1229, 2001)

P-2, P-4, P-12: Kang S. S., Saponins from the root of Pulsatilla koreana, Arch. Pharm . Res. 12(1), 42-47, 1989

P-8, P-14: Yoshihiro M., Akihito Y., Minpei K., Tomoki A., and Yutaka S., Triterpene saponins and lignans from the root Pulsatilla chinensis and their cytotoxic activity against HL-60 cells, J. Nat. Prod. 62, 1279-1283, 1999)

P-16: Viqar U. A., Spectroscopic data of saponins. Vol. Ⅱ, pp.1151, CRC press)

신규 사포닌의 화학구조는 분광기를 이용한 1차원 분광학적 방법(¹³C NMR, ¹H NMR, DEPT)과 2차원 분광학적 방법(¹H- ¹H COSY, HMQC, HMBC), FABMS 데이터, 및 화학적 방법(산 가수분해방법: 0.4 M 염산수용액과 디옥산(dioxane)의 1:1 혼합용액을 아르곤(Ar) 기체 존재 하에서 90 ℃로 2 시간정도 가열하는 방법을 사용) 등을 이용하여 규명하였다. 표 2에는 백두옹에서 분리한 6종의 사포닌 구조를, 표 3과 표 4에는 이들의 아글리콘과 당의 ¹³C-NMR 데이터를 각각 표시하였다.

백두옹으로부터 분리한 6종의 신규 사포닌들의 구조

물질	아글리콘	R1	R2	R3	R4
P-5	(Ⅰ)	Glu	Rha	OH	H
P-7	(Ⅰ)	H	S1	OH	H
P-9	(Ⅰ)	Glu	Rha	H	H
P-13	(Ⅰ)	H	S1	H	H
P-15	(Ⅰ)	Glu	H	OH	H
P-17	(Ⅱ)	H	S2	OH	H

신규 사포닌의 아글리콘 부분에 해당하는 ¹³C-NMR 데이터

	아글리콘	P-5	P-7	P-9	P-13	P-15	P-17
C-1	39.2	39.6	39.5	39.3	39.6	39.2	39.2
C-2	27.9	26.8	26.7	27.0	27.2	26.4	26.5
C-3	73.5	81.6	81.5	89.0	89.3	82.2	81.4
C-4	42.9	44.0	43.8	39.8	40.1	43.7	43.8
C-5	48.8	48.1	48.0	56.3	48.2	47.9	47.8
C-6	18.6	18.5	18.3	18.7	18.9	18.3	18.3
C-7	34.5	34.8	34.6	34.9	35.2	34.6	33.0
C-8	41.1	41.5	41.3	41.3	41.5	41.3	39.9
C-9	51.0	51.4	51.2	51.0	51.3	51.1	48.4
C-10	37.4	37.4	37.2	37.3	37.6	37.3	37.1
C-11	21.3	21.6	21.5	21.4	21.7	21.4	24.0
C-12	26.1	26.5	26.3	26.3	26.5	26.3	122.6
C-13	38.6	38.4	38.8	38.7	38.9	38.8	145.3
C-14	42.9	43.2	43.0	43.0	43.3	43.0	42.4
C-15	31.2	30.7	30.5	30.5	30.4	30.5	28.6
C-16	32.9	33.3	33.2	33.2	33.3	33.1	24.0
C-17	56.6	57.0	56.9	56.9	56.5	56.9	46.9
C-18	47.7	50.2	50.0	50.0	50.2	50.0	42.3
C-19	49.7	48.4	48.0	48.0	48.2	48.0	46.8
C-20	151.2	151.6	151.6	151.6	151.0	151.6	31.1
C-21	30.3	31.6	31.5	31.5	31.5	31.4	34.4
C-22	37.6	38.0	37.9	37.9	38.2	37.8	30.1
C-23	68.0	64.3	64.2	28.1	28.5	64.5	64.3
C-24	12.9	14.1	14.0	17.0	17.3	13.6	14.3
C-25	16.8	17.3	17.1	16.6	16.8	17.1	16.3
C-26	16.5	16.8	16.6	16.6	16.8	16.6	17.7
C-27	14.9	15.3	15.1	15.0	15.3	15.0	26.4
C-28	178.9	179.3	180.0	180.0	180.0	180.0	181.1
C-29	109.9	110.3	110.0	110.0	110.1	110.1	33.5
C-30	19.5	19.8	19.6	19.7	19.9	19.6	24.0

신규 사포닌의 당 부분에 해당하는 ¹³C-NMR 데이터

탄소 No.	Pul-Aa )	P-11b)	P-5	P-7	P-9	P-13	P-15	P-17
Ara
1	106.4	104.6	104.7	105.0	105.1	105.7	106.9	105.1
2	73.2	76.3	76.8	75.8	76.7	76.2	73.8	75.6
3	74.7	74.9	75.2	75.1	74.0	75.0	74.8	74.9
4	69.6	69.6	80.6	69.9	79.6	70.2	79.9	69.8
5	64.8	65.8	65.6	66.4	64.5	66.2	66.4	66.3
Rha
1		102.1	102.1	101.7	102.0	102.1		101.6
2		72.9	72.8	71.8	72.6	71.8		71.9
3		72.7	72.6	83.2	72.5	83.8		83.7
4		74.5	74.5	73.1	74.0	73.4		73.1
5		70.1	70.0	69.8	70.0	69.8		69.8
6		18.9	19.0	18.6	18.8	18.9		18.6
Glu
1			107.0	106.9	106.5	107.2	106.5	106.7
2			75.8	76.0	75.6	76.3	75.9	75.6
3			78.9	78.6	78.7	78.9	78.8	76.8
4			71.7	71.9	71.5	72.1	71.6	81.1
5			79.1	78.7	78.9	79.0	78.5	76.9
6			62.9	62.7	62.7	62.9	62.8	61.9
Glu'
1'								104.9
2'								75.1
3'								78.4
4'								71.6
5'								78.5
6'								62.5

비교물질; 풀사틸로사이드(Pulsatilloside) A와 P-11(아네모사이드 A₃)

a) 풀사틸로사이드 A: Wen-Cai Ye et al., Triterpenoids from Pullsatilla chinensis, Pytochemistry, 42, 799-802, 1996.

b) 아네모사이드 A₃: Viqar U. A., Spectroscopic data of saponins. Vol. Ⅲ, pp.3036, CRC press(2000).

