JP2004346027A

JP2004346027A - トリテルペン化合物、その製造方法及びそれを有効成分として含有する癌抑制剤

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Publication number: JP2004346027A
Application number: JP2003145860A
Authority: JP
Inventors: Reiko Tanaka; 麗子田中
Original assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date: 2003-05-23
Filing date: 2003-05-23
Publication date: 2004-12-09
Anticipated expiration: 2023-05-23
Also published as: JP4442116B2

Abstract

【課題】腫瘍の縮小・撲滅及び成長の抑制に有効な医薬となり得るような殺癌細胞活性、及び、正常細胞に復帰することのできない潜在性細胞を既に保有する個体に対しても有効な発癌抑制手段となり得るような発癌プロモーション抑制活性の両癌抑制活性を有する化合物等を提供すること。
【解決手段】式（Ｉ）で示されるトリテルペン化合物又はその薬学的に許容される塩、

前記のトリテルペン化合物又はその薬学的に許容される塩をマンサク科植物から抽出する工程を有することを特徴とするトリテルペン化合物の製造方法、前記のトリテルペン化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする癌抑制剤等が提供可能となった。
【選択図】なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なトリテルペン化合物、その製造方法及びそれを有効成分として含有する癌抑制剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
診療及び治療法の開発等により、癌は昨今と比べるとずっと「治る病気」となりつつあるが高齢化社会の進行とともに癌の罹患者と死亡者は依然として増加している。日本癌学会の発表によると現在、死亡統計上３人に１人は癌によって死亡していると報告されている。癌の抑制については、罹患後の治療だけではなく、癌が発生する前にその発生を抑えようとする考え方、即ち癌予防に対する関心も近年高まりつつある。
癌の抑制のうち罹患後の治療において、悪性腫瘍、即ち、癌に対する治療法は早期発見・外科的手術とともに化学療法が併用されているが、臨床的に実用又は試用されている多くの抗癌剤は、例えば、固形癌に対して必ずしも充分に満足できる効果を有するものではないと言わざるを得ない場合が存在している。
一方、癌の抑制のうち癌予防において、化学物質による癌発症（化学発癌）の機構に関しては、近年、発癌イニシエーション及び発癌プロモーションと呼ばれる二つの過程を経由すると考える発癌二段階説が広く認められている。イニシエーションとは、発癌イニシエーターと総称される物質が、正常細胞のＤＮＡに不可逆的に損傷を与えて潜在性細胞（ｉｎｉｔｉａｔｅｄｃｅｌｌ）に変化させる過程であり、発癌プロモーションとは、発癌プロモーターと総称される物質が、発癌イニシエーションで生じた発癌潜在性細胞に働きかけ、それを癌細胞に導く過程である。発癌イニシエーション及び発癌プロモーションの両方の過程を抑えることができれば、癌の発生を抑制することが可能となる。とりわけ、発癌プロモーションの抑制は、正常細胞に復帰することのできない潜在性細胞を既に保有する個体に対しても有効な発癌抑制手段となる。
【０００３】
【特許文献１】
特開昭６３−５７３１９号公報
【特許文献２】
特公平８−２７８８号公報
【特許文献３】
特開平２−８２８２９５号公報
【特許文献４】
特開平６−３２９５３７号公報
【特許文献５】
特開平６−３２９５９０号公報
【特許文献６】
特開平７−２５２１４１号公報
【特許文献７】
特開平８−１１９８６６号公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記前者の治療の観点からは、腫瘍の縮小・撲滅及び成長の抑制に有効な医薬となり得るような殺癌細胞活性化合物の開発が切望されており、一方、上記後者の予防の観点からは、発癌プロモーションを抑制する活性を有する成分を含有し発癌の抑制に有効な医薬品、食品、化粧品等のごとき発癌プロモーション抑制化合物の開発が切望されている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、かかる状況の下、鋭意検討した結果、マンサク科植物であるモミジバフウの球果から分離精製された新規トリテルペン化合物が、殺癌細胞活性及びプロモーションを抑制する活性（以下、発癌プロモーション抑制活性と記すこともある。）の両癌抑制活性を有することを見出し、本発明に至った。
