CN107115372B - 一种含有罗布麻叶总黄酮的抗肿瘤药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及制药领域，具体提供了一种含有罗布麻叶总黄酮的抗肿瘤药物组合物，所述药物组合物由罗布麻叶总黄酮和蒽环类药物组成，其中所述蒽环类药物为吡柔比星或表柔比星，本发明药物组合物对蒽环类药物具有更好的抗肿瘤效果、且有效地减轻或避免了患者的心脏毒性、降低毒副作用。

Description

一种含有罗布麻叶总黄酮的抗肿瘤药物组合物

技术领域

本发明涉及制药领域，具体涉及一种具有增效并保护心脏毒性的含有罗布麻叶总黄酮的抗肿瘤药物组合物。

背景技术

肿瘤疾病目前属于人类的多发病之一，给患者带来了较大痛苦，目前肿瘤的治疗多以化学治疗为主，然而对患者进行化学治疗的同时，由于治疗药物的副作用，又给患者增加了疾病本身以外的痛苦，轻微的如头痛、恶心、乏力，严重的如脱发、肝肾及心脏毒性等等。

蒽环类药物，如表柔比星、吡柔比星等已被广泛地用于治疗血液系统恶性肿瘤和实体肿瘤，如乳腺癌、淋巴瘤、急性白血病等。其在抗肿瘤方面具有良好的效果。2014年《NCCN乳腺癌指南》推荐，乳腺癌首选辅助化疗方案为AC×4→T(P)×4(阿霉素、表柔比星、吡柔比星/环磷酰胺-紫杉醇)。然而，该类药物最突出的化疗毒副反应为心脏毒性(Anthracycline-Induced Cardiotoxicity，AIC)，主要表现为严重的急性、慢性、迟发性心肌毒性，为剂量限制性。Oeffinger KC等研究指出[2006年新英格兰医学杂志]，经化疗后乳腺癌患者长期存活者存在的问题：心脏原因引起的死亡率较正常人增高8.2倍；发生心衰的风险性高15倍，心血管疾病发生风险高10倍。

鉴于蒽环类药物的心脏毒性问题，国内外很多研究人员曾对心脏保护剂，包括辅酶Q10、左卡尼汀、N-乙酰半胱氨酸、抗氧化剂(VC和VE等)以及其他的铁螯合剂(如去铁敏和EDTA)进行了相关研究，这些研究认为，这些保护剂或许具有一定的心脏保护效果。但是，Van等^[4]使用Meta分析显示，辅酶Q10、左卡尼汀、N-乙酰半胱氨酸、VC和VE等对于蒽环类化疗没有明显的心脏保护作用。

右丙亚胺(Dexrazoxane)是美国Chiron公司开发的心脏保护药，其为双内酰亚胺类化合物，是乙二胺四乙酸(EDTA)的衍生物，1995年7月获FDA批准专属用于女性乳腺癌接受吡柔比星治疗所产生的心脏毒性的保护药。Chakrabarti等研究表明，右丙亚胺在细胞内转变为开环螯合剂，干扰铁离子中介的自由基的形成。Van等认为，只有右丙亚胺可使病人明显获益，心衰的发生率明显降低。然而，该药是否会干扰蒽环类药物的抗癌药效，是目前担心的问题，事实上己有证据提出该药可能会降低蒽环类药的抗癌药效。因此，临床肿瘤化疗迫切需要兼有预防蒽环类心脏毒性和增效抗肿瘤的药物。

罗布麻(Apocynum venetum L.)，为夹竹桃科(Apocynaceae)罗布麻属植物。我国罗布麻资源非常丰富，分布范围也很广，主要分布在沿海及内地半湿润及湿润地区，生长于河岸、山沟、山坡的砂质地，如辽宁、吉林、内蒙古、甘肃、新疆、陕西、山西、山东、河南、河北、江苏及安徽北部等地。现已有引种栽培驯化。罗布麻生态适应能力强，分布广泛，生境差异较大，有效成分的积累与气候、土壤和降雨量等生态环境因素有关，与采收期也密切相关。不同区域的地理气候差异，造就了罗布麻的多种不同生态类型，从而不同产地罗布麻叶总黄酮含量不同，而且罗布麻叶总黄酮中各类黄酮类物质种类及其含量也不尽相同(安徽全椒、天津武清及陕西高陵含量测定，其总黄酮的含量分别为1.25％、1.75％、1.34％，上述产地的罗布麻叶中均不含芦丁)。李庆华等研究认为，东北不同产地野生罗布麻叶总黄酮含量以辽河入海口和松嫩草原野生罗布麻叶总黄酮较高，并具有较强的抗氧化活性，可以作为提取用于药品、食品领域高效能天然抗氧化剂的潜在资源。罗布麻叶中主要含有黄酮类、鞣质、低分子有机酸、长链脂肪酸酯、醇类、甾体类等成分，而总黄酮在罗布麻各器官的分布规律为花、叶、茎、根、果实。

研究发现，目前对于同时兼有保护蒽环类药物心脏毒性和增效蒽环类药物化疗疗效尚缺乏有效治疗药物及干预手段，其系统治疗尚属空白。

因此，寻找一种具有更好抗肿瘤效果、且能有效预防或治疗抗肿瘤药物的毒副作用的药物组合物、一直是本领域技术人员研究的热点。

发明内容

针对以上情况，本发明提供一种含有罗布麻叶总黄酮的抗肿瘤药物组合物，所述药物组合物由罗布麻叶总黄酮和蒽环类药物组成，其中所述蒽环类药物为表柔比星或吡柔比星。

本发明所述罗布麻叶总黄酮可以是本领域各种药用罗布麻叶总黄酮，其制备方法和来源并不受限制，以符合药用为基本前提，作为实施方案之一，可以选择例如罗布麻叶总黄酮中有效成分含量应大于或等于70％，例如包括不限于80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％以上。作为本发明实施方案之一，作为示例性的说明，例如罗布麻叶总黄酮经乙醇回流纯化后紫外分光光度计法证实的主要成分含量为72.1％(以芦丁计)，并对其中黄酮类物质进行测定，金丝桃苷为4.59％、芦丁9.86％、槲皮素0.12％。

