ES2869904T3 - Compuestos de Antrodia camphorata, método para prepararlos y uso de los mismos - Google Patents

Compuestos de Antrodia camphorata, método para prepararlos y uso de los mismos Download PDF

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Abstract

Compuesto de la fórmula AC007-H1, AC009-H1 o AC012-H1: **(Ver fórmula)**

Description

DESCRIPCIÓN
Compuestos de Antrodia camphorata, método para prepararlos y uso de los mismos
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
1. CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0001] La presente invención se refiere a compuestos específicos purificados de Antrodia camphorata, una composición que comprende compuestos específicos purificados de Antrodia, los métodos para prepararlos y el uso médico de los mismos; particularmente los compuestos inhiben la proliferación de las células cancerosas y la angiogénesis, y se utilizan para el tratamiento del cáncer.
2. DESCRIPCIÓN DEL ESTADO DE LA TÉCNICA
[0002] Antrodia camphorata (originalmente denominado Antrodia cinnamomea) es un hongo endémico taiwanés que crece en el tronco hueco de Cinnamomum kanchirai Hayata, Lauraceae. En la medicina popular, el Antrodia camphorata es un antídoto útil para la intoxicación por alimentos o un pesticida; se usa también para el tratamiento de la hepatitis u otras enfermedades del hígado. Con respecto a su alto valor médico, la dificultad de su cultivo y su lenta velocidad de crecimiento, se publicaron varias investigaciones en genómica y metabolómica para una mayor comprensión acerca del uso médico y el método de cultivo de Antrodia camphorata (Lu et al. 2014 PNAS Lin et al. 2011 J Agr Food Chem).
[0003] Antrodia camphorata comprende una cantidad de compuesto bioactivo que es capaz de un uso médico, incluidos polisacáridos de molécula grande y terpenos de molécula pequeña. El polisacárido consiste en varias unidades de monosacárido, la mayor parte de las cuales es 1,3-p-D-glucano, identificadas por espectrometría. Se ha informado de que los poliscacáridos de Antrodia camphorata tienen diversos usos médicos, tales como la inhibición de la angiogénesis (Yang et al. 2009 J Ethnopharmacol Cheng et al. 2005 Life Sci), la inhibición de la respuesta inmunitaria (Meng et al. 2012 Nutrition), la modulación de la respuesta inmunitaria y la inhibición del asma (Liu et al.2010 Immunology), la inhibición de la hepatitis B (Lee et al. 2002 FEMS Microbiol Lett), la inhibición de la proliferación de las células cancerosas (Liu et al. 2004 Toxicol Appl Pharmacol Lee et al. 2014 Food Funct); además, se ha informado de que el antrodan, una glicoproteína extraída de Antrodia camphorata, proporciona un efecto hepatoprotector (Ker et al. 2014 PLoS ONE, TW500628, US 7763723).
[0004] Además, los triterpenoides son también un gran grupo de compuestos médicos de Antrodia camphorata. Ante todo, Cherng et al. informaron de 3 nuevos ergostanos, un grupo de compuestos triterpenoides: antcinas A-C (Cherng et al. 1995 J Nat Prod), y otros 4 nuevos compuestos triterpenoides: antcinas E-F metil antcinato G metil antcinato H (Cherng et al. 1996 Phytochemistry); después de esos informes, se informó de que decenas de compuestos triterpenoides son aplicables al uso terapéutico, tal como la inhibición de la proliferación de células cancerosas (Wu et al. 2010 J Nat Prod), la inhibición de la inflamación (Liaw et al. 2013 J Nat Prod), el tratamiento del cáncer de hígado y la hepatitis (Lien et al. 2014 Molecules), antifatiga (Huang et al. 2012 Evid Based Complement Altern Med).
[0005] La CN 103570531 divulga 5 nuevos compuestos purificados de los micelios de Antrodia cinnamomea, que pueden inhibir una reacción de inflamación y el crecimiento de células cancerosas, incluidas las células de cáncer de hígado, de cáncer cervical o de cáncer de estómago.
[0006] La US 2008119565 divulga nuevos compuestos, antroquinonol B y antroquinonol C, aislados de extractos de Antrodia camphorate, que pueden inhibir el crecimiento del cáncer de mama, el cáncer de pulmón, el cáncer hepático y el cáncer de próstata.
[0007] La US7109232 divulga 5 nuevos compuestos purificados de Antrodia camphorata y el uso, incluidos el antiinflamatorio y el anticanceroso; la US7732482 divulga que los dichos 5 compuestos son eficaces en la supresión de la fibrosis de los organismos. La US7342137 divulga un nuevo grupo de compuestos de Antrodia camphorata, que inhiben varias líneas celulares de cáncer. La US7745647 demuestra los nuevos diterpenos del cuerpo fructífero del Antrodia camphorata y su uso como un agente neuroprotector. La US7994158 proporciona el ácido deshidrosulfurénico purificado de Antrodia camphorata inhibe la proliferación del cáncer, especialmente la leucemia y el cáncer pancreático; además, la US7531627 proporciona una nueva proteína de 29kDa ACA1 de Antrodia camphorata, que mejora la inflamación y tiene potencial para el tratamiento del cáncer.