即ち本発明は、
１．式（Ｉ）で示されるトリテルペン化合物又はその薬学的に許容される塩；
【化２】

２．前項１記載のトリテルペン化合物又はその薬学的に許容される塩をマンサク科植物から抽出する工程を有することを特徴とするトリテルペン化合物の製造方法；
３．前項１記載のトリテルペン化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする癌抑制剤
等を提供するものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
式（Ｉ）で示される化合物又はその薬学的に許容される塩（以下、本発明化合物と記すこともある。）の製造方法について説明する。本発明化合物の出発材料としてマンサク科植物、好ましくはモミジバフウの球果を用いる。マンサク科植物は、常緑又は落葉の低木から高木であり、亜熱帯から温帯にかけて１００種程度が知られている。日本でもマンサク、トキワマンサク、ヒョウガミズキ、トサミズキ、フウ、モミジバフウ、イスノキ等が知られており、庭木としてしばしば植えられている一般的な樹木である。モミジバフウはマンサク科の落葉広葉樹であり、別名アメリカフウと呼ばれる。街路樹又は公園樹としてごく一般的に植えられている高木であり入手は容易である。モミジバフウの樹脂や果物は止血、香料、鎮痛又は利尿目的で用いられ、日本薬局方にも収載されている。当該出発材料をブレンダーで破砕又はナイフ等で細かく刻んだ後、室温〜約８０℃の温度において、出発材料が浸る程度の容量のクロロホルム、ｎ−ヘキサン、塩化メチレン、ジエチルエーテル、アセトン等の有機溶媒又はこれらが混合されてなる溶媒に２日間から半月間程度浸漬する。また、出発材料を溶媒とともに煮沸還流してもよい。好ましくは溶媒としてクロロホルムを用い、室温にて１週間浸漬する。この浸漬液を濾紙又は綿栓にて濾過した後、得られた濾過液から減圧濃縮法等により溶媒を留去する。得られた残渣を粗抽出物とし、これに次の精製操作を行う。当該粗抽出物を再びクロロホルム、ｎ−ヘキサン、塩化メチレン、ジエチルエーテル、アセトン等の有機溶媒に溶解し、得られた溶液を、シリカゲル、アルミナ、セルロースパウダー等を用いたカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー等に供して分画するか、又はこれらの方法を組み合わせて分画した後、再結晶することにより本発明化合物を得る。好ましくは、当該粗抽出物をクロロホルムに溶解し、得られた溶液をシリカゲルが充填されたカラムクロマトグラフィーに供する。溶出溶媒としてクロロホルム／酢酸エチルを用い、クロロホルム１００％から出発し、濃度勾配を付けステップワイズに酢酸エチルの濃度を増加させる。具体的には、３２Ｌのクロロホルム、８Ｌのクロロホルム−酢酸エチル混合液（クロロホルム：酢酸エチル＝２０：１）、３２Ｌのクロロホルム−酢酸エチル混合液（クロロホルム：酢酸エチル＝１０：１）、１９Ｌのクロロホルム−酢酸エチル混合液（クロロホルム：酢酸エチル＝５：１）、１０Ｌのクロロホルム−酢酸エチル混合液（クロロホルム：酢酸エチル＝２：１）と順次溶出して１Ｌずつ分画を行う。クロロホルム−酢酸エチル混合液（クロロホルム：酢酸エチル＝２：１）で溶出した画分７９から９８までの合計１０Ｌを分取する。分取した画分を、クロロホルム−メタノール混合液（クロロホルム：メタノール＝１０：１）を溶媒にした薄層クロマトグラフィーに供し、抽出物の確認を行なう。抽出物の検出は波長２５４ｎｍの紫外線で行う。抽出物の確認は高速液体クロマトグラフィーで行うこともできる。この場合、カラムとしてＯＤＳを用い、８０％のアセトニトリルを溶媒として流し、波長２５４ｎｍの紫外線で検出を行う。こうして抽出物の確認を行った後、メタノール−クロロホルム混合液（メタノール：クロロホルム＝２：１）にて再結晶させることにより、単一の本発明化合物を得ることができる。
このようにして得られる本発明化合物は、赤外吸収スペクトル、紫外吸収スペクトル、マススペクトル又はＮＭＲスペクトル等を測定することにより、その化学構造を確認することができる。
【０００７】
本発明化合物には不斉炭素が存在するが、殺癌細胞活性及び発癌プロモーション抑制活性の両癌抑制活性を有する限り可能な立体配置の化合物が全て含まれる。
【０００８】