本发明组合物中所述表柔比星或吡柔比星均为已知上市的药物，本领域技术人员无论市购或按已有方法合成均能得到符合药用标准的化合物。

本发明中，本领域技术人员也可以将柔红霉素、去甲氧柔红霉素或阿克拉霉素与罗布麻叶总黄酮组合以用于受试者心脏毒性的保护和抗肿瘤药物的增效，其体内体外的使用剂量范围可以由本领域技术人员参考本发明所公开的剂量范围进行确定。

本发明由罗布麻叶总黄酮和蒽环类药物组成的组合物中，当将本发明药物组合物向受试者施用时(例如包括但不限于口服施用)，所述组合物中罗布麻叶总黄酮与蒽环类药物的质量比为(50～200)∶(15～18)；作为另一实施方案之一、所述组合物中罗布麻叶总黄酮与蒽环类药物的质量比为(100～200)∶(15～18)；作为更进一步实施方案之一、罗布麻叶总黄酮与蒽环类药物优选为200∶(15～18)。

本发明药物组合物中，作为实施方案之一、本发明组合物直接作用于癌细胞或心肌细胞时，所述罗布麻叶总黄酮与蒽环类药物组合物的质量/体积浓度比(30～90)∶(2.90-3.32)；作为进一步实施方案之一，所述罗布麻叶总黄酮与蒽环类药物的质量/体积浓度比为(60～90)∶(2.90～3.32)。

本发明中，作为实施方案之一，本发明罗布麻叶总黄酮与吡柔比星的组合物向受试者施用时(例如包括但不限于口服施用)，作为实施方案之一，所述药物组合物中罗布麻叶总黄酮与吡柔比星的质量比为(50～200)∶18；作为另一实施方案之一，所述组合物中罗布麻叶总黄酮与吡柔比星的质量比为(100～200)∶18；作为进一步实施方案之一，罗布麻叶总黄酮与吡柔比星的质量比优选为200∶18；作为示例性的说明，罗布麻叶总黄酮与吡柔比星的质量比包括但不限于50∶18、100∶18或200∶18等等。其中当向受试者施用本发明药物组合物时，本领域技术人员通常会针对不同的受试者进行剂量的相应变化和/或调整，例如当向人类患者施用时，本领域技术人员通常会按照一定的比例关系换算成人用的相应剂量，换算后组合物各组分之间质量比例关系同样在本发明的保护的比例范围内。

同样作为本发明示例性说明，所述药物组合物罗布麻叶总黄酮与吡柔比星的组合包括但不限于为50mg/kg和18mg/kg、100mg/kg和18mg/kg、或200mg/kg和18mg/kg的组合物。

本发明中，作为实施方案之一，本发明罗布麻叶总黄酮与吡柔比星组合物直接作用于癌细胞或心肌细胞时，所述罗布麻叶总黄酮与吡柔比星的质量体积浓度比为(30～90)∶3.32；作为进一步实施方案之一，布麻叶总黄酮与吡柔比星的质量体积浓度比为(60～90)∶3.32；作为更进一步实施方案之一，布麻叶总黄酮与吡柔比星的质量/体积浓度比为60∶3.32；作为示例性的说明，罗布麻叶总黄酮与吡柔比星的质量/体积浓度比包括但不限于30∶3.32、60∶3.32或90∶3.32等等。

作为示例性的说明，所述组合物中罗布麻叶总黄酮与吡柔比星的组合物包括但不限于为30μg/ml和3.32μg/ml、60ug/ml和3.32μg/ml、或60μg/ml和3.32μg/ml的组合物。

本发明中，罗布麻叶总黄酮与表柔比星进行组合并向受试者施用时(例如包括但不限于口服施用)，作为本发明实施方案之一，所述药物组合物中罗布麻叶总黄酮与表柔比星的质量比为(50～200)∶15；作为本发明进一步实施方案之一，所述组合物中罗布麻叶总黄酮与表柔比星的质量比为(100～200)∶15；作为本发明更进一步实施方案之一，优选为200∶15；其中当向受试者施用本发明药物组合物时，本领域技术人员通常会针对不同的受试者进行剂量的相应变化和/或调整，例如当向人类患者施用时，本领域技术人员通常会按照一定的比例关系换算成人用的相应剂量，换算后组合物各组分之间质量比例关系同样在本发明的保护的比例范围内。

作为示例性的说明，本发明罗布麻叶总黄酮与表柔比星组合物的质量比包括但不限于50∶15、100∶15或200∶15等等。

同样作为示例性的说明，所述药物组合物罗布麻叶总黄酮与表柔比星的组合为50mg/kg和15mg/kg、100mg/kg和15mg/kg、或200mg/kg和15mg/kg的组合物。

本发明中，作为实施方案之一，本发明罗布麻叶总黄酮与表柔比星组合物直接作用于癌细胞或心肌细胞时，所述罗布麻叶总黄酮与表柔比星的质量/体积浓度比为(30～90)∶2.90；作为进一步实施方案之一，布麻叶总黄酮与表柔比星的质量/体积浓度比为(60～90)∶2.90；作为更进一步实施方案之一，布麻叶总黄酮与表柔比星的质量/体积浓度比为60∶2.90；作为示例性的说明，罗布麻叶总黄酮与吡柔比星的质量/体积浓度比包括但不限于30∶2.90、60∶2.90或90∶2.90等等。

同样作为示例性的说明，所述组合物中罗布麻叶总黄酮与表柔比星的组合物包括但不限于为30ug/ml和2.90μg/ml、60μg/ml和2.90μg/ml、或60μg/ml和2.90μg/ml的组合物等等。