[0008] Los mecanismos por los que los compuestos de Antrodia inhiben el cáncer difieren según la estructura química. Yeh et al. informaron de que la lactona sesquiterpénica antrocina suprime la vía de señalización JAK2/STAT3 e induce la apoptosis (Yeh et al. 2013 Carcinogenesis); Yang et al. informa de que el extracto de Antrodia suprime la vía HER-2/neu e inhibe el cáncer ovárico (Yang et al. 2013 J Ethnopharmacol); además, Wang et al. informaron de que el antroquinonol D causa la desmetilación del ADN y tiene potencial para tratar el cáncer (Wang et al. 2014 J Agric Food Chem).
[0009] En resumen, Antrodia camphorata tiene una cantidad de sustancias con potencial para tratar cánceres, algunas de las cuales se ha demostrado que son eficaces contra varios cánceres. Sin embargo, poco se conoce acerca de si todavía hay otros nuevos compuestos no descubiertos y su efecto anticanceroso. La presente invención extrae una serie de compuestos de Antrodia camphorata, identifica sus estructuras e investiga sus efectos sobre varias enfermedades.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
[0010] En un aspecto, la presente invención proporciona un compuesto con la fórmula AC0007-H1, AC009-H1 o AC012-H1:
Figure imgf000003_0001
[0011] En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer que comprende la cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto seleccionado del grupo que consiste en las siguientes fórmulas AC007-H1, AC009-H1 y AC012-H1:
Figure imgf000004_0001
o la combinación de al menos dos de dichos compuestos, y vehículos, sales o profármacos farmacéuticamente aceptables.
[0012] En una forma de realización, los vehículos incluyen excipientes, diluyentes, espesantes, productos de relleno, aglutinantes, desintegrantes, lubricantes, agentes oleaginosos o no oleaginosos, tensioactivos, agentes de suspensión, agentes gelificantes, adyuvantes, conservantes, antioxidantes, estabilizadores, agentes colorantes o mezclas de los mismos.
[0013] En otra forma de realización, el tratamiento del cáncer se realiza a través de la inhibición de la proliferación de las células cancerosas.
[0014] En otra forma de realización, la composición farmacéutica se formula para la inyección intravenosa, la inyección subcutánea, la administración oral o la administración tópica.
[0015] En otra forma de realización, la composición farmacéutica es una pastilla, una píldora, una cápsula, un líquido, una suspensión, un gel, una dispersión, una solución, una emulsión, una pomada o una loción.
[0016] En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica según la invención para usar en un método para el tratamiento del cáncer administrando una dosificación eficaz de la composición farmacéutica.
[0017] En una forma de realización, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de próstata, cáncer de hígado, melanoma, cáncer cerebral y cáncer colorrectal.
[0018] En la forma de realización preferida, el cáncer es cáncer colorrectal y cáncer de hígado.
[0019] En otra forma de realización, la composición farmacéutica se administra vía inyección intravenosa, inyección subcutánea, administración oral o administración tópica.
[0020] En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para obtener derivados bioactivos de sustitución de grupos hidroxilo en el C4 de los compuestos bioactivos de Antrodia camphorate por los pasos que comprenden:
la hidrolización de los compuestos bioactivos en 1 equivalente molar de metanol;
después de que se complete la reacción precedente, la adición de Amberlite ácida y luego la filtración por membrana filtrante para obtener el producto intermedio;
la elución del producto intermedio por cromatografía de gel de sílice, usando gel de sílice como resina de separación, gradiente de hexano y acetato de etilo como fase móvil, donde el gradiente de elución de hexano:acetato de etilo es de 4:1 a 1:1; el producto se eluye a aproximadamente una proporción de 1:1 de la solución de gradiente; la purificación del producto por HPLC en fase inversa, usando una columna semipreparatoria C18 y solución de metanol: 0,1% de tampón FA (solución salina tamponada con fosfato) = 75:25 como eluyente isocrático para obtener los derivados bioactivos de la sustitución de grupos hidroxilo en el C4, donde los compuestos de las fórmulas AC006, AC007, AC009, AC011 y AC012 como se representa a continuación:
Figure imgf000006_0001
son los compuestos bioactivos de Antrodia camphorata.
[0021] Además, la presente invención proporciona también una composición antiangiogénica y antiproliferativa que comprende las sustancias anteriormente mencionadas de Antrodia camphorata, un diluyente, excipiente o vehículo apropiado; además, la composición puede inhibir la proliferación de células altamente proliferativas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0022] La presente invención se entenderá más completamente a partir de la descripción detallada dada aquí a continuación y los dibujos anexos que se dan a modo de ilustración solo, y, por tanto, no son limitativos de la presente invención, y donde:
la figura 1 muestra el efecto antiangiogénico del extracto AC012 in vitro y (A) grupo de control, (B) AC0120,1 pg/ml, (C) AC0120,3 pg/ml y (D) AC012 1 pg/ml se añadió por separado al cultivo celular de CPE.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA FORMA DE REALIZACIÓN PREFERIDA
[0023] A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados aquí tienen el significado entendido comúnmente por una persona experta en la técnica a la que esta invención pertenece. Como se utiliza en este caso, los términos siguientes tienen los significados asignados a ellos a menos que se especifique lo contrario. La presente invención se describirá ahora más específicamente con referencia a las formas de realización siguientes, que se proporcionan a efectos de demostración antes que de limitación; sin embargo, se debe entender que la presente invención no está limitada a las formas de realización preferidas mostradas. A menos que se especifique lo contrario, todos los materiales usados aquí son materiales comercialmente disponibles y pueden ser fácilmente adquiridos.
[0024] El término "tratamiento", "bajo tratamiento" y términos similares se refieren a los métodos que alivian, mejoran, reducen o revierten la enfermedad del paciente o cualquier síntoma relevante causado por la enfermedad, o métodos que pueden evitar el comienzo de tales enfermedades o cualquiera de los síntomas resultantes.