本発明化合物が有する殺癌細胞活性は下記の方法により確認することができる。ヒト培養細胞パネルを利用したｉｎｖｉｔｒｏ薬剤感受性試験は、まず、例えば、肺癌ではＡ５４９細胞、大腸癌ではＫＭ−１２細胞、胃癌ではＭＫＮ−４５細胞、乳癌ではＨＢＣ−４細胞、卵巣癌ではＯＶＣＡＲ−３細胞、中枢神経系癌（脳腫瘍）ではＵ２５１細胞、腎癌ではＡＣＨＮ細胞等の多くのヒト培養細胞を収集する。全ての細胞株に被験化合物を添加し、細胞増殖抑制効果及び細胞致死効果を検定するｉｎｖｉｔｒｏ薬剤感受性試験を行う。増殖率の測定は、被験化合物を添加した後、例えば、４８時間後の生存細胞数を蛋白質結合性色素スルホローダミンＢによる染色により蛋白量として比色測定する。全てのヒト培養細胞の被験化合物感受性測定データをコンピューターに入力し、細胞増殖を５０％阻害する濃度（ＧＩ５０）、見かけ上細胞増殖を完全に抑える濃度（ＴＧＩ）及び細胞数を播き込み時の５０％に減少させる濃度（ＬＣ５０）を計算し、以下の情報処理を行う。ＧＩ５０値、ＴＧＩ値、ＬＣ５０値はそれぞれ試験細胞株固有の数値が得られる。その全体平均ＧＩ５０値、ＴＧＩ値、ＬＣ５０値を求め、この平均値と個々の細胞でのＬｏｇＧＩ５０値との差を求め、それらを平均ＬｏｇＧＩ５０値を基準にし、絶対値化して正負にて表記する。正の値が大きい場合ほど薬剤感受性（ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）が高い癌細胞株と判断できる。また最も薬剤感受性が高いものと平均との差をＤｅｌｔａで示し、Ｒａｎｇｅは最も薬剤感受性の高い癌細胞株と最も薬剤感受性の低い癌細胞株のＬｏｇＧＩ５０値の差を示すものである。ＬｏｇＴＧＩ値、ＬｏｇＬＣ５０値についても同様である。
上記方法を用いて本発明化合物の殺癌細胞活性を調べることができる。尚、原法は［「癌と化学療法」２４（２）：１２９−１３５，１９９７］等に記載される公知の方法である。
【０００９】
本発明化合物のプロモーション抑制活性を測定する方法としては、例えば、ＥＢＡ−ＥＡ誘導試験法［Ｋｏｎｉｓｈｉ，Ｔ．ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，２１，９９３（１９９８）］が挙げられる。この試験法は、１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート（以下、ＴＰＡと記す。）、テレオシジン等の発癌プロモーターが、バーキットリンパ腫由来エプスタイン・バー・ウイルス潜在感染ヒトリンパ芽球様細胞株（Ｒａｊｉ細胞、ＡＴＣＣから入手可能）中に潜在するエプスタイン・バー・ウイルス（以下、ＥＢＶと記す。）を活性化する現象に基づいた方法であり、当該測定の工程としては、まず前記のような発癌プロモーターと被験物質とをＲａｊｉ細胞に接触させ、発癌プロモーターによるＥＢＶ活性化を被験物質が抑制する効力を測定する。当該方法で測定されたＥＢＶ活性化抑制活性とプロモーション抑制活性との高い相関性が、多くの化合物で示されている。
また、他のプロモーション抑制活性を測定する方法としては、ＴＰＡによる細胞のリン脂質代謝亢進を、被験物質が抑制する効力を測定する方法をあげることもできる。測定の工程としては、まず、ヒト子宮頸癌由来のＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣから入手可能）の培養液に被験物質を添加し、一定時間（例えば、１時間）の後に、適量（例えば、５０ｎＭ程度）のＴＰＡと、放射性無機リン酸（以下、^３２Ｐｉと記す。）とを加え、更に培養を行う。一定時間（例えば、４時間）の後に、細胞のリン脂質を抽出し、当該リン脂質の中へ取り込まれた^３２Ｐｉの放射活性を測定し、得られた測定値と溶媒対照群の放射活性の値との差異に基づき発癌プロモーション抑制活性の有無又は程度を評価する。
さらにまた、プロモーション抑制活性は、齧歯類を用いたｉｎｖｉｖｏニ段階発癌実験によって調べることもできる。例えば、マウスの背中の毛を手術用バリカン等で刈り落とし、背中の皮膚に、アセトン又はメタノール等の有機溶媒に溶解した７，１２−ジメチルベンズアントラセン（以下、ＤＭＢＡと記す。）を適量、例えば、約１μｇ〜１０００μｇ程度塗布する。ＤＭＢＡ塗布より一定期間（例えば、１週間）経過した後から、被験物質とＴＰＡとを一定頻度（例えば、週２回程度）で皮膚に塗布する。具体的には例えば、前記のようにＤＭＢＡを塗布した皮膚に、まずアセトン又はメタノール等の有機溶媒に溶解した被験物質を塗布し、約１時間後に、アセトン又はメタノール等の有機溶媒に溶解したＴＰＡを適量（例えば、約０．１μｇ〜約１０μｇ程度）塗布する。このような処理を行いながら、一定期間（例えば、約１０〜５０週間程度）に渡って経時的に観察を行い、処理を行った背中の皮膚に腫瘍の発生したマウスの数及び発生した腫瘍の数を測定する。被験物質とＴＰＡとを塗布した群における腫瘍の発生したマウスの数及び発生した腫瘍の数を、被験物質の代わりに溶媒を塗布した群における腫瘍の発生したマウスの数及び発生した腫瘍の数と比較することにより、被験物質の発癌プロモーション抑制活性を調べることができる。
【００１０】
