TWI280881B - Use of hederagenin 3-O-alpha-L-rhamnopyranosyl((1->2)-[beta-D-glucopyranosyl(1->4)]-alpha-L-arabinopyranoside or an extract from pulsatillae radix containing the same as a therapeutic agent for solid tumors - Google Patents

Description

1280881 玖、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關利用下式⑴所示之常春藤苷元α、 L-吡喃鼠李糖基-D·吡喃葡萄糖基 阿拉伯吡喃糖苷：

或含有其之白頭翁萃取物作為實體腫瘤之治療劑 【先前技術】 八，1 王 vruisauua spec] 的乾根（Ki Hwan Bae，Korean Medicinai 取如，i999)。 據中藥，已知白頭翁具有涼血 a飞八 A ^ ^ 的療效。白頭翁亦 用作為消火劑、收斂劑、止 便血、癔疾、鼻出血及牙出血：劑’且可用以治 srp ,. 出血。白頭翁的花朵稱為白頭 華（Puls_a Flos)，且可用以 巧白碩 荦子m A A s、療瘧疾或天花。白頭翁 葉子私為白頭翁薄葉，且 “ 此外，已有報導指出…痛、水腫或心痛 巧视等扣出白頭翁之前敖蕴 的抗菌療效，且呈有對r ............有對抗阿米巴痢 -有對抗滴蟲的殺滴蟲療效。 白碩病含有9%之矣角脊，且例 頭翁素、白頭翁素、毛U、 式：=原 N兀、白#脂酸、 92380 6 1280881 齊徵果酸之衍生物及其糖苷等成分已自白頭翁中單離出 來： 原白頭翁素

°"0、h05^^h毛莨苷

Λ

常春藤苷元：R = H 常春藤脊元3-O-b-D-D比喃蔔萄糖苔；R = glc 二帖類糖脊（Patensin) ; R = 9丨c-gal 23-經基-白樺脂酸；r1：=R3 = h, R2 = 〇H 白頭翁酸（PusatHlic add) : Ri· R2 = 〇, R3 = Η 白頭翁糖杳（卩1^11丨1〇$1(16)六；81=只3=^,|^2 = 3阳 白頭翁糖苷 Β ; R, = Η· R2 = ΟΗ· R3 = gloglc 上述各成分之藥理效果尚未經廣泛地研究，但據報導 原白頭翁素具有絲毒性（mitotoxicity)(Vonderbank，

Pharmazie 5, 210, 1950)。Li 等人（!^，112.等人，丫&〇1^1^[1 Hsueh Pao· 28, 3 26 3 1，1993)亦報導毛莨苷藉由DNA聚合 酶的抑制作用而對KB細胞具有細胞毒性。

Shimizu 等人（Chem· Pharm· Bull·，26，1666，1978)自 白頭翁（Pulsatilla cerna)及白頭翁（Pulsatilla koreana)將常 春藤苷元3-Ο-α -L-吡喃鼠李糖基（1—2)-[召-D-吡喃葡萄 7 92380 1280881 糖基（1—4)]-a-L-阿拉伯吼喃糖脊單離出來；Y〇shihiro等 人（J· Nat. Pro·，62，12 79, 1999)自白頭翁（Pulsatilla Chinensis)將常春藤脊元3-0-a -L-吡喃鼠李糖基（1—2)-[召-D-吡喃葡萄糖基（1—4)]-a -L-阿拉伯吡喃糖苷單離出 來；Ekabo 等人（J. Nat. Prdo.，5 9, 43 1，1996)自塞爪尼阿莎 曼尼阿菌（Serjania salzmanniana Schlecht)將常春藤苷元 3-0- a -L-吡喃鼠李糖基（1— 2)-[ -D-吡喃葡萄糖基（1— 4)] -a 阿拉伯吡喃糖苷單離出來。Kang等人（Arch. Pharm.