[0025] El término "farmacéuticamente aceptable" se utiliza para describir sustancias que se van a usar en la composición que deben ser compatibles con otros ingredientes en la formulación y ser inocuas para el sujeto.
[0026] La composición inventiva se puede preparar en una forma de dosificación para la aplicación adecuada de la composición inventiva usando tecnología entendida comúnmente por una persona experta en la técnica a través de la formulación del compuesto o los compuestos anteriormente mencionado(s) con un vehículo farmacéuticamente aceptable, donde los excipientes incluyen, pero de forma no limitativa, solución, emulsión, suspensión, polvo, pastilla, píldora, gragea, tableta, goma de mascar, suspensión acuosa y otras formas adecuadas.
[0027] El "vehículo farmacéuticamente aceptable" puede contener uno o varios reactivos seleccionados de la lista siguiente: solventes, emulsionantes, agentes de suspensión, descomponedores, agentes aglutinantes, excipientes, agentes estabilizantes, agentes quelantes, diluyentes, agentes gelificantes, conservantes, lubricantes, tensioactivos y otros agentes adecuados para usar en la invención.
[0028] En las composiciones anteriormente mencionadas, se pueden añadir, según se desee, uno o más adyuvantes de disolución, tampones, conservantes, colorantes, fragancias, agentes aromatizantes y similares, que se usan comúnmente para la formulación.
[0029] El término "excipientes farmacéuticamente aceptables", como se utiliza en este caso, se refiere a las sustancias conocidas por las personas expertas en la técnica, que son fisiológicamente inertes, farmacológicamente inactivas y son compatibles con las características tanto físicas como químicas del compuesto o los compuestos proporcionado(s). Los excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero de forma no limitativa, polímeros, plastificantes, productos de relleno, lubricantes, diluyentes, aglutinantes, desintegrantes, solventes, cosolventes, tensioactivos, conservantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, colorantes o pigmentos de calidad farmacéutica y agentes de viscosidad.
[0030] El término "composición farmacéutica" se utiliza para describir composiciones sólidas o líquidas en una forma, concentración y pureza que son adecuadas para la administración en los pacientes y pueden inducir los cambios fisiológicos deseados tras la administración. Las composiciones farmacéuticas son típicamente estériles y no pirógenas.
[0031] El término "dosificación eficaz" como se utiliza en este caso se refiere a la dosificación necesaria para causar, provocar o contribuir a la respuesta biológica esperada. Como conoce una persona experta en la técnica, la dosificación eficaz de una composición farmacéutica varía en función de los siguientes factores, incluidos el criterio de evaluación biológico deseado, el fármaco que se va a administrar, la composición de la matriz de encapsulación, el tejido diana, etc.
Ejemplo 1: preparación de las sustancias activas de Antrodia camphorata
[0032] El medio de micelio de Antrodia camphorata se extrajo dos veces con reflujo usando hexano durante 1-3 h cada vez y los dos extractos de hexano se combinaron después de filtrar al vacío. Una columna se preparó utilizando gel de sílice (malla de 70-230) y micelios y se eluyó con soluciones de gradiente de n-hexano/acetato de etilo para obtener la fracción F1, F2 y F3 y la elución de gradiente correspondiente fue 17-22% de acetato de etilo, 23-27% de acetato de etilo y 28-33% de acetato de etilo, respectivamente. La fracción resultante F3 se dividió en tres fracciones F3-1-F3-3 por tiempo de retención.
[0033] Separar la fracción F3-1 por cromatografía en columna de gel de sílice (elución de gradiente de 50:1 a 20:1) usando CH2Cl2/acetona como la fase móvil y recoger la fracción de 40:1-15:1 para la purificación adicional con una columna de HPLC semipreparatoria de fase normal y usar n-hexano/acetato de etilo (4:1) para obtener AC006 purificado.
[0034] Separar la fracción F3-2 con una columna de gel de sílice de MPLC de fase normal y usar soluciones de gradiente CH2Cl2/acetona (100%:0% a 70%:30%) como la fase móvil. Recoger la fracción de 95%:5% a 85%:15% y dividir en tres fracciones y purificar adicionalmente la fracción F3-2-3 por cromatografía en columna de gel de sílice usando n-hexano/acetato de etilo (100%:0% a 0%:100%) como la fase móvil y recoger la fracción de n-hexano/acetona = 90/10-70-30. Continuar con la purificación por cromatografía en columna de gel de sílice usando n-hexano/acetato de etilo (100%:0% a 0%:100%) como la fase móvil y obtener AC007 con la solución de elución de n-hexano/acetato de etilo = 60/40.
[0035] Separar la fracción F-3-3 con una columna de gel de sílice de MPLC de fase normal usando elución de gradiente CH2Cl2/acetona (100%:0% a 0%:100%) y recoger fracciones de 90%:10% a 70%:30% que luego se dividieron en 5 fracciones. Purificar adicionalmente F-3-3-5 (la fracción de CH2Cl2/acetona = 73/27) con una columna de gel de sílice usando n-hexano/acetona (95%:5% a 50%:50%) como la fase móvil. Recoger las fracciones de 85%:15% a 70%:30% y dividir en 5 fracciones. Tomar F3-3-5-1 (n-hexano/acetona = 90/10-80/20) para la purificación de columna C-18 de MPLC de fase inversa usando un 1% de ácido fórmico en gradiente H2O/metanol = 35/65-20/80 como la fase móvil. Tomar la fracción de un 1% de ácido fórmico en H2O/metanol = 28/72-22/78 para la purificación por cromatografía en columna de gel de sílice con n-hexano/acetato de etilo como la fase móvil y elución de gradiente (80%:20% a 50%:50%) y obtener AC012 con la solución de elución de n-hexano/acetato de etilo (75%:25%-65%:35%).