在用本发明药物组合物治疗各种肿瘤时，在将本发明组合物制成同时给药的药剂的方案中，罗布麻叶总黄酮与蒽环类药物可以含在同一种药物制剂如片剂或胶囊中，也可以将罗布麻叶总黄酮类药物与蒽环类药物分别做成制剂，如分别做成片剂或胶囊，并采用本领域常规的方式将它们包装或结合在一起，患者然后按照药品说明书的指示同时服用；在将本发明组合物制成先后给药的药剂的方案中，可以将罗布麻叶总黄酮与蒽环类药物分别做成不同的制剂，并采用本领域常规的方式将它们包装或结合在一起，患者然后按照药品说明书指示的先后顺序进行服用，或将上述组合物成分制成一种控释的制剂，先释放组合物中的一种成分、再释放组合物中的另一种成分、患者只需要服用该控释组合物制剂；在将本发明组合物制备成交叉给药的药剂的方案中，可以将罗布麻叶总黄酮与蒽环类药物分别做成不同的制剂，并采用本领域常规的方式将它们包装或结合在一起，患者然后按照药品说明书指示的交叉顺序服用，或者将该药物组合物制备成交叉释放的控释制剂。

本发明组合物制剂规格可以为本领域常用的规格，作为示例性的说明，例如包括不限于单元制剂中含有200mg的罗布麻叶总黄酮和18mg吡柔比星；100mg的罗布麻叶总黄酮和18mg吡柔比星；或200mg的罗布麻叶总黄酮和18mg吡柔比星。

本发明组合物在制备治疗癌症的药物中的应用中，所述组合物可以同时使用或以任何先后的顺序使用，如可以将罗布麻叶总黄酮与蒽环类药物同时给患者服用；也可以先服用其中的一种，然后再服用另一种药物，对于罗布麻叶总黄酮与蒽环类药物的时间间隔没有特别要求，但优选服用两种药物的时间间隔不超过一天。

本发明中，可将本发明药物组合物采用本领域常规的方法制备成适于胃肠道给药或非胃肠道给药的药物制剂，本发明优选制成胃肠道给药的药物制剂，其制剂形式可以为常规片剂或胶囊、或控释、缓释制剂。在本发明组合物的药物制剂中，根据不同的制剂形式和制剂规格，所述组合物在制剂中的含量可以由本领域技术人员根据本发明并结合并领域常识进行确定；制剂使用的辅料可采用本领域常规的辅料，以不和本发明组合物发生反应或不影响本发明药物的疗效为前提；所述制剂的制备方法可采用本领域常规的制备方法进行制备。

本发明中，组合物的制备方法没有什么限制，可以将本发明药物组合物进行直接混合然后做成制剂，或分别和/或相应的辅料混合分别做成制剂，然后再按照本领域常规的方式包装在一起，或分别和相应的辅料混合然后再混合做成制剂。

本发明中的药物组合物的给药剂量根据给药对象、给药途径或药物的制剂形式不同可以进行适当的变化，但以保证该药物组合物在哺乳动物体内能够达到有效的血药浓度为前提。

本发明还提供一种上述药物组合物在制备预防或治疗抗肿瘤药物心脏毒性作用药物中的应用。

在相关的实验中发现，10～120μg/ml罗布麻叶总黄酮对乳腺癌MDA-MB-231细胞具有不同程度的抑制作用，10～100μg/ml罗布麻叶总黄酮的抑制作用具有显著性差异，其中以60μg/ml抑制作用最佳。而120μg/ml罗布麻叶总黄酮对乳腺癌MDA-MB-231细胞具有促进其增殖作用。

进一步的实验证明，本发明以3.32μg/ml吡柔比星、右丙亚胺组联合吡柔比星、单纯罗布麻叶总黄酮(60μg/ml)及罗布麻叶总黄酮(罗布麻叶总黄酮提前1h处理细胞)联合吡柔比星(共4组)作用于乳腺癌MDA-MB-231细胞，处理细胞24h后的结果显示，单纯应用吡柔比星、单纯应用右丙亚胺及单纯罗布麻叶总黄酮对MDA-MB-231细胞均有显著抑制增殖作用(癌细胞抑制率分别为32.91％、10.85％、21.16％)；罗布麻叶总黄酮联合吡柔比星较右丙亚胺联合吡柔比星效果更强(癌细胞抑制率为67.55％及86.87％)，说明罗布麻叶总黄酮联合吡柔比星较右丙亚胺联合应用吡柔比星时具有较强的抗肿瘤增殖效应(P＜0.05)。

同时，在另一体外实验中，予以吡柔比星处理H9c2心肌细胞，复制心脏毒性(心肌细胞损伤)模型，给予右丙亚胺及罗布麻叶总黄酮(罗布麻叶总黄酮提前1h处理细胞)，以观察二者对心肌细胞的保护作用。处理细胞24h后的结果显示，吡柔比星可显著提高心肌细胞抑制率；右丙亚胺及90μg/ml罗布麻叶总黄酮可减轻吡柔比星所致心肌细胞损伤作用，降低细胞抑制率；而60μg/ml罗布麻叶总黄酮对心肌细胞抑制率显著降低，且优于右丙亚胺阳性药对照组(P＜0.05)。

在体内实验中，预先予以大鼠不同的罗布麻叶总黄酮(50、100及200mg/kg)灌胃7天，第7天以尾静脉注射吡柔比星(18mg/kg)复制Wistar大鼠急性心脏毒性模型，结果显示，吡柔比星可致大鼠心率增快、QRS波畸形或倒置、房颤、室上性心动过速等心电图改变；心脏收缩及舒张功能降低；外周血心肌酶谱升高、SOD活力下降及MDA升高。应用右丙亚胺及50、100及200mg/kg罗布麻叶总黄酮组均可改善吡柔比星所致心脏毒性，其中以中、高剂量罗布麻叶总黄酮组改善作用最好，绝大多数指标优于右丙亚胺，体现在具有降低外周血心肌酶、抗氧化损伤相关酶活力及改善心脏收缩与舒张功能障碍。形态学观察结果显示，尾静脉注射吡柔比星后，大鼠心肌组织内可见数量不等的灶状、小灶状性或涉及几个心肌细胞的病变。表现为肌浆红染，部分细胞的细胞核浓染，不规则，部分细胞核消失；也可见部分细胞空泡变性及脂肪变性。未见肌间水肿及炎细胞浸润。病变主要分布于中膜。右丙亚胺组及罗布麻叶总黄酮各剂量组均能减轻上述心肌病变程度及病变数量，以罗布麻叶总黄酮中、高剂量疗效最佳。研究成果，罗布麻叶总黄酮对吡柔比星所致心脏毒性具有保护作用。