아글리콘의 구조 확인

P-5: 리베르만-부카르트(Liebermann-Burchard) 반응에 양성인 것으로 보아 트리터펜계 물질임이 예상된다. FABMS를 통하여 이온값이 m/z = 935[M+Na]⁺을 얻어 P-5의 분자식이 C₄₇H₇₆O₁₇임을 확인할 수 있었다. ¹H-NMR의 4.90 ppm과 4.71 ppm에서의 넓은 두 개의 싱글렛 피크는 올레핀 그룹의 수소에 해당되며, 이는 탄소 NMR의 110.3 ppm과 151.6 ppm의 탄소 피크의 존재로도 증명된다. 또한 IR의 1640 ㎝ ^{- 1}의 흡수대에서도 그 존재를 증명할 수 있다. 수소 NMR의 1.74 ppm의 메틸기는 이중결합에 결합된 메틸기이며, 이는 탄소 NMR의 19.7 ppm 피크의 존재와 DEPT 조작에서 4가 탄소에 결합된 사실로도 증명된다. 말하자면, 아글리콘 구조 중에 이소프로필렌 기가 있음이 확실하다. 트리터펜 아글리콘 구조 중에 이소프로필렌 기를 갖고 있는 것은 루판계에 속한다. 따라서 P-5의 아글리콘은 루판계에 속할 가능성이 높다. 이외에도 루판계 화합물의 구조상 특징은 각(angular) 메틸기를 다수 갖는다는 것이다. P-5의 DEPT 스펙트럼을 통해, 메틸 탄소, 즉 19.8, 18.6, 15.3, 17.3, 16.8, 14.1 ppm에서 6 개의 메틸기를 확인할 수 있었고, 이 중 19.8 ppm의 것은 위의 프로필렌기에 결합된 메틸기이고, 수소 NMR의 1.63 ppm의 저자장 더블렛(J = 7.2 Hz)은 람노스(표 4)의 메틸에 해당한다. 탄소 NMR 상 64.3 ppm 과 62.9 ppm와 수소 NMR 상 3.59(d, J = 13.8 Hz) ppm과 3.72 (d, J = 12.6 Hz) ppm의 피크는 하이드록시메틸기에 해당하는 것으로 2 몰의 글루코스가 구조 중에 존재하거나, 1 몰의 글루코스와 아글리콘 구조 중에 1 몰의 하이드록시메틸기가 있거나 둘 중 하나이다. 루판의 구조는 아글리콘 중에 6개의 메틸기, 또는 5개의 메틸기와 1개의 하이드록시메틸기를 갖는 예가 흔하다. 통상적으로 발견되는 구조 중에는 23번 탄소가 여기에 해당된다. 탄소 NMR 상, 179.3 ppm의 피크는 카복실 기의 존재를 의미하므로 P-5는 카복실 기를 갖는 사포닌이다. 또한, 카복실 기는 IR 상에서 3400 ㎝^-1 부근에서의 넓은 흡수피크와 1680 ㎝ ^{- 1}(C=O) 부근의 날카로운 흡수피크를 통해 카복실산의 존재를 재확인할 수 있었다. 이외에도 DEPT 조작을 통하여 14개의 메틸렌 탄소, 20개의 메틴(methines) 탄소와 7개의 4급 탄소들(quarternary carbons)을 확인하였다.

상기한 것을 종합하여 보면 P-5는 23-하이드록시베툴린산임이 틀림없다. P-5의 아글리콘 부분은 이미 알려진 루판 사포닌인 아네모사이드 A₃(anemoside A ₃ )의 데이터와도 일치한다[Anemoside A ₃ : Viqar U. A., Spectroscopic data of saponins. Vol. Ⅲ, pp. 3036, CRC press, W. Zhenjie, D. Linsheng and Z. Shouxun. J. Chin. Pharm . Univ., 22, 265(1991)].

같은 구조해석으로 P-7과 P-15도 아글리콘으로서 23-하이드록시베툴린산을 갖고 있음을 알 수 있다. 다음은 P-9의 아글리콘 부분으로 DEPT 스펙트럼에서 7개의 메틸기가 확인되었으며, 람노스의 메틸기를 제외하면 아글리콘 중에는 6개의 메틸기가 남는다. 다른 데이터가 P-5와 같은 것으로 보아, 이는 베툴린산임을 알 수 있다. 같은 해석으로 P-13의 아글리콘 구조도 베툴린산임을 확인하였다.

한편, P-17의 아글리콘은 23-하이드록시베툴린산과 베툴린산과는 다르게 12번과 13번 탄소 사이의 올레핀기와 28번의 카복실기를 가지는 헤데라제닌 구조임을 알 수 있었다(표 3). 이는 기지 물질인 P-6의 아글리콘 부분과 비교하여 재확인되었다.

당의 구조 확인

우선 P-5의 구조를 검토하기로 한다. P-5의 수소 NMR을 보면, 당 특이적인 아노머 수소 피크, 즉 6.30(b, s) ppm에서 α-람노피라노실기를, 5.11(d, J = 7.86 Hz) ppm에서 β-글루코피라노실기를, 4.96(d, J = 6.66 Hz) ppm에서 α-아라비노피라노실기를 확인할 수 있었다. 특히, 람노스의 존재는 1.63 ppm의 메틸기가 더블렛(J = 7.2 Hz)으로 나타나는 것으로 확인할 수 있었다(표 4).

이들 3개의 당의 결합위치를 결정하기 위해서는 아라비노스와 람노스를 갖고 있는 P-11의 구조해석이 선행되는 것이 유리하다. P-11(아네모사이드 A₃)의 바탕구조로는 이미 알려진 물질인 풀사틸로사이드 A (3-O-α-L-아라비노피라노실-23-하이드록시베툴린산)로 정해놓고 그 아라비노실기의 2번 OH에 람노스를 결합시키고 NMR 상의 글리코실화 쉬프트(glycosylation shift)를 계산한 후 이 쉬프트가 P-5에서 관찰되는지를 확인한다. 우선 풀사틸로사이드 A의 아라비노실기의 2번 OH가 람노실과 결합된 P-11의 C-2의 이동을 보면 73.2 ppm 에서 76.3ppm으로 저자장 이동을 하였다. P-5의 C-2도 같은 범위인 76.8 ppm에 나타났다. 따라서 P-5의 아라비노실의 C-2가 당과의 결합위치임을 알 수 있다. 이 글리코실화 쉬프트는 3.1 ppm으로 람노실기가 아라비노스의 C-2와 결합할 때의 평균 글리코실화 쉬프트인 3.0-3.6 ppm의 범위이다. 이와는 달리 글루코피라노실기의 것은 9-13 ppm인 것임을 감안할 때 P-5의 람노실기는 아라비노실의 C-2가 결합되었음을 확인할 수 있다. P-5와 풀사틸로사이드 A의 당 부분의 탄소 NMR 데이터를 비교해 보면, 아라비노실의 C-4 의 글리코실화 쉬프트가 11 ppm으로 나타나서 이 위치에 글루코피라노실이 결합되었음을 알 수 있다. 이로써, P-5는 23-하이드록시-3β-[(O-α-L-람노피라노실-(1→2)-O-[O-β-D-글루코피라노실-(1→4)]-α-L-아라비노피라노실)옥시]루프-20(29)-엔-오익산으로 동정하였다. 당 부분의 입체화학적 확인은 이미 동일 구조의 트리사카라이드를 갖고 있는 기지의 유사구조의 사포닌 배당체(P-6, P-10)와 비교함으로써 재확인할 수 있었다.