[0036] Separar F3-3-5-3 por cromatografía en columna de gel de sílice C-18 de MPLC de fase inversa y usar un 1% de ácido fórmico en H2O/metanol = 25/75 y elución isocrática con 15 ml por minuto como la fase móvil para obtener la fracción que contiene la mayor parte de AC009, y luego purificar adicionalmente la fracción a 130-170 minutos de tiempo de retención con soluciones de gradiente de gel de sílice (100%:0% a 0%:100%) usando CH2Cl2/acetato de etilo como la fase móvil y recoger AC009 con la solución de elución de CH2Cl2/acetato de etilo = 80/20-60/40.
[0037] Tomar F3-1 y purificar por cromatografía en columna C-18 de HPLC en fase inversa usando una fase móvil de un 1% de ácido fórmico/metanol = 25%:75% isocrática para obtener AC-05-01.
[0038] Tomar la fracción F3-3-5-4 (n-hexano/acetona = 76/24) y purificar por cromatografía de columna C-18 de HPLC en fase inversa usando un 1% de ácido fórmico en H2O/metanol = 25%:75% y una elución isocrática como la fase móvil para obtener AC011.
[0039] Donde los extractos AC006, AC007, AC009, AC011 y AC012 son los compuestos bioactivos de Antrodia camphorata.
Ejemplo 2 Estructura química de sustancias activas purificadas de los micelios de Antrodia camphorata
[0040] Los compuestos fueron identificados por métodos espectroscópicos, incluidos los análisis por resonancia magnética nuclear (RMN) 1D y 2D y espectrales de masas. La estructura se muestra a continuación.
Ejemplo 2.1
[0041]
Figure imgf000008_0001
[0042] EIMS, m/z 471,2701 [M+Na]+; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) 55,77 (1H, d, J = 3,2 Hz, H-4), 5,18 (1H, t, J = 5,6 Hz, H-12), 5,16 (1H, t, J = 6,4 Hz, H-8), 5,11 (1H, dt, J = 1,6, 8,8 Hz, H-16), 4,43 (1H, q, J=6,8, H-15), 4,00 (3H, s, H-24), 3,62 (3H, s, H-23), 2,53 (1H, m, H-6), 2,29 (1H, m, H-7a), 2,24 (2H, m, H-14), 2,11 (2H, m, H-11), 2,10 (3H, s, -OAc), 2,08 (1H, m, H-10a), 2,02 (1H, m, H-7b), 1,94 (1H, m, H-10b), 1,92 (1H, m, H-5), 1,71 (3H, d, J = 1,2 Hz, H-18), 1,66 (3H, d, J = 1,2 Hz, H-19), 1,64 (3H, s, H-20), 1,58 (3H, s, H-21), 1,18 (3H, d, J = 6,8 Hz, H-22); 13C RMN (100 MHz, CD3OD) 5199,2 (s, C-1), 171,6 (s, - COCH3), 160,7 (s, C-3), 138,9 (s, C-2), 138,8 (s, C-9), 134,9 (s, C-17), 132,9 (s, C-13), 129,6 (d, C-16), 128,4 (d, C-12), 122,2 (d, C-8), 70,4 (d, C-4), 68,1 (d, C-15), 61,2 (q, C 23), 60,4 (q, C-24), 49,2 (t, C-14), 44,4 (d, C-5), 42,6 (d, C-6), 40,9 (t, C-10), 28,1 (t, C-7), 27,6 (t, C-11), 26,1 (q, C-18), 21,0 (q, - COCH3), 18,5 (q, C-19), 16,8 (q, C-20), 16,5 (q, C-21), 13,3 (q, C-22).
Ejemplo de referencia 2.2
[0043]
Figure imgf000009_0001
[0044] EIMS, m/z 471,2690 [M+Na]+; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) 55,76 (1H, d, J = 3,1 Hz, H-4), 5,57 (1H, m, H-16), 5,55 (1H, m, H-15), 5,16 (1H, t, J = 7,3 Hz, H-12), 5,15 (1H, t, J = 7,1 Hz, H-8), 3,99 (3H, s, H-24), 3,61 (3H, s, H-23), 2,52 (1H, m, H-6), 2,27 (1H, m, H-7a), 2,11 (2H, m, H-11), 2,10 (3H, s, -OAc), 2,02 (1H, m, H-7b), 2,00 (2H, m, H-10), 1,93 (1H, m, H-5), 1,59 (3H, s, H-20), 1,58 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-14), 1,57 (3H, s, H-21), 1,25 (3H, s, H-19), 1,25 (3H, s, H-18), 1,17 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-22); 13C RMN (100 MHz, CD3OD) 5 199,1 (s, C-1), 171,4 (s, -COCH3), 160,6 (s, C-3), 140,5 (d, C-16), 138,9 (s, C-2), 138,7 (s, C-9), 135,1 (s, C-13), 126,2 (d, C-15), 126,1 (d, C-12), 122,1 (d, C-8), 71,1 (s, C-17), 70,3 (d, C-4), 61,1 (q, C-23), 60,2 (q, C-24), 44,2 (d, C-5), 43,5 (t, C-14), 42,5 (d, C-6), 40,8 (t, C-10), 30,0 (q, C-18), 30,0 (q, C-19), 28,0 (t, C-7), 27,5 (t, C-11), 20,8 (q, - COCH3), 16,3 (q, C-21), 16,1 (q, C-20), 13,1 (q, C-22).