本发明药物组合物不仅提高了药物的抗肿瘤活性，而且对吡柔比星所致心脏毒性具有保护作用，减轻或避免了毒副作用的发生。

附图说明

图1：实施例1中罗布麻叶总黄酮高效液相色谱图；

图2：实验例1中1.1.1部分的罗布麻叶总黄酮对吡柔比星诱导H9c2细胞毒性的保护作用(

)；

图3：实验例1中1.1.2部分的0～160μg/ml罗布麻叶总黄酮对人乳腺癌MDA-MB-231细胞抑制作用筛选散点图；

图4：实验例1中1.1.3部分的罗布麻叶总黄酮联合吡柔比星对人乳腺癌细胞MD-MBA-231抑制作用(

)；

图5：实验例1中1.2.1部分的罗布麻叶总黄酮对表柔比星诱导H9c2细胞毒性的保护作用(

)；

图6：实验例1中1.2.2部分的罗布麻叶总黄酮联合表柔比星对人乳腺癌细胞MD-MBA-231抑制作用(

)；

图7：实验例2中a)部分的罗布麻叶总黄酮对吡柔比星致急性心脏毒性大鼠24h心电图的影响，其中X轴：时间ms；Y轴：电压mV；A：正常对照组；B：吡柔比星组；C：右丙亚胺组；D：罗布麻叶总黄酮低浓度组；E：罗布麻叶总黄酮中浓度组；F：罗布麻叶总黄酮高浓度组；

图8：实验例2中a)部分的罗布麻叶总黄酮对吡柔比星致大鼠急性心脏毒性48h心电图的影响；X轴：时间ms；Y轴：电压mV；A：正常对照组；B：吡柔比星组；C：右丙亚胺组；D：罗布麻叶总黄酮低浓度组；E：罗布麻叶总黄酮中浓度组；F：罗布麻叶总黄酮高浓度组；

图9：实验例2中a)部分的罗布麻叶总黄酮对吡柔比星致大鼠急性心脏毒性72h心电图的影响；X轴：时间ms；Y轴：电压mV；A：正常对照组；B：吡柔比星组；C：右丙亚胺组；D：罗布麻叶总黄酮低浓度组；E：罗布麻叶总黄酮中浓度组；F：罗布麻叶总黄酮高浓度组；

图10：实验例2中b)部分的罗布麻叶总黄酮对吡柔比星致大鼠急性心脏毒性24h左心功能的影响；X轴：时间ms；Y轴：电压mV；A：正常对照组；B：吡柔比星组；C：右丙亚胺组；D：罗布麻叶总黄酮低浓度组；E：罗布麻叶总黄酮中浓度组；F：罗布麻叶总黄酮高浓度组；

图11：实验例2中b)部分的罗布麻叶总黄酮对吡柔比星致大鼠急性心脏毒性48h左心功能的影响；X轴：时间ms；Y轴：电压mV；A：正常对照组；B：吡柔比星组；C：右丙亚胺组；D：罗布麻叶总黄酮低浓度组；E：罗布麻叶总黄酮中浓度组；F：罗布麻叶总黄酮高浓度组；

图12：实验例2中b)部分的罗布麻叶总黄酮对吡柔比星致大鼠急性心脏毒性72h左心功能的影响；X轴：时间ms；Y轴：电压mV；A：正常对照组；B：吡柔比星组；C：右丙亚胺组；D：罗布麻叶总黄酮低浓度组；E：罗布麻叶总黄酮中浓度组；F：罗布麻叶总黄酮高浓度组；

图13：实验例2中e)部分的罗布麻叶总黄酮对吡柔比星致大鼠急性心脏毒性心脏组织形态学变化(HE染色，×200)。

具体实施方式

本发明通过以下实施例和实验例用于进一步阐述本发明，但不以任何的方式限制本发明的有效范围。

实施例1罗布麻叶总黄酮的制备

制备方法：

a)将干燥的罗布麻叶粉碎过20-50目筛成药粉，用10倍量的浓度为75％的乙醇加热回流2h，提取2次，合并提取液，滤过，回收乙醇，浓缩，得到浓缩液；

b)将步骤a浓缩液用D101大孔树脂进行纯化，先用水洗，再用50％乙醇洗脱，滤液合并、浓缩即得。

检测方法：用分光光度法测定提取液中总黄酮的含量；

c)精密称取芦丁样品，用30％乙醇溶解，准确量取不同体积的溶液，在506nm处测定吸光度，绘制标准曲线。

d)精密称取0.0193g罗布麻叶总黄酮置于50ml容量瓶中，分别精密移取1、2、3ml置于10ml容量瓶中，按药典方法在506nm波长处测其吸光度，并计算含量，结果见表1。

表1 罗布麻叶总黄酮纯化后含量测定

取样体积(ml)	吸光度	含量(％)
			1	0.327	73.7
2	0.650	72.1
			3	0.980	72.1

e)应用HPLC方法检测罗布麻叶总黄酮其中主要黄酮的含量

色谱条件：

安捷伦1260四元低压泵，DAD检测器，手动进样(10μl定量环)，色谱柱：PlatisilODS C₁₈(5μm，250mm×4.6mm)，检测波长：256nm，360nm，370nm，254nm，346nm，368nm，参比波长：500nm。

柱温：55℃，流速：1.0ml·min^-1，流动相：B(乙腈)-D(0.4％磷酸-水)，梯度条件：0-25min，15％B；25-33min，15％-17％B；33-37min，17％～19％；37～40min，19％B；40～45min，19％～25％B；45～50min，25％～30％；50～55min，30％～90％B，结果见图1。

实施例2～13含有罗布麻叶总黄酮的抗肿瘤药物组合物实施例及实验例

各组合物的制备按以下表2中的比例进行制备。

对于实施例2～13中的液体组合物的制备，可以将对应浓度的本发明组合物制备成同一种溶液中，然后施用时直接使用；也可以将它们分别制成相应浓度的溶液，然后进行混合并在施用时直接使用；也可以在使用时进行混合后在进行施用，或分别向受试者施用，它们施用的先后顺序并不受限制。