本発明化合物は、例えば、本発明化合物を含む天然物由来の抽出物若しくはその加工品、本発明化合物自体、或いは、本発明化合物と、医薬担体若しくは賦形剤、食品成分又は化粧品成分等とが混合されてなる組成物等を含み、腫瘍や癌の発生を抑制し、かつ、発生した腫瘍や癌を治療する医薬品、食品又は化粧品等として利用され得る。用いられる医薬担体若しくは賦形剤、食品成分又は化粧品成分等は、当該癌抑制剤の具体的用途に応じて適宜選択することができる。また、抑制剤の形態も、具体的用途に応じて、例えば、種々の固体や液体等の形態とすることができる。
【００１１】
例えば、本発明化合物を医薬品として用いる場合には、その投与形態を必要に応じて適宜選択することができる。具体的な形態としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤等の経口剤、注射剤、経皮吸収剤、ローション剤、クリーム剤、軟膏剤、坐剤等の非経口剤等をあげることができる。
経口剤としての投与量は、患者の年令、体重、疾患の程度により異なるが、通常成人で本発明化合物の重量として約０．０１ｍｇ〜約１ｇ／日である。
経口剤は、例えば、乳糖、デンプン、ショ糖、ブドウ糖、マンニトール、コンスターチ、無機塩類等を用いて常法に従って製造される。また、必要に応じて前記の賦形剤の他に、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、乳化剤、滑沢剤、湿潤剤、流動化剤、保存剤、矯味剤、着色剤、香料等を使用することができる。結合剤としては、例えば、デンプン、デキストリン、アラビアゴム末、ヒドロキシプロピルスターチ、結晶セルロース、エチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等を挙げることができる。崩壊剤としては、例えば、デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等があげられる。界面活性剤としては、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、大豆レシチン、卵黄レシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ポリソルベート８０等があげられる。滑沢剤としては、例えば、タルク、ロウ類、水素添加植物油、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム等があげられる。流動化剤としては、例えば、軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウム等があげられる。
また、経口剤の剤形としては、例えば、懸濁液、乳化剤、シロップ剤、エリキシル剤等をあげることもでき、これらの剤形には、矯味矯臭剤、着色剤等が含まれていてもよい。
非経口剤としての投与量は、患者の年齢、体重、疾患の程度により異なるが、通常成人で本発明化合物の重量として約０．０１ｍｇ〜約１ｇ／日である。
注射剤は常法に準じて製造すればよい。用いられる希釈剤として、例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、落花生油、大豆油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等をあげることができる。さらに必要に応じて、殺菌剤、防腐剤、安定剤等を加えてもよい。
ローション剤には、通常用いられる添加剤が含まれていてもよく、懸濁剤として、例えば、アラビアゴム、トラガント、デキストリン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、カルボキシビニルポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ベントナイト、ビーガム、無水ケイ酸等が挙げられる。乳化剤としては、例えば、石ケン、ラウリル硫酸ナトリウム、ソルビタン、脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、モノグリセリド等が挙げられる。湿潤剤としては、例えば、グリセリン、プロピレングリコール、ソルビトール、１，３−ブチレングリコール、ｄｌ−ピロリドンカルボン酸、乳酸ナトリウム等が挙げられる。保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、塩化ベンザルコニウム等が挙げられる。これらを用いて、常法に準じてローション剤を調製する。
その他の非経口剤としては、例えば、外用液剤、ゲル状軟膏等の経皮吸収剤、直腸内投与のための坐剤等が挙げられ、これら製剤は常法に準じて製造すればよい。
【００１２】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
実施例１（本発明化合物の調製）