P-5의 구조가 확정됨으로써 같은 방식으로 P-15와 P-9 구조를 확인할 수 있었다. 또한, P-7에 대한 아노머 수소의 화학적 쉬프트와 커플링 상수를 보면 β-글루코피라노실기(5.42 ppm, d, J = 7.8 Hz), α-람노피라노실기(6.19 ppm, br, s), α-아라비노피라노실기(4.99 ppm, d, J = 6.6 Hz)를 갖고 있다. P-7의 아라비노피라노실기에는 글리코실화 쉬프트가 일어나지 않고, 람노피라노실기의 C-3이 P-11에 비하여 10.5 ppm 저자장으로 이동하였으므로, 여기에 글루코피라노실기가 결합되었음을 알 수 있다. P-7은 23-하이드록시-3β-[(O-β-D-글루코피라노실-(1→3)-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-α-L-아라비노피라노실)옥시]루펜-20(29)-엔-오익산임을 밝혀냈다.

P-13도 같은 방식으로 구조해석을 할 수 있었으며, 이는 3β-[(O-β-D-글루코피라노실-(1→3)-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-α-L-아라비노피라노실)옥시]루프-20(29)-엔-28-오익산으로 동정되었다.

마지막으로, P-17의 당의 구조를 보기로 한다. 이 물질의 수소 NMR을 보면, 그 아노머 수소와 입체구조를 확인할 수 있는데, 5.37 ppm(d, J = 7.8 Hz)과 5.13 ppm(d, J = 7.8 Hz)에서 2 몰의 β-글루코피라노실기, 5 ppm, J = 6.6 Hz)에서 α-람노피라노실기, 6.21 ppm에서 α-아라비노피라노실기를 각각 확인할 수 있었고, 탄소 NMR(표 4)을 보면 이 구조 중에 P-13이 내포되어 있음을 알 수 있다. 다만, P-13의 말단 글루코피라노실기의 C-4가 P-13에 비하여 9.0 ppm 저자장으로의 이동이 있었다. 이는 P-13의 말단 글루코스의 C-4의 OH에 글루코스가 결합되어 있음을 증명하고 있다. 그러므로 P-17은 3-O-[O-β-D-글루코피라노실-(1→4) -O-β-D-글루코피라노실-(1→3)-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-α-L-아라비노피라노실]헤데라제닌이다.

백두옹의 사포닌 중 항암성이 인정되는 것은 P-6, P-10, P-14, P-17 등 4가지이며, 이 중 P-17은 신규 물질이다. 한편, 항암성이 가장 강한 P-6과 항암성이 좋은 P-10, P-14, P-17을 저농도로 혼합한 처방들의 항암성이 우수한 것으로 확인되었다. 여기에는 가산성 법칙(additivity rule)이 적용된다. 또한, P-6과 뚜렷한 항암성을 인정받지 못하는 P-2, P-5, P-8 등을 혼합하여 만든 처방에서도 상당한 항암성 상승효과를 확인할 수 있었다.

본 발명의 화합물 및 처방의 사람에 대한 투여량은 2.5 ㎎/㎏ 내지 6.0 ㎎/㎏ 범위이며, 특히 3 ㎎/㎏ 내지 4 ㎎/㎏ 범위이면 어느 양이든 취할 수 있다. 본 발명의 화합물과 처방 모두가 물에 용이하게 용해되므로, 생리식염수, 링거액 등에 용해시켜 주사제로 하는 것이 좋다. 또한 좌제, 내복제, 외용제나 흡입제(inhalation agent)로도 적합하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하나, 이에 의해 본 발명의 범위가 어떤 식으로든지 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 전처리

백두옹 분말 500 g을 80% 메탄올 1 ℓ을 사용하여 상온에서 24 시간 추출하였다. 상기 추출을 3회 실시하여 합한 후, 50 ℃의 온탕기에서 감압건고하여 암갈색의 추출물 63 g을 얻었다. 이를 증류수 250 ㎖에 현탁시키고 동량의 부탄올로 3회 추출한 후 합친 부탄올층을 건고하였다. 이 건고물에 에틸아세테이트 100 ㎖을 가하고 흔들어 주어 에틸아세테이트 용해분을 제거한 후 잔류물을 탈수하여 밝은 갈색의 고체 11 g을 얻었다.

1 - 1. 세파덱스 LH - 20을 통한 분획

상기 고형물 2 g을 달아 80% 메탄올 25 ㎖에 녹인 후(불용물이 생기면 원심분리하여 제거함) 세파덱스(Sephadex) LH-20 400 g으로 충진되어 있는 칼럼(400 g, 60×5 ㎝)에 가하고 흡입시킨 후, 80% 메탄올로 계속 크로마토그래피를 수행하였다(유출속도 1 ㎖/분, 분획량 2 ㎖/튜브). 튜브를 순서대로 실리카겔 박막 상에 점적한 후, 전개하여 분획을 나누었다(전개용매: 부탄올-아세트산-물 = 4:1:1 혼합액의 상층; 발색, 10% 황산용액을 분무한 후 가열, 도 1). 동일한 Rf 값을 갖는 4개의 분획을 얻었다. 같은 분획과정을 5회 정도 반복 실시하여 분획-1 2.1 g(수율: 19.1%), 분획-2 1.4 g(수율: 12.7%), 분획-3 2.7 g(수율: 24.5%), 분획-4 1.0 g(수율: 9.1%)을 수득하였다.