Res.，1 2( 1 )42-47，1 989)亦自白頭翁（Pulsatilla koreana)將 · 常春藤脊元3-0· a -L-D比喃鼠李糖基（1— 2)-[万-D-D比喃葡 萄糖基（1—4)]-α -L-阿拉伯吡喃糖苷單離出來，並再確認 其結構。Yoshihiro等人於上述文獻中報導常春藤苷元及齊 墩果酸衍生物對HL-60人類白血病細胞顯示出細胞毒性。 Yoshihiro 等人報導自中國白頭翁（Chinese pulsatiuae radix) (Pulsatilla Chinensis)單離的常春藤苷元3_〇_α _L_〇比喃鼠 李糖基（1—2M/3 -D•吡喃葡萄糖基（1—4)]-α阿拉伯吡籲 喃糖苷對HL-60細胞顯示出弱的細胞毒性，亦即38# g/ml 之ED^。而且，大部分的皂角苷及許多種天然產物普遍顯 示出該細胞毒性程度，因而基於此，上述化合物無法說是 具有抗腫瘤活性。因此，迄今未曾知常春藤苷元3_〇_ L-吡喃鼠李糖基（1—2)-[/3 -D-吡喃葡萄糖基（1—4)]_α 阿拉伯吡喃糖苷具有抗腫瘤活性，特別是對抗實體腫瘤。 【發明内容】 本發明人自包含田七（Anthriscus sylvestHs 92380 8 1280881

Hoffman)、白頭翁等之草藥 發現此種物質可择由女▲—虱鬼臼毒素分離出來，並 成長，且因而心韓？血官新生來抑制實體腫瘤細胞的 本發明人進行(韓國專利…。號)。 的研九，以自草攀彳 結果，本發明人自白〜令開發出抗遁瘤劑。 機溶液中，Ρ μ〜、17又付—部份，該部分難溶於有 微/合欲r，但易溶於水 物，並因此完成本發/自㈣份分離出抗腫瘤化合 口此本發明的目的係提供實I# H#广田 4 治療劑包括由白頭翁單㈣/、只體腫瘤用之治療劑，該讀 押得而人右^ @ 、 出來的抗腫瘤化合物或由白頭翁 有抗腫瘤化合物作為活性成分的部份。 本’X明之一目的係提供實體腫瘤 劑包括含常春藤苷元vn 康d “療 I-比味葡萄糖基（1叫]L I南鼠李糖基（1—2^_ 分的白頭翁萃取L。 L-阿拉伯D比喃糖苔作為活性成 本文所用之“實體腫瘤’，係指除了血癌以外 瘤塊（maSStumor)，其代表實例為肺腫瘤。 於本發明中叫或者，含有常纖元3 吼喃鼠李糖基（卜2)·[Μ·吼喃㈣糖基卜4)]1心阿 拉㈣鳴糖脊的白頭翁萃取物之製法為：藉由以乙醇水溶 :萃取白頭翁，然後將丙酮添加至其中發生沉澱，得到水 岭性部分，再使該部分通過以扑以以lh2〇管柱，得到反 值為0.48至〇.5之部分（spx3)’再喷灑硫酸，接著加熱而f 另一方面，本發明提供一種實體腫瘤之治療劑， 形成紅色，然後形成藍色 該 92380 9 1280881 療劑包括當IΡ _ η 土# 甘元3-〇i-L-吡喃鼠李糖基（1—2H/S- D -吼喃葡萄糖夷 八 /土 U〜4)]l -L-阿拉伯吡喃糖苷作為活化成 分0 本發明將詳細說明如下。 根據本發明，& ^ 曰頭翁萃取物係以50〇/〇乙醇粹取而得到 難以溶於丙酮之WT立 1 #分，將該部分以Sephadex LH20純 化，得到SPX3部八 ^ 刀，而由§PX3部分，最終得到純的 SB365 〇纺仆人1 1 — ^ 口物為常春藤苷元3-〇-α -L-吡喃鼠李糖基（1 且、[冷D吡南葡萄糖基（1—4)]-α -L-阿拉伯吡喃糖苷， t對於由老鼠肺腫瘤細胞，LLC(Lewis Lung Carci_a)細 ^或頒肺腫瘤細胞，NCI_H23細胞，所形成之實體腫 瘤而比臨床藥物阿黴素更能展現出較高的抗腫瘤活 性。 w ★特別是，本發明由白頭翁製備抗腫瘤部分及由該部分 單離出抗腫瘤物質的方法將說明如下。