Ejemplo de referencia 2.3
[0045]
Figure imgf000009_0002
[0046] EIMS, m/z 471,26498 [M+Na]+; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) 55,77 (1H, d, J = 3,2 Hz, H-4), 5,39 (1H, td, J = 7,2, 1,2 Hz, H-16), 5,16 (1H, td, J = 7,2, 0,8 Hz, H-12), 5,16 (1H, td, J = 7,2, 0,8 Hz, H-8), 4,00 (3H, s, H-23), 3,91 (2H, s, H-18), 3,62 (3H, s, H-24), 2,53 (1H, m, H-6), 2,28 (1H, m, H-7a), 2,14 (2H, m, H-11), 2,14 (2H, m, H-15), 2,10 (3H, s, -OAc), 2,04 (1H, m, H-7b), 2,03 (2H, m, H-10), 2,03 (2H, m, H-14), 1,92 (1H, m, H-5), 1,64 (3H, s, H-19), 1,62 (3H, s, H-20), 1,58 (3H, s, H-21), 1,18 (3H, d, J = 7,2 Hz, H-22); 13C RMN (100 MHz, CD3OD) 5 199,2 (s, C-1), 171,6 (s, - COCH3), 160,8 (s, C-3), 138,9 (s, C-2), 138,8 (s, C-9), 136,0 (s, C-13), 136,0 (s, C-17), 126,7 (d, C-16), 125,7 (d, C-12), 122,2 (d, C-8), 70,5 (d, C-4), 69,1 (t, C-18), 61,3 (q, C-24), 60,4 (q, C-23), 44,4 (d, C-5), 42,6 (d, C-6), 41,0 (t, C-10), 40,7 (t, C-14), 28,1 (t, C-7), 27,6 (t, C-16), 27,5 (t, C-11), 21,0 (q, - COCH3), 16,5 (q, C-21), 16,3 (q, C-20), 13,9 (q, C-19), 13,1 (q, C-22).
Ejemplo de referencia 2.4
[0047]
Figure imgf000010_0001
AC012
[0048] EIMS, m/z 473,2846 [M+Na]+; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) 55,77 (1H, d, J = 3,2 Hz, H-4), 5,16 (1H, t, J = 7,6 Hz, H-8), 5,13 (1H, t, J = 7,2 Hz, H-12), 4,00 (3H, s, H-24), 3,62 (3H, s, H-23), 3,38 (1H, d, J = 10,2 Hz, H-18a), 3,31 (1H, d, J = 5,6 Hz, H-18b), 2,53 (1H, m, H-6), 2,26 (1H, m, H-7a), 2,13 (2H, m, H-11), 2,10 (3H, s, -OAc), 2,04 (1H, m, H-7b), 2,00 (2H, m, H-10), 1,96 (2H, m, H-14), 1,93 (1H, m, H-5), 1,60 (3H, s, H-20), 1,58 (3H, s, H-21), 1,56 (1H, m, H-17), 1,36 (2H, m, H-15), 1,06 (2H, m, H-16), 1,06 (3H, d, J = 4,8 Hz, H-22), 0,90 (3H, d, J = 6,8 Hz, H-19); 13C RMN (100 MHz, CD3OD) 5 198,9 (s, C-1), 171,3 (s, - COCH3), 160,5 (s, C-3), 138,7 (s, C-9), 138,6 (s, C-2), 136,2 (s, C-13), 125,3 (d, C-12), 122,0 (d, C-8), 70,3 (d, C-4), 68,4 (t, C-18), 61,1 (q, C-23), 60,2 (q, C-24), 44,2 (d, C-5), 42,5 (d, C-6), 41,0 (t, C-14), 40,9 (t, C-10), 36,8 (d, C-17), 34,0 (t, C-16), 28,0 (t, C-7), 27,4 (t, C-11), 26,5 (t, C-15), 20,9 (q, - COCH3), 17,2 (q, C-19), 16,4 (q, C-21), 16,0 (q, C-20), 13,2 (q, C-22).
Ejemplo de referencia 2.5
[0049]
Figure imgf000010_0002
AC011
[0050] EIMS, m/z 475,2553 [M+Na]+; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) 55,81 (1H, d, J = 3,2 Hz, H-4), 5,57 (1H, m, H-16), 5,55 (1H, m, H-15), 5,15 (1H, t, J = 6,8 Hz, H-12), 5,12 (1H, t, J = 7,2 Hz, H-8), 3,99 (3H, s, H-23), 3,62 (3H, s, H-22), 2,66 (1H, d, J = 5,2 Hz, H-14), 2,38 (2H, m, H-6), 2,09 (3H, s, -OAc), 2,05 (2H, m, H-11), 2,03 (1H, m, H-7a), 2,01 (2H, m, H-10), 1,99 (1H, m, H-7b), 1,92 (1H, m, H-5), 1,58 (3H, s, H-20), 1,58 (3H, s, H-21), 1,25 (3H, s, H-19), 1,25 (3H, s, H-18); 13C RMN (100 MHz, CD3OD) 5197,1 (s, C-1), 171,6 (s, - COCH3), 161,8 (s, C-3), 140,5 (d, C-15), 139,5 (s, C-2), 135,2 (s, C-13), 126,2 (d, C-16), 126,0 (d, C-12), 122,2 (d, C-8), 121,9 (s, C-9), 71,1 (s, C-17), 71,1 (d, C-4), 61,1 (q, C-22), 60,0 (q, C-23), 43,5 (t, C-14), 40,8 (t, C-10), 39,2 (t, C-6), 38,3(d, C-5), 30,1 (t, C-7), 30,0 (q, C-18), 30,0 (q, C-19), 27,5 (t, C-11), 20,7 (q, - COCH3), 16,3 (q, C-21), 16,2 (q, C-20).
Ejemplo de referencia 2.6
[0051]
Figure imgf000011_0001
[0052] EIMS, m/z 385,2379 [M+Na]+ ; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) 55,25 (1H, t, J = 4,3 Hz, H-12), 5,20 (1H, t, J = 4.8 Hz, H-8), 4,69 (1H, m, H-15), 4,16 (1H, q, J = 4,1 Hz, H-4), 2,73 (1H, m, H-17), 2,36 (1H, m , H-14a), 2,31 (1H, m, H-6), 2,29 (1H, m, H-7a), 2,27 (2H, m, H-3), 2,23 (1H, m, H-14b), 2,19 (1H, m, H-16a), 2,16 (2H, m, H-11), 2,08 (2H, m, H-10), 2,02 (1H, m, H-7b), 1,98 (1H, m, H-16b), 1,88 (2H, m, H-2), 1,67 (3H, s, H-20), 1,65 (3H, s, H-21), 1,41 (1H, m, H-5), 1,23 (3H, d, J = 4,9 Hz, H-19), 1,06 (3H, d, J = 4,3 Hz, H-22); 13C RMN (100 MHz, CD3OD) 5 213.8 (s, C-1), 182,7 (s, H-18), 137,9 (s, C-9), 131,8 (s, C-13), 129,3 (d, C-12), 122,7 (d, C-8), 78,8 (d, C-15), 76,2 (d, C-4), 48,6 (d, C-6), 48,2 (d, C-5), 46,0 (t, C-14), 40,6 (t, C-10), 36,6 (t, C-3), 35,7 (t, C-16), 35,1 (d, C-17), 32,9 (t, C-7), 29,6 (t, C-2), 27,5 (t, C-11), 16,5 (q, C-20), 16,3 (q, C-21), 16,0 (q, C-19), 11,8 (q, C-22).
Ejemplo 3 Modificación de sustituyente de compuestos purificados de los micelios de Antrodia camphorata
[0053] Después de la identificación de la estructura química, los compuestos purificados fueron modificados posteriormente para sustituir el sustituyente de C4 y C3. El método de modificación se describe a continuación. Los nuevos compuestos con el grupo hidroxilo (-OH) en el C4 están marcados con "H1"; los nuevos compuestos con el grupo hidroxilo en el C4 y adicionalmente el grupo dimetóxido en el C3 están marcados con "H2".
[0054] AC012 fue hidrolizado en 1 N (equivalente molar) de NaOMe (metóxido sódico) y metanol anhidro, respectivamente. Durante la hidrolización, la reacción se monitoreó por TLC (cromatografía en capa fina) hasta que se completó la reacción. Después de la finalización, se añadió Amberlite ácida para neutralizar y luego se filtró por membrana filtrante para obtener el producto intermedio.
[0055] El producto intermedio fue eluido por cromatografía de gel de sílice de fase normal, usando gel de sílice como resina de separación, gradiente de hexano y acetato de etilo como fase móvil, donde el gradiente de elución de hexano:acetato de etilo es de 4:1 a 1:1. Como el proceso de elución se monitoreó por TLC, la mezcla de productos (AC012-H1 y AC012-H2) se eluyó en una proporción aproximadamente 1:1 de la solución de gradiente, y luego se recogió y se condensó.
[0056] La purificación de producto respectivo se realizó por HPLC en fase inversa, usando una columna semipreparatoria C18 y solución de metanol: 0,1% de tampón FA (solución salina tamponada con fosfato) = 75:25 como eluyente isocrático. El tiempo de retención para recoger AC012-H1 fue de 25 a 31 minutos; el tiempo de retención para recoger AC012-H2 fue de 39 a 43 minutos.
[0057] La estructura química de AC012-H1 y AC012-H2 se muestran a continuación:
Figure imgf000012_0001
[0058] El mismo método de modificación en este ejemplo se puede aplicar a otros compuestos purificados en la presente invención para hacer la sustitución similar.
[0059] Si la entrada inicial de reactivo fue AC007, el tiempo de retención para recoger AC007-H1 fue de 36 a 43 minutos; AC007-H2, de 47 a 53 minutos.
[0060] Si la entrada inicial de reactivo fue AC009, el tiempo de retención para recoger AC009-H1 fue de 27 a 32 minutos; AC009-H2, de 35 a 40 minutos.
Ejemplo 4 Análisis de actividad antiangiogénica de las sustancias activas de los micelios de Antrodia camphorata
[0061] Se realizaron un ensayo de SRB y un ensayo de formación de tubos capilares en matrigel para evaluar el efecto antiangiogénico de los compuestos purificados.
Ensayo de SRB
[0062] Se cultivaron células progenitoras endoteliales (CPE, 5x103 células/pocillo) en placas de 96 pocillos y fueron privadas de nutrientes con medio sin suero durante 48 h. Luego las células se incubaron en medio con FBS al 10% en ausencia o presencia de varias concentraciones de AC012 (0,1,0,3, 1,3, 10 y 30 ^g/ml) durante 48 h. Después del tratamiento, el medio se descartó en primer lugar. Para fijar las células adherentes, se añadieron 100 ^l de ácido tricloroacético (10% (p/v)) a cada pocillo y se incubaron a 4 °C durante 1 hora. Entonces las placas se lavaron con agua desionizada y se secaron al aire. A cada pocillo se le añadió 50 ^l de solución de sulforrodamina B (SRB) (al 0,4% p/v en ácido acético al 1%) y se incubó durante 5 min a temperatura ambiente. Para eliminar la s Rb no unida en las placas, las placas se lavaron con ácido acético al 1 % y luego se secaron al aire. La SRB unida residual se solubilizó con 100 ^l de 10 mM de tampón de base Tris (pH 10,5), y luego se leyó usando un lector de placas de microtitulación a 495 nm.
Formación de tubos capilares en matrigel
[0063] Se añadió matrigel a placas de 15 pocillos (ibidi) en un volumen total de 10 ^l en cada pocillo. Se dejaron reposar las placas a 37 °C durante 30 min para formar una capa de gel. Después de la formación de gel, se aplicaron CPE (5 x 103 células) tratadas con o sin AC012 (0,1, 0,3, 1 ^g/ml) en presencia de VEGF (20 ng/ml) a cada pocillo, y las placas se incubaron a 37 °C durante 16 horas con CO2 al 5%. Tras la incubación, se usó el microscopio de contraste de fases invertido (Nikon, Japón) para la observación de los sujetos.
[0064] Las concentraciones inhibitorias de la proliferación celular del 50% de las CPE (IC50) fue 29 ^g/ml. En una concentración de 1 ^g/ml, el AC012 fue capaz de inhibir el 31,89% de la formación de tubos.
Ejemplo 5 Análisis de antiproliferación de las sustancias activas de los micelios de Antrodia camphorata [0065] El efecto antiangiogénico de los compuestos purificados implica el efecto antiproliferativo sobre la célula cancerosa; el ensayo de SRB se realizó para investigar adicionalmente el efecto antiproliferativo de un compuesto purificado en varias líneas celulares.
[0066] El fin del experimento in vitro es evaluar el efecto de AC006, AC007, AC009, AC011 y AC012 sobre la proliferación celular en varias líneas celulares (AC006, AC007, AC009, AC011 y AC012 no son según la invención).
[0067] Varias líneas celulares (5x103 células/pocillo) se subcultivaron sobre placas de 96 pocillos y fueron privadas de nutrientes con medio sin suero durante 48 h. Luego las células se incubaron en medio con FBS al 10% en ausencia o presencia de varias concentraciones de AC006, AC007, AC009 y AC012 (0,1, 0,3, 1, 3, 10 y 30 |jg/ml) durante 48 horas. Después del tratamiento, el medio se descartó en primer lugar. Después del tratamiento, el medio se descartó en primer lugar. Para fijar las células adherentes, se añadieron 100 j l de ácido tricloroacético (10% (p/v)) a cada pocillo y se incubó a 4 °C durante 1 hora. Entonces las placas se lavaron con agua desionizada y se secaron al aire. A cada pocillo se le añadió 50 j l de solución de sulforrodamina B (SRB) (al 0,4% p/v en ácido acético al 1%) y se incubó durante 5 min a temperatura ambiente. Para eliminar la SRB no unida en las placas, las placas se lavaron con ácido acético al 1 % y luego se secaron al aire. La SRB unida residual se solubilizó con 100 j l de 10 mM de tampón de base Tris (pH 10,5), y luego se leyó usando un lector de placas de microtitulación a 495 nm.
Ejemplo de referencia 5.1 Resultados de AC006
[0068] Siete líneas celulares de cáncer (cuatro tipos de cánceres) se usan en este experimento y las concentraciones inhibidoras del 50% de la proliferación celular (IC50) se enumeran a continuación:
Tabla 1.
Figure imgf000013_0002
Ejemplo de referencia 5.2.1 Resultados de AC007
[0069] Siete líneas celulares de cáncer (cinco tipos de cánceres) se usan en este experimento y las concentraciones inhibitorias del 50% de la proliferación celular (IC50) se enumeran a continuación:
Tabla 2
Figure imgf000013_0003
Ejemplo 5.2.2 Resultados de AC007-H1
[0070] Las concentraciones inhibitorias del 50% de la proliferación celular (IC50) se enumeran a continuación (AC007 no son según la invención):
Tabla 3
Figure imgf000013_0001
Figure imgf000014_0001
Ejemplo de referencia 5.3.1 Resultados de AC009
[0071] Diez líneas celulares de cáncer (cuatro tipos de cánceres) se usan en este experimento y las concentraciones inhibitorias del 50% de la proliferación celular (IC50) se enumeran a continuación:
Tabla 4.
Figure imgf000014_0003
Ejemplo 5.3.2 Resultados de AC009-H1
[0072] Las concentraciones inhibitorias del 50% de la proliferación celular (IC50) se enumeran a continuación (AC009 no son según la invención):
Tabla 5.
Figure imgf000014_0002
Ejemplo de referencia 5.4 Resultados de AC011
[0073] Cuatro líneas celulares de cáncer se usan en este experimento y las concentraciones inhibitorias del 50% de la proliferación celular (IC50) se enumeran a continuación:
Tabla 6.
Figure imgf000014_0004
Ejemplo de referencia 5.4.1 Resultados de AC012
[0074] Ocho líneas celulares de cáncer (cinco tipos de cánceres) se usan en este experimento y las concentraciones inhibitorias del 50% de la proliferación celular (IC50) se enumeran a continuación:
Tabla 7.
Figure imgf000015_0002
Ejemplo 5.4.2 Resultados de AC012-H1
[0075] Las concentraciones inhibitorias del 50% de la proliferación celular (IC50) se enumeran a continuación (AC012 no son según la invención):
Tabla 8.
Figure imgf000015_0001
[0076] En la presente invención, los compuestos bioactivos se purificaron a un constituyente definido y demostraron tener efectos inhibitorios sobre la angiogénesis a concentraciones muy bajas. Tal compuesto no solo se puede purificar a partir del micelio de Antrodia camphorata por fermentación líquida, sino que también se puede producir a través de la síntesis química. Este nuevo proceso puede reducir significativamente el coste de preparación y resolver el problema de la alta demanda del escaso Antrodia camphorata. La presente invención proporciona una nueva aplicación de sustancias bioactivas que van a usarse como fármacos a través de su actividad antiangiogénesis y antiproliferativa en las células altamente proliferativas, es decir, células cancerosas. Además, modificando el sustituyente, los compuestos bioactivos muestran propiedades más eficaces antiproliferativas y anticancerosas. Según el resultado de los ejemplos, el AC012-H1 muestra una eficacia extraordinaria contra las células de cáncer colorrectal, la proliferación de las cuales fue inhibida significativamente por el AC012-H1, lo que implica que la modificación del sustituyente es exitosa en el aumento de la eficacia contra las células cancerosas, especialmente las células cancerosas colorrectales, donde la característica de la línea celular HCT116 es una baja expresión de Bax (Wang et al. 2012), factor de crecimiento independiente de (TGF a y EGFR) (Howell et al. 1998). Adicionalmente, algunos compuestos muestran una eficacia excelente contra la proliferación de las células de cáncer de hígado, específicamente, Huh-7, células tumorigénicas de tipo epitelial derivadas de una persona asiática, con una mutación de HFE (Vecchi et al. 2009).
[0077] En resumen, la presente invención presenta un enfoque original para la extracción de compuestos bioactivos y además identificó sus propiedades multifuncionales en cuanto a la antiangiogénesis y la antiproliferación.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Compuesto de la fórmula AC007-H1, AC009-H1 o AC012-H1:
Figure imgf000016_0001
2. Composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer que comprende la cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto seleccionado del grupo que consiste en las siguientes fórmulas AC007-H1, AC009-H1 y AC012-H1:
Figure imgf000016_0002
Figure imgf000017_0001
o la combinación de al menos dos de los dichos compuestos, y vehículos, sales o profármacos farmacéuticamente aceptables.
3. Composición farmacéutica según la reivindicación 2, donde los vehículos incluyen excipientes, diluyentes, espesantes, productos de relleno, aglutinantes, desintegrantes, lubricantes, agentes oleaginosos o no oleaginosos, tensioactivos, agentes de suspensión, agentes gelificantes, adyuvantes, conservantes, antioxidantes, estabilizadores, agentes colorantes o mezclas de los mismos.
4. Composición farmacéutica según la reivindicación 2, donde la composición farmacéutica se formula para la inyección intravenosa, la inyección subcutánea, la administración oral o la administración tópica.
5. Composición farmacéutica según la reivindicación 2, donde la composición farmacéutica es una pastilla, una píldora, una cápsula, un líquido, una suspensión, un gel, una dispersión, una solución, una emulsión, una pomada o una loción.
6. Composición farmacéutica según la reivindicación 2 para usar en un método para el tratamiento del cáncer administrando una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica.
7. Composición farmacéutica para el uso según la reivindicación 6, donde el tratamiento del cáncer se realiza a través de la inhibición de la proliferación de las células cancerosas.
8. Composición farmacéutica para el uso según la reivindicación 6, donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en el cáncer de próstata, el cáncer de hígado, el melanoma, el cáncer cerebral y el cáncer colorrectal.
9. Composición farmacéutica para el uso según la reivindicación 6, donde el cáncer es el cáncer colorrectal y el cáncer de hígado.
10. Composición farmacéutica para el uso según la reivindicación 6, donde la composición farmacéutica se administra vía inyección intravenosa, inyección subcutánea, administración oral o administración tópica.
11. Método para obtener derivados bioactivos de sustitución de grupos hidroxilo en el C4 de los compuestos bioactivos de Antrodia camphorata por los pasos que comprenden:
la hidrolización de los compuestos bioactivos en 1 equivalente molar de metanol;
después de que se complete la hidrólisis, la adición de Amberlite acida y luego la filtración por membrana filtrante para obtener el producto intermedio;
la elución del producto intermedio por cromatografía de gel de sílice, usando gel de sílice como resina de separación, solución de gradiente de hexano y acetato de etilo como fase móvil, donde el gradiente de elución de hexano:acetato de etilo es de 4:1 a 1:1, y el producto se eluye a aproximadamente una proporción 1:1 de la solución de gradiente;
la purificación del producto por HPLC en fase inversa, usando una columna semipreparatoria C18 y solución de metanol: 0,1% de tampón FA (solución salina tamponada con fosfato) = 75:25 como eluyente isocrático para obtener los derivados bioactivos de la sustitución de grupos hidroxilo en el C4;
donde los compuestos de las fórmulas AC006, AC007, AC009, AC011 y AC012 como se representa a continuación:
Figure imgf000019_0001
5 son los compuestos bioactivos de Antrodia camphorata.
Ċ
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