1 - 2. 실리카겔 크로마토그래피를 이용한 물질의 정제

세파덱스를 통해 얻은 4개의 각 분획은 실리카겔 크로마토그래피(Merck-EM Type 60: 70-230 mesh)를 실시하여 정제하였다. 분획-1은 실리카겔 350 g으로 충진된 컬럼(80×4.8 ㎝)을 사용하여 용매조건[CHCl₃:MeOH:H₂O = 100:0:0(500 ㎖)→90: 10:0(500 ㎖)→80:20:0(500 ㎖)→60:30:0.5(2 ℓ)] 하에서 용출하여 정제된 분획-1-1'(0.91 g, Rf = 0.08 in CHCl₃ -MeOH-H₂O = 6:3:0.5)을 얻었다. 분획-2는 분획-1과 같이 처리하여 분획-2-2'(0.78 g, Rf = 0.2 in CHCl_{3 -} MeOH-H₂O = 6:3:0.5)를 얻었다. 분획-3은 실리카겔 300 g으로 충진된 동일한 컬럼(80×4.8 ㎝)을 사용하여 클로로포름, 메탄올, 에틸아세테이트, 물의 혼합용액(CHCl₃ -MeOH-EA-H₂O = 2:2:4:1)의 하층을 전개용매로 하여 분획-3-1'(0.55 g, 동일 용매상의 Rf = 0.09), 분획-3-2'(1.23 g, Rf = 0.16), 분획-3-3'(0.85 g, Rf = 0.30)으로 재분획하였다. 분획-4는 분획-3의 재분획 조건과 동일한 조건 하에서 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 분획-4-1'(0.73 g, Rf = 0.37)을 얻었다.

1 - 3. HPLC 를 이용한 단일물질의 분리

HPLC(High Pressure Liquid Chromatography)를 이용한 물질의 분리는 시마즈 (Shimadzu Co.)사의 액체 크로마토그래피(모델명: CLASS-VP ver. 6.12)를 사용하였다. 분획-1-1'과 분획-1-2'를 분리할 때는 일본 칸토(KANTO Co.)사의 Mightysil 컬럼(250 ㎜×10 ㎜, RP-C₁₈: 5 ㎛)을 사용하였으며, 나머지 분획들의 분리에는 워터스(Waters)사의 Spherisorb® S5 ODS2 컬럼을 사용하였다. 전개용매로는 메탄올과 물의 혼합용액, 또는 아세토니트릴과 물의 혼합용액을 사용하였으며, UV-검출기의 검출파장은 210 ㎚로 고정하였다. HPLC를 통해 최종적으로 단리된 물질들의 구조는 1차원과 2차원 NMR(¹³C-NMR, ¹H-NMR, ¹H- ¹H COSY, HMQC 및 HMBC) 데이터, FABMS 데이터를 이용하여 기존의 문헌들과 비교하여 동정하였다.

실시예 2: 분획 - 1 - 1'로부터 물질 P-1과 P-2의 분리

실시예 1에서 얻은 분획-1-1' 0.91 g을 완전히 녹일 수 있는 최소량의 메탄올(15 ㎖ 미만)에 녹인 후, 컬럼이 막히는 것을 방지하기 위해 0.45 ㎛ 멤브레인 필터(미국 워터스사 제품)를 사용하여 2회 여과하였다. 이 여액을 일본 칸토 (KANTO Co.)사의 물질 분리용 Mightysil 컬럼(250 ㎜×10 ㎜, RP-C₁₈: 5 ㎛)이 장착된 HPLC에 1회당 100 ㎕씩 주입하여 물질을 분리하였다(150회 정도 반복). 그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 13.8 분대와 18.6 분대의 체류시간(retention time)을 갖는 두 종류의 물질을 분리할 수 있었으며, 이렇게 얻은 두 종류의 백색 무정형 고체를 각각 P-1(145.0 ㎎)과 P-2(70.5 ㎎)로 명명하였다. 이 때의 전개용매 조건은 80% 메탄올로, 유속은 1 ㎖/분이었다.

분획-1-1'로부터 분리된 P-1과 P-2는 이미 보고된 바가 있는 23-하이드록시-3β-[(O-α-L-람노피라노실-(1→2)-O-[O-β-D-글루코피라노실-(1→4)]-α-L-아라비노피라노실)옥시]루-20(29)-펜-오익산 28-O-α-L-람노피라노실-(1→4)-O-β-D-글루코피라노실-(1→6)-β-D-글루코피라노실 에스터(Yoshihiro M., Akihito Y., Minpei K., Mari H., Chiseko S., and Yutaka S., New bisdesmosidic triterpene saponins from the root of Pulsatilla chinensis, J. Nat. Prod. 64, 1226-1229, 2001)와 3-O-[O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[O-β-D-글루코피라노실-(1→4)]-α-L-아라비노피라노실]헤데라제닌 28-O-α-L-람노피라노실-(1→4)-O-β-D-글루코피라노실-(1→6)-β-D-글루코피라노실 에스터(Kang S. S., Saponins from the root of Pulsatilla koreana, Arch. Pharm . Res. 12(1), 42-47, 1989)으로 각각 동정되었다.

실시예 3: 분획 - 2 - 2'로부터 물질 P-3과 P-4의 분리

실시예 1에서 얻은 분획-2-2'(0.78 g)의 물질 분리를 실시예 2와 동일한 HPLC 조건 하에서 실행하여 14 분대와 17.4 분대의 체류시간을 갖는 두 물질 분획을 각각 포집하여 50 ℃ 온탕기에서 감압건고하였다(도 3). 이 두 물질을 각각 P-3 (164.6 ㎎)과 P-4(35.7 ㎎)로 명명하였으며, 두 물질 모두 백색의 무정형 고체 형태였다.

P-3과 P-4의 구조동정 결과, 각각 이미 P-1과 P-2이 보고된 문헌에서 보고된 바 있는 23-하이드록시-3β-[(O-α-L-람노피라노실-(1→2)-α-L-아라비노피라노실) 옥시]루-20(29)-펜-오익산 28-O-α-L-람노피라노실-(1→4)-O-β-D-글루코피라노실-(1→6)-β-D-글루코피라노실 에스터(Yoshihiro M., Akihito Y., Minpei K., Mari H., Chiseko S., and Yutaka S., New bisdesmosidic triterpene saponins from the root of Pulsatilla chinensis, J. Nat. Prod. 64, 1226-1229, 2001)와 3-O-[O-α-L-람노피라노실-(1→2)-α-L-아라비노피라노실]헤데라제닌 28-O-α-L-람노피라노실-(1→4)-O-β-D-글루코피라노실-(1→6)-β-D-글루코피라노실 에스터(Kang S. S., Saponins from the root of Pulsatilla koreana, Arch. Pharm. Res. 12(1), 42-47, 1989)로 동정되었다.