(1) 由白頭翁製備抗腫瘤部分WT 。白頭翁粉末係以5G%之乙醇水溶液萃取，且於減壓下 乾燥’於所得的乾燥物質中添加5至1〇倍量之丙酮。將該 混合物搖晃，以3,000rpm離心，將其上澄液傾析，得到不 溶性部分。將上述程序重複兩次。餘留之不溶性部分易溶 於水，因而指定為“ WT部分”。該部分對於以τ τ 1趴以LLC細胞 移植之BDF1老鼠及以NCI_H23細胞移植之裸鼠_示心 高的抗腫瘤活性。 (2) 由WT部分製備SPX3部分 92380 10 !28〇881 多種濃度下將一定量之WT部分溶解於一定量之曱醇 水溶液中，然後於以相同溶劑穩定之Sephadex LH20管柱 中分段分離。於此情形下，最佳之單離係使用80%之曱醇 水溶液來達成，且50〇mg之WT部分的適當填充管柱大小 為60x 4 cm。結果，得到SPX1部分（試管編號26至66)、 SPX2部分（試管編號66至91)、SPX3部分（試管編號91 至111)、及SPX4部分（試管編號lu至138)。當於矽膠板 上展開之部分上喷灑硫酸，並將該板加熱時，spX3部分 首先形成紅色，一段時間後形成藍色，spx3部分含有& 值為0.48至〇·5之點滴化合物作為主要成分。spX3部分 對於以LLC細胞移植之BDF]^鼠及以NCI_H2^胞移植 之裸鼠已顯示出高的抗腫瘤活性。 (3)由SPX3部分單離出SB365 為了自可展現出抗腫瘤活性之SPX3部分單離出抗雇 瘤物貝，進行HPLC已得到純化合物sb365。為了鑑定 B365 的結構，進行[ieberman-Burchard 反應、IR、ιΗ_ Γ:春二：3R 〇及乙醇/硫酸水解反應。結果確認S B 3 6 葡萄糖基(二;广鼠李糖基 4)]-a-L-阿拉伯吡喃糖苷，而常春藤脊A 3 〇 t L··喃鼠李掩基（iyD_D_萄糖基^二 阿拉㈣喃糖穿為已自白頭翁單離出之4角脊成 本發明夕A 1 、 一合物取物或由該萃取物所單離出之純 子於貧體腫瘤細胞具有弱的細胞毒性，但於 92380 11 1280881 動物實驗中出乎預料地顯示出優異之抗腫瘤活性。因此， 本發明之白頭翁萃取物或由其所單離出之純SB365化合物 可改善由以前臨床使用之抗腫瘤劑所引起之問題，例如降 低由減少血細胞所引致之免疫反應。亦可預期本發明之白 頭翁萃取物或由其所單離出之純SB365化合物對例如造血 幹細胞等之快速分裂細胞顯示出低的毒性。 本發明之白頭翁部分和SB365可與醫藥上可接受之習 知載劑組合，並製造成多種醫藥領域上習知之配方，例如 口服配方（如溶液、懸浮液等）；注射配方（如可注射之溶液 或懸浮液、立即可用之注射用乾粉等）；以及局部可投予之 配方（如油嘗、乳膏、及溶液）。本發明活性成分可溶於水， 且可溶於多種溶液，例如生理食鹽水、林格氏液⑻剛、 —小及營養液等。該等醫藥配方可經由靜脈内、皮 下、腹膜内、或局部投予。