大阪府吹田市千里中央公園内において平成１３年１１月に採取されたモミジバフウの球果６．８ｋｇを細かく刻み、これを室温にて１５Ｌのクロロホルムに１週間浸漬し、濾紙を用いて濾過を行った。濾液を常圧下で１／３量程度まで加熱濃縮した後、４５℃に加温して減圧濃縮し溶媒を留去することにより、クロロホルム抽出エキス９８．３ｇを得た。表１に示したように、当該抽出エキスを２００ｍＬのクロロホルムに溶かし、クロロホルムで調製したシリカゲル（シリカゲル６０、メルク社製）２ｋｇを用いたカラムクロマトグラフィーに供し、３２Ｌのクロロホルム、８Ｌのクロロホルム−酢酸エチル混合液（クロロホルム：酢酸エチル＝２０：１）、３２Ｌのクロロホルム−酢酸エチル混合液（クロロホルム：酢酸エチル＝１０：１）、１９Ｌのクロロホルム−酢酸エチル混合液（クロロホルム：酢酸エチル＝５：１）、１０Ｌのクロロホルム−酢酸エチル混合液（クロロホルム：酢酸エチル＝２：１）、２０Ｌの酢酸エチルのみと順次溶出して各々１Ｌずつ分画を行った。クロロホルム−酢酸エチル混合液（クロロホルム：酢酸エチル＝２：１）で得られたフラクション６９から７８までを採取し、溶媒としてクロロホルム−メタノール混合液（クロロホルム：メタノール＝１０：１）を用いた薄層クロマトグラフィーにてフラクションの確認を行った。検出には波長２５４ｎｍのＵＶランプを用いた。フラクションのより詳細な解析のためＯＤＳカラムを用いた高速液体クロマトグラフィーを行った。溶媒として８０％アセトニトリルを用い、検出には波長２５４ｎｍのＵＶランプを用いた。フラクションの確認を行った後、当該フラクションを加熱して溶媒を留去した。これを１Ｌのクロロホルムに溶解し同量のメタノールを添加の上、クロロホルムを１／２量程度に加熱濃縮を行った後、室温で２〜３時間放置して再結晶化を行い、化合物１を５３０ｍｇ得た。
【００１３】
【表１】

【００１４】
実施例２（物性値測定）
実施例１で得られた化合物１の物性値を測定した。
【００１５】
化合物１：２５−ａｃｅｔｏｘｙ−３α−ｈｙｄｒｏｘｙｏｌｅａｎ−１２−ｅｎ−２８−ｏｉｃａｃｉｄ
無色針状結晶，Ｃ_３２Ｈ_５０Ｏ_５．融点２８２−２８４℃ （ＭｅＯＨ−ＣＨＣｌ_３），［α］_Ｄ ^１５＋４２．９゜（ｃ０．２２，ＣＨＣｌ_３）．赤外吸収スペクトルνｍａｘ：３４６３（ＯＨ），３１００〜２７００及び１７０３（ＣＯＯＨ），２９６８，２９２０，２８６０，１７２１及び１２６５（ＯＡｃ），１４６１，１３７９，１３６３，１２１１，１１７２，１０６０，１０１４，９８３ｃｍ^−１．高分解能マススペクトル：Ｍ＋ｍ／ｚ＝５１４．３６５４［Ｃ_３２Ｈ_５０Ｏ_５，５１４．３６５６として算出］．ＮＭＲスペクトル ^１Ｈ−ＮＭＲ（ｐｙｒｉｄｉｎｅＤ５）：δ ０．９４２（３Ｈ，ｓ，Ｍｅ−２９），１．００３（３Ｈ，ｓ，Ｍｅ−３０），１．０１９（３Ｈ，ｓ，Ｍｅ−２３），１．０５９（３Ｈ，ｓ，Ｍｅ−２４），１．２３８（３Ｈ，ｓ，Ｍｅ−２６），１．２６３（３Ｈ，ｓ，Ｍｅ−２７），２．０７６（３Ｈ，ｓ，ＣＨ_２ＯＣＯＣＨ _３），４．１７及び４．２９（各１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ，Ｈ−２５），４．９９（１Ｈｔ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，Ｈ−３β），５．５４（１Ｈｔ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，Ｈ−１２）．^１３Ｃ−ＮＭＲ（ｐｙｒｉｄｉｎｅＤ５）： δ １７．９（Ｃ−２６），１８．３（Ｃ−６），２１．２（ＣＨ_２ＯＣＯＣＨ_３），２１．８（Ｃ−２４），２３．７（Ｃ−２２），２３．８（Ｃ−３０），２４．８（Ｃ−２），２５．３（Ｃ−１１），２６．６（Ｃ−２７），２８．４（Ｃ−１５），２８．５（Ｃ−２３），２９．６（Ｃ−１），３１．０（Ｃ−２０），３３．２（Ｃ−１６ａｎｄＣ−２９），３３．３（Ｃ−７），３４．２（Ｃ−２１），３６．７（Ｃ−４），４０．１（Ｃ−８），４１．８（Ｃ−１０），４１．９（Ｃ−１８），４２．４（Ｃ−１４），４６．６（Ｃ−１７），４６．７（Ｃ−１９），４９．１（Ｃ−９），５０．８（Ｃ−５），６０．３（Ｃ−２５），７８．５（Ｃ−３），１２３．８（Ｃ−１２），１４４．６（Ｃ−１３），１７０．４（ＣＨ_２ＯＣＯＣＨ_３），１８０．２（Ｃ−２８）．マススペクトル：５１４（０．３）［Ｍ］＋，４５４（７）［Ｍ−ＨＯＡｃ］＋，４３９（１），４３６（２），４２４（１０），３９７（２２），２７９（１１），２４８（４４），２３４（１４），２０３（１００），１８９（３１），１７５（２８），１７３（１１），１３３（２３），１１９（２１），１０５（１８），９５（１５）．なお、化合物１のＮＭＲスペクトルを図１及び図２に示した。
【００１６】
試験例１（殺癌細胞活性の測定）