对于实施例2～13中的固体组合物的制备，可以将对应质量的药物直接进行混合，使用同时服用；也可以将它们分别制成单元制剂，在施用时同时向受试者服用，或先后服用，但它们之间使用先后顺序并不受限制。

各实验例的方法包括如下

试剂和方法：

试剂：大鼠血清脑钠素BNP(MEXN-R0119)、血清心肌肌钙蛋白T(MEXN-R0994)及肌酸激酶同工酶MB(MEXN-R0995)试剂盒均购于上海美轩生物科技有限公司。丙二醛(A003-1)、乳酸脱氢酶LDH(A020-2)及超氧化物歧化酶SOD(A001-3)等试剂盒均购买于南京建成生物工程研究所。

动物：清洁级Wistar大鼠购自吉林大学动物实验中心。常规饲养，房间恒温在20～28℃，自动人工光照明暗各12h，标准饲养

细胞：人乳腺癌MDA-MB-231细胞和大鼠心肌细胞H9c2由吉林大学再生医学研究所孙非教授惠赠。

药品：罗布麻叶总黄酮：由实施例1制备；表柔比星：浙江海正药业股份有限公司；吡柔比星：深圳万乐药业有限公司；药物来源。

体外实验方法：细胞培养，MTT实验筛选罗布麻叶总黄酮对心肌细胞及乳腺癌细胞最佳的给药浓度，分别联合表柔比星、吡柔比星作用心肌细胞及乳腺癌细胞最佳的给药浓度。

体内实验方法：分别预先给予罗布麻叶总黄酮后，应用表柔比星、吡柔比星分别复制大鼠急性心脏毒性模型，观察不同给药组合对大鼠心电图、左心室收缩压(LVSP，mmHg)、左心室舒张压(LVDP，mmHg)、左心室终末舒张压(LVEDP，mmHg)、左心室内压最大上升速率(dp/dtmax，mmHg/s)、左心室内压最大下降速率(-dp/dtmax，mmHg/s)、心率(HR)等数据；分析心肌酶谱、抗氧化指标及心脏组织形态学变化。

表2 罗布麻叶总黄酮与吡柔比星、表柔比星的组合物

实验例1 体外试验

1.1.1不同比例的罗布麻叶总黄酮和吡柔比星组合物对H9c2细胞抑制率的影响(MTT法)

试验方法：

H9c2心肌细胞接种于96孔培养板中，当细胞生长到培养孔面积大约80％时，根据实验需要进行不同的处理：(1)分别给予及30、60及90μg/ml不同浓度的罗布麻叶总黄酮(TFF)预处理1h后弃去，PBS洗2次，再用3.32μg/ml吡柔比星培养24h；(2)TFF预处理的24后弃去，PBS洗2次，再用3.32μg/ml吡柔比星培养24h；每个处理因素设8个复孔。终止培养后，每孔加入10μl MTT，轻摇，37℃孵育。然后测量细胞抑制率，测量结果参见表3和图2。

数据统计数据使用SPSS 17.0软件进行组间单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

表3 罗布麻叶总黄酮对吡柔比星诱导H9c2细胞毒性的保护作用(

n＝8)

注：与正常对照组比较，^aP＜0.05；与模型组比较，^bP＜0.05；与右丙亚胺组比较，^cP＜0.05

结论：

通过予以吡柔比星处理H9c2心肌细胞，复制心脏毒性(心肌细胞损伤)模型，结果显示，吡柔比星显著提高心肌细胞抑制率；右丙亚胺及各组罗布麻叶总黄酮均可减轻吡柔比星所致心肌细胞损伤作用，显著降低细胞抑制率；30μg/ml、90μg/ml罗布麻叶总黄酮对心肌损伤有改善作用但不显著，而60μg/ml罗布麻叶总黄酮组可显著降低心肌细胞抑制率，且明显低于右丙亚胺阳性药对照组。

1.1.2不同比例的罗布麻叶总黄酮和吡柔比星组合物对人乳腺癌MDA-MB-231细胞活性的影响

试验方法：

培养在DMEM+10％胎牛血清(FBS)完全培养基中进行；在37℃，5％浓度的CO₂，饱和湿度的细胞培养箱中培养。细胞系状态稳定后，将细胞铺于96孔板中，每孔5000个细胞，每孔含完全培养基90μl。人乳腺癌MDA-MB-231细胞按以下方式分组并处理：

(1)对照组：完全培养基溶液8孔处理；

(2)罗布麻叶总黄酮各剂量组：用完全培养基配制浓度为0、10、20、40、60、80、100、120、140及160μg/ml的罗布麻叶总黄酮溶液，每组设8个复孔。

以上分组及加药处理24h后，每孔中加入20μl磷酸盐缓冲溶液(PBS溶液)配制的5mg/ml的噻唑蓝(MTT)溶液继续培养4h。吸走上层培养基(人乳腺癌细胞用平板离心机先将悬浮的细胞离心至孔底)，每孔中加入150μl二甲亚飒(DMSO)进行溶解，振荡器上溶解10min后，用酶标仪于495nm检测吸光度(OD值)。结果见表4及图3。

表4 罗布麻叶总黄酮总黄酮对人乳腺癌MDA-MB-231细胞的影响(

n＝8)

注：与正常对照组比较^aP＜0.05，^bP＜0.01

根据上述10、20、40、60、80、100及120μg/ml罗布麻叶总黄酮对人乳腺癌MDA-MB-231细胞抑制率，提示10～100μg/ml罗布麻叶总黄酮对乳腺癌MDA-MB-231细胞具有显著抑制作用，其中以60μg/ml抑制作用最佳。而大于120μg/ml罗布麻叶总黄酮对乳腺癌MDA-MB-231细胞具有促进其增殖作用。

1.1.3不同比例的罗布麻叶总黄酮和吡柔比星组合物对人乳腺癌MDA-MB-231细胞活性的影响

试验方法：

培养在DMEM+10％胎牛血清(FBS)完全培养基中进行；在37℃，5％浓度的CO₂，饱和湿度的细胞培养箱中培养。细胞系状态稳定后，将细胞铺于96孔板中，每孔5000个细胞，每孔含完全培养基90μl。人乳腺癌MDA-MB-231细胞按以下方式分组并处理：