本毛月對人類所建議之活性成分的劑量於把365的情 形下為3.5至8.0mg/kg體重，於§ρχ3部分的情形下為π 至伽幽體重’或於WT部分的情形下為2〇〇至3〇〇呵~ 體重。最適劑量於SB365的情形下為6·5ϊη_體重，於 SPX3部分的情形下為25哺§體重，或於W 下為250mg/kg體會。缺工 ，刀w I月〜 重w而，該劑量可視病患之年齡、體 重、健康情形、病症嚴重性等而作適當地調整。 【實施方式】 μtr彳實施例可更加瞭解本發明，然而熟習此項技藝 者將瞭解所述之特定物質及結果㈣以說明本發明，㈣ 92380 12 1280881 寺貝細•例不擬亦不應對本發明範圍有所侷限，而後附之申 請專利範圍將會更詳細說明本發明。 實施例1 ·· WT部分之製備 5(^之白頭翁粉末以5〇〇111]1之50%乙醇水溶液萃取三 次，減壓下乾燥該萃取物，以得到22g之乾物質。於此等 乾物質中添加300ml之丙酮，將該混合物搖晃，以3,〇〇〇 rpm離心。將其上澄液移除，得到沉澱物。對於該沉澱物， 重複兩次丙酮處理。丟棄丙酮層，並乾燥不溶性部分以得籲· 到17.8g之乾物質（WT部分）。使所得之WT部分進行矽膠· TLC(展開溶劑·· 4 : 1 : 1之比率的丁醇：乙酸：水，顯色 反應·噴灑硫酸，接著加熱）。結果示於第丨圖。於第丨圖 中，如下所述，Rf值在〇·48至〇·5〇範圍内之藍點對應於 本發明之活性成分。如下文實驗例丨所示，冒丁部分對以 LLC細胞移植之BDF1老鼠則顯示出較高的抗腫瘤活性（腫 瘤成長抑制率：57%)。 實施例2 : SPX部分之製備 560mg之WT部分可使用甲醇與水（8〇 : 2〇)之混合溶 液以 之流速經 Sephadex LH2〇 管柱（2〇〇g，6〇χ * cm)而進-步分段分離’而分段容積為^心試管。將該等 部分依序㈣膠薄層上點滴，並予以展開，得到各部分（展 開溶劑：4: 1 : 1之比率的丁醇··乙酸：水，顯色反應： 噴灌硫酸，接著加熱）。結果示於第2圖。於第2圖中， SPX1(139mg，24·8%)係經由收集編號為％至μ之試管而 知’ SPX1由4個主要點組成，纟中較低者與硫酸酸反應 92380 13 1280881 後形成黃色。SPX2(344mg，61.4%)係經由收集編號為66 至9丨之試管而得，SPX2由2個主要點組成。spx3(6img， 10.9%)係經由收集編號為91至ln之試管而得，於噴灑硫 酸，接著加熱之後首先形成紅色，一段時間後則形成藍色。 SPX3部分含有Rf值在心48至〇·5〇範圍内之一個點作為其 主要成分。SPX4(15.7mg，2.8%)係經由收集編號為lu至 138之試管而得。SPX3及SPX4部分於薄層上皆僅顯示出 一個點，因而具有較高的純度。 如下文貫驗例1所示，投藥15日之後，SPX3展現出 60%之腫瘤成長抑制率。相對之下，spxi、、及 並未展現出任何作用，因此假設噴灑硫酸可形成藍色的物 質為具有抗腫瘤活性之成分。SPX3部分本身可用作為抗 腫瘤劑。 實施例3 : SB365之單離 為了自SPX3部分單離出純物質，進行HpLC如下。 將反相矽膠（RP-C18，250x l〇mm，Metachem 製）用作 為固定相，將甲醇與水（8〇 : 2〇)的混合液用作為移動相。 偵測波長為21〇nm，而流速為1 ml/min。結果示於第3圖。 如第3圖所示，SPX3由3種主要物質組成、由所得之分 離量可知心為8·5分鐘及10·4分鐘的峰含 為一的峰則含有主要成分。因此，假㈣^ 具有抗腫瘤活性。如上所述，自31mg spX3收集心為23 3 分鐘之物質，該物質以硫酸展開呈藍色且為活性成分，而 獲得2.8mg之SB365。將收集之心為23·3分鐘的部分乾 92380 14 1280881 燥，並於上述條件下進行HPLC以量測該部分之純度。結 果示於第4圖，由第4圖可確認S B 3 6 5為純物質。將所得 SB 3 65直接用於下述結構鑑定及抗腫瘤活性試驗。 如下述實驗例1及實驗例2所示，SB365分別對於以 LLC細胞移植之BDF1老鼠及以NCI-H23細胞移植之裸鼠 分別展現出81%及82.1 %之腫瘤成長抑制率，因而具有優 異之抗腫瘤活性。 實施例4 : SB365活性化合物之結構鑑定及確認 上述單離之SB365為白色非晶形，且具有239至241 C 之溶點及[a ]D 為+23.6 (c，〇.2，MeOH)，KLiebermann-Buchard反應呈陽性，因而確認為糖脊。此外，根據 IRCcnT1)，於 3400(寬，-OH)、2940(寬，C-H)、1695(C = 〇)、 1455、及1040(C-0)處觀察到尖峰。亦假設於looo至11〇〇 及3 000至34〇0範圍之内的吸收峰為糖苷。