실시예 4: 분획 - 3 - 1'로부터 물질 P-17의 분리

실시예 1에서 얻은 분획 3-1'(0.55 g)을 메탄올 10 ㎖에 완전히 녹인 후, 0.45 ㎛ 멤브레인 필터(미국 워터스사 제품)를 사용하여 2회 정도 여과하였다. 이 여액을 워터스사의 Spherisorb^® S5 ODS2 컬럼이 장착된 HPLC에서 유속을 3.5 ㎖/분으로 고정시킨 상태로 36% 아세토니트릴을 전개용매로 사용하여 1회당 100 ㎕씩 주입하여 체류시간이 26.5 분대인 주물질 분획을 포집하였다(도 4). 100회 정도 반복하여 분획을 합하여 50 ℃ 온탕기에서 감압건고하여 백색의 무정형 고체 60.2 ㎎을 얻어 P-17로 명명하였다.

P-17의 구조동정 결과, 이 물질은 기존의 문헌에 보고된 바 없는 신물질로서 3-O-[O-β-D-글루코피라노실-(1→4)-O-β-D-글루코피라노실-(1→3)-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-α-L-아라비노피라노실]헤데라제닌으로 동정되었다. 구조결정은 표3과 표 4의 데이터를 해석하여 행하였다. 백색의 무정형 고체, 녹는점: 260-262 ℃, 편광도: [α]_D ²⁵ = -6(c=0.1, MeOH), m/z: 1097[M+Na]⁺.

실시예 5: 분획 - 3 - 2'으로부터 물질 P-5와 P- 6 의 분리

실시예 1에서 얻은 분획-3-2'(1.23 g)을 메탄올 15 ㎖에 완전히 녹인 후, 0.45 ㎛ 멤브레인 필터(미국 워터스사 제품)를 사용하여 2회 정도 여과하였다. 이 여액을 실시예 4에서 사용된 동일한 컬럼을 사용하여 유속을 1.5 ㎖/분으로 하고, 40% 아세토니트릴을 전개용매로 사용하여 1회당 100 ㎕씩 주입하였다. 체류시간 33.4 분대와 43.5 분대의 두 물질 분획을 포집하고, 이를 50 ℃ 온탕기에서 감압건고하여 각각 149.4 ㎎과 310 ㎎의 백색 무정형 고체을 얻었다(도 5). 이 두 물질을 P-5와 P-6 으로 명명하였다.

P-5는 문헌에 보고된 바 없는 신물질로서, 표 3 및 표 4의 데이터를 사용하여 구조해석한 결과, 23-하이드록시-3β-[(O-α-L-람노피라노실-(1→2)-O-[O-β-D-글루코피라노실-(1→4)]-α-L-아라비노피라노실)옥시]루-20(29)-펜-28-오익산임이 밝혀졌다. 백색의 무정형 고체, 녹는점: 250-252 ℃, 편광도: [α]_D ²⁵ = -11.25(c=0.1, MeOH), m/z: 935 [M+Na]⁺

P-6은 SB365®로 알려진 공지 물질로서, 그 구조동정 결과 3-O-[O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[O-β-D-글루코피라노실-(1→4)]-α-L-아라비노피라노실]헤데라제닌(Yoshihiro M., Akihito Y., Minpei K., Tomoki A., and Yutaka S., Triterpene saponins and lignans from the root Pulsatilla chinensis and their cytotoxic activity against HL-60 cells, J. Nat. Prod. 62, 1279-1283, 1999 ; Kang S. S., Saponins from the root of Pulsatilla koreana, Arch. Pharm . Res. 12(1), 42-47, 1989)으로 동정되었다.

실시예 6: 분획 - 3 - 3'으로부터 물질 P-7, P-8, P-9, P-10, P-13, P-14, P-15, P-16의 분리

실시예 1에서 얻은 분획-3-3' 0.86 g을 메탄올 15 ㎖에 완전히 녹인 후, 0.45 ㎛ 멤브레인 필터(미국 워터스사 제품)를 사용하여 2회 정도 여과하였다. 이 여액을 Spherisorb® S5 ODS2 컬럼이 장착된 HPLC에서 유속을 3 ㎖/분으로 하고, 43% 아세토니트릴을 전개용매로 사용하여 1회당 100 ㎕씩 주입하면서 총 8개의 물질분획을 포집하여 감압건고하였다(도 6). 이들 모두는 백색의 무정형 고체 형태로 분리되었으며, 분리되는 순서에 따라 물질 P-7(26.0 ㎎), P-8(121.1 ㎎), P-9(31.0 ㎎), P-10(21.7 ㎎), P-13(15.6 ㎎), P-14(39.6 ㎎), P-15(7.7 ㎎), P-16(17.1 ㎎)으로 명명하였다.

분획-3-3'에서 분리된 8개의 물질 중 루페노익 사포닌 계열의 물질 P-7, P-9, P-13, P-15은 신규 물질로 이들 각각의 구조는 다음과 같다.

P-7: 23-하이드록시-3β-[(O-β-D-글루코피라노실-(1→3)-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-α-L-아라비노피라노실)옥시]루-20(29)-펜-오익산. 백색의 무정형, 녹는점: 252-254 ℃, 편광도: [α]_D ²⁵ = -11.25(c = 0.1, MeOH), m/z = 935[M+Na]⁺

P-9: 3β-[(O-α-L-람노피라노실-(1→2)-O-[O-β-D-글루코피라노실-(1→4)]-α-L-아라비노피라노실)옥시]루-20(29)-펜-오익산. 백색의 무정형, 녹는점: 247-250 ℃, 편광도: [α]_D ²⁵ = -5.99(c = 0.05, in MeOH), m/z = 919[M+Na]⁺

P-13: 3β-[(O-β-D-글루코피라노실-(1→3)-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-α-L-아라비노피라노실)옥시]루-20(29)-펜-오익산. 백색의 무정형, 녹는점: 245-250 ℃, 편광도: [α]_D ²⁵ = -6.0(c = 0.05, in MeOH), m/z = 919[M+Na]⁺

P-15: 23-하이드록시-3β-[(O-β-D-글루코피라노실-(1→4)-α-L-아라비노피라노실)옥시]루-20(29)-펜-오익산. 백색의 무정형, 녹는점: 267-269 ℃, 편광도: [α]_D ²⁵ = -27.7(c = 0.09, in MeOH-H₂O = 9:1), m/z = 789[M+Na]⁺

나머지 물질들은 공지의 물질로서 다음과 같다.