(1)对照组：完全培养基溶液8孔处理；

(2)吡柔比星组：用完全培养基配制浓度为3.32μg/ml的吡柔比星溶液，每孔中处理；

(3)罗布麻叶总黄酮组：用完全培养基配制浓度为30、60、90μg/ml的罗布麻叶总黄酮溶液，每组做8个复孔；

(4)吡柔比星和罗布麻叶总黄酮组合药物组：用完全培养基配制浓度为3.32μg/ml的吡柔比星溶液及30、60、90μg/ml的罗布麻叶总黄酮混合药液，每组做8个复孔；

(5)吡柔比星和右丙亚胺组合药物组：用完全培养基配制浓度为3.32μg/ml的吡柔比星溶液及60μg/ml的罗布麻叶总黄酮混合药液，每组做8个复孔。

以上分组及加药处理24h后，每孔中加入20μl磷酸盐缓冲溶液(PBS溶液)配制的5mg/ml的噻唑蓝(MTT)溶液继续培养4h。吸走上层培养基(人乳腺癌细胞用平板离心机先将悬浮的细胞离心至孔底)，每孔中加入150μl二甲亚飒(DMSO)进行溶解，振荡器上溶解10min后，用酶标仪在495nm检测吸光度OD值。最后测量各组细胞抑制率，结果参见表5和图4。

表5 罗布麻叶总黄酮联合吡柔比星对人乳腺癌细胞MD-MBA-231抑制作用(

n＝8)

注：与正常对照组比较，^aP＜0.05；与模型组比较，^bP＜0.05；与右丙亚胺联合吡柔比星组比较，^cP＜0.05

结论：

本发明以3.32μg/ml吡柔比星、右丙亚胺组联合吡柔比星组、罗布麻叶总黄酮及单纯罗布麻叶总黄酮(罗布麻叶总黄酮提前1h处理细胞)联合吡柔比星抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞，处理细胞24h后的结果显示，单纯应用吡柔比星、单纯应用右丙亚胺及单纯罗布麻叶总黄酮对均有显著抑制增殖作用(癌细胞抑制率分别为32.91％、10.85％、21.12％)；各组罗布麻叶总黄酮联合吡柔比星(癌细胞抑制率为23.59％、32.44％、27.33％)较右丙亚胺联合吡柔比星(抑制率13.14％)效果更强，(P＜0.05)，以60μg/ml罗布麻叶总黄酮作用最佳。说明罗布麻叶总黄酮联合吡柔比星组较右丙亚胺联合应用吡柔比星具有更强的抗肿瘤增殖效应，其中60μg/ml抗肿瘤增殖效应最佳。

1.2.1不同比例的罗布麻叶总黄酮和表柔比星组合物对H9c2细胞抑制率的影响(MTT法)

试验方法：

H9c2心肌细胞接种于96孔培养板中，当细胞生长到培养孔面积大约80％时，根据实验需要进行不同的处理：(1)分别给予及30、60及90μg/ml不同浓度的罗布麻叶总黄酮(TFF)预处理1h后弃去，PBS洗2次，再用2.90μg/ml表柔比星培养24h；(2)TFF预处理的24后弃去，PBS洗2次，再用2.90μg/ml表柔比星培养24h；每个处理因素设8个复孔。终止培养后，每孔加入10μl MTT，轻摇，37℃孵育。然后测量细胞抑制率，测量结果参见表6和图5。

数据统计数据使用SPSS 17.0软件进行组间单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

表6 罗布麻叶总黄酮对表柔比星诱导H9c2细胞毒性的保护作用(

n＝8)

注：与正常对照组比较，^aP＜0.05；与模型组比较，^bP＜0.05；与右丙亚胺组比较，^cP＜0.05

结论：

通过予以表柔比星处理H9c2心肌细胞，复制心脏毒性(心肌细胞损伤)模型，结果显示，表柔比星可显著提高心肌细胞抑制率；右丙亚胺及各组罗布麻叶总黄酮可减轻表柔比星所致心肌细胞损伤作用，显著降低细胞抑制率；30μg/ml、90μg/ml罗布麻叶总黄酮对心肌损伤有改善作用但不显著，而60μg/ml罗布麻叶总黄酮组可显著降低心肌细胞抑制率，且明显优于右丙亚胺阳性药对照组。

1.2.2不同比例的罗布麻叶总黄酮和表柔比星组合物对人乳腺癌MDA-MB-231细胞活性的影响

试验方法：

培养在DMEM+10％胎牛血清(FBS)完全培养基中进行；在37℃，5％浓度的CO₂，饱和湿度的细胞培养箱中培养。细胞系状态稳定后，将细胞铺于96孔板中，每孔5000个细胞，每孔含完全培养基90μl。人乳腺癌MDA-MB-231细胞按以下方式分组并处理：

(1)对照组：完全培养基溶液10孔处理；

(2)表柔比星组：用完全培养基配制浓度为2.90μg/ml的表柔比星溶液，每孔中处理；

(3)罗布麻叶总黄酮组：用完全培养基配制浓度为30、60、90μg/ml的罗布麻叶总黄酮溶液，每组做8个复孔；

(4)表柔比星和罗布麻叶总黄酮组合药物组：用完全培养基配制浓度为2.90μg/ml的表柔比星溶液及30、60、90μg/ml的罗布麻叶总黄酮混合药液，每组做8个复孔；

(5)表柔比星和右丙亚胺组合药物组：用完全培养基配制浓度为2.90μg/ml的吡柔比星溶液及60μg/ml的罗布麻叶总黄酮混合药液，每组做8个复孔。

以上分组及加药处理24h后，每孔中加入20μl磷酸盐缓冲溶液(PBS溶液)配制的5mg/ml的噻唑蓝(MTT)溶液继续培养4h。吸走上层培养基(人乳腺癌细胞用平板离心机先将悬浮的细胞离心至孔底)，每孔中加入150μl二甲亚飒(DMSO)进行溶解，振荡器上溶解10min后，用酶标仪在495nm检测吸光度OD值。最后测量各组细胞抑制率，结果参见表7和图6。