実施例１で得られた化合物１（２５−ａｃｅｔｏｘｙ−３α−ｈｙｄｒｏｘｙｏｌｅａｎ−１２−ｅｎ−２８−ｏｉｃａｃｉｄ）について、下記のヒト培養細胞パネルを利用したｉｎｖｉｔｒｏ薬剤感受性試験を用い、殺癌細胞活性の測定を行った。
乳癌由来細胞株ＨＢＣ−４、ＢＳＹ−１、ＨＢＣ−５、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、中枢神経系癌由来細胞株Ｕ２５１、ＳＦ−２６８、ＳＦ−２９５、ＳＦ−５３９、ＳＮＢ−７５、ＳＮＢ−７８、大腸癌由来細胞株ＨＣＣ２９９８、ＫＭ−１２、ＨＴ−２９、ＨＣＴ−１５、ＨＣＴ−１１６、肺癌由来細胞株ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ５２２、ＮＣＩ−Ｈ４６０、Ａ５４９、ＤＭＳ２７３、ＤＭＳ１１４、悪性黒色腫（メラノーマ）由来細胞株ＬＯＸ−ＩＭＶＩ、卵巣癌由来細胞株ＯＶＣＡＲ−３、ＯＶＣＡＲ−４、ＯＶＣＡＲ−５、ＯＶＣＡＲ−８、ＳＫ−ＯＶ−３、腎癌由来細胞株ＲＸＦ−６３１Ｌ、ＡＣＨＮ、胃癌由来細胞株Ｓｔ−４、ＭＫＮ１、ＭＫＮ７、ＭＫＮ２８、ＭＫＮ４５、ＭＫＮ７４、前立腺癌由来細胞株ＤＵ−１４５、ＰＣ−３の３９列株を９６穴ウェルプレートに播種し、これに翌日、前記化合物の溶液（５ｄｏｓｅ、１０^−４Ｍから１０^−８Ｍまで１ｌｏｇ間隔）を添加した。これを２日間培養した後、細胞増殖を蛋白質結合性色素スルホローダミンＢによる染色により比色測定した。測定結果をコンピューターに入力し情報処理を行った。
各濃度におけるＭｅａｎＯｐｔｉｃａｌＤｅｎｓｉｔｙ（ＯＤｔｅｓｔ）が、前記化合物を添加する直前（ＴｉｍｅＺｅｒｏ）のＯＤ値（Ｔｚ）より大（ＯＤｔｅｓｔ＞Ｔｚ）の時、
ＰｅｒｃｅｎｔＧｒｏｗｔｈ（ＰＧ％）＝（（ＯＤｔｅｓｔ − Ｔｚ）／（ＯＤｃｏｎｔｒｏｌＴｚ））×１００
但し、ＯＤｃｏｎｔｒｏｌはＣｏｎｔｒｏｌのＯＤ値を示す。
逆に、（ＯＤｔｅｓｔ＜Ｔｚ）の時は、
（ＰＧ％）＝（（ＯＤｔｅｓｔ − Ｔｚ）／Ｔｚ））×１００
この場合、ＰＧ％は（−）となる。
３９列株の癌細胞毎に、上記で求められたＰＧ％の値を、濃度（対数）に対してプロットして臓器癌別にまとめた薬剤感受性試験の結果を図３〜図１１に示した。図３〜図１１はそれぞれ図３：乳癌由来細胞株、図４：中枢神経系癌由来細胞株、図５：大腸癌由来細胞株、図６：肺癌由来細胞株、図７：悪性黒色腫（メラノーマ）由来細胞株、図８：卵巣癌由来細胞株、図９：腎癌由来細胞株、図１０：胃癌由来細胞株及び図１１：前立腺癌由来細胞株について示した。
また、データ解析のパラメータとしてＴｉｍｅＺｅｒｏの細胞数を基準として、Ｃｏｎｔｒｏｌに比べて増殖を５０％に抑制する濃度としてＧＩ５０値、ＴｉｍｅＺｅｒｏと同じ細胞数に増殖を抑制する濃度としてＴＧＩ値、ＴｉｍｅＺｅｒｏの５０％に細胞数を減少させる濃度としてＬＣ５０値を導き出した。各曲線がＰＧ５０％、０％、−５０％の横線と交わる点の濃度がそれぞれＬｏｇＧＩ５０値、ＬｏｇＴＧＩ値、ＬｏｇＬＣ５０値に相当する。
次に３９列株の癌細胞に対するＭｅａｎＧｒａｐｈｓを癌種ごとにまとめたものを表３に示す。検定した全ての癌細胞株についてＬｏｇＧＩ５０値の平均値を求め、これをＭｅａｎＧｒａｐｈＭｉｄｐｏｉｎｔ（ＭＧ＿ＭＩＤ）と記する。この平均値と個々の癌細胞株でのＬｏｇＧＩ５０値との差を求め、それらを平均ＬｏｇＧＩ５０値を基準にし、絶対値化して正負にて表記した。薬剤感受性（ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）が高い癌細胞株ほど正の値が大きい。「１」は１Ｌｏｇを表す。ＭｅａｎＧｒａｐｈｓの下段に表示されたＤｅｌｔａは最も薬剤感受性が高いものと平均との差を示し、その下のＲａｎｇｅは最も薬剤感受性の高い癌細胞株と最も薬剤感受性の低い癌細胞株のＬｏｇＧＩ５０値の差を示すものである。ＬｏｇＴＧＩ値、ＬｏｇＬＣ５０値についても同様である。前記化合物は濃度１０^−４Ｍでの試験により大腸癌由来細胞株ＨＴ−２９、ＨＣＴ−１１６、肺癌由来細胞株Ａ５４９、腎癌由来細胞株ＡＣＨＮ、次いで中枢神経系癌細胞株Ｕ２５１、ＳＦ−５３９において薬剤高感受性を示した。このような結果から前記化合物は殆どの癌細胞株に対して癌細胞致死活性を示し、中でも大腸癌に対して高い癌細胞致死活性を有することが判った。尚、前記化合物における細胞に対する強い毒性は認められなかった。
以上より、図３〜図１１及び表２の結果を併せ、本発明化合物が殺癌細胞活性を有することが確認された。
【００１７】
【表２】