就1H-NMR而言，該光譜具有典型的皂角苷之NMR 圖案。於 0.91ppm、〇.92ppm、0.98ppm、l.OOppm、1.07ppm、 及1.21ppm處觀察到六個-CH3基，且於1.64ppm處觀察到 另一呈雙重峰之-CH3基。由此可知該化合物於其糖基中包 含一個鼠李糖基。於 6·25 ppm(寬）、5.11 ppm(lH，J = 7.80 Hz)、及4.97 ppm(lH，J = 6.66Hz)處觀察到異位性質子。因 此，確認SB365為具有三個糖基之糖苷。 根據13CNMR，於65.4ppm處（C-23)觀察到經甲基，且 於 l〇4.2ppm(C-l，）、106.7Ppm(C-l，”）及 l〇1.7ppm(C-l，）處 觀察到三個異位性碳訊號。於122.5ppm(C-12)及144.8ppm 15 92380 1280881 (匕13)處觀察到兩個烯烴碳。於18〇2叩1^((^28)處觀察到 一個羧基碳。一般而言，當糖係鍵結至第2 8位置時，顯示 出約4 Hz之醣化作用的低磁場方向偏移（18〇 2ppm— 176 2 ppm)。於本發明化合物中，並未觀察到上述現象，因此確 認該化合物於第28位置上不具有糖基。 接著，將該化合物於乙醇/硫酸中水解，以確認其糖基 及配糖基的結構。比較水解產物之物化性數據、配糖某、 13C-NMR及iH-NMR數據之後，確認SB%5為常春藤^ 元。此外，藉由比較型TLC，確認水解糖為鼠李糖勝^拉 伯糖及葡甸糖。 根據上述分析結果及公告文獻中的數攄， 吟 、ϋ 6 5經石害 認為常春藤苷元3-0- a _L-吡喃鼠李糖基（14 。 2) - [ /5 - - 口比 喃葡萄糖基4)]_ 〇； -L-阿拉伯D比喃糖脊。 SB365之iH-NMR及13C-NMR數據示於下表i中。 92380 16 1280881 表

位置 ^(ppm) J(Hz) 13C(ppm) 位置 ]H(ppm) J(Hz) 13C(ppm) C-l C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 C-7 C-8 C-9 C-10 C-ll C-12 C-13 C-14 C-15 C-16 C-17 C-18 C-19 C-20 C-21 C-22 C-23 C-24 C-25 C-26 C-27 C-28 C-29 C-30 3.28d 10.9 5.45s 4.36,3.67 重疊 7/ 11 oo 11 0 9 9 2 1X 11 0.92 s 1.00 s 38.9 阿拉伯糖 26.1 c-r 81.0 C-2’ 43.5 C-3’ 48.1 C-4’ 18.1 C-5’ 32.8 鼠李糖 39.7 C-l” 47.8 C-2” 36.9 C-3” 23.9 C-4” 122.5 C-5” 144.8 C-6” 42.1 葡萄糖 28.3 C-l，，， 23.8 C-2，，， 46.2 C-3，，， 41.9 C-4，，， 46.4 C_5，，， 30.9 C-6，” 34.2 33.2 65.4 14.0 16.0 17.4 26.3 180.2 32.8 23.7 4.97d 6.66 6.25br 1.64 5.94 5.lid 7.80 104.2 4 4 2 9 0 5 6 3 8 7 7 6 .73 4 1 6 6 )12.2.49.8 ^77761 7 6. o 0 5 2 8 5 5 8 18 2 7 7 7 7 6 17 92380 1280881 實驗例1 :對於以LLC細胞移植之BDF1老鼠之抗腫瘤活 性 用於此貫驗之老鼠種類為BDFI，且使用體重為18至 25g之健康雄性老鼠。於23至24〇c下控溫之地點以自由方 式將水及食物供給該等動物，且以不含抗生素的鼠食予以 餵養。LLC細胞於C57BL/6老鼠中經皮下培養14曰。取 出含有LLC細胞之組織，於其中添加無菌冷的生理食鹽水 (5ml/g組織）以製備細胞懸浮液。〇.2ml之該細胞懸浮液經修· 皮下移植至BDF1老鼠之鼠蹊區。 · 移植24小時之後，將上述老鼠分成數個由5隻老鼠所 組成之組群。然後將WT部分及spx部分、及SB365之樣 口口溶解於生理食鹽水中，並各以 (SPX1)、mmg/kg(SPX2)、3〇 5mg/kg(spx3)、8 lmg/kg (SPX4)、及6.4mg/kg(SB365)之濃度經腹膜内注射。對呈 陰性反應之對照組僅注射生理食鹽水，對呈陽性反應之對 照組則注射阿黴素（0.5mg/kg)。注射係安排從腫瘤移植後_ 24小時開始每日投予樣品一次連續7日，並停止一日，然 後再連續進行6曰。 為了評估SB365對老鼠的毒性，實驗老鼠每週稱重兩 次。於樣品投予後之第14日及第15日，量測控制組與試 驗組的腫瘤體積之後計算抗腫瘤活性如下··