表7 罗布麻叶总黄酮联合表柔比星对人乳腺癌细胞MD-MBA-231抑制作用(

n＝8)

注：与正常对照组比较，^aP＜0.05；与模型组比较，^bP＜0.05；与右丙亚胺联合表柔比星组比较，^cP＜0.05

结论：

本发明以2.90μg/ml表柔比星、右丙亚胺组联合表柔比星组、罗布麻叶总黄酮及单纯罗布麻叶总黄酮(罗布麻叶总黄酮提前1h处理细胞)联合表柔比星抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞，处理细胞24h后的结果显示，单纯应用表柔比星、单纯应用右丙亚胺及单纯罗布麻叶总黄酮对均有显著抑制增殖作用(癌细胞抑制率分别为49.91％、30.72％、36.67％)；各组罗布麻叶总黄酮联合表柔比星(癌细胞抑制率分别为36.45％、43.28％、36.12％)较右丙亚胺联合表柔比星(癌细胞抑制率31.25％)效果更强，(P＜0.05)，以60μg/ml罗布麻叶总黄酮作用最佳。说明罗布麻叶总黄酮联合表柔比星组较右丙亚胺联合应用表柔比星具有更强的抗肿瘤增殖效应，其中60μg/ml抗肿瘤增殖效应最佳。

实验例2 体内试验

不同比例组合的罗布麻叶总黄酮和吡柔比星组合物对吡柔比星诱导Wistar大鼠急性心脏毒性的保护作用

蒽环类药物急性心脏毒性模型制备：

按照人类疾病动物模型复制方法及《五味子乙素和右丙亚胺对阿霉素诱导心脏毒性的保护作用》文章中方法进行制备。

药品、试剂及动物：

药品：盐酸吡柔比星(THP，深圳万乐股份有限公司)、注射用右丙亚胺(DZR，江苏奥赛康药业股份有限公司)、罗布麻叶总黄酮(TFF，按照实施1制备)。

试剂：大鼠血清脑钠素BNP(MEXN-R0119)、血清心肌肌钙蛋白T(MEXN-R0994)及肌酸激酶同工酶MB(MEXN-R0995)试剂盒均购于上海美轩生物科技有限公司。丙二醛(A003-1)、乳酸脱氢酶LDH(A020-2)及超氧化物歧化酶SOD(A001-3)等试剂盒均购买于南京建成生物工程研究所。

动物：清洁级Wistar大鼠购自吉林大学动物实验中心。常规饲养，房间恒温在20～28℃自动人工光照明暗各12h，标准饲养。

实验方法：

取体重在180～200g的96只Wistar大鼠，饲养1周后开始实验。急性心脏毒性模型的建立将大鼠随机分为6组，分别为正常对照组、THP组、TFF 200mg/kg+THP组、TFF 100mg/kg+THP组、TFF 50mg/kg+THP组和DZR+THP组，参见表8。

表8 罗布麻叶总黄酮对吡柔比星诱导急性心脏毒性的心电图改善情况

给药方式如表9：

表9 动物分组及药物处理方法

大鼠心脏功能的测定大鼠在给予THP 72h后，用7％水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔麻醉，固定于自制的手术台上，在胸锁骨胸锁乳突肌内侧分离右颈总动脉，头端结扎，向心端插入连有感受器的静脉留置针，将静脉留置针缓缓插入，使之通过左侧动脉瓣和房室瓣进入左心室，采集左心室内压曲线，BL-420E生物机能实验系统会自动采集左心室收缩压(LVSP，mmHg)、左心室舒张压(LVDP，mmHg)、左心室终末舒张压(LVEDP，mmHg)、左心室内压最大上升速率(dp/dtmax，mmHg/s)、左心室内压最大下降速率(-dp/dtmax，mmHg/s)、心率(HR)等数据。心肌酶谱的检测大鼠在给予THP后24、48及72h，腹主动脉采血，室温静置4-6h，3000rpm、4℃离心15min，分装血清，保存于-80℃冰箱。根据试剂盒的要求，全自动生化分析仪检MDA、SOD及BNP、CK-MB、CTnT、LDH，统计各组数据并分析。

实验结果

a)不同比例的罗布麻叶总黄酮和吡柔比星组合物致大鼠急性心脏毒性24、48及72h心电图的影响。

由图7～9结果显示：正常对照组R波变化不明显，偶发心律失常；吡柔比星18mg/kg组的心律失常发生率及R波电压下降幅度显著高于正常对照组；罗布麻叶总黄酮各剂量组与吡柔比星组比较，心律失常发生率及R波电压下降幅度有所减轻，尤以罗布麻叶总黄酮中、高剂量组心律失常发生率低。100mg/kg、200mg/kg罗布麻叶总黄酮组较右丙亚胺组心脏收缩及舒张功能明显改善，以200mg/kg罗布麻叶总黄酮组效果最佳。

b)不同比例的罗布麻叶总黄酮和吡柔比星组合物致大鼠急性心脏毒性24、48及72h左心功能的影响.

表10 罗布麻叶总黄酮对吡柔比星组合物致急性心脏毒性大鼠24h心功能的影响(

n＝6)

注：与正常对照组比较，^aP＜0.05；与模型组比较，^bP＜0.05；与右丙亚胺组比较，^cP＜0.05.

表11 罗布麻叶总黄酮对吡柔比星致大鼠急性心脏毒性48h心功能的影响(

n＝6)

注：与正常对照组比较，^aP＜0.05；与模型组比较，^bP＜0.05；与右丙亚胺组比较，^cP＜0.05.

表12 罗布麻叶总黄酮对吡柔比星致大鼠急性心脏毒性72h心功能的影响(

n＝6)

注：与正常对照组比较，^aP＜0.05；与模型组比较，^bP＜0.05；与右丙亚胺组比较，^cP＜0.05.