P-8: 3-O-[O-β-D-글루코피라노실-(1→3)-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-α-L-아라비노피라노실]헤데라제닌(Yoshihiro M., Akihito Y., Minpei K., Tomoki A., and Yutaka S., Triterpene saponins and lignans from the root Pulsatilla chinensis and their cytotoxic activity against HL-60 cells, J. Nat. Prod. 62, 1279-1283, 1999)

P-10: 3-O-[O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[O-β-D-글루코피라노실-(1→4)]-α-L-아라비노피라노실]올레아놀릭산(Yoshihiro M., Akihito Y., Minpei K., Tomoki A., and Yutaka S., Triterpene saponins and lignans from the root Pulsatilla chinensis and their cytotoxic activity against HL-60 cells, J. Nat. Prod. 62, 1279-1283, 1999)

P-14: 3-O-[O-β-D-글루코피라노실-(1→3)-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-α-L-아라비노피라노실]올레아놀릭산(Yoshihiro M., Akihito Y., Minpei K., Tomoki A., and Yutaka S., Triterpene saponins and lignans from the root Pulsatilla chinensis and their cytotoxic activity against HL-60 cells, J. Nat. Prod. 62, 1279-1283, 1999)

P-16: 3-O-[O-β-D-글루코피라노실-(1→4)-α-L-아라비노피라노실]헤데라제닌(Viqar U. A., Spectroscopic data of saponins. Vol. II, pp.1151, CRC press, 2000)

실시예 7: 분획 - 4 - 1'으로부터 물질 P-11, P-12의 분리

실시예 1에서 얻은 분획-4-1'(0.73 g)을 메탄올 15 ㎖에 완전히 녹인 후, 0.45 ㎛ 멤브레인 필터(미국 워터스사 제품)를 사용하여 2회 여과하였다. 이 여액을 Spherisorb® S5 ODS2 컬럼이 장착된 HPLC에서 유속을 2 ㎖/분으로 하고, 45% 아세토니트릴을 전개용매로 사용하여 1회당 100 ㎕씩 주입하면서 체류시간이 27.1 분대와 30.8 분대의 두 물질분획을 포집하여 감압건고하였다(도 7). 이 두 물질을 P-11(200.8 ㎎)과 P-12(160.9 ㎎)로 명명하였으며, 모두 백색 무정형 고체 형태로 분리되었다.

P-11과 P-12는 이미 문헌에 보고된 바 있는 물질로서, 23-하이드록시-3β-[(O-α-L-람노피라노실-(1→2)-α-L-아라비노피라노실)옥시]루-20(29)-펜-오익산(Yoshihiro M., Akihito Y., Minpei K., Mari H., Chiseko S., and Yutaka S., New bisdesmosidic triterpene saponins from the root of Pulsatilla chinensis, J. Nat. Prod. 64, 1226-1229, 2001)과 3-O-[O-α-L-람노피라노실-(1→2)-α-L-아라비노피라노실]헤데라제닌(Yoshihiro M., Akihito Y., Minpei K., Tomoki A., and Yutaka S., Triterpene saponins and lignans from the root Pulsatilla chinensis and their cytotoxic activity against HL-60 cells, J. Nat. Prod. 62, 1279-1283, 1999 ; Kang S. S., Saponins from the root of Pulsatilla koreana, Arch. Pharm. Res. 12(1), 42-47, 1989)으로 각각 동정되었다.

실험예 1: 백두옹에서 분리한 15종의 사포닌들의 항암성 측정 실험

백두옹으로부터 분리된 17종의 사포닌 중 P-12와 P-14는 동물실험에 충분한 양을 분리하지 못하였으므로 동물실험에서 제외하였다.

1. 시료의 제조:

1-1. 단리된 사포닌으로부터 주사제 조제

투여량은 6.6 μmol/㎏으로 통일하였다. 주사제제는 생리식염수 용액으로 하였으며, 식 0.132 μmol(각 물질)×5(마리 수)×14(주사일 수)로 계산된 양을 정밀히 달아, 크레모포어(Cremophore) 0.5 g을 함유한 생리식염수 14 ㎖에 녹인 것으로 하였다. 마우스 마리당 이 액 0.2 ㎖씩을 1 일 1회 복강 주사하였다. 양성 대조군에는 Taxol^® 주사제(Bristol-Myers Squibb사: 6 ㎎/㎖)를 투여하였으며, Taxol^® 주사제 2.8 ㎖을 생리식염수 11.2 ㎖에 녹이고, 그 중 0.2 ㎖을 마우스 마리당 1회 주사량으로 하였다. Taxol^®의 투여량은 문헌치(12.5 ㎎/㎏, J. Microencapsulation, Vol. 7, No. 2, pp.191-197, 1990)로부터 환산하였다.

1-2. 처방으로부터 주사제의 조제

몰수의 계산은 조성물의 몰수의 합, 즉 6.6 μmol/㎏으로 하였으며, 조제는 단리된 물질의 경우와 같이 행하였다. 단, 처방 7의 경우에는 4개 사포닌량의 합인 2.6 μmol/kg을 1/4 하여 동일량으로 조제하였다.

2. 투약 스케줄:

마우스의 몸무게 변화를 참고하며 주사하였으며, 4 일 연속 투약 후, 그 다음 1 일 휴약을 원칙으로 하였다.

3. 실험 동물:

실험에 사용한 마우스는 4 주령의 체중이 20-23 g의 건강한 수컷 BDF-1으로서, 대한실험동물센터에서 공급받아 사용하였다.

4. BDF-1의 사육:

사육기간 동안, 온도는 22±2 ℃, 습도는 65±5%로 유지하였으며, 12 시간을 주기로 명암을 주었다. 물과 먹이는 제한없이 공급하였으며, 사료는 항생제 무첨가 마우스용 사료를 사용하였다.

5. 동물실험 방법:

테루히로(Teruhiro)의 방법으로 BDF-1의 왼쪽 앞 겨드랑이 피하에 LL/2 (Lewis lung carcinoma cell) 1×10⁶ 세포/마우스를 이식하였다. 이식한지 24 시간이 경과하였을 때, 각 군을 5 마리씩 나눈 후, 매일 체중변화를 점검하면서 2 주간 복강 주사하였다. 대조군의 암 부피(tumor volume)가 약 2 ㎤되었을 때부터 암 크기를 측정한, 다음 아래의 계산식으로 암 부피를 구하여 각 시료의 항암효과를 측정하였다.