腫瘤體積（mm3) =長度（mm)x寬度2(mm2)/2 腫瘤成長抑制率（％) = (C-T)x 1 〇〇/C (C :對照組之平均腫瘤體積，τ ··試驗組之平均腫瘤 92380 18 1280881 體積） 結果示於下表2。 表2 白頭翁部分及SB365對以LLC細胞移植之BDF1老鼠的腫 瘤成長抑制率（IR，％) 化合物部分 老鼠數目 腫瘤成長抑制率（％) 第14日a) 第15日a) WT 5 56 55 SPX1 5 10 12 SPX2 5 25 3 0 SPX3 5 57 60 SPX4 5 8 10 SB365 5 82 79 ~ 阿黴素 5 60 64 a)腫瘤細胞移植後之日數 如上表2所不，WT部分及SPX3顯示腫瘤成長抑制率 分別為55%及60%，而於腫瘤細胞移植後之第15日， 素的64%之腫瘤成長抑制率。 顯示79%之腫瘤成長抑制率，該腫瘤成長抑制率高於阿徽 實驗例2 :對以NCI_H23細胞移植之裸鼠的抗腫瘤活性 此實驗使用由Harlan公司（USA)獲得之5週歲及ι( 至25g重之雌性裸鼠作為實驗動物。該鼠於無菌動物室 適應環境-週之後使用。以自動控制方式，將動物室维 請代之溫度、55± 5%之濕度A 12小時之光暗週期 下。實驗動物用之固體食物係經輻射殺菌，而飲用水則 92380 19 1280881 高壓爸殺菌。以自由方式將食物及飲用水供給該等動物。 使用由美國的National Cancer Institute (NCI)提供，並保 存於 ％ 國的 Korean Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB)之人類腫瘤細胞株。將人類腫瘤細 胞中之肺腫瘤細胞，NCI-H23細胞，轉植至裸鼠。3x 107 個細胞/ml之腫瘤細胞以〇.3ml/20g體重之體積經皮下移植 至老鼠。每日將樣品經腹膜内注射至老鼠歷時13日，亦 即’腫瘤細胞移植之後除第8曰以外的第1曰至第14日。 里測母一隻動物注射期間所形成之腫瘤大小，且亦量測每 一隻動物之任何體重改變。於腫瘤細胞移植後之第1 6曰， 將裸鼠殺掉，並將腫瘤移除、稱重。於第1日、第5日、 第9日、及第14日，呈陽性反應之對照組經腹膜内注射 〇Jmg/kg體重的阿黴素。結果示於下表3。 表3 SB3 65對以NCI-H23細胞移植之裸鼠的腫瘤成長抑制率 (IR，％)