表10～12和图10～12结果提示，大鼠在给予吡柔比星(THP)造模后(24、48及72h)，可引发左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张压(LVDP)左心室内压最大上升速率(dp/dtmax)、左心室内压最大下降速率(-dp/dtmax)和心率等下降，左心室终末舒张压(LVEDP)上升。与THP组相比，提前给予罗布麻叶总黄酮或DZR的大鼠，可明显改善心脏的收缩和舒张功能，且罗布麻叶总黄酮中高剂量组保护心脏作用效果好于DZR(右丙亚胺)P＜0.05。

c)罗布麻叶总黄酮对吡柔比星致大鼠急性心脏毒性外周血24、48及72h心肌酶谱的影响

表13 罗布麻叶总黄酮对吡柔比星致急性心脏毒性大鼠外周血24h心肌酶谱的影响(

n＝6)

注：与正常对照组比较，^aP＜0.05；与模型组比较，^bP＜0.05；与右丙亚胺组比较，^cP＜0.05

表14 罗布麻叶总黄酮对吡柔比星致急性心脏毒性大鼠外周血48h心肌酶谱的影响(

n＝6)

注：与正常对照组比较，^aP＜0.05；与模型组比较，^bP＜0.05；与右丙亚胺组比较，^cP＜0.05

表15 罗布麻叶总黄酮对吡柔比星致急性心脏毒性大鼠外周血72h心肌酶谱的影响(

n＝6)

注：与正常对照组比较，^aP＜0.05；与模型组比较，^bP＜0.05；与右丙亚胺组比较，^cP＜0.05

表13～15结果显示，相对于正常对照组，大鼠在给予吡柔比星造模24、48及72h后会引起外周血中心肌酶的升高；右丙亚胺在三个时间点可明显降低心肌酶活性或含量，不同剂量组的罗布麻叶总黄酮也具有类似的作用，但高剂量组作用最好，绝大多数酶活性或含量优于右丙亚胺组，中剂量组次之，而低剂量组的改善作用不及DZR组。

d)罗布麻叶总黄酮对吡柔比星致大鼠急性心脏毒性外周血24、48及72h SOD、MDA影响

表16 罗布麻叶总黄酮对吡柔比星致急性心脏毒性大鼠外周血24hsOD、MDA影响(

n＝6)

注：与正常对照组比较，^aP＜0.05；与模型组比较，^bP＜0.05；与右丙亚胺组比较，^cP＜0.05

表17 罗布麻叶总黄酮对吡柔比星致急性心脏毒性大鼠外周血48h sOD、MDA影响(

n＝6)

注：与正常对照组比较，^aP＜0.05；与模型组比较，^bP＜0.05；与右丙亚胺组比较，^cP＜0.05

表18 罗布麻叶总黄酮对吡柔比星致急性心脏毒性大鼠外周血24h sOD、MDA影响(

n＝6)

注：与正常对照组比较，^aP＜0.05；与模型组比较，^bP＜0.05；与右丙亚胺组比较，^cP＜0.05

表16～18统计结果提示：与正常对照组相比，大鼠在给予吡柔比星后可造成超氧化物歧化酶(SOD)等酶活力下降，丙二醛(MDA)含量升高；右丙亚胺可明显提高SOD的活力，降低丙二醛的含量；罗布麻叶总黄酮三个剂量组对于SOD、MDA的作用与右丙亚胺类似，但高剂量组作用最好，绝大多数指标均优于右丙亚胺，中剂量组次之。

e)罗布麻叶总黄酮对吡柔比星致大鼠急性心脏毒性心脏组织形态学变化(HE染色，×200)；

由图13可以看出，正常对照组：心肌细胞类圆形或多边形，胞浆均匀呈淡色，核圆形，较小，居中。肌纤维排列整齐，肌细胞间连接紧密，心肌细胞间有极少量结缔组织，毛细血管丰富。

模型对照组：可见数量不等的、仅涉及几个心肌细胞的病变。表现为肌浆红染，部分细胞的细胞核浓染，不规则，部分细胞核消失；也可见部分细胞空泡变性及脂肪变性。未见肌间水肿及炎细胞浸润。

右丙亚胺组：可见数量不等的、仅涉及几个心肌细胞的病变。表现为肌浆红染，小部分细胞的细胞核浓染，不规则，部分细胞核消失；也可见部分细胞空泡变性及脂肪变性。未见肌间水肿及炎细胞浸润。

罗布麻叶总黄酮低浓度组：病变基本与右丙亚胺组相近。

罗布麻叶总黄酮中浓度组：正常心肌细胞间见散在几个心肌细胞的病变，可见数量不等的、仅涉及几个心肌细胞的病变，但病变的数目及病变细胞数量较模型对照组有所减少。表现为肌浆红染，部分细胞的细胞核浓染，不规则；未见细胞空泡变性及脂肪变性，肌间水肿及炎细胞浸润。

罗布麻叶总黄酮高浓度组：可见数量不等的、仅涉及几个心肌细胞的病变，但病变的数目及病变细胞数量较模型对照组有所减少。表现为肌浆红染，小部分细胞的细胞核浓染，不规则，部分细胞核消失；也可见部分细胞空泡变性及脂肪变性。未见肌间水肿及炎细胞浸润。

Claims (4)

1.一种含有罗布麻叶总黄酮的抗肿瘤药物组合物，其特征在于，所述药物组合物由罗布麻叶总黄酮和蒽环类药物组成，其中所述蒽环类药物为表柔比星或吡柔比星，所述罗布麻叶总黄酮与吡柔比星的质量比为200∶18或质量/体积浓度比为60∶3.32；罗布麻叶总黄酮与表柔比星的质量比为200∶15或质量/体积浓度比为60∶2 .90。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中罗布麻叶总黄酮与吡柔比星的组合为200mg/kg和18mg/kg的组合物；或者60μg/ml和3 .32μg/ml的组合物。

3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中罗布麻叶总黄酮与表柔比星的组合为200mg/kg和15mg/kg的组合物；或者60μg/ml和2 .90μg/ml的组合物。

4.权利要求1-3任一所述药物组合物在制备预防或治疗蒽环类抗肿瘤药物导致的心脏毒性的药物中的应用。

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