上記の結果に基づき算出したＧＩ５０値（５０％増殖阻止濃度）、ＴＧＩ値（増殖完全阻止濃度）、ＬＣ５０値（５０％細胞減少濃度）を各癌細胞株毎にまとめた図（ＭｅａｎＧｒａｐｈｓ）を示した。各癌細胞株間での平均したＬｏｇＧＩ５０値、ＬｏｇＴＧＩ値及びＬｏｇＬＣ５０値を示し（各ＭＧ−ＭＩＤ値）、各平均値からみた個々の癌細胞株の薬剤感受性を正負により示した。「１」は１Ｌｏｇで表し、正の値ほど薬剤高感受性を意味する。Ｄｅｌｔａは最も感受性が高いものと平均との差を示し、Ｒａｎｇｅは最も感受性の高い癌細胞株と最も薬剤感受性の低い癌細胞株との差を示すものである。各臓器名はＢｒ：乳癌由来細胞、ＣＮＳ：中枢神経系由来癌細胞、Ｃｏ：大腸癌由来細胞、Ｌｕ：肺癌由来細胞、Ｍｅ：悪性黒色腫（メラノーマ）由来細胞、Ｏｖ：卵巣癌由来細胞、Ｒｅ：腎癌由来細胞、Ｓｔ：胃癌由来細胞、ｘＰｇ：前立腺癌由来細胞で表した。
【００１８】
試験例２（発癌プロモーション抑制活性の測定）
実施例１で得られた化合物１（２５−ａｃｅｔｏｘｙ−３α−ｈｙｄｒｏｘｙｏｌｅａｎ−１２−ｅｎ−２８−ｏｉｃａｃｉｄ）について、ＥＢＡ−ＥＡ誘導試験法（Ｋｏｎｉｓｈｉ，Ｔ．ｅｔａｌ．、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、２１、９９３（１９９８））により、発癌プロモーション抑制活性の測定を行った。バーキットリンパ腫由来のＥＢＶ潜在感染ヒトリンパ芽球様細胞株（Ｒａｊｉ細胞）の培養には、ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬）に１０ｖ／ｖ％となるように牛胎仔血清（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を加えた培地を使用した。この培地で培養した場合のＥＢＶの活性化率（Ｒａｊｉ細胞の自然誘発率）は、０．１％以下であった。前記培地で培養したＲａｊｉ細胞の培養液を１×１０^６細胞／ｍｌとなるように調製し、ＤＭＳＯに溶解した酪酸（４ｍＭ）とＴＰＡ（２０ｎｇ／ｍｌ）とを加えて、ＣＯ_２インキュベ−タ−中で３７℃にて４８時間培養した後、得られた培養液の塗抹標本を作製した。上咽頭癌患者血清を用いた間接蛍光抗体法によりＥＢＶ初期抗原（ＥＢＶ−ＥＡ）を染色し、陽性細胞（該初期抗原の発現した細胞）の発現率を測定してこれを陽性コントロ−ル（１００）に対する割合（％）を求めた。一方、前記と同様に調製したＲａｊｉ細胞の培養液に、ＤＭＳＯに溶解した酪酸（４ｍＭ）、１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ、２０ｎｇ／ｍｌ）及び被験化合物を加えて同様に培養した後、陽性細胞の発現率を測定してこれを陽性コントロ−ル（１００）に対する割合（％）を求めた。各試験において、少なくとも５００細胞を測定し、また２回の繰り返し試験を行った。尚、毎回、ＴＰＡ及び被験化合物は添加せず酪酸だけを添加した系である陰性コントロ−ルと上記の陽性コントロ−ルとの両試験を併行して行った。
化合物１の測定結果を表３に示した。被験化合物の処理により、用量相関的にＥＢＶ−ＥＡの活性化率の低下が認められ、いずれの濃度においても比較対照であるオレアノール酸に比較すると明らかに低い値を示した。この結果から、化合物１は顕著なプロモーション抑制活性を有することが確認された。尚、化合物１には、細胞に対する強い毒性は認められなかった。
【００１９】
【表３】

１）陽性コントロール（ＴＰＡ添加系）の値を１００とした。
２）括弧内の数値は細胞の生存率（ＴＰＡ添加系の生存率を１００％とした）を示す。
【００２０】
【発明の効果】
本発明により、殺癌細胞活性及び発癌プロモーション抑制活性の両癌抑制作用を有する化合物が提供可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、化合物１の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示した図である。
【図２】図２は、化合物１の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示した図である。
【図３】図３は、ヒト培養癌細胞パネルを利用したｉｎｖｉｔｒｏ薬剤感受性試験により、化合物１の各種の乳癌由来培養細胞に対する薬剤感受性を測定した結果を示した図である。横軸は、培養癌細胞に添加した前記化合物の濃度（１０^−８Ｍ〜１０^−４Ｍ）を示し、縦軸は各癌細胞群における生存細胞数の割合を百分率で示す。前記化合物の添加前（ＴｉｍｅＺｅｒｏ）の細胞数を１００％とした。図中のパラメーターは下記の通りである。
◆：ＨＢＣ−４細胞、■：ＢＳＹ−１細胞、△：ＨＢＣ−５細胞、□：ＭＣＦ−７細胞、◇：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞
【図４】図４は、ヒト培養癌細胞パネルを利用したｉｎｖｉｔｒｏ薬剤感受性試験により、化合物１の各種の中枢神経系癌由来培養細胞に対する薬剤感受性を測定した結果を示した図である。横軸は、培養癌細胞に添加した前記化合物の濃度（１０^−８Ｍ〜１０^−４Ｍ）を示し、縦軸は各細胞群における生存細胞数の割合を百分率で示す。前記化合物の添加前（ＴｉｍｅＺｅｒｏ）の細胞数を１００％とした。図中のパラメーターは下記の通りである。