암의 부피(tumor volume, ㎣) = 길이(㎜)×넓이²(㎟) / 2

암성장 저지율(%) = [(대조군의 평균 암 부피(C) - 시료 투약군의 평균 암 부피(T)) / 대조군의 평균 암 부피(C)] ×100

6. 결과

6-1. 17종의 사포닌들이 갖는 암성장 저지율(IR, %)

백두옹으로부터 분리한 17종의 사포닌들이 갖는 암성장 저지율(IR, %)

사포닌	투여량(㎎/㎏)	항암성(%)a)
P-1	9.1	35.28
P-2	9.1	9.15
P-3	8.0	-0.84
P-4	8.0	3.64
P-5	6.0	27.52
P-6b)	6.0	66.92
P-7	6.0	-0.72
P-8	6.0	28.04
P-9	5.9	6.28
P-10c)	5.9	37.83
P-11	4.9	34.85
P-12	4.9	20.10
P-13	-e)	-
P-14	5.9	48.78
P-15	-	-
P-16	5.0	22.82
P-17	7.2	50.32
Taxolf )	12.5	35.8

a) 각 항암활성 값은 3회 측정된 값의 평균값(%)으로 하였다.

b) (주)에스비피사의 특허출원 물질(대한민국 특허출원 제2002-43016호)로서 투약용량은 6.0 ㎎/㎏으로 하였으며, 나머지 물질에 대한 투약용량은 이를 기준으로 분자량에 비례하여 사용하였다.

c) (주)삼양제넥스사의 특허출원 물질(대한민국 특허출원 제1999-17919호)을 사용하였다.

d) 음성 대조군으로 독소루비신을 사용하였다.

e) 물질의 보유량이 부족하여 동물실험을 하지 못하였다.

f) Taxol®을 음성 대조군으로 사용하였으며, 용량은 문헌상(J. Microencapsulation, Vol. 7, No. 2, pp. 191-197, 1990)의 투여량 12.5 ㎎/㎏으로 하였다.

표 5로부터 알 수 있는 바와 같이, 분리한 사포닌 중 P-6(66%), P-10(38%), P-14(48%) 및 P-17(50%)은 좋은 항암성을 보이나, 나머지 물질들은 약한 작용을 나타내고 있음을 알 수 있다. 이들 사포닌들은 모두 올레아난을 아글리콘으로 하고 있는 것이 특징이다. 기타 루판을 아글리콘으로 하고 있는 물질들은 납득할만한 항암성을 보이지 않으며, 아글리콘의 28번 탄소의 카복실산이 에스터화된 물질은 거의 항암성을 보이지 않았다. 이들 중 P-17은 신물질이고, 그 외 P-6, P-10 및 P-14는 공지의 물질이다. P-6은 동물의 고형암에 대하여 항암성을 보인다(대한민국 특허출원 제2002-43016호). P-10은 몇 종의 암세포에 대하여 비교적 강한 세포독성을 보이고 있으나(대한민국 특허출원 제1999-17919호) 동물모델에서는 P-6, P-14, P-17 보다 월등하게 약한 항암성을 보이고 있다.

본 발명에서는 신규 물질인 P-17이 50%의 암성장 저지율은 보이고, 기지 물질인 P-14가 48%의 암성장 저지율을 보이는 사실이 주목할 만하다.

6-2. 사포닌들의 항암성에 대한 상호 상승효과

표 6에 사포닌을 혼합투여함으로써 기대되는 항암성 상승효과를 나타내었다.

백두옹으로부터 분리한 17종의 사포닌들의 항암성에 대한 상호 상승효과

처방	투여량	항암성(%)a)
1	P-6(3.3 μmol/㎏) + P-10(3.3 μmol/㎏)	55
2	P-6(3.3 μmol/㎏) + P-17(3.3 μmol/㎏)	73
3	P-6(3.3 μmol/㎏) + P-14(3.3 μmol/㎏)	63
4	P-6(3.3 μmol/㎏) + P-5(3.3 μmol/㎏)	33
5	P-6(2.2 μmol/㎏) + P-10(2.2 μmol/㎏) + P-17(2.2 μmol/㎏)	64
6	P-6(1.65 μmol/㎏) + P-10(1.65 μmol/㎏) + P-14(1.65 μmol/㎏)	55
7	P-6(0.66 μmol/㎏) + P-2(0.66 μmol/㎏) + P-5(0.66 μmol/㎏) + P-8(0.66 μmol/㎏)	31

^a) 각 항암활성 값은 3회 측정된 값의 평균값(%)으로 하였다.

실험은 단독 투여할 경우의 물질의 몰수를 혼합하는 물질의 수에 따라 그들 물질의 양을 1/2, 1/3, 1/4, 1/10로 줄여서 혼합하여 6개의 처방을 구성하였다. 예를 들어, 처방 1의 항암성은 P-6 3.3 μmol/㎏과 P-10 3.3 μmol/㎏을 생리식염수 14 ㎖에 녹이고, 이 용액 0.2 ㎖을 BDF1 마우스의 복강에 격일로 8회 주사하고 16 일에 암의 크기를 측정하고 대조군의 암 크기에 대한 백분율로 표시한 것이다. 이는 P-6을 6.6 μmol/㎏을 투여하였을 때 얻은 66%에 비하여 낮은 항암성이지만, 처방 1에는 P-6의 함량이 그 절반인 3.3 μmol/㎏이라는 점을 고려하면 상당히 높은 항암성이다. 처방 2에서는 P-6 3.3 μmol/㎏에 단독 항암성이 비교적으로 높았던 P-17 3.3 μ/㎏을 동시 투여함으로써 암성장 저지율 73%을 보여 상승효과가 매우 높았으며, 처방 3의 경우도 마찬가지로 해석할 수 있다. 처방 4는 P-6 3.3 μmol/㎏과 항암성 약한 P-5 3.3 μmol/㎏을 혼합하여 투여한 것으로 그 항암성은 33%로 약한 편이다. 처방 5는 항암성이 좋은 P-6, P-10, P-17의 3종 사포닌을 2.2 μmol/㎏씩 혼합하여 투여한 것으로 64%의 암성장 저지율을 보였다. 이 값은 P-6 을 6.6 μmol/㎏ 단독으로 투여하였을 때와 같은 수준의 항암성이다. 처방 6은 처방 5의 P-17 대신 P-14을 가하여 구성한 처방이다. 이 처방의 항암성은 55%로 상당히 높은 수치이다. 처방 7은 P-6에 항암성이 경미한 P-2, P-5, P-8을 0.66 μmol/㎏ 혼합하여 투여한 것으로서 비교적 낮은 암성장 저지율(31%)을 보였다.

결론적으로, 분리한 사포닌 중 암성장 저지율이 가장 강한 P-6을 중심으로 기타 사포닌을 가미하여 처방을 구성하고 이들의 항암성을 측정하였다. 처방 1, 처방 2, 처방 3, 처방 4는 두 물질로 구성되어 있으며, 각 물질의 농도를 3.3 μmol/㎏으로 조정함으로써 그들 농도의 합이 6.6 μmol/㎏이 되게 하였다.