呈陰性反應 之對照組 阿黴素 (0.5mg/ kg) SB365 (1.6 mg/kg) SB365 (3.2 mg/kg) 組群

52.3 如上表3所示，於腫瘤細胞移植後之第16日，6 4 mg/kg之SB365顯示出82.1%之高腫瘤成長抑制率。 實驗例3 :細胞毒性試驗 92380 20 1280881 由KRIBB研究中心獲得腫瘤細胞A549、SK-MEL-2 及MCF-7，並用於此實驗。培養基係藉由將一袋之含 楚酸胺酸的RPMI164〇培養基、於5(rc之水浴中加熱3〇 分鐘而失活的100ml胎牛血清（fetal b〇vine serum，FBS)、 2g之NaHC03、l〇〇,〇〇〇單位之盤尼西林及1⑽mg之鍊黴 素添加至注射用無菌蒸餾水，以〇· 1N hcl調整該混合物 之pH值至總體積為1升，該混合物經過濾殺菌而製得， 且使用前於4°C下儲存。該等細胞藉由每三日增殖一次而 維持著，而含有0.5%胰蛋白及2% EDTA的生理食鹽水（PBS) 係用以使細胞與培養板孔分開。 根據NCI於1989年所開發出之硫羅丹明 (Sulf〇rhodamine-B，SRB)方法對腫瘤細胞之細胞毒性進行 測試，以量測活體外之藥物的抗腫瘤活性。 具體而言，使用0.5%之胰蛋白-EDTA溶液（PBS)將細 胞與培養板孔分開，然後製備3至5x 1 04個細胞/ml之細 胞懸浮液。接著’將細胞懸浮液（1 8〇 # 1/孔）添加至96-孔 板，並將該培養板置於37t、5%C02下之培養器中進行培 養24小時。 將該樣品溶解於二甲亞楓（DMSO)中，以培養基或三級 蒸餾水稀釋，獲得所需之實驗用濃度，並連續稀釋至最後 的0.2%或更低之DMSO濃度。於96 -孔板之每一個孔中添 加20 // 1之經連續稀釋的樣品溶液，然後將該培養板置於 3 7°C、5%C〇2下之培養器中進行培養48小時。此時添加 樣品溶液，收集τζ(零時）培養板。將培養基從Tz培養板及 21 92380 1280881 攸培養完成後之各培養板移開， 三氯乙酸(―⑷。將 靜置！小時，以使該等細胞於培養板底部上固定“田胞固 定化完成後，財洗〉條培養板5至6次而完全移 TCA溶液，將所得培養板於室溫下乾燥直至不含水氣。 於完全乾燥的培養板中添加〇·Μ之含有〇.4%SBR 於1%乙酸之染色液，以進行細胞染色3g分鐘。以 酸溶液洗料養板5至6次，以完全移除未與細胞結合之 SRB，將培養板於室溫下乾燥。於培養板中添加⑽之 lOmMTris溶液’以溶解染料。然後利用微盤分析儀於 520nm波長下量測光學密度（〇D)。 計算樣品對遽瘤細胞之Ed5〇值[5〇%有效劑量（ng/ ml) : 50%之腫瘤細胞成長受到抑制]如下。t值係定義為 =添加樣品後開始培養時的〇D值，c(對照組）值為未經樣 品處理之培養板孔# 0D|，而τ(試驗組）值為經樣品處理 之培養板孔的OD值。自Tz、〇及τ值，利用下式量測藥 劑之細胞毒性： 於 τζ- τ 的情形下，（T-Tz)/(C_TJX 100 於 τζ〈τ 的情形下，（Τ-Τζ)/ τζχ 100 由上述所算出的值，使用Lotus程式之數據迴歸函數 (data regression function)獲得樣品之 εε>5()值。 結果，SB3 65對人類肺腫瘤細胞（A549細胞）、人類黑 色素瘤細胞（SK-MEL2)及人類乳癌細胞（MCF7)之ed5()值 分別為 >20 // g/ml、>l〇 " g/ml、及 >1〇 # g/ml。因此 δΒ364 22 92380 1280881 對實體腫瘤具有些微之細胞毒性。