◆：Ｕ２５１細胞、■：ＳＦ−２６８細胞、△：ＳＦ−２９５細胞、□：ＳＦ−５３９細胞、◇：ＳＮＢ−７５細胞、●：ＳＮＢ−７８細胞
【図５】図５は、ヒト培養癌細胞パネルを利用したｉｎｖｉｔｒｏ薬剤感受性試験により、化合物１の各種の大腸癌由来培養細胞に対する薬剤感受性を測定した結果を示した図である。横軸は、培養癌細胞に添加した前記化合物の濃度（１０^−８Ｍ〜１０^−４Ｍ）を示し、縦軸は各癌細胞群における生存細胞数の割合を百分率で示す。前記化合物の添加前（ＴｉｍｅＺｅｒｏ）の細胞数を１００％とした。図中のパラメーターの通りである。
◆：ＨＣＣ２９９８細胞、■：ＫＭ−１２細胞、△：ＨＴ−２９細胞、□：ＨＣＴ−１５細胞、◇：ＨＣＴ−１１６細胞
【図６】図６は、ヒト培養癌細胞パネルを利用したｉｎｖｉｔｒｏ薬剤感受性試験により、化合物１の各種の肺癌由来培養細胞に対する薬剤感受性を測定した結果を示した図である。横軸は、培養癌細胞に添加した前記化合物の濃度（１０^−８Ｍ〜１０^−４Ｍ）を示し、縦軸は各癌細胞群における生存細胞数の割合を百分率で示す。前記化合物の添加前（ＴｉｍｅＺｅｒｏ）の細胞数を１００％とした。図中のパラメーターは下記の通りである。
◆：ＮＣＩ−Ｈ２３細胞、■：ＮＣＩ−Ｈ２２６細胞、△：ＮＣＩ−Ｈ５２２細胞、□：ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞、◇：Ａ５４９細胞、●：ＤＭＳ２７３細胞、▲：ＤＭＳ１１４細胞
【図７】図７は、ヒト培養癌細胞パネルを利用したｉｎｖｉｔｒｏ薬剤感受性試験により、化合物１の悪性黒色腫（メラノーマ）由来培養細胞に対する薬剤感受性を測定した結果を示した図である。横軸は、培養癌細胞に添加した前記化合物の濃度（１０^−８Ｍ〜１０^−４Ｍ）を示し、縦軸は各癌細胞群における生存細胞数の割合を百分率で示す。前記化合物の添加前（ＴｉｍｅＺｅｒｏ）の細胞数を１００％とした。図中のパラメーターは下記の通りである。
◆：ＬＯＸ−ＩＭＶＩ細胞
【図８】図８は、ヒト培養癌細胞パネルを利用したｉｎｖｉｔｒｏ薬剤感受性試験により、化合物１の各種の卵巣癌由来培養細胞に対する薬剤感受性を測定した結果を示した図である。横軸は、培養癌細胞に添加した前記化合物の濃度（１０^−８Ｍ〜１０^−４Ｍ）を示し、縦軸は各癌細胞群における生存細胞数の割合を百分率にて示す。前記化合物の添加前（ＴｉｍｅＺｅｒｏ）の細胞数を１００％とした。図中のパラメーターは下記の通りである。
◆：ＯＶＣＡＲ−３細胞、■：ＯＶＣＡＲ−４細胞、△：ＯＶＣＡＲ−５細胞、□：ＯＶＣＡＲ−８細胞、◇：ＳＫ−ＯＶ−３細胞
【図９】図９は、ヒト培養癌細胞パネルを利用したｉｎｖｉｔｒｏ薬剤感受性試験により、化合物１の各種の腎癌由来培養細胞に対する薬剤感受性を測定した結果を示した図である。横軸は、培養癌細胞に添加した前記化合物の濃度（１０^−８Ｍ〜１０^−４Ｍ）を示し、縦軸は各癌細胞群における生存細胞数の割合を百分率で示す。前記化合物の添加前（ＴｉｍｅＺｅｒｏ）の細胞数を１００％とした。図中のパラメーターは下記の通りである。
◆：ＲＸＦ−６３１Ｌ細胞、■：ＡＣＨＮ細胞
【図１０】図１０は、ヒト培養癌細胞パネルを利用したｉｎｖｉｔｒｏ薬剤感受性試験により、化合物１の各種の胃癌由来培養細胞に対する薬剤感受性を測定した結果を示した図である。横軸は、培養癌細胞に添加した前記化合物の濃度（１０^−８Ｍ〜１０^−４Ｍ）を示し、縦軸は各癌細胞群における生存細胞数の割合を百分率で示す。前記化合物の添加前（ＴｉｍｅＺｅｒｏ）の細胞数を１００％とした。図中のパラメーターは下記の通りである。
◆：Ｓｔ−４細胞、■：ＭＫＮ１細胞、△：ＭＫＮ７細胞、□：ＭＫＮ２８細胞、◇：ＭＫＮ４５細胞，●：ＭＫＮ７４細胞
【図１１】図１１は、ヒト培養癌細胞パネルを利用したｉｎｖｉｔｒｏ薬剤感受性試験により、化合物１の各種の前立腺癌由来培養細胞に対する薬剤感受性を測定した結果を示した図である。横軸は、培養癌細胞に添加した前記化合物の濃度（１０^−８Ｍ〜１０^−４Ｍ）を示し、縦軸は各癌細胞群における生存細胞数の割合を百分率にて示す。前記化合物の添加前（ＴｉｍｅＺｅｒｏ）の細胞数を１００％とした。図中のパラメーターは下記の通りである。
◆：ＤＵ−１４５細胞、■：ＰＣ−３細胞

Claims

式（Ｉ）で示されるトリテルペン化合物又はその薬学的に許容される塩。
請求項１記載のトリテルペン化合物又はその薬学的に許容される塩をマンサク科植物から抽出する工程を有することを特徴とするトリテルペン化合物の製造方法。
請求項１記載のトリテルペン化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする癌抑制剤。