상기 결과로부터, 백두옹 성분 중 P-6이 주 항암물질이나, 백두옹의 항암성은 결국 항암성을 갖는 사포닌과의 동시작용의 합으로 나타난다고 할 수 있다(additivity rule). 이 현상은 처방 5와 처방 6에서도 분명히 나타난다. 처방 7은 P-6과 항암성이 미약한 사포닌 P-2, P-5, P-8로 구성된 처방으로 암성장 저지율은 31%로 약한 편이다. 그러나 항암성 31%는 P-6의 항암용량인 6.6 μmol/㎏의 1/10인 0.66 μmol/㎏ 용량에서 보면 상당한 항암성이라 할 수 있다.

6-3. 백두옹 사포닌의 항암성에 대한 종합적 평가

1) 백두옹의 사포닌 중 항암성이 인정되는 것은 P-6, P-10, P-14, P-17 등 4가지이며, 이 중 P-17은 신규 물질이다.

2) 항암성이 가장 강한 P-6과 항암성이 좋은 P-10, P-14, P-17을 저농도로 혼합한 처방들의 항암성이 우수하였다. 여기에는 가산성 법칙(additivity rule)이 적용된다.

3) P-6과 뚜렷한 항암성을 인정받지 못하는 P-2, P-5, P-8 등을 혼합하여 만든 처방에서도 상당한 항암성 상승효과를 확인할 수 있었다.

본 발명에 따르면, 백두옹으로부터 분리된 신규 사포닌 P-5, P-7, P-9, P-13, P-15 또는 P-17, 상기 P-17을 함유하는 항-고형암 조성물, 및 백두옹으로부터 분리된 사포닌 P-1 내지 P-17 중 2 이상의 성분을 포함하는 항-고형암 조성물이 제공된다.

Claims (5)

1. 유효성분으로서 백두옹으로부터 분리된, 하기 P-1 내지 P-4 및 P-7 내지 P-17로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상, 및 P-6을 포함하는 항-고형암 조성물:

   P-1: 23-하이드록시-3β-[(O-α-L-람노피라노실-(1→2)-O-[O-β-D-글루코피라노실-(1→4)]-α-L-아라비노피라노실)옥시]루-20(29)-펜-오익산 28-O-α-L-람노피라노실-(1→4)-O-β-D-글루코피라노실-(1→6)-β-D-글루코피라노실 에스터;

   P-2: 3-O-[O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[O-β-D-글루코피라노실-(1→4)]-α-L-아라비노피라노실]헤데라제닌 28-O-α-L-람노피라노실-(1→4)-O-β-D-글루코피라노실-(1→6)-β-D-글루코피라노실 에스터;

   P-3: 23-하이드록시-3β-[(O-α-L-람노피라노실-(1→2)-α-L-아라비노피라노실)옥시]루-20(29)-펜-오익산 28-O-α-L-람노피라노실-(1→4)-O-β-D-글루코피라노실-(1→6)-β-D-글루코피라노실 에스터;

   P-4: 3-O-[O-α-L-람노피라노실-(1→2)-α-L-아라비노피라노실]헤데라제닌 28-O-α-L-람노피라노실-(1→4)-O-β-D-글루코피라노실-(1→6)-β-D-글루코피라노실 에스터;

   P-6: 3-O-[O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[O-β-D-글루코피라노실-(1→4)]-α-L-아라비노피라노실]헤데라제닌;

   P-7: 23-하이드록시-3β-[(O-β-D-글루코피라노실-(1→3)-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-α-L-아라비노피라노실)옥시]루-20(29)-펜-오익산;

   P-8: 3-O-[O-β-D-글루코피라노실-(1→3)-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-α-L-아라비노피라노실]헤데라제닌;

   P-9: 3β-[(O-α-L-람노피라노실-(1→2)-O-[O-β-D-글루코피라노실-(1→4)]-α-L-아라비노피라노실)옥시]루-20(29)-펜-오익산;

   P-10: 3-O-[O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[O-β-D-글루코피라노실-(1→4)]-α-L-아라비노피라노실]올레아놀릭산;

   P-11: 23-하이드록시-3β-[(O-α-L-람노피라노실-(1→2)-α-L-아라비노피라노실)옥시]루-20(29)-펜-오익산;

   P-12: 3-O-[O-α-L-람노피라노실-(1→2)-α-L-아라비노피라노실]헤데라제닌;

   P-13: 3β-[(O-β-D-글루코피라노실-(1→3)-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-α-L-아라비노피라노실)옥시]루-20(29)-펜-오익산;

   P-14: 3-O-[O-β-D-글루코피라노실-(1→3)-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-α-L-아라비노피라노실]올레아놀릭산;

   P-15: 23-하이드록시-3β-[(O-β-D-글루코피라노실-(1→4)-α-L-아라비노피라노실)옥시]루-20(29)-펜-오익산;

   P-16: 3-O-[O-β-D-글루코피라노실-(1→4)-α-L-아라비노피라노실]헤데라제닌; 및

   P-17: 3-O-[O-β-D-글루코피라노실-(1→4)-O-β-D-글루코피라노실-(1→3)-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-α-L-아라비노피라노실]헤데라제닌.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, P-10, P-14 및 P-17로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상, 및 P-6을 포함하는 조성물.
4. 유효성분으로서 백두옹으로부터 분리된, 하기 P-2, P-5, P-6 및 P-8을 포함하는 항-고형암 조성물:

   P-2: 3-O-[O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[O-β-D-글루코피라노실-(1→4)]-α-L-아라비노피라노실]헤데라제닌 28-O-α-L-람노피라노실-(1→4)-O-β-D-글루코피라노실-(1→6)-β-D-글루코피라노실 에스터;

   P-5: 23-하이드록시-3β-[(O-α-L-람노피라노실-(1→2)-O-[O-β-D-글루코피라노실-(1→4)]-α-L-아라비노피라노실)옥시]루-20(29)-펜-오익산;

   P-6: 3-O-[O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[O-β-D-글루코피라노실-(1→4)]-α-L-아라비노피라노실]헤데라제닌; 및

   P-8: 3-O-[O-β-D-글루코피라노실-(1→3)-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-α-L-아라비노피라노실]헤데라제닌.
5. 제1항, 제3항, 또는 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 주사제, 좌제, 내복제, 외용제 또는 흡입제로 제형화되는 조성물.

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