配方例1 ··製備含有WT部分之注射用溶液 將：實施例〗製得的250mg之wt部分 之生理食鹽水，以製備注射用溶液。 %^10mI 配方例2··製備含有spx3部分之注射用乾粉 將由實施例2製得的25 ^ u pl y- 邛为溶解於1 Oml 之林秸氏液，然後凍乾以製備立 田， 用 主射用乾粉。使 用别，该粉將以蒸餾水再造。 史 配方例3 :製備含有SB365 #分之注射用溶液 妖炊將由貫施例3製得的6.5吨之SB365溶解於胸之 °氏液，然後殺菌，以製備注射用溶液。 [產業應用性] 八抑白頭翁的WT與SPX3部分、及根據本發明由該等部 :早離出之SB365部分，亦即常春藤苷元3_〇υ_吼喃 氣李糖基（卜2Hm南葡萄糖基（i_4)]m可拉伯 吡喃糖苷，不僅對實體腫瘤具有高的腫瘤成長抑制率，由 於白頭翁的WT與SPX3部分及SB365部分易溶於水，亦 可藉由溶解於包含生理食鹽水、林格氏液、或營養液之/多 谷;夜中而方便使用，且因S B 3 6 5部分，亦即常春藤脊元 3_〜α 士_吼喃鼠李糖基（1—2)-[沒_D_吡喃葡萄糠基（1—々）] 阿拉伯吡喃糖苷，具有低的細胞毒性，因而可改善 以如所開發出之抗腫瘤劑的副作用。因此，可期待常春藤 甘凡-L-吡喃鼠李糖基（1—2H/3 _D-吡喃葡萄糖基 4)l· a 阿拉伯吡喃糖苷將非常適合作為實體腫戶之 92380 23 1280881 治療劑。 【圖式簡單說明】 第1圖係顯示WT部分之矽膠TLC圖案； 第2圖係顯示以Sephadex LH20管柱純化的SPX3部 分之矽膠TLC圖案； 第3圖係顯示SPX3部分之HPLC層析圖；以及 第4圖係顯示SB365部分之HPLC層析圖。 24 92380

Claims (1)

1280881 第92119105號專利申請案1秦_ 3補充 申請專利範圍修正本 b~^ ^ j 一 ^ (95年8月8日） •:種實體腫瘤之治療劑’包括白頭翁萃取物之水溶性部 =作=活性成分，其中，該白頭翁萃取物之水溶性部分 s有吊春藤苷元3-0- α -L-π匕喃鼠李糖基ο—])·[万_D_ °比喃葡萄糖基（1—4)]ϋ阿拉伯吼喃糠苦，且係藉由 以乙醇水溶液萃取白頭翁，並將丙酮添加至其中形 澱而製備。 2·如申請專利範圍第！項之治療劑，其中，該白頭翁萃取 物之水溶性部分以每日200 i 3〇〇mg/kg體重之劑量投 予。 申π專利範圍第1項之治療劑，其中，該白頭翁萃取 物之水溶性部分為Rf值在〇.48至〇 5〇範圍内之部分， 於噴灑硫酸，接著加熱之後形成紅色，然後形成藍色， 該部分係’再通過SephadexLH2〇管柱而製得。 4.如申請專利範圍第3項之治療劑，其中，該白頭翁萃取 物之水，谷性部分以每曰2〇至4〇mg/kg體重之劑量投予。 5·—種實體腫瘤之治療劑，包括常春㈣元％^如比 喃鼠李糖基（1— 2)以如*喃㈣糖基（1— 4)]_ α心 阿拉伯°比喃糖苷作為活性成分。 6.如申4專利範m第5項之治療劑，其中，常春藤皆元 3-〇+L-t南鼠李糖基（h2H/5_D_吼喃葡萄糖基 (1 —4)]- a -L-阿拉伯吡喃糖苷以每日3 ·5至8mg/kg體重 92380(修正本) 1 128〇881 之劑量投予D 7•如申請專利範圍第丨至4項中任一 劑係溶解於選自生理♦越 、化療诏，該治療 群之溶液以用於投予木格氏液及營養液所成組 8·如申請專利範圍第 於選自生理食鹽水 以用於投予。 5或6項之治療劑，該治療劑係溶解 林格氏液及營養液所成組群之溶液 92380(修正本) 2