JP2018507175A - 牛樟芝化合物、その製造方法及び用途 - Google Patents
牛樟芝化合物、その製造方法及び用途 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2018507175A JP2018507175A JP2017535086A JP2017535086A JP2018507175A JP 2018507175 A JP2018507175 A JP 2018507175A JP 2017535086 A JP2017535086 A JP 2017535086A JP 2017535086 A JP2017535086 A JP 2017535086A JP 2018507175 A JP2018507175 A JP 2018507175A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hexane
- silica gel
- ethyl acetate
- compound
- column chromatography
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 110
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 title claims abstract description 47
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 32
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims abstract description 11
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 11
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims abstract description 4
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 186
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 151
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 123
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 103
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 59
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 claims description 52
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 49
- 238000003820 Medium-pressure liquid chromatography Methods 0.000 claims description 33
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 31
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 29
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 23
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims description 20
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 17
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- -1 oral preparation Substances 0.000 claims description 13
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 11
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 11
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 11
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims description 10
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 10
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 claims description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 10
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 claims description 9
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 9
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 9
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 9
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 9
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 claims description 8
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 claims description 7
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 claims description 7
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 7
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 claims description 7
- 239000012264 purified product Substances 0.000 claims description 7
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 7
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 claims description 6
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 claims description 6
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 claims description 6
- 239000003826 tablet Substances 0.000 claims description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 5
- 239000002775 capsule Substances 0.000 claims description 5
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 claims description 5
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 5
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims description 5
- 239000000945 filler Substances 0.000 claims description 5
- 239000003349 gelling agent Substances 0.000 claims description 5
- 239000000049 pigment Substances 0.000 claims description 5
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 5
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 claims description 5
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 5
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 claims description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 5
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 claims description 5
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims description 4
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 4
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 claims description 3
- 239000002585 base Substances 0.000 claims description 3
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 claims description 3
- 239000003921 oil Substances 0.000 claims description 3
- 239000002674 ointment Substances 0.000 claims description 3
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 claims description 3
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 claims description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 2
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 45
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 abstract 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 58
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 31
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 20
- IOOMXAQUNPWDLL-UHFFFAOYSA-N 2-[6-(diethylamino)-3-(diethyliminiumyl)-3h-xanthen-9-yl]-5-sulfobenzene-1-sulfonate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1S([O-])(=O)=O IOOMXAQUNPWDLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 19
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 15
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 13
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 13
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 12
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 12
- 238000002451 electron ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 12
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 12
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 12
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 10
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 9
- WQDUMFSSJAZKTM-UHFFFAOYSA-N Sodium methoxide Chemical compound [Na+].[O-]C WQDUMFSSJAZKTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 8
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 8
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 8
- 241000254173 Coleoptera Species 0.000 description 7
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 6
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 6
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 230000009702 cancer cell proliferation Effects 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- SDYJYMBMSYYZIC-UHFFFAOYSA-N 7,7-dimethyl-4-methylidene-3,3a,5,6,6a,8,9,10-octahydrobenzo[h][2]benzofuran-1-one Chemical compound C=C1CCC2C(C)(C)CCCC32C(=O)OCC31 SDYJYMBMSYYZIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920002498 Beta-glucan Polymers 0.000 description 4
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-MZCSYVLQSA-N Deuterated methanol Chemical compound [2H]OC([2H])([2H])[2H] OKKJLVBELUTLKV-MZCSYVLQSA-N 0.000 description 4
- 241001486992 Taiwanofungus camphoratus Species 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 229930191713 antcin Natural products 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 4
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 4
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 4
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 4
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 4
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 3
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 3
- 238000005084 2D-nuclear magnetic resonance Methods 0.000 description 2
- 101150107995 ACA1 gene Proteins 0.000 description 2
- 0 CC(*)=C[C@](CC(N=O)=ICCC(N)=CI[C@](CN)[C@@](*)C(O*)=C(C([Cn])=O)ON)O Chemical compound CC(*)=C[C@](CC(N=O)=ICCC(N)=CI[C@](CN)[C@@](*)C(O*)=C(C([Cn])=O)ON)O 0.000 description 2
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 2
- 206010008428 Chemical poisoning Diseases 0.000 description 2
- 241000723347 Cinnamomum Species 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000004278 EU approved seasoning Substances 0.000 description 2
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 2
- 206010016952 Food poisoning Diseases 0.000 description 2
- 208000019331 Foodborne disease Diseases 0.000 description 2
- 241000222336 Ganoderma Species 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 2
- 102100031180 Hereditary hemochromatosis protein Human genes 0.000 description 2
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 2
- 101000997832 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase JAK2 Proteins 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 241000218195 Lauraceae Species 0.000 description 2
- ZWMDJBNGXKAIRO-UHFFFAOYSA-N Methyl antcinate H Natural products CC12CCC(O)C(C)C1CC(=O)C1=C2C(=O)C(O)C2(C)C(C(C)CCC(=C)C(C)C(=O)OC)CCC21 ZWMDJBNGXKAIRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 2
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 2
- 108010017324 STAT3 Transcription Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100024040 Signal transducer and activator of transcription 3 Human genes 0.000 description 2
- HATRDXDCPOXQJX-UHFFFAOYSA-N Thapsigargin Natural products CCCCCCCC(=O)OC1C(OC(O)C(=C/C)C)C(=C2C3OC(=O)C(C)(O)C3(O)C(CC(C)(OC(=O)C)C12)OC(=O)CCC)C HATRDXDCPOXQJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000006747 Transforming Growth Factor alpha Human genes 0.000 description 2
- 101800004564 Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 description 2
- 102100033444 Tyrosine-protein kinase JAK2 Human genes 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000000729 antidote Substances 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 2
- 239000012867 bioactive agent Substances 0.000 description 2
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 2
- 235000019658 bitter taste Nutrition 0.000 description 2
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 235000015218 chewing gum Nutrition 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000006184 cosolvent Substances 0.000 description 2
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 2
- LIVBXKAVLWBDCR-FRRGXQJJSA-N dehydrosulphurenic acid Natural products [H][C@@]1(C[C@H](O)[C@@]2(C)C3=CC[C@]4([H])[C@]([H])(CC[C@H](O)C4(C)C)C3=CC[C@]12C)[C@@H](CCC(=C)C(C)C)C(O)=O LIVBXKAVLWBDCR-FRRGXQJJSA-N 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 125000001891 dimethoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 229930004069 diterpene Natural products 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 2
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 2
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 2
- 235000011194 food seasoning agent Nutrition 0.000 description 2
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000002035 hexane extract Substances 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000007721 medicinal effect Effects 0.000 description 2
- 238000002705 metabolomic analysis Methods 0.000 description 2
- 230000001431 metabolomic effect Effects 0.000 description 2
- ZWMDJBNGXKAIRO-PRBDMEKXSA-N methyl antcinate H Chemical compound C([C@@]12C)C[C@@H](O)[C@@H](C)[C@@H]1CC(=O)C1=C2C(=O)[C@H](O)[C@]2(C)[C@@H]([C@H](C)CCC(=C)C(C)C(=O)OC)CC[C@H]21 ZWMDJBNGXKAIRO-PRBDMEKXSA-N 0.000 description 2
- 229930183875 methylantcinate Natural products 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 2
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 2
- 238000004305 normal phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 2
- 238000000238 one-dimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 239000004014 plasticizer Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 229930009674 sesquiterpene lactone Natural products 0.000 description 2
- 150000002107 sesquiterpene lactone derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 2
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 150000003648 triterpenes Chemical class 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- WAAWMJYYKITCGF-WTPIMUJOSA-N 5alpha-ergostane Chemical compound C([C@@H]1CC2)CCC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@H](C)CC[C@H](C)C(C)C)[C@@]2(C)CC1 WAAWMJYYKITCGF-WTPIMUJOSA-N 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- JQOAQUXIUNVRQW-UHFFFAOYSA-N hexane Chemical compound CCCCCC.CCCCCC JQOAQUXIUNVRQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011796 hollow space material Substances 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006186 oral dosage form Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 208000013223 septicemia Diseases 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
- C07C69/02—Esters of acyclic saturated monocarboxylic acids having the carboxyl group bound to an acyclic carbon atom or to hydrogen
- C07C69/12—Acetic acid esters
- C07C69/21—Acetic acid esters of hydroxy compounds with more than three hydroxy groups
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
- A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
- A61K31/22—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/06—Fungi, e.g. yeasts
- A61K36/07—Basidiomycota, e.g. Cryptococcus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C45/00—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds
- C07C45/61—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds by reactions not involving the formation of >C = O groups
- C07C45/64—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds by reactions not involving the formation of >C = O groups by introduction of functional groups containing oxygen only in singly bound form
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C45/00—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds
- C07C45/78—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C45/00—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds
- C07C45/78—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives
- C07C45/79—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives by solid-liquid treatment; by chemisorption
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C49/00—Ketones; Ketenes; Dimeric ketenes; Ketonic chelates
- C07C49/527—Unsaturated compounds containing keto groups bound to rings other than six-membered aromatic rings
- C07C49/577—Unsaturated compounds containing keto groups bound to rings other than six-membered aromatic rings containing ether groups, groups, groups, or groups
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C49/00—Ketones; Ketenes; Dimeric ketenes; Ketonic chelates
- C07C49/587—Unsaturated compounds containing a keto groups being part of a ring
- C07C49/753—Unsaturated compounds containing a keto groups being part of a ring containing ether groups, groups, groups, or groups
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C67/00—Preparation of carboxylic acid esters
- C07C67/48—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C67/00—Preparation of carboxylic acid esters
- C07C67/48—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives
- C07C67/56—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives by solid-liquid treatment; by chemisorption
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
- C07D307/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
- C07D307/26—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having one double bond between ring members or between a ring member and a non-ring member
- C07D307/30—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having one double bond between ring members or between a ring member and a non-ring member with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
- C07D307/32—Oxygen atoms
- C07D307/33—Oxygen atoms in position 2, the oxygen atom being in its keto or unsubstituted enol form
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C2601/00—Systems containing only non-condensed rings
- C07C2601/12—Systems containing only non-condensed rings with a six-membered ring
- C07C2601/16—Systems containing only non-condensed rings with a six-membered ring the ring being unsaturated
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Alternative & Traditional Medicine (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Botany (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Abstract
本発明は、牛樟芝から抽出された化合物及びその調製方法を提供する；また、本発明は、AC006、AC007、AC009、AC011、AC012、AC007-H1、AC009-H1及びAC012-H1からなるグループから選択された前記牛樟芝化合物を開示し、該化合物は肝癌、脳腫瘍、前立腺癌、乳癌、大腸癌と黒色腫を抑制する効果を有する。
Description
本発明は牛樟芝から純化された化合物、その調製方法及び用途に関する；特には該化合物が癌細胞の増殖及び血管の新生を抑制し、それにより癌を治療する効果に達することができるものを示す。
牛樟芝（Antrodia camphorata、以前はAntrodia cinnamomeaと命名された）は牛樟樹（Cinnamomum kanchirai Hayata、lauraceae）の空洞部に寄生するキノコで、台湾だけに生息するキノコである。昔から伝承医療に、樟芝は優れた解毒剤として、食物中毒や農薬中毒に適用でき、民間には肝炎や肝臓関連の病気の治療に用いる。樟芝は高度な薬用価値があり、栽培しにくくて成長は遅い原因で、今まで樟芝に対するゲノミクス及びメタボロミクスは研究され（Lu et al. 2014 PNAS、Lin et al. 2011 J Agr Food Chem）、それで牛樟芝の医薬用途及び栽培方法をもっと認識することを狙っている。
牛樟芝には高分子の多糖類と小分子のトリテルペン類化合物などの多種類の生物活性を有する物質が薬物として利用できる。そのうち多糖類は様々な単糖が結合したもので存在し、スペクトルで分析すると多糖類は1,3- β‐D‐グルカン（1,3-β-D-glucan）という成分を有することが分かる。報道された牛樟芝多糖にある多種類の医療用途は、血管新生を抑制すること（Yang et al. 2009 J Ethnopharmacol、Cheng et al. 2005 Life Sci）、免疫を抑制すること（Meng et al. 2012 Nutrition）、免疫反応を調節し且つ喘息を抑制すること（Liu et al. 2010 Immunology）、B型肝炎ウイルスを抑制すること（Lee et al. 2002 FEMS Microbiol Lett）、癌細胞の成長を抑制すること（Liu et al. 2004 Toxicol Appl Pharmacol、Lee et al. 2014 Food Funct）などを含む；更にアントロダン（antrodan）は、牛樟芝から抽出された糖タンパク質（glycoprotein、protein-bound polysaccharide）で、肝臓が受ける損傷を避ける機能を有する（Ker et al. 2014 PLoS ONE、TW500628、US 7763723）。
また、トリテルペン類化合物（Triterpenoids）は牛樟芝の主要な医薬用化合物であり、牛樟芝にある苦味の主な根源でもある。初期にはCherng et al.がエルゴスタン（ergostane）である三種類の新型なトリテルペン類化合物：antcins A-C(Ｃherng et al.1995 J Nat Prod)、及び四種類の新型なトリテルペン類化合物：antcins E-F、methyl antcinate G、methyl antcinate H(Cherng et al. 1996 Phytochemistry)を開示した。その後何十種類のトリテルペン類化合物には、癌細胞の成長を抑制すること（Wu et al. 2010 J Nat Prod）、免疫反応を抑制すること（Liaw et al. 2013 J Nat Prod）、肝癌や肝炎を治療すること（Lien et al. 2014 Molecules）、疲労を抵抗すること（Huang et al. 2012 Evid Based Complement Altern Med）などを含む医療効果があると報道された。
米国特許申請US7109232には牛樟芝から純化された五種類の新型な化合物及びその用途が開示され、その用途は炎症及び腫瘍への抵抗を含む；US7732482には前記化合物が器官線維症を抑制する効果を有することが開示された。US7342137には、多種類の癌細胞の成長を抑制する効果を有する新型な牛樟芝化合物グループが開示された。US7745647には子実体から分離した新型なジテルペン類化合物が開示され、それは神経細胞を保護する効果を有する。US7994158には牛樟芝から純化されたデヒドロスルフレン酸（dehydrosulphurenic acid）が開示され、それは腫瘍細胞、特に白血病や膵癌を抑制する効果を有する。US7531627には分子量が29ｋDaである新型な牛樟芝タンパク質ACA1が開示され、それは免疫を促進する効果及び癌を治療する潜在力を有する。
牛樟芝の癌を抑制するメカニズムは化合物の化学構造によって異なっている。Yeh et al.はセスキテルペンラクトンアントロシン（sesquiterpene lactone antrocin）がJAK２／STAT３のメッセージ伝送経路を抑制でき、それによりアポトーシス（apoptosis）を誘発することを報道した（Yeh et al. 2013 Carcinogenesis）；Yang et al.は牛樟芝でHER-2／neuのメッセージ伝送を抑制するほか、卵巣癌を抑制できることを報道した（Yang et al. 2013 J Ethnopharmacol）；Wang et al.はアントロキノノールD（antroquinonol D）がDNAを脱メチル化にすることができ、且つ癌を抑制する潜在力を有することを報道した（Wang et al. 2014 J Agric Food Chem）。
要約すると、牛樟芝は抗癌の潜在力を有する物質を含み、多種類の癌に対して治療効果があることがすでに検証されたが、まだ新型な化合物が存在しているかどうか、及びどんな化合物が抗癌効果を有するかということについてはほとんど知られていない。もしも牛樟芝から新型な化合物を純化する上、その構造と効果を分析できれば、癌の治療に応用でき、新薬の開発にも役に立つ。
本発明の目的は、AC007-H1化合物を提供することであり、該化合物は下記に示された：
本発明のもう一つの目的は、AC009-H1化合物を提供することであり、該化合物は下記に示された：
本発明のもう一つの目的は、AC012-H1化合物を提供することであり、該化合物は下記に示された：
本発明はまた癌を治療するための医薬組成物を提供し、それには治療に有効な量の化合物、及び少なくとも一種類の薬学的に許容されるキャリア、塩類、やプロドラッグが含まれ、該化合物はAC006、AC007、AC009、AC011、AC012、AC007-H1、AC009-H1及びAC012-H1からなるグループから選択されるか、又は前記化合物の少なくとも二つから任意に組み合わせ得る。
そのうち、該キャリアは賦形剤、希釈剤、増粘剤、充填剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、油性や非油性の基剤、界面活性剤、懸濁化剤、ゲル化剤、補助剤、防腐剤、酸化防止剤、安定剤、色素や香料を含む。
そのうち、該医薬組成物は癌細胞の増殖を抑制することで治療する。
そのうち、該医薬組成物は静脈注射、皮下注射、経口、や塗抹の方法で患者に投与する。
そのうち、該医薬組成物は溶液、乳剤、懸濁剤、粉末、錠剤、油剤、軟膏剤、経口剤、カプセルを含む剤形をする。
本発明はまた癌を治療する方法を提供し、有効な量の医薬組成物を投与し、該医薬組成物は治療に有効な量の前記化合物を含む。
そのうち、該癌は前立腺癌、肝癌、黒色腫、脳腫瘍、大腸癌からなるグループから選択される。
そのうち、比較的に良い実施様態には、該がんが大腸癌と肝癌である。
そのうち、該医薬組成物は静脈注射、皮下注射、経口や塗抹の方法で患者に投与する。
本発明は更に牛樟芝菌糸体で生物活性を有する化合物及びその誘導体を調製する方法を提供し、それは以下のステップを含む：
牛樟芝菌糸体をｎ-ヘキサンで二回に還流抽出し、それぞれ一時間から三時間まで行った後、二回の抽出液を混合して濾過する；
７０−３２０ウェルのシリカゲル（silica gel）（７０−２３０ｍesh）を取り菌糸体と１：１（ｗ／ｗ）の重量比でカラムに充填し、ｎ-Hexane／酢酸エチル（Ethyl acetate）の勾配で溶出し、溶出物はF1、F2とF3という割合に分けられ、それぞれの勾配は１７−２２％のEthyl acetate、２３−２７％のEthyl acetate及び２８−３３％のEthyl acetateであり、F3を保持時間（retention time）の順序に基づいて三つの段階F3-1~F3-3に分ける；
F3-1を取って移動相であるジクロロメタン／アセトン（CH2Cl2/Acetone）を用いて、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し（極性は50：1から20：1まで勾配溶出する）、40：1−15：1という段階を取り、更に順相MPLCでカラムを半分取しｎ-Hexane／Ethyl acetate（4：1）で分離純化してから化合物AC006を得る；
F3-2を順相MPLCシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、移動相であるCH2Cl2/Acetoneを用いて勾配分離し（100％：0％ to 70%:30%）、95％:5％から85％:15％までの段階を取ってF3-2-1からF3-2-3まで三つの段階に分ける；
F3-2-3を更に分離純化し、移動相であるn-hexane/Acetoneを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し（100%:0% to 0%:100%）、n-hexane/Acetone=90/10から70/30までの段階を取って移動相であるn-hexane/Acetoneを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し続けて（100%:0% to 0%:100%)、n-hexane/Ethyl acetate=60/40にAC007を得る；
F-3-3を順相MPLCシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、移動相であるCH2Cl2/Acetoneを用いて勾配溶出分離し（100％：0％ to 0%:100%）、90％:10％から70％:30％までの段階を取ってF3-3-1からF3-3-5まで五つの段階に分ける；F-3-3-5（CH2Cl2/Acetone=73/27の段階）を更に分離純化し、移動相であるn-hexane/Acetoneを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離して（95%:5% to 50%:50%）、85%:15% to 70%:30%段階を取ってF3-3-5-1からF3-3-5-5まで五つの段階に分ける；
F3-3-5-1（n-hexane/Acetone=90/10-80/20）を更に逆相MPLC C-18カラムクロマトグラフィーで分離純化し、移動相である1％のメタノール／Methanol＝35％／65％から20％／80％まで勾配溶出し、28%/72%-22%/78%の段階を取って移動相であるn-hexane/Ethyl acetate=80%:20%から50%:50%までシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し、n-hexane/Ethyl acetate=75%:25%-65%:35%にAC012を得る；
F3-3-5-3を更に逆相MPLC C-18シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離純化し、移動相である1％のメタノール／Methanol＝25／75などの勾配で15ｍL／minの流速で溶出し、AC009が主とする段階（保持時間は130‐170min）を取って更に純化し、移動相であるCH2Cl2/Ethyl acetateを用いて（silica gel）シリカゲルカラムクロマトグラフィーで勾配溶出し（90%:0% to 0%:100%）、CH2Cl2/Ethyl acetate=80%/20%- 60%/40%にAC009を得る；
F3-3-5-4（n-hexane/Acetone=76/24)を取って逆相MPLC C-18カラムクロマトグラフィーで分離純化し、移動相である1％のメタノール／Methanol＝25％:75％などまで勾配溶出し、純化産物はAC011である；
ここにおいて、該AC006、AC007、AC009、AC011、AC012はすなわち生物活性を有する化合物である。
牛樟芝菌糸体をｎ-ヘキサンで二回に還流抽出し、それぞれ一時間から三時間まで行った後、二回の抽出液を混合して濾過する；
７０−３２０ウェルのシリカゲル（silica gel）（７０−２３０ｍesh）を取り菌糸体と１：１（ｗ／ｗ）の重量比でカラムに充填し、ｎ-Hexane／酢酸エチル（Ethyl acetate）の勾配で溶出し、溶出物はF1、F2とF3という割合に分けられ、それぞれの勾配は１７−２２％のEthyl acetate、２３−２７％のEthyl acetate及び２８−３３％のEthyl acetateであり、F3を保持時間（retention time）の順序に基づいて三つの段階F3-1~F3-3に分ける；
F3-1を取って移動相であるジクロロメタン／アセトン（CH2Cl2/Acetone）を用いて、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し（極性は50：1から20：1まで勾配溶出する）、40：1−15：1という段階を取り、更に順相MPLCでカラムを半分取しｎ-Hexane／Ethyl acetate（4：1）で分離純化してから化合物AC006を得る；
F3-2を順相MPLCシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、移動相であるCH2Cl2/Acetoneを用いて勾配分離し（100％：0％ to 70%:30%）、95％:5％から85％:15％までの段階を取ってF3-2-1からF3-2-3まで三つの段階に分ける；
F3-2-3を更に分離純化し、移動相であるn-hexane/Acetoneを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し（100%:0% to 0%:100%）、n-hexane/Acetone=90/10から70/30までの段階を取って移動相であるn-hexane/Acetoneを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し続けて（100%:0% to 0%:100%)、n-hexane/Ethyl acetate=60/40にAC007を得る；
F-3-3を順相MPLCシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、移動相であるCH2Cl2/Acetoneを用いて勾配溶出分離し（100％：0％ to 0%:100%）、90％:10％から70％:30％までの段階を取ってF3-3-1からF3-3-5まで五つの段階に分ける；F-3-3-5（CH2Cl2/Acetone=73/27の段階）を更に分離純化し、移動相であるn-hexane/Acetoneを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離して（95%:5% to 50%:50%）、85%:15% to 70%:30%段階を取ってF3-3-5-1からF3-3-5-5まで五つの段階に分ける；
F3-3-5-1（n-hexane/Acetone=90/10-80/20）を更に逆相MPLC C-18カラムクロマトグラフィーで分離純化し、移動相である1％のメタノール／Methanol＝35％／65％から20％／80％まで勾配溶出し、28%/72%-22%/78%の段階を取って移動相であるn-hexane/Ethyl acetate=80%:20%から50%:50%までシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し、n-hexane/Ethyl acetate=75%:25%-65%:35%にAC012を得る；
F3-3-5-3を更に逆相MPLC C-18シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離純化し、移動相である1％のメタノール／Methanol＝25／75などの勾配で15ｍL／minの流速で溶出し、AC009が主とする段階（保持時間は130‐170min）を取って更に純化し、移動相であるCH2Cl2/Ethyl acetateを用いて（silica gel）シリカゲルカラムクロマトグラフィーで勾配溶出し（90%:0% to 0%:100%）、CH2Cl2/Ethyl acetate=80%/20%- 60%/40%にAC009を得る；
F3-3-5-4（n-hexane/Acetone=76/24)を取って逆相MPLC C-18カラムクロマトグラフィーで分離純化し、移動相である1％のメタノール／Methanol＝25％:75％などまで勾配溶出し、純化産物はAC011である；
ここにおいて、該AC006、AC007、AC009、AC011、AC012はすなわち生物活性を有する化合物である。
ここにおいて、比較的良い実施様態には、該生物活性を有する化合物を更にC4がヒドロキシル基である誘導体の調製に用いられるが、下記ステップを含む：
１モル当量のメタノールで該生物活性を有する化合物を加水分解させる；
加水分解反応が終わった後アンバライト樹脂を加えて濾紙で濾過した後中間産物を得る；
シリカゲルカラムクロマトグラフィーで該中間産物を分離し、n-ヘキサンと酢酸エチルを移動相とし、勾配比例をn-ヘキサンと酢酸エチル4:1から1:1までとして、勾配比例が1:1である時点に産物を収集する；
該産物を逆相HPLC及びC18によりカラムを半取分し純化し、メタノール／FAバッファで75:25で勾配溶出し、C4がヒドロキシル基である誘導体を得ることができる。
また、本発明は血管の新生と癌細胞の増殖を抑制する組成物を提供し、それは上記牛樟芝抗生物質、適当な希釈剤、賦形剤を含み、該組成物は高い増殖能力を持つ細胞の増殖を抑制できる。
１モル当量のメタノールで該生物活性を有する化合物を加水分解させる；
加水分解反応が終わった後アンバライト樹脂を加えて濾紙で濾過した後中間産物を得る；
シリカゲルカラムクロマトグラフィーで該中間産物を分離し、n-ヘキサンと酢酸エチルを移動相とし、勾配比例をn-ヘキサンと酢酸エチル4:1から1:1までとして、勾配比例が1:1である時点に産物を収集する；
該産物を逆相HPLC及びC18によりカラムを半取分し純化し、メタノール／FAバッファで75:25で勾配溶出し、C4がヒドロキシル基である誘導体を得ることができる。
また、本発明は血管の新生と癌細胞の増殖を抑制する組成物を提供し、それは上記牛樟芝抗生物質、適当な希釈剤、賦形剤を含み、該組成物は高い増殖能力を持つ細胞の増殖を抑制できる。
本明細書に使用するあらゆる技術性及び科学専門用語は、別に定義されたものを除いて、全部当業者が理解できる共通的意味を持つ。本発明は下記実施例で説明されるが、それらの例に限られない。別に説明されるものを除き、本発明が使用する材料は全部市販されて取得しやすく、下記はただ取得できるルートの例を示す。
専門用語「治療」、「治療に用いる」及びそれに類似する用語は患者が患っている診断可能な病気及び該病気による相関的な病症を遅延、改善、削減、や逆転する方法及び該病気やそれが属するいずれかの病症を予防する方法を指す。
専門用語「薬学的に許容される」とは物質や組成物がその薬学的な製剤にあるほかの成分と相容れるべきる上、患者の病症を悪化させない意味をする。
本発明が提供する化合物や組成物は当業者に知られている技術で、本発明が提供する化合物や組成物を、少なくとも一種類の薬学的に許容されるキャリア（vehicle）と結合し、本発明の組成物に適用する剤形を調製できるものを指す。ここにおいて該剤形は溶液、乳剤、懸濁液、粉末、錠剤、経口剤、タブレット、チューインガム、カプセル及びほかの類似物や本発明に適用する剤形を含むがそれらに限るわけではない。
専門用語「薬学的に許容されるキャリア」は下記から選択される一種類や多種類のタイプを含む：溶剤、乳化剤、懸濁剤、分解剤、結合剤、賦形剤、安定化剤、キレート剤、希釈剤、ゲル化剤、防腐剤、潤滑剤、界面活性剤及びほかの類似物や本発明に適用するキャリア。
前記組成物において、また需要によって一種類や多種類の上記製剤分野で通常に使用する溶解補助剤、緩衝剤、着色剤、調味剤などを適切に添加できる。
専門用語「薬学的に許容される賦形剤」はポリマー、樹脂、可塑剤、充填剤、潤滑剤、希釈剤、結合剤、崩壊剤、溶媒、共溶媒、界面活性剤、防腐剤、甘味剤、香味剤、医薬グレードの染料や顔料、及び増粘剤の少なくとも一つを含むがそれらに限られない。
専門用語「医薬組成物」は固体や液体組成物を指し、それは患者に投与しやすい適切な形式、濃度と純度をし、投与された後、ほしい生理的変化を誘発できる；医薬組成物は無菌及び／又は非発熱性のもの（non-pyrogenic）である。
専門用語「有効な量」は予期の生体反応を生成し、引き起こす必要な使用量を指すが、治癒する必要な定量ではない。当業者には理解でき、医薬組成物の有効な量が下記原因で変化する可能性はある：希望の生物終点、予定に提供する生物活性剤、カプセル化マトリックス（encapsulating matrix）の組成、目的組織など。
実施例1 牛樟芝化合物の調製
牛樟芝の液体発酵菌糸体をｎ−ヘキサン（n-hexane）で二回還流（reflux）させ、各回は１−３時間行う；排気し濾過した後、二回のn-hexane抽出液を合併する；７０−２３０ウェルのシリカゲル（silica gel）（７０‐２３０mesh）を取って菌糸体と１：１（ｗ／ｗ）の重量比でカラムに充填し、n-Hexane／酢酸エチル（Ethyl acetate）で勾配溶出し、溶出物はF1、F2とF3の三層に分けられ（fraction）、勾配はそれぞれ17-22%のEthyl acetate、23-27%のEthyl acetate及び28-33%のEthyl acetateで、F3を保持時間（retention time）の順序によって三つの段階F3-1~F3-3に分ける。
F3-1を取って移動相であるジクロロメタン／アセトン（CH2Cl2/Acetone）を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し（極性が５０：１から２０：１まで勾配溶出する）、４０：１−１５：１の段階を取り、順相HPLC（Medium pressure liquid chromatography）でカラムを半取分し純化しn-Hexane / Ethyl acetate （４：１）で分離純化して化合物AC006を得る。
F3-2を順相MPLC（Medium pressure liquid chromatography）シリカゲルカラムクロマトグラフィーで、移動相であるCH2Cl2/ Acetoneで勾配分離し（100%:0% to 70%: 30%）、95％：5％から85％：15％までの段階を取り三つの段階に分ける；F3-2-3を更に分離純化し、移動相であるn-hexane/Acetoneを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し（100%:0% to 0%:100%）、n-hexane/Acetone=90/10から70/30までの段階を取って移動相であるn-hexane/Ethyl acetateを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し（100%:0% to 0%:100%）n-hexane/Ethyl acetate=60/40にAC007を得る。
F-3-3を順相MPLCシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて、移動相であるCH2Cl2/ Acetoneで勾配分離し（100%:0% to 0%: 100%）、90％：10％から70％：30％までの段階を取り五つの段階に分ける；F-3-3-5(CH2Cl2/Acetone=73/27の段階)を更に分離純化し、移動相であるn-hexane/Acetoneを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し（95％：5％ to 50％：50％）、85%:15%から70%:30%までの段階を取って五つの段階に分ける；F3-3-5-1（n-hexane/Acetone=90/10-80/20）を取り逆相MPLC C-18カラムクロマトグラフィーで更に分離純化し、移動相である１％のメタノール水溶液/ Methanol=35％/65％から20％/80％を勾配として、28％/72％−22％/78％の段階を取って更に移動相である n-hexane/Ethyl acetate=80%:20%から50％/50％までシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し、n-hexane/Ethyl acetate=75%:25%-65%:35%にAC012を得る。
F3-3-5-3を取って逆相（reverse phase）MPLC C-18カラムクロマトグラフィーで分離純化し、移動相である１％のメタノール水溶液/ Methanol=25/75を用いて１５ml/minの流速で勾配（isocratic）溶出し、AC009を主とする段階（保持時間は１３０−１７０min）を取って更に純化し、移動相であるCH2Cl2/Ethyl acetate以（silica gel）シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離して勾配溶出し（90%:0% to 0%:100%）、CH2Cl2/Ethyl acetate=80%/20%- 60%/40%にAC009を得る。
F3-1を取り逆相MPLC C-18シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離純化し、移動相である１％のメタノール水溶液/ Methanol=25%/75%を用いて１５ml/minの流速で勾配溶出し、純化産物はAC-05-01である。
F3-3-5-4（n-hexane/Acetone=76/24）を取り逆相MPLC C-18シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離純化し、移動相である１％のメタノール水溶液/ Methanol=25%/75%を用いて１５ml/minの流速で勾配溶出し、純化産物はAC011。
ここにおいて該抽出物はAC006、AC007、AC009、AC011、AC012すなわち牛樟芝にある抗がん活性を有する化合物。
実施例２ 牛樟芝化合物の化学構造に対する分析
前記抽出された化合物は、スペクトル分析でその化学構造を識別し、１D/２D NMR及び質量分析計の使用が含まれる。該化合物の構造分析結果は下記のとおりである：
実施例２．１
EIMS, m/z 471.2701 [M+Na]+; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 5.77 (1H, d, J = 3.2 Hz, H-4), 5.18 (1H, t, J = 5.6 Hz, H-12), 5.16 (1H, t, J = 6.4 Hz, H-8), 5.11 (1H, dt, J = 1.6, 8.8 Hz, H-16), 4.43 (1H, q, J=6.8, H-15), 4.00 (3H, s, H-24), 3.62 (3H, s, H-23), 2.53 (1H, m, H-6), 2.29 (1H, m, H-7a), 2.24 (2H, m, H-14), 2.11 (2H, m, H-11), 2.10 (3H, s, -OAc), 2.08 (1H, m, H-10a), 2.02 (1H, m, H-7b), 1.94 (1H, m, H-10b), 1.92 (1H, m, H-5), 1.71 (3H, d, J = 1.2 Hz, H-18), 1.66 (3H, d, J = 1.2 Hz, H-19), 1.64 (3H, s, H-20), 1.58 (3H, s, H-21), 1.18 (3H, d, J = 6.8 Hz, H-22); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ 199.2 (s, C-1), 171.6 (s, - COCH3), 160.7 (s, C-3), 138.9 (s, C-2), 138.8 (s, C-9), 134.9 (s, C-17), 132.9 (s, C-13), 129.6 (d, C-16), 128.4 (d, C-12), 122.2 (d, C-8), 70.4 (d, C-4), 68.1 (d, C-15), 61.2 (q, C-23), 60.4 (q, C-24), 49.2 (t, C-14), 44.4 (d, C-5), 42.6 (d, C-6), 40.9 (t, C-10), 28.1 (t, C-7), 27.6 (t, C-11), 26.1 (q, C-18), 21.0 (q, - COCH3), 18.5 (q, C-19), 16.8 (q, C-20), 16.5 (q, C-21), 13.3 (q, C-22).
実施例２．２
EIMS, m/z 471.2690 [M+Na]+; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 5.76 (1H, d, J = 3.1 Hz, H-4), 5.57 (1H, m, H-16), 5.55 (1H, m, H-15), 5.16 (1H, t, J = 7.3 Hz, H-12), 5.15 (1H, t, J = 7.1 Hz, H-8), 3.99 (3H, s, H-24), 3.61 (3H, s, H-23), 2.52 (1H, m, H-6), 2.27 (1H, m, H-7a), 2.11 (2H, m, H-11), 2.10 (3H, s, -OAc), 2.02 (1H, m, H-7b), 2.00 (2H, m, H-10), 1.93 (1H, m, H-5), 1.59 (3H, s, H-20), 1.58 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-14), 1.57 (3H, s, H-21), 1.25 (3H, s, H-19), 1.25 (3H, s, H-18), 1.17 (3H, d, J = 7.0 Hz, H-22); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ 199.1 (s, C-1), 171.4 (s, - COCH3), 160.6 (s, C-3), 140.5 (d, C-16), 138.9 (s, C-2), 138.7 (s, C-9), 135.1 (s, C-13), 126.2 (d, C-15), 126.1 (d, C-12), 122.1 (d, C-8), 71.1 (s, C-17), 70.3 (d, C-4), 61.1 (q, C-23), 60.2 (q, C-24), 44.2 (d, C-5), 43.5 (t, C-14), 42.5 (d, C-6), 40.8 (t, C-10), 30.0 (q, C-18), 30.0 (q, C-19), 28.0 (t, C-7), 27.5 (t, C-11), 20.8 (q, - COCH3), 16.3 (q, C-21), 16.1 (q, C-20), 13.1 (q, C-22).
実施例２．３
EIMS, m/z 471.26498 [M+Na]+; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 5.77 (1H, d, J = 3.2 Hz, H-4), 5.39 (1H, td, J = 7.2, 1.2 Hz, H-16), 5.16 (1H, td, J = 7.2, 0.8 Hz, H-12), 5.16 (1H, td, J = 7.2, 0.8 Hz, H-8), 4.00 (3H, s, H-23), 3.91 (2H, s, H-18), 3.62 (3H, s, H-24), 2.53 (1H, m, H-6), 2.28 (1H, m, H-7a), 2.14 (2H, m, H-11), 2.14 (2H, m, H-15), 2.10 (3H, s, -OAc), 2.04 (1H, m, H-7b), 2.03 (2H, m, H-10), 2.03 (2H, m, H-14), 1.92 (1H, m, H-5), 1.64 (3H, s, H-19), 1.62 (3H, s, H-20), 1.58 (3H, s, H-21), 1.18 (3H, d, J = 7.2 Hz, H-22); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ 199.2 (s, C-1), 171.6 (s, - COCH3), 160.8 (s, C-3), 138.9 (s, C-2), 138.8 (s, C-9), 136.0 (s, C-13), 136.0 (s, C-17), 126.7 (d, C-16), 125.7 (d, C-12), 122.2 (d, C-8), 70.5 (d, C-4), 69.1 (t, C-18), 61.3 (q, C-24), 60.4 (q, C-23), 44.4 (d, C-5), 42.6 (d, C-6), 41.0 (t, C-10), 40.7 (t, C-14), 28.1 (t, C-7), 27.6 (t, C-16), 27.5 (t, C-11), 21.0 (q, - COCH3), 16.5 (q, C-21), 16.3 (q, C-20), 13.9 (q, C-19), 13.1 (q, C-22).
実施例２．４
EIMS, m/z 473.2846 [M+Na]+; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 5.77 (1H, d, J = 3.2 Hz, H-4), 5.16 (1H, t, J = 7.6 Hz, H-8), 5.13 (1H, t, J = 7.2 Hz, H-12), 4.00 (3H, s, H-24), 3.62 (3H, s, H-23), 3.38 (1H, d, J = 10.2 Hz, H-18a), 3.31 (1H, d, J = 5.6 Hz, H-18b), 2.53 (1H, m, H-6), 2.26 (1H, m, H-7a), 2.13 (2H, m, H-11), 2.10 (3H, s, -OAc), 2.04 (1H, m, H-7b), 2.00 (2H, m, H-10), 1.96 (2H, m, H-14), 1.93 (1H, m, H-5), 1.60 (3H, s, H-20), 1.58 (3H, s, H-21), 1.56 (1H, m, H-17), 1.36 (2H, m, H-15), 1.06 (2H, m, H-16), 1.06 (3H, d, J = 4.8 Hz, H-22), 0.90 (3H, d, J = 6.8 Hz, H-19); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ 198.9 (s, C-1), 171.3 (s, - COCH3), 160.5 (s, C-3), 138.7 (s, C-9), 138.6 (s, C-2), 136.2 (s, C-13), 125.3 (d, C-12), 122.0 (d, C-8), 70.3 (d, C-4), 68.4 (t, C-18), 61.1 (q, C-23), 60.2 (q, C-24), 44.2 (d, C-5), 42.5 (d, C-6), 41.0 (t, C-14), 40.9 (t, C-10), 36.8 (d, C-17), 34.0 (t, C-16), 28.0 (t, C-7), 27.4 (t, C-11), 26.5 (t, C-15), 20.9 (q, - COCH3), 17.2 (q, C-19), 16.4 (q, C-21), 16.0 (q, C-20), 13.2 (q, C-22).
実施例２．５
EIMS, m/z 475.2553 [M+Na]+; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 5.81 (1H, d, J = 3.2 Hz, H-4), 5.57 (1H, m, H-16), 5.55 (1H, m, H-15), 5.15 (1H, t, J = 6.8 Hz, H-12), 5.12 (1H, t, J = 7.2 Hz, H-8), 3.99 (3H, s, H-23), 3.62 (3H, s, H-22), 2.66 (1H, d, J = 5.2 Hz, H-14), 2.38 (2H, m, H-6), 2.09 (3H, s, -OAc), 2.05 (2H, m, H-11), 2.03 (1H, m, H-7a), 2.01 (2H, m, H-10), 1.99 (1H, m, H-7b), 1.92 (1H, m, H-5), 1.58 (3H, s, H-20), 1.58 (3H, s, H-21), 1.25 (3H, s, H-19), 1.25 (3H, s, H-18); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ 197.1 (s, C-1), 171.6 (s, - COCH3), 161.8 (s, C-3), 140.5 (d, C-15), 139.5 (s, C-2), 135.2 (s, C-13), 126.2 (d, C-16), 126.0 (d, C-12), 122.2 (d, C-8), 121.9 (s, C-9), 71.1 (s, C-17), 71.1 (d, C-4), 61.1 (q, C-22), 60.0 (q, C-23), 43.5 (t, C-14), 40.8 (t, C-10), 39.2 (t, C-6), 38.3(d, C-5), 30.1 (t, C-7), 30.0 (q, C-18), 30.0 (q, C-19), 27.5 (t, C-11), 20.7 (q, - COCH3), 16.3 (q, C-21), 16.2 (q, C-20).
実施例２．６
EIMS, m/z 385.2379 [M+Na]+; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 5.25 (1H, t, J = 4.3 Hz, H-12), 5.20 (1H, t, J = 4.8 Hz, H-8), 4.69 (1H, m, H-15), 4.16 (1H, q, J = 4.1 Hz, H-4), 2.73 (1H, m, H-17), 2.36 (1H, m , H-14a), 2.31 (1H, m, H-6), 2.29 (1H, m, H-7a), 2.27 (2H, m, H-3), 2.23 (1H, m, H-14b), 2.19 (1H, m, H-16a), 2.16 (2H, m, H-11), 2.08 (2H, m, H-10), 2.02 (1H, m, H-7b), 1.98 (1H, m, H-16b), 1.88 (2H, m, H-2), 1.67 (3H, s, H-20), 1.65 (3H, s, H-21), 1.41 (1H, m, H-5), 1.23 (3H, d, J = 4.9 Hz, H-19), 1.06 (3H, d, J = 4.3 Hz, H-22); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ 213.8 (s, C-1), 182.7 (s, H-18), 137.9 (s, C-9), 131.8 (s, C-13), 129.3 (d, C-12), 122.7 (d, C-8), 78.8 (d, C-15), 76.2 (d, C-4), 48.6 (d, C-6), 48.2 (d, C-5), 46.0 (t, C-14), 40.6 (t, C-10), 36.6 (t, C-3), 35.7 (t, C-16), 35.1 (d, C-17), 32.9 (t, C-7), 29.6 (t, C-2), 27.5 (t, C-11), 16.5 (q, C-20), 16.3 (q, C-21), 16.0 (q, C-19), 11.8 (q, C-22).
実施例３ 牛樟芝化合物の置換基修飾
前記牛樟芝化合物の化学構造を分析した後、そのC3とC4置換基を修飾する；その置換基で改造された産物がC4に水酸基（−OH）で置換されたものは、H1で標識される；その置換基で改造された産物がC4に水酸基で置換され且つC4にジメトキシ（dimethoxy）で置換されたものは、H2で標識される。
１モル当量のNaOMe （Sodium methoxide)及び無水エタノールを溶剤としてAC012を加水分解反応させる。加水分解プロセスをTLC(thin layer chromatography)で監視測定し、完全に反応した後アンバーライト樹脂（amberlite）を加えて中和反応させ、またamberliteを濾紙で濾過した後中間産物を得る。
該中間産物を順相システムを利用してシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分析し、シリカゲルで樹脂を分離し、hexane/ethyl acetateを流動相とし、溶出比例はhexane:ethyl acetate=4:1から1:1まで、溶出プロセスをTLCで監視測定し、AC012-H1とAC012-H2の混合物はhexane:ethyl acetate=1:1である時点に溶出され、それを収集して濃縮し、濃縮された産物を得る。
濃縮された該産物を逆相HPLCで最後に純化し、C18でステンレス製カラムを半分取し、移動相であるエタノール：0.1％のリン酸緩衝生理食塩水（phosphate buffered saline）＝75：25を用いて単一比例で溶出する。
AC012-1の保持時間（retention time）は約31minから25minまで；AC012-H2は39minから43minまで。
AC012-1の保持時間（retention time）は約31minから25minまで；AC012-H2は39minから43minまで。
AC012-H1及びAC012-H2の化学構造は下記に示すように：
AC012-H1
同じ置換基の加水分解方法は本発明が提供する他の牛樟芝化合物にも適用できる。
AC012-H1
初期半応物がAC007であれば、AC007-H1の保持時間は36‐43min；AC007-H2の保持時間は47‐53min。
初期反応物がAC009であれば、AC009-H1の保持時間は27‐32min；AC009-H2の保持時間は35‐40min。
実施例４ 牛樟芝化合物が血管新生を抑制する効果
本発明はSR8試験及び血管形成試験（matrigel capillary tube formation assay）を使用し、牛樟芝から純化される化合物が血管新生を抑制する効果を分析する。
SRB試験はヒト内皮前駆細胞（EPC、endothelial progenitor cells）を5*103の細胞/培養皿ウェル（cell/well）の数量比例で96ウェルの培養皿に置き、且つそれを無血清（serum free）の培地に置かせて48時間飢餓状態にさせた後、10％のFBS培地及び異なる濃度のAC012に入れて48時間培養し、AC012の濃度はそれぞれ0.1、0.3、1、3、10と30マイクログラム/ミリリットル（μg/ml）。処理薬物で培養した後の培地を取り出して、培養皿のウェルに100マイクロリットル（μl）10％のトリクロロ酢酸（trichloroacetic acid）（ｗ/ｖ）を加え、4℃で1時間放置することで細胞を固定する。培養皿を脱イオン水で洗浄して乾燥する。それぞれのウェルに50マイクロリットル0.4％のSulforhodamine B (SRB) (w/v)（また1％の酢酸を含む）を加えて室温で5min放置し、次に1％の酢酸で細胞と結合しないSRBを洗浄してから乾燥する。細胞と結合したSRBを100マイクロリットル10ｍMのTrisバッファ（ｐHは10.5）で溶解し、且つ光度計で495ｎｍに定量する。
Matrigel capillary tube formation試験は下記ステップを含む：Matrigelを10μl/wellで15ウェルの培養皿に加え、37℃で30min放置してゲル層（gel layer）を形成する。その後、5*103のEPC細胞、VEGF(vascular endothelia growth factor)、及び濃度が異なっているAC012（0、0.1、0.3、1μg/ml）を培養皿のウェルに入れ、37℃、5％の二酸化炭素という条件で16時間放置する。その後、位相差顕微鏡（inverted contrast phase microscope (Nikon, Japan)）で細胞の生成を観察する。
AC012が血管新生を抑制する効果：IC50は29μg/ml；1μg/mlのAC012は31.89％の血管新生を抑制できる。
実施例５ 牛樟芝化合物が癌細胞の増殖を抑制する効果
SRB試験で牛樟芝から純化される化合物及びその誘導体が癌細胞の増殖を抑制する効果を分析する；この実施例はすなわちAC006、AC007、AC009、AC011とAC012、及びその加水分解で置換基を改造した産物が、多種類の癌細胞株の増殖を抑制する効果を分析するわけである。
それぞれの細胞株を5*103cell/wellsの数量比例で96ウェルの培養皿に置き、且つそれを無血清（serum free）の培地で48時間飢餓状態にさせた後、10％のFBS培地及び0.1、0.3、1、3、10と30μg/mlなどという濃度のAC006、AC007、AC009、AC011、AC012に入れて48時間培養する。処理薬物で培養した後の培地を取り出して培養皿のウェルに100マイクロリットル（μl）10％のトリクロロ酢酸（trichloroacetic acid）（ｗ/ｖ）を加え、4℃で1時間放置することで細胞を固定する。培養皿を脱イオン水で洗浄して乾燥する。それぞれのウェルに50マイクロリットル0.4％のSulforhodamine B (SRB) (w/v)（また1％の酢酸を含む）を加えて室温で5min放置し、次に1％の酢酸で細胞と結合しないSRBを洗浄してから乾燥する。細胞と結合したSRBを100マイクロリットル10ｍMのTris緩衝液（ｐHは10.5）で溶解し、且つ光度計で495ｎｍに定量する。
実施例5.1 AC006の抑制効果
AC006で4種類の異なる癌をテストし、7種類の異なる癌細胞株は含まれ、それは半数の癌細胞の増殖を抑制できる有効な濃度、すなわちIC50効果、その結果はフラフ１に掲示される：
実施例5.2 AC007及びその誘導体の抑制効果
AC007で5種類の異なる癌をテストし、7種類の異なる癌細胞株は含まれ、そのIC50効果の結果はフラフ2、グラフ3に掲示される：
実施例5.3 AC009及びその誘導体の抑制効果
AC009及びその誘導体で4種類の異なる癌をテストし、10種類の異なる癌細胞株は含まれ、そのIC50効果の結果がフラフ4、グラフ5に掲示される：
実施例5.4 AC011の抑制効果
AC011で4種類の異なる癌細胞株をテストするIC50効果は、その結果がフラフ6に掲示される：
実施例5.4 AC012及びその誘導体の抑制効果
AC012及びその誘導体で5種類の異なる癌をテストし、8種類の異なる癌細胞株は含まれ、そのIC50効果の結果がフラフ7、グラフ8に掲示される：
実施例に開示されたものをまとめると、本発明は牛樟芝化合物及びその抽出方法を提供し、且つその化学構造を分析し、それが低濃度で血管新生を抑制する効果を開示する；該牛樟芝化合物に基づき、本発明も化学的に新規な化合物を合成する方法を提供する。本発明に開示された新規な抽出方法は該化合物を大量に純化でき、牛樟芝子実体を培養するコストを軽減する。
本発明も該化合物が癌細胞の増殖を抑制できる効果を有することを開示し、癌治療用薬物の調製に適用できる。その他、牛樟芝化合物の加水分解により、その置換基を改造して得る新規な化合物H１は、化合物が癌細胞、特に大腸癌細胞株の増殖を抑制する効果を効果的に向上させることができる；ここでHCT116は低い表現量を特徴とするBax（Wang et al. 2012)、及びgrowth factor(TGFα and EGFR)-independent (Howell et al. 1998)である。更に、本発明で提供される化合物は肝癌細胞にとってもその増殖を抑制する高度な効果を有し、特にアジア人からの上皮様肝癌細胞株（epithelial-like tumorigenic cells）であるHuh-7に対してHFE突然変異を特徴とする（Vecchi et al. 2009）。
要約すると、本発明は牛樟芝化合物を純化する方法を提供し、その化学構造、及びそれが血管新生及び癌細胞の増殖を抑制する効果に関する。
本発明は牛樟芝から純化された化合物、その製造方法及び用途に関する。特に、該化合
物が癌細胞の増殖及び血管の新生を抑制し、それにより癌を治療することができる。
物が癌細胞の増殖及び血管の新生を抑制し、それにより癌を治療することができる。
牛樟芝（Antrodia camphorata、以前はAntrodia cinnamomeaと命名された）は牛樟樹（
Cinnamomum kanchirai Hayata、lauraceae）の空洞部に寄生するキノコで、台湾だけに生
息するキノコである。昔から伝承医療に、樟芝は優れた解毒剤として、食物中毒や農薬中
毒に適用でき、民間には肝炎や肝臓関連の病気の治療に用いる。樟芝は高度な薬用価値が
あり、栽培しにくくて成長は遅いため、今まで樟芝に対するゲノミクス及びメタボロミク
スは研究され（Lu et al. 2014 PNAS、Lin et al. 2011 J Agr Food Chem）、それによっ
て、牛樟芝の医薬用途及び栽培方法をより理解することを意図している。
Cinnamomum kanchirai Hayata、lauraceae）の空洞部に寄生するキノコで、台湾だけに生
息するキノコである。昔から伝承医療に、樟芝は優れた解毒剤として、食物中毒や農薬中
毒に適用でき、民間には肝炎や肝臓関連の病気の治療に用いる。樟芝は高度な薬用価値が
あり、栽培しにくくて成長は遅いため、今まで樟芝に対するゲノミクス及びメタボロミク
スは研究され（Lu et al. 2014 PNAS、Lin et al. 2011 J Agr Food Chem）、それによっ
て、牛樟芝の医薬用途及び栽培方法をより理解することを意図している。
牛樟芝には高分子の多糖類と小分子のトリテルペン類化合物などの多種類の生物活性を
有する物質がが含有され、それが薬物として利用できる。そのうち多糖類は様々な単糖が
結合したもので存在し、スペクトルで分析すると多糖類は1,3- β‐D‐グルカン（1,3-β
-D-glucan）という成分を有している。公表された牛樟芝多糖にある多種類の医療用途は
、血管新生を抑制すること（Yang et al. 2009 J Ethnopharmacol、Cheng et al. 2005 L
ife Sci）、免疫を抑制すること（Meng et al. 2012 Nutrition）、免疫反応を調節し且
つ喘息を抑制すること（Liu et al. 2010 Immunology）、Ｂ型肝炎ウイルスを抑制するこ
と（Lee et al. 2002 FEMS Microbiol Lett）、癌細胞の成長を抑制すること（Liu et al
. 2004 Toxicol Appl Pharmacol、Lee et al. 2014 Food Funct）などを含む。更にアン
トロダン（antrodan）は、牛樟芝から抽出された糖タンパク質（glycoprotein、protein-
bound polysaccharide）で、肝臓が受ける損傷を避ける機能を有する（Ker et al. 2014
PLoS ONE、TW500628、US 7763723）。
有する物質がが含有され、それが薬物として利用できる。そのうち多糖類は様々な単糖が
結合したもので存在し、スペクトルで分析すると多糖類は1,3- β‐D‐グルカン（1,3-β
-D-glucan）という成分を有している。公表された牛樟芝多糖にある多種類の医療用途は
、血管新生を抑制すること（Yang et al. 2009 J Ethnopharmacol、Cheng et al. 2005 L
ife Sci）、免疫を抑制すること（Meng et al. 2012 Nutrition）、免疫反応を調節し且
つ喘息を抑制すること（Liu et al. 2010 Immunology）、Ｂ型肝炎ウイルスを抑制するこ
と（Lee et al. 2002 FEMS Microbiol Lett）、癌細胞の成長を抑制すること（Liu et al
. 2004 Toxicol Appl Pharmacol、Lee et al. 2014 Food Funct）などを含む。更にアン
トロダン（antrodan）は、牛樟芝から抽出された糖タンパク質（glycoprotein、protein-
bound polysaccharide）で、肝臓が受ける損傷を避ける機能を有する（Ker et al. 2014
PLoS ONE、TW500628、US 7763723）。
また、トリテルペン類化合物（Triterpenoids）は牛樟芝の主要な医薬用化合物であり
、牛樟芝にある苦味の主な根源でもある。初期にはCherng et al.がエルゴスタン（ergos
tane）である三種類の新型なトリテルペン類化合物、antcins A-C(Ｃherng et al.1995 J
Nat Prod)及び四種類の新型なトリテルペン類化合物、antcins E-F、methyl antcinate
G、methyl antcinate H(Cherng et al. 1996 Phytochemistry)を開示した。その後、何十
種類ものトリテルペン類化合物には、癌細胞の成長を抑制すること（Wu et al. 2010 J N
at Prod）、免疫反応を抑制すること（Liaw et al. 2013 J Nat Prod）、肝癌及び肝炎を
治療すること（Lien et al. 2014 Molecules）、疲労を低減すること（Huang et al. 201
2 Evid Based Complement Altern Med）などを含む医療効果があると発表された。
、牛樟芝にある苦味の主な根源でもある。初期にはCherng et al.がエルゴスタン（ergos
tane）である三種類の新型なトリテルペン類化合物、antcins A-C(Ｃherng et al.1995 J
Nat Prod)及び四種類の新型なトリテルペン類化合物、antcins E-F、methyl antcinate
G、methyl antcinate H(Cherng et al. 1996 Phytochemistry)を開示した。その後、何十
種類ものトリテルペン類化合物には、癌細胞の成長を抑制すること（Wu et al. 2010 J N
at Prod）、免疫反応を抑制すること（Liaw et al. 2013 J Nat Prod）、肝癌及び肝炎を
治療すること（Lien et al. 2014 Molecules）、疲労を低減すること（Huang et al. 201
2 Evid Based Complement Altern Med）などを含む医療効果があると発表された。
米国特許US7109232には牛樟芝から精製された五種類の新型な化合物及びその用途が開
示され、その用途は炎症及び腫瘍への抵抗を含む。US7732482には前記化合物が器官線維
症を抑制する効果を有することが開示された。US7342137には、多種類の癌細胞の成長を
抑制する効果を有する新規な牛樟芝化合物群が開示された。US7745647には子実体から分
離した新型なジテルペン類化合物が開示され、それは神経細胞を保護する効果を有する。
US7994158には牛樟芝から純化されたデヒドロスルフレン酸（dehydrosulphurenic acid）
が開示され、それは腫瘍細胞、特に白血病や膵癌を抑制する効果を有する。US7531627に
は分子量が29ｋDaである新型な牛樟芝タンパク質ACA1が開示され、それは免疫を促進する
効果及び癌を治療する潜在力を有する。
示され、その用途は炎症及び腫瘍への抵抗を含む。US7732482には前記化合物が器官線維
症を抑制する効果を有することが開示された。US7342137には、多種類の癌細胞の成長を
抑制する効果を有する新規な牛樟芝化合物群が開示された。US7745647には子実体から分
離した新型なジテルペン類化合物が開示され、それは神経細胞を保護する効果を有する。
US7994158には牛樟芝から純化されたデヒドロスルフレン酸（dehydrosulphurenic acid）
が開示され、それは腫瘍細胞、特に白血病や膵癌を抑制する効果を有する。US7531627に
は分子量が29ｋDaである新型な牛樟芝タンパク質ACA1が開示され、それは免疫を促進する
効果及び癌を治療する潜在力を有する。
牛樟芝の癌を抑制するメカニズムは化合物の化学構造によって異なっている。Yeh et a
l.はセスキテルペンラクトンアントロシン（sesquiterpene lactone antrocin）がJAK２
／STAT３のメッセージ伝送経路を抑制し、それによりアポトーシス（apoptosis）を誘発
することを発表した（Yeh et al. 2013 Carcinogenesis）。Yang et al.は牛樟芝でHER-2
／neuのメッセージ伝送を抑制するほか、卵巣癌を抑制できることを発表した（Yang et a
l. 2013 J Ethnopharmacol）。Wang et al.はアントロキノノールD（antroquinonol D）
がDNAを脱メチル化し、且つ癌を抑制する潜在力を有することを発表した（Wang et al. 2
014 J Agric Food Chem）。
l.はセスキテルペンラクトンアントロシン（sesquiterpene lactone antrocin）がJAK２
／STAT３のメッセージ伝送経路を抑制し、それによりアポトーシス（apoptosis）を誘発
することを発表した（Yeh et al. 2013 Carcinogenesis）。Yang et al.は牛樟芝でHER-2
／neuのメッセージ伝送を抑制するほか、卵巣癌を抑制できることを発表した（Yang et a
l. 2013 J Ethnopharmacol）。Wang et al.はアントロキノノールD（antroquinonol D）
がDNAを脱メチル化し、且つ癌を抑制する潜在力を有することを発表した（Wang et al. 2
014 J Agric Food Chem）。
要約すると、牛樟芝は抗癌の可能性を有する物質を含み、多種類の癌に対して治療効果
があることがすでに検証されたが、まだ新型な化合物が存在しているかどうか及びどんな
化合物が抗癌効果を有するかということについてはほとんど知られていない。牛樟芝から
新型な化合物を精製する上で、その構造と効果を分析できれば、癌の治療に応用でき、新
薬の開発に有効である。
があることがすでに検証されたが、まだ新型な化合物が存在しているかどうか及びどんな
化合物が抗癌効果を有するかということについてはほとんど知られていない。牛樟芝から
新型な化合物を精製する上で、その構造と効果を分析できれば、癌の治療に応用でき、新
薬の開発に有効である。
発明の目的は、式（Ｉ）に示した化合物を提供することである。
R1は水素又はアセチル基である。
そのうち、この化合物はAC007及びAC007-H1であり、下記に示される。
本発明は、また式（ＩＩ）に示した化合物を提供する。
R1は水素又はアセチル基である。
この化合物は、AC009及びAC009-H1であり、下記に示される。
本発明は、更に式（ＩＩＩ）に示した化合物を提供する。
R1は水素又はアセチル基である。
この化合物はAC012及びAC012-H1であり、下記に示される。
本発明は、また癌を治療するための医薬組成物を提供する。それには治療に有効な量の
化合物及び少なくとも一種類の薬学的に許容されるキャリア、塩類又はプロドラッグが含
まれる。この化合物はAC006、AC007、AC009、AC011、AC012、AC007-H1、AC009-H1及びAC0
12-H1からなるグループから選択されるか又は前記化合物の少なくとも二つから任意に組
み合わることができる。
化合物及び少なくとも一種類の薬学的に許容されるキャリア、塩類又はプロドラッグが含
まれる。この化合物はAC006、AC007、AC009、AC011、AC012、AC007-H1、AC009-H1及びAC0
12-H1からなるグループから選択されるか又は前記化合物の少なくとも二つから任意に組
み合わることができる。
キャリアは賦形剤、希釈剤、増粘剤、充填剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、油性又は非油
性の基剤、界面活性剤、懸濁化剤、ゲル化剤、補助剤、防腐剤、酸化防止剤、安定剤、色
素、香料を含む。
性の基剤、界面活性剤、懸濁化剤、ゲル化剤、補助剤、防腐剤、酸化防止剤、安定剤、色
素、香料を含む。
医薬組成物は癌細胞の増殖を抑制することにより、治療に用いられる。
医薬組成物は静脈注射、皮下注射、経口又は塗布の方法で患者に投与される。
医薬組成物は溶液、乳剤、懸濁剤、粉末、錠剤、油剤、軟膏剤、経口剤、カプセルを含
む剤形を有する。
本発明はまた癌を治療する方法を提供し、有効な量の医薬組成物を投与し、該医薬組成
物は治療に有効な量の前記化合物を含む。
癌は前立腺癌、肝癌、黒色腫、脳腫瘍、大腸癌からなるグループから選択される。なか
でも、大腸癌及び肝癌に対して有効である。
医薬組成物は静脈注射、皮下注射、経口又は塗布の方法で患者に投与される。
医薬組成物は静脈注射、皮下注射、経口又は塗布の方法で患者に投与される。
医薬組成物は溶液、乳剤、懸濁剤、粉末、錠剤、油剤、軟膏剤、経口剤、カプセルを含
む剤形を有する。
本発明はまた癌を治療する方法を提供し、有効な量の医薬組成物を投与し、該医薬組成
物は治療に有効な量の前記化合物を含む。
癌は前立腺癌、肝癌、黒色腫、脳腫瘍、大腸癌からなるグループから選択される。なか
でも、大腸癌及び肝癌に対して有効である。
医薬組成物は静脈注射、皮下注射、経口又は塗布の方法で患者に投与される。
本発明は更に牛樟芝菌糸体で生物活性を有する化合物及びその誘導体を製造する方法を
提供し、それは以下のステップを含む。
牛樟芝菌糸体をｎ-ヘキサンで二回還流抽出する。それぞれ一時間から三時間まで行っ
た後、二回の抽出液を混合して濾過する。
７０−３２０ウェルのシリカゲル（silica gel）（７０−２３０ｍesh）を取り、菌糸
体と１：１（ｗ／ｗ）の重量比でカラムに充填し、ｎ-ヘキサン／酢酸エチルの勾配で溶
出する。溶出物はF1、F2とF3に分画され、それぞれの勾配は１７−２２％の酢酸エチル、
２３−２７％の酢酸エチル及び２８−３３％の酢酸エチルである。F3を保持時間（retent
ion time）の順序に基づいて三つの段階F3-1〜F3-3に分ける。
F3-1を取って移動相であるジクロロメタン／アセトン（CH2Cl2/Acetone）を用いて、シ
リカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し（極性は50：1から20：1まで勾配溶出する）
、40：1−15：1という段階を取り、更に順相MPLCでカラムを分取しｎ-ヘキサン／酢酸エ
チル（4：1）で分離、精製してから化合物AC006を得る。
F3-2を順相MPLCシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、移動相であるCH2Cl2/Acetone
を用いて勾配分離し（100％：0％ to 70%:30%）、95％:5％から85％:15％までの段階を
取ってF3-2-1からF3-2-3まで三つの段階に分ける。
F3-2-3を更に分離、精製し、移動相であるｎ−ヘキサン／アセトンを用いてシリカゲル
カラムクロマトグラフィーで分離し（100%:0% to 0%:100%）、ｎ−ヘキサン／アセトン=9
0/10から70/30までの段階を取って、移動相であるｎ−ヘキサン／アセトンを用いてシリ
カゲルカラムクロマトグラフィーで分離し続け（100%:0% to 0%:100%)、ｎ−ヘキサン／
酢酸エチル=60/40にAC007を得る。
F-3-3を順相MPLCシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、移動相であるCH2Cl2/Aceton
eを用いて勾配溶出分離し（100％：0％から 0%:100%）、90％:10％から70％:30％までの
段階を取ってF3-3-1からF3-3-5まで五つの段階に分ける。
F-3-3-5（CH2Cl2/Acetone=73/27の段階）を更に分離、精製し、移動相であるn-hexane/
Acetoneを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離して（95%:5%から 50%:50%
）、85%:15%から70%:30%段階を取ってF3-3-5-1からF3-3-5-5まで五つの段階に分ける。
提供し、それは以下のステップを含む。
牛樟芝菌糸体をｎ-ヘキサンで二回還流抽出する。それぞれ一時間から三時間まで行っ
た後、二回の抽出液を混合して濾過する。
７０−３２０ウェルのシリカゲル（silica gel）（７０−２３０ｍesh）を取り、菌糸
体と１：１（ｗ／ｗ）の重量比でカラムに充填し、ｎ-ヘキサン／酢酸エチルの勾配で溶
出する。溶出物はF1、F2とF3に分画され、それぞれの勾配は１７−２２％の酢酸エチル、
２３−２７％の酢酸エチル及び２８−３３％の酢酸エチルである。F3を保持時間（retent
ion time）の順序に基づいて三つの段階F3-1〜F3-3に分ける。
F3-1を取って移動相であるジクロロメタン／アセトン（CH2Cl2/Acetone）を用いて、シ
リカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し（極性は50：1から20：1まで勾配溶出する）
、40：1−15：1という段階を取り、更に順相MPLCでカラムを分取しｎ-ヘキサン／酢酸エ
チル（4：1）で分離、精製してから化合物AC006を得る。
F3-2を順相MPLCシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、移動相であるCH2Cl2/Acetone
を用いて勾配分離し（100％：0％ to 70%:30%）、95％:5％から85％:15％までの段階を
取ってF3-2-1からF3-2-3まで三つの段階に分ける。
F3-2-3を更に分離、精製し、移動相であるｎ−ヘキサン／アセトンを用いてシリカゲル
カラムクロマトグラフィーで分離し（100%:0% to 0%:100%）、ｎ−ヘキサン／アセトン=9
0/10から70/30までの段階を取って、移動相であるｎ−ヘキサン／アセトンを用いてシリ
カゲルカラムクロマトグラフィーで分離し続け（100%:0% to 0%:100%)、ｎ−ヘキサン／
酢酸エチル=60/40にAC007を得る。
F-3-3を順相MPLCシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、移動相であるCH2Cl2/Aceton
eを用いて勾配溶出分離し（100％：0％から 0%:100%）、90％:10％から70％:30％までの
段階を取ってF3-3-1からF3-3-5まで五つの段階に分ける。
F-3-3-5（CH2Cl2/Acetone=73/27の段階）を更に分離、精製し、移動相であるn-hexane/
Acetoneを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離して（95%:5%から 50%:50%
）、85%:15%から70%:30%段階を取ってF3-3-5-1からF3-3-5-5まで五つの段階に分ける。
F3-3-5-1（n-hexane/Acetone=90/10-80/20）を更に逆相MPLC C-18カラムクロマトグラ
フィーで分離、精製し、移動相である1％のメタノール／Methanol＝35％／65％から20％
／80％まで勾配溶出し、28%/72%-22%/78%の段階を取って移動相であるn-hexane/Ethyl ac
etate=80%:20%から50%:50%までシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し、n-hexane
/Ethyl acetate=75%:25%-65%:35%にAC012を得る。
F3-3-5-3を更に逆相MPLC C-18シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離、精製し、
移動相である1％のメタノール／Methanol＝25／75などの勾配で15ｍL／minの流速で溶出
し、AC009が主とする段階（保持時間は130‐170min）を取って更に精製し、移動相である
CH2Cl2/Ethyl acetateを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで勾配溶出し（90%:
0% から0%:100%）、CH2Cl2/Ethyl acetate=80%/20%- 60%/40%にAC009を得る。
F3-3-5-4（n-hexane/Acetone=76/24)を取って逆相MPLC C-18カラムクロマトグラフィ
ーで分離、精製し、移動相である1％のメタノール／Methanol＝25％:75％などまで勾配溶
出し、精製物はAC011である。
これらAC006、AC007、AC009、AC011、AC012はすなわち生物活性を有する化合物である
。
フィーで分離、精製し、移動相である1％のメタノール／Methanol＝35％／65％から20％
／80％まで勾配溶出し、28%/72%-22%/78%の段階を取って移動相であるn-hexane/Ethyl ac
etate=80%:20%から50%:50%までシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し、n-hexane
/Ethyl acetate=75%:25%-65%:35%にAC012を得る。
F3-3-5-3を更に逆相MPLC C-18シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離、精製し、
移動相である1％のメタノール／Methanol＝25／75などの勾配で15ｍL／minの流速で溶出
し、AC009が主とする段階（保持時間は130‐170min）を取って更に精製し、移動相である
CH2Cl2/Ethyl acetateを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで勾配溶出し（90%:
0% から0%:100%）、CH2Cl2/Ethyl acetate=80%/20%- 60%/40%にAC009を得る。
F3-3-5-4（n-hexane/Acetone=76/24)を取って逆相MPLC C-18カラムクロマトグラフィ
ーで分離、精製し、移動相である1％のメタノール／Methanol＝25％:75％などまで勾配溶
出し、精製物はAC011である。
これらAC006、AC007、AC009、AC011、AC012はすなわち生物活性を有する化合物である
。
好ましい実施様態では、該生物活性を有する化合物を更にC4がヒドロキシル基である誘
導体の製造に用いられ、下記ステップを含む。
１モル当量のメタノールで該生物活性を有する化合物を加水分解させる。
加水分解反応が終わった後アンバライト樹脂を加えて濾紙で濾過した後、中間産物を得
る。
シリカゲルカラムクロマトグラフィーで該中間産物を分離し、n-ヘキサンと酢酸エチル
を移動相とし、勾配比例をn-ヘキサンと酢酸エチル4:1から1:1までとして、勾配比例が1:
1である時点に生成物を収集する。
この生成物を逆相HPLC及びC18によりカラムを取分して精製し、メタノール／FAバッフ
ァにて75:25で勾配溶出し、C4がヒドロキシル基である誘導体を得る。
また、本発明は血管の新生と癌細胞の増殖を抑制する組成物を提供する。それは上記牛
樟芝抗生物質、適当な希釈剤、賦形剤を含む。この組成物は高い増殖能力を持つ細胞の増
殖を抑制することができる。
導体の製造に用いられ、下記ステップを含む。
１モル当量のメタノールで該生物活性を有する化合物を加水分解させる。
加水分解反応が終わった後アンバライト樹脂を加えて濾紙で濾過した後、中間産物を得
る。
シリカゲルカラムクロマトグラフィーで該中間産物を分離し、n-ヘキサンと酢酸エチル
を移動相とし、勾配比例をn-ヘキサンと酢酸エチル4:1から1:1までとして、勾配比例が1:
1である時点に生成物を収集する。
この生成物を逆相HPLC及びC18によりカラムを取分して精製し、メタノール／FAバッフ
ァにて75:25で勾配溶出し、C4がヒドロキシル基である誘導体を得る。
また、本発明は血管の新生と癌細胞の増殖を抑制する組成物を提供する。それは上記牛
樟芝抗生物質、適当な希釈剤、賦形剤を含む。この組成物は高い増殖能力を持つ細胞の増
殖を抑制することができる。
本明細書に使用するあらゆる技術性及び科学専門用語は、別に定義されたものを除いて
、全部当業者が理解できる共通的意味を持つ。本発明は下記実施例で説明されるが、それ
らの例に限られない。別に説明されるものを除き、本発明が使用する材料は全部市販され
て取得しやすく、下記はただ取得できるルートの例を示す。
、全部当業者が理解できる共通的意味を持つ。本発明は下記実施例で説明されるが、それ
らの例に限られない。別に説明されるものを除き、本発明が使用する材料は全部市販され
て取得しやすく、下記はただ取得できるルートの例を示す。
用語「治療」、「治療に用いる」及びそれに類似する用語は患者が患っている診断可能
な病気及び該病気による相関的な病症を遅延、改善、緩和又は逆転する方法及び該病気や
それが属するいずれかの病症を予防する方法を指す。
用語「薬学的に許容される」とは、物質及び組成物が、その薬学的な製剤にあるほかの
成分を含むことができ、患者の病症を悪化させないことを意味する。
本発明が提供する化合物及び組成物は当業者に知られている技術で、本発明が提供する
化合物及び組成物を、少なくとも一種類の薬学的に許容されるキャリア（vehicle）と組
み合わせ、本発明の組成物に適用する剤形を製造できるものを指す。剤形は溶液、乳剤、
懸濁液、粉末、錠剤、経口剤、タブレット、チューインガム、カプセル及びほかの類似物
、本発明に適用する剤形を含むがそれらに限定されない。
用語「薬学的に許容されるキャリア」は下記から選択される一種類又は多種類のタイプ
を含む。溶剤、乳化剤、懸濁剤、分解剤、結合剤、賦形剤、安定化剤、キレート剤、希釈
剤、ゲル化剤、防腐剤、潤滑剤、界面活性剤及びほかの類似物、本発明に適用するキャリ
ア等である。
な病気及び該病気による相関的な病症を遅延、改善、緩和又は逆転する方法及び該病気や
それが属するいずれかの病症を予防する方法を指す。
用語「薬学的に許容される」とは、物質及び組成物が、その薬学的な製剤にあるほかの
成分を含むことができ、患者の病症を悪化させないことを意味する。
本発明が提供する化合物及び組成物は当業者に知られている技術で、本発明が提供する
化合物及び組成物を、少なくとも一種類の薬学的に許容されるキャリア（vehicle）と組
み合わせ、本発明の組成物に適用する剤形を製造できるものを指す。剤形は溶液、乳剤、
懸濁液、粉末、錠剤、経口剤、タブレット、チューインガム、カプセル及びほかの類似物
、本発明に適用する剤形を含むがそれらに限定されない。
用語「薬学的に許容されるキャリア」は下記から選択される一種類又は多種類のタイプ
を含む。溶剤、乳化剤、懸濁剤、分解剤、結合剤、賦形剤、安定化剤、キレート剤、希釈
剤、ゲル化剤、防腐剤、潤滑剤、界面活性剤及びほかの類似物、本発明に適用するキャリ
ア等である。
前記組成物において、また必要により、一種類又は多種類の上記製剤分野で通常に使用
する溶解補助剤、緩衝剤、着色剤、調味剤などを適切に添加できる。
用語「薬学的に許容される賦形剤」はポリマー、樹脂、可塑剤、充填剤、潤滑剤、希釈
剤、結合剤、崩壊剤、溶媒、共溶媒、界面活性剤、防腐剤、甘味剤、香味剤、医薬グレー
ドの染料及び顔料ならびに増粘剤の少なくとも一つを含むが、それらに限定されない。
用語「医薬組成物」は固体又は液体組成物を指し、それは患者に投与しやすい適切な製
剤、濃度、純度を有し、投与された後、意図する生理的変化を誘発することができる。医
薬組成物は無菌及び／又は非発熱性のもの（non-pyrogenic）である。
用語「有効な量」は意図する生体反応を生じさせ、引き起こす必要な使用量を指すが、
治癒する必要な定量ではない。当業者には理解でき、医薬組成物の有効な量が下記原因で
変化する可能性はある。希望の生物終点、予定に提供する生物活性剤、カプセル化マトリ
ックス（encapsulating matrix）の組成、目的組織などである。
する溶解補助剤、緩衝剤、着色剤、調味剤などを適切に添加できる。
用語「薬学的に許容される賦形剤」はポリマー、樹脂、可塑剤、充填剤、潤滑剤、希釈
剤、結合剤、崩壊剤、溶媒、共溶媒、界面活性剤、防腐剤、甘味剤、香味剤、医薬グレー
ドの染料及び顔料ならびに増粘剤の少なくとも一つを含むが、それらに限定されない。
用語「医薬組成物」は固体又は液体組成物を指し、それは患者に投与しやすい適切な製
剤、濃度、純度を有し、投与された後、意図する生理的変化を誘発することができる。医
薬組成物は無菌及び／又は非発熱性のもの（non-pyrogenic）である。
用語「有効な量」は意図する生体反応を生じさせ、引き起こす必要な使用量を指すが、
治癒する必要な定量ではない。当業者には理解でき、医薬組成物の有効な量が下記原因で
変化する可能性はある。希望の生物終点、予定に提供する生物活性剤、カプセル化マトリ
ックス（encapsulating matrix）の組成、目的組織などである。
実施例１：牛樟芝化合物の製造
牛樟芝の液体発酵菌糸体をｎ−ヘキサン（n-hexane）で二回還流（reflux）させ、各回
は１−３時間行う。排気し濾過した後、二回のn-hexane抽出液を合わせる。７０−２３０
ウェルのシリカゲル（７０‐２３０mesh）を取って菌糸体と１：１（ｗ／ｗ）の重量比で
カラムに充填し、n-Hexane／酢酸エチル（Ethyl acetate）で勾配溶出する。溶出物を、F
1、F2及びF3の三層に分ける（fraction）。勾配はそれぞれ17-22%のEthyl acetate、23-2
7%のEthyl acetate及び28-33%のEthyl acetateで、F3を保持時間（retention time）の順
序によって三つの段階F3-1〜F3-3に分ける。
牛樟芝の液体発酵菌糸体をｎ−ヘキサン（n-hexane）で二回還流（reflux）させ、各回
は１−３時間行う。排気し濾過した後、二回のn-hexane抽出液を合わせる。７０−２３０
ウェルのシリカゲル（７０‐２３０mesh）を取って菌糸体と１：１（ｗ／ｗ）の重量比で
カラムに充填し、n-Hexane／酢酸エチル（Ethyl acetate）で勾配溶出する。溶出物を、F
1、F2及びF3の三層に分ける（fraction）。勾配はそれぞれ17-22%のEthyl acetate、23-2
7%のEthyl acetate及び28-33%のEthyl acetateで、F3を保持時間（retention time）の順
序によって三つの段階F3-1〜F3-3に分ける。
F3-1を取って移動相であるジクロロメタン／アセトン（CH2Cl2/Acetone）を用いてシリ
カゲルカラムクロマトグラフィーで分離し（極性が５０：１から２０：１まで勾配溶出す
る）、４０：１−１５：１の段階を取り、順相HPLC（Medium pressure liquid chromatog
raphy）でカラムを取分し、精製、n-Hexane / Ethyl acetate （４：１）で分離、精製し
て化合物AC006を得る。
カゲルカラムクロマトグラフィーで分離し（極性が５０：１から２０：１まで勾配溶出す
る）、４０：１−１５：１の段階を取り、順相HPLC（Medium pressure liquid chromatog
raphy）でカラムを取分し、精製、n-Hexane / Ethyl acetate （４：１）で分離、精製し
て化合物AC006を得る。
F3-2を順相MPLC（Medium pressure liquid chromatography）シリカゲルカラムクロマ
トグラフィーで、移動相であるCH2Cl2/ Acetoneで勾配分離し（100%:0% to 70%: 30%）、
95％：5％から85％：15％までの段階を取り三つの段階に分ける。
F3-2-3を更に分離純化し、移動相であるn-hexane/Acetoneを用いてシリカゲルカラムク
ロマトグラフィーで分離し（100%:0% to 0%:100%）、n-hexane/Acetone=90/10から70/30
までの段階を取って移動相であるn-hexane/Ethyl acetateを用いてシリカゲルカラムクロ
マトグラフィーで分離し（100%:0% to 0%:100%）n-hexane/Ethyl acetate=60/40にAC007
を得る。
トグラフィーで、移動相であるCH2Cl2/ Acetoneで勾配分離し（100%:0% to 70%: 30%）、
95％：5％から85％：15％までの段階を取り三つの段階に分ける。
F3-2-3を更に分離純化し、移動相であるn-hexane/Acetoneを用いてシリカゲルカラムク
ロマトグラフィーで分離し（100%:0% to 0%:100%）、n-hexane/Acetone=90/10から70/30
までの段階を取って移動相であるn-hexane/Ethyl acetateを用いてシリカゲルカラムクロ
マトグラフィーで分離し（100%:0% to 0%:100%）n-hexane/Ethyl acetate=60/40にAC007
を得る。
F-3-3を順相MPLCシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて、移動相であるCH2Cl2/
Acetoneで勾配分離し（100%:0% to 0%: 100%）、90％：10％から70％：30％までの段階
を取り五つの段階に分ける。
F-3-3-5(CH2Cl2/Acetone=73/27の段階)を更に分離、精製し、移動相であるn-hexane/Ac
etoneを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し（95％：5％から50％：50％
）、85%:15%から70%:30%までの段階を取って五つの段階に分ける。
F3-3-5-1（n-hexane/Acetone=90/10-80/20）を取り逆相MPLC C-18カラムクロマトグラ
フィーで更に分離、精製し、移動相である１％のメタノール水溶液/ Methanol=35％/65％
から20％/80％を勾配として、28％/72％−22％/78％の段階を取って更に移動相である n-
hexane/Ethyl acetate=80%:20%から50％/50％までシリカゲルカラムクロマトグラフィー
で分離し、n-hexane/Ethyl acetate=75%:25%-65%:35%にAC012を得る。
Acetoneで勾配分離し（100%:0% to 0%: 100%）、90％：10％から70％：30％までの段階
を取り五つの段階に分ける。
F-3-3-5(CH2Cl2/Acetone=73/27の段階)を更に分離、精製し、移動相であるn-hexane/Ac
etoneを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し（95％：5％から50％：50％
）、85%:15%から70%:30%までの段階を取って五つの段階に分ける。
F3-3-5-1（n-hexane/Acetone=90/10-80/20）を取り逆相MPLC C-18カラムクロマトグラ
フィーで更に分離、精製し、移動相である１％のメタノール水溶液/ Methanol=35％/65％
から20％/80％を勾配として、28％/72％−22％/78％の段階を取って更に移動相である n-
hexane/Ethyl acetate=80%:20%から50％/50％までシリカゲルカラムクロマトグラフィー
で分離し、n-hexane/Ethyl acetate=75%:25%-65%:35%にAC012を得る。
F3-3-5-3を取って逆相（reverse phase）MPLC C-18カラムクロマトグラフィーで分離
純化し、移動相である１％のメタノール水溶液/ Methanol=25/75を用いて１５ml/minの流
速で勾配（isocratic）溶出し、AC009を主とする段階（保持時間は１３０−１７０min）
を取って更に精製し、移動相であるCH2Cl2/Ethyl acetate以（silica gel）シリカゲルカ
ラムクロマトグラフィーで分離して勾配溶出し（90%:0% to 0%:100%）、CH2Cl2/Ethyl ac
etate=80%/20%- 60%/40%にAC009を得る。
純化し、移動相である１％のメタノール水溶液/ Methanol=25/75を用いて１５ml/minの流
速で勾配（isocratic）溶出し、AC009を主とする段階（保持時間は１３０−１７０min）
を取って更に精製し、移動相であるCH2Cl2/Ethyl acetate以（silica gel）シリカゲルカ
ラムクロマトグラフィーで分離して勾配溶出し（90%:0% to 0%:100%）、CH2Cl2/Ethyl ac
etate=80%/20%- 60%/40%にAC009を得る。
F3-1を取り逆相MPLC C-18シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離純化し、移動相
である１％のメタノール水溶液/ Methanol=25%/75%を用いて１５ml/minの流速で勾配溶出
し、精製物はAC-05-01である。
である１％のメタノール水溶液/ Methanol=25%/75%を用いて１５ml/minの流速で勾配溶出
し、精製物はAC-05-01である。
F3-3-5-4（n-hexane/Acetone=76/24）を取り逆相MPLC C-18シリカゲルカラムクロマト
グラフィーで分離、精製し、移動相である１％のメタノール水溶液/ Methanol=25%/75%を
用いて１５ml/minの流速で勾配溶出し、精製物はAC011である。
抽出物はAC006、AC007、AC009、AC011、AC012すなわち牛樟芝にある抗がん活性を有す
る化合物である。
グラフィーで分離、精製し、移動相である１％のメタノール水溶液/ Methanol=25%/75%を
用いて１５ml/minの流速で勾配溶出し、精製物はAC011である。
抽出物はAC006、AC007、AC009、AC011、AC012すなわち牛樟芝にある抗がん活性を有す
る化合物である。
実施例２：牛樟芝化合物の化学構造に対する分析
前記抽出された化合物は、スペクトル分析でその化学構造を識別し、１D/２D NMR及び
質量分析計の使用が含まれる。この化合物の構造分析結果は下記のとおりである。
前記抽出された化合物は、スペクトル分析でその化学構造を識別し、１D/２D NMR及び
質量分析計の使用が含まれる。この化合物の構造分析結果は下記のとおりである。
実施例２．１：AC006
EIMS, m/z 471.2701 [M+Na]+; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 5.77 (1H, d, J = 3.2 Hz
, H-4), 5.18 (1H, t, J = 5.6 Hz, H-12), 5.16 (1H, t, J = 6.4 Hz, H-8), 5.11 (1H,
dt, J = 1.6, 8.8 Hz, H-16), 4.43 (1H, q, J=6.8, H-15), 4.00 (3H, s, H-24), 3.62
(3H, s, H-23), 2.53 (1H, m, H-6), 2.29 (1H, m, H-7a), 2.24 (2H, m, H-14), 2.11
(2H, m, H-11), 2.10 (3H, s, -OAc), 2.08 (1H, m, H-10a), 2.02 (1H, m, H-7b), 1.94
(1H, m, H-10b), 1.92 (1H, m, H-5), 1.71 (3H, d, J = 1.2 Hz, H-18), 1.66 (3H, d,
J = 1.2 Hz, H-19), 1.64 (3H, s, H-20), 1.58 (3H, s, H-21), 1.18 (3H, d, J = 6.8
Hz, H-22); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ 199.2 (s, C-1), 171.6 (s, - COCH3), 160.
7 (s, C-3), 138.9 (s, C-2), 138.8 (s, C-9), 134.9 (s, C-17), 132.9 (s, C-13), 12
9.6 (d, C-16), 128.4 (d, C-12), 122.2 (d, C-8), 70.4 (d, C-4), 68.1 (d, C-15), 6
1.2 (q, C-23), 60.4 (q, C-24), 49.2 (t, C-14), 44.4 (d, C-5), 42.6 (d, C-6), 40.
9 (t, C-10), 28.1 (t, C-7), 27.6 (t, C-11), 26.1 (q, C-18), 21.0 (q, - COCH3), 1
8.5 (q, C-19), 16.8 (q, C-20), 16.5 (q, C-21), 13.3 (q, C-22).
, H-4), 5.18 (1H, t, J = 5.6 Hz, H-12), 5.16 (1H, t, J = 6.4 Hz, H-8), 5.11 (1H,
dt, J = 1.6, 8.8 Hz, H-16), 4.43 (1H, q, J=6.8, H-15), 4.00 (3H, s, H-24), 3.62
(3H, s, H-23), 2.53 (1H, m, H-6), 2.29 (1H, m, H-7a), 2.24 (2H, m, H-14), 2.11
(2H, m, H-11), 2.10 (3H, s, -OAc), 2.08 (1H, m, H-10a), 2.02 (1H, m, H-7b), 1.94
(1H, m, H-10b), 1.92 (1H, m, H-5), 1.71 (3H, d, J = 1.2 Hz, H-18), 1.66 (3H, d,
J = 1.2 Hz, H-19), 1.64 (3H, s, H-20), 1.58 (3H, s, H-21), 1.18 (3H, d, J = 6.8
Hz, H-22); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ 199.2 (s, C-1), 171.6 (s, - COCH3), 160.
7 (s, C-3), 138.9 (s, C-2), 138.8 (s, C-9), 134.9 (s, C-17), 132.9 (s, C-13), 12
9.6 (d, C-16), 128.4 (d, C-12), 122.2 (d, C-8), 70.4 (d, C-4), 68.1 (d, C-15), 6
1.2 (q, C-23), 60.4 (q, C-24), 49.2 (t, C-14), 44.4 (d, C-5), 42.6 (d, C-6), 40.
9 (t, C-10), 28.1 (t, C-7), 27.6 (t, C-11), 26.1 (q, C-18), 21.0 (q, - COCH3), 1
8.5 (q, C-19), 16.8 (q, C-20), 16.5 (q, C-21), 13.3 (q, C-22).
実施例２．２：AC007
EIMS, m/z 471.2690 [M+Na]+; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 5.76 (1H, d, J = 3.1 Hz
, H-4), 5.57 (1H, m, H-16), 5.55 (1H, m, H-15), 5.16 (1H, t, J = 7.3 Hz, H-12),
5.15 (1H, t, J = 7.1 Hz, H-8), 3.99 (3H, s, H-24), 3.61 (3H, s, H-23), 2.52 (1H,
m, H-6), 2.27 (1H, m, H-7a), 2.11 (2H, m, H-11), 2.10 (3H, s, -OAc), 2.02 (1H,
m, H-7b), 2.00 (2H, m, H-10), 1.93 (1H, m, H-5), 1.59 (3H, s, H-20), 1.58 (2H, d
, J = 8.0 Hz, H-14), 1.57 (3H, s, H-21), 1.25 (3H, s, H-19), 1.25 (3H, s, H-18),
1.17 (3H, d, J = 7.0 Hz, H-22); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ 199.1 (s, C-1), 171
.4 (s, - COCH3), 160.6 (s, C-3), 140.5 (d, C-16), 138.9 (s, C-2), 138.7 (s, C-9)
, 135.1 (s, C-13), 126.2 (d, C-15), 126.1 (d, C-12), 122.1 (d, C-8), 71.1 (s, C-
17), 70.3 (d, C-4), 61.1 (q, C-23), 60.2 (q, C-24), 44.2 (d, C-5), 43.5 (t, C-14
), 42.5 (d, C-6), 40.8 (t, C-10), 30.0 (q, C-18), 30.0 (q, C-19), 28.0 (t, C-7),
27.5 (t, C-11), 20.8 (q, - COCH3), 16.3 (q, C-21), 16.1 (q, C-20), 13.1 (q, C-2
2).
, H-4), 5.57 (1H, m, H-16), 5.55 (1H, m, H-15), 5.16 (1H, t, J = 7.3 Hz, H-12),
5.15 (1H, t, J = 7.1 Hz, H-8), 3.99 (3H, s, H-24), 3.61 (3H, s, H-23), 2.52 (1H,
m, H-6), 2.27 (1H, m, H-7a), 2.11 (2H, m, H-11), 2.10 (3H, s, -OAc), 2.02 (1H,
m, H-7b), 2.00 (2H, m, H-10), 1.93 (1H, m, H-5), 1.59 (3H, s, H-20), 1.58 (2H, d
, J = 8.0 Hz, H-14), 1.57 (3H, s, H-21), 1.25 (3H, s, H-19), 1.25 (3H, s, H-18),
1.17 (3H, d, J = 7.0 Hz, H-22); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ 199.1 (s, C-1), 171
.4 (s, - COCH3), 160.6 (s, C-3), 140.5 (d, C-16), 138.9 (s, C-2), 138.7 (s, C-9)
, 135.1 (s, C-13), 126.2 (d, C-15), 126.1 (d, C-12), 122.1 (d, C-8), 71.1 (s, C-
17), 70.3 (d, C-4), 61.1 (q, C-23), 60.2 (q, C-24), 44.2 (d, C-5), 43.5 (t, C-14
), 42.5 (d, C-6), 40.8 (t, C-10), 30.0 (q, C-18), 30.0 (q, C-19), 28.0 (t, C-7),
27.5 (t, C-11), 20.8 (q, - COCH3), 16.3 (q, C-21), 16.1 (q, C-20), 13.1 (q, C-2
2).
実施例２．３：AC009
EIMS, m/z 471.26498 [M+Na]+; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 5.77 (1H, d, J = 3.2 H
z, H-4), 5.39 (1H, td, J = 7.2, 1.2 Hz, H-16), 5.16 (1H, td, J = 7.2, 0.8 Hz, H-
12), 5.16 (1H, td, J = 7.2, 0.8 Hz, H-8), 4.00 (3H, s, H-23), 3.91 (2H, s, H-18)
, 3.62 (3H, s, H-24), 2.53 (1H, m, H-6), 2.28 (1H, m, H-7a), 2.14 (2H, m, H-11),
2.14 (2H, m, H-15), 2.10 (3H, s, -OAc), 2.04 (1H, m, H-7b), 2.03 (2H, m, H-10),
2.03 (2H, m, H-14), 1.92 (1H, m, H-5), 1.64 (3H, s, H-19), 1.62 (3H, s, H-20),
1.58 (3H, s, H-21), 1.18 (3H, d, J = 7.2 Hz, H-22); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ
199.2 (s, C-1), 171.6 (s, - COCH3), 160.8 (s, C-3), 138.9 (s, C-2), 138.8 (s, C-
9), 136.0 (s, C-13), 136.0 (s, C-17), 126.7 (d, C-16), 125.7 (d, C-12), 122.2 (d
, C-8), 70.5 (d, C-4), 69.1 (t, C-18), 61.3 (q, C-24), 60.4 (q, C-23), 44.4 (d,
C-5), 42.6 (d, C-6), 41.0 (t, C-10), 40.7 (t, C-14), 28.1 (t, C-7), 27.6 (t, C-1
6), 27.5 (t, C-11), 21.0 (q, - COCH3), 16.5 (q, C-21), 16.3 (q, C-20), 13.9 (q,
C-19), 13.1 (q, C-22).
z, H-4), 5.39 (1H, td, J = 7.2, 1.2 Hz, H-16), 5.16 (1H, td, J = 7.2, 0.8 Hz, H-
12), 5.16 (1H, td, J = 7.2, 0.8 Hz, H-8), 4.00 (3H, s, H-23), 3.91 (2H, s, H-18)
, 3.62 (3H, s, H-24), 2.53 (1H, m, H-6), 2.28 (1H, m, H-7a), 2.14 (2H, m, H-11),
2.14 (2H, m, H-15), 2.10 (3H, s, -OAc), 2.04 (1H, m, H-7b), 2.03 (2H, m, H-10),
2.03 (2H, m, H-14), 1.92 (1H, m, H-5), 1.64 (3H, s, H-19), 1.62 (3H, s, H-20),
1.58 (3H, s, H-21), 1.18 (3H, d, J = 7.2 Hz, H-22); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ
199.2 (s, C-1), 171.6 (s, - COCH3), 160.8 (s, C-3), 138.9 (s, C-2), 138.8 (s, C-
9), 136.0 (s, C-13), 136.0 (s, C-17), 126.7 (d, C-16), 125.7 (d, C-12), 122.2 (d
, C-8), 70.5 (d, C-4), 69.1 (t, C-18), 61.3 (q, C-24), 60.4 (q, C-23), 44.4 (d,
C-5), 42.6 (d, C-6), 41.0 (t, C-10), 40.7 (t, C-14), 28.1 (t, C-7), 27.6 (t, C-1
6), 27.5 (t, C-11), 21.0 (q, - COCH3), 16.5 (q, C-21), 16.3 (q, C-20), 13.9 (q,
C-19), 13.1 (q, C-22).
実施例２．４：AC012
EIMS, m/z 473.2846 [M+Na]+; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 5.77 (1H, d, J = 3.2 Hz
, H-4), 5.16 (1H, t, J = 7.6 Hz, H-8), 5.13 (1H, t, J = 7.2 Hz, H-12), 4.00 (3H,
s, H-24), 3.62 (3H, s, H-23), 3.38 (1H, d, J = 10.2 Hz, H-18a), 3.31 (1H, d, J
= 5.6 Hz, H-18b), 2.53 (1H, m, H-6), 2.26 (1H, m, H-7a), 2.13 (2H, m, H-11), 2.1
0 (3H, s, -OAc), 2.04 (1H, m, H-7b), 2.00 (2H, m, H-10), 1.96 (2H, m, H-14), 1.9
3 (1H, m, H-5), 1.60 (3H, s, H-20), 1.58 (3H, s, H-21), 1.56 (1H, m, H-17), 1.36
(2H, m, H-15), 1.06 (2H, m, H-16), 1.06 (3H, d, J = 4.8 Hz, H-22), 0.90 (3H, d,
J = 6.8 Hz, H-19); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ 198.9 (s, C-1), 171.3 (s, - COCH
3), 160.5 (s, C-3), 138.7 (s, C-9), 138.6 (s, C-2), 136.2 (s, C-13), 125.3 (d,
C-12), 122.0 (d, C-8), 70.3 (d, C-4), 68.4 (t, C-18), 61.1 (q, C-23), 60.2 (q, C
-24), 44.2 (d, C-5), 42.5 (d, C-6), 41.0 (t, C-14), 40.9 (t, C-10), 36.8 (d, C-1
7), 34.0 (t, C-16), 28.0 (t, C-7), 27.4 (t, C-11), 26.5 (t, C-15), 20.9 (q, - CO
CH3), 17.2 (q, C-19), 16.4 (q, C-21), 16.0 (q, C-20), 13.2 (q, C-22).
, H-4), 5.16 (1H, t, J = 7.6 Hz, H-8), 5.13 (1H, t, J = 7.2 Hz, H-12), 4.00 (3H,
s, H-24), 3.62 (3H, s, H-23), 3.38 (1H, d, J = 10.2 Hz, H-18a), 3.31 (1H, d, J
= 5.6 Hz, H-18b), 2.53 (1H, m, H-6), 2.26 (1H, m, H-7a), 2.13 (2H, m, H-11), 2.1
0 (3H, s, -OAc), 2.04 (1H, m, H-7b), 2.00 (2H, m, H-10), 1.96 (2H, m, H-14), 1.9
3 (1H, m, H-5), 1.60 (3H, s, H-20), 1.58 (3H, s, H-21), 1.56 (1H, m, H-17), 1.36
(2H, m, H-15), 1.06 (2H, m, H-16), 1.06 (3H, d, J = 4.8 Hz, H-22), 0.90 (3H, d,
J = 6.8 Hz, H-19); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ 198.9 (s, C-1), 171.3 (s, - COCH
3), 160.5 (s, C-3), 138.7 (s, C-9), 138.6 (s, C-2), 136.2 (s, C-13), 125.3 (d,
C-12), 122.0 (d, C-8), 70.3 (d, C-4), 68.4 (t, C-18), 61.1 (q, C-23), 60.2 (q, C
-24), 44.2 (d, C-5), 42.5 (d, C-6), 41.0 (t, C-14), 40.9 (t, C-10), 36.8 (d, C-1
7), 34.0 (t, C-16), 28.0 (t, C-7), 27.4 (t, C-11), 26.5 (t, C-15), 20.9 (q, - CO
CH3), 17.2 (q, C-19), 16.4 (q, C-21), 16.0 (q, C-20), 13.2 (q, C-22).
実施例２．５：AC011
EIMS, m/z 475.2553 [M+Na]+; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 5.81 (1H, d, J = 3.2 Hz
, H-4), 5.57 (1H, m, H-16), 5.55 (1H, m, H-15), 5.15 (1H, t, J = 6.8 Hz, H-12),
5.12 (1H, t, J = 7.2 Hz, H-8), 3.99 (3H, s, H-23), 3.62 (3H, s, H-22), 2.66 (1H,
d, J = 5.2 Hz, H-14), 2.38 (2H, m, H-6), 2.09 (3H, s, -OAc), 2.05 (2H, m, H-11
), 2.03 (1H, m, H-7a), 2.01 (2H, m, H-10), 1.99 (1H, m, H-7b), 1.92 (1H, m, H-5)
, 1.58 (3H, s, H-20), 1.58 (3H, s, H-21), 1.25 (3H, s, H-19), 1.25 (3H, s, H-18)
; 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ 197.1 (s, C-1), 171.6 (s, - COCH3), 161.8 (s, C-3)
, 140.5 (d, C-15), 139.5 (s, C-2), 135.2 (s, C-13), 126.2 (d, C-16), 126.0 (d, C
-12), 122.2 (d, C-8), 121.9 (s, C-9), 71.1 (s, C-17), 71.1 (d, C-4), 61.1 (q, C-
22), 60.0 (q, C-23), 43.5 (t, C-14), 40.8 (t, C-10), 39.2 (t, C-6), 38.3(d, C-5)
, 30.1 (t, C-7), 30.0 (q, C-18), 30.0 (q, C-19), 27.5 (t, C-11), 20.7 (q, - COCH
3), 16.3 (q, C-21), 16.2 (q, C-20).
, H-4), 5.57 (1H, m, H-16), 5.55 (1H, m, H-15), 5.15 (1H, t, J = 6.8 Hz, H-12),
5.12 (1H, t, J = 7.2 Hz, H-8), 3.99 (3H, s, H-23), 3.62 (3H, s, H-22), 2.66 (1H,
d, J = 5.2 Hz, H-14), 2.38 (2H, m, H-6), 2.09 (3H, s, -OAc), 2.05 (2H, m, H-11
), 2.03 (1H, m, H-7a), 2.01 (2H, m, H-10), 1.99 (1H, m, H-7b), 1.92 (1H, m, H-5)
, 1.58 (3H, s, H-20), 1.58 (3H, s, H-21), 1.25 (3H, s, H-19), 1.25 (3H, s, H-18)
; 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ 197.1 (s, C-1), 171.6 (s, - COCH3), 161.8 (s, C-3)
, 140.5 (d, C-15), 139.5 (s, C-2), 135.2 (s, C-13), 126.2 (d, C-16), 126.0 (d, C
-12), 122.2 (d, C-8), 121.9 (s, C-9), 71.1 (s, C-17), 71.1 (d, C-4), 61.1 (q, C-
22), 60.0 (q, C-23), 43.5 (t, C-14), 40.8 (t, C-10), 39.2 (t, C-6), 38.3(d, C-5)
, 30.1 (t, C-7), 30.0 (q, C-18), 30.0 (q, C-19), 27.5 (t, C-11), 20.7 (q, - COCH
3), 16.3 (q, C-21), 16.2 (q, C-20).
実施例２．６：AC-05-01
EIMS, m/z 385.2379 [M+Na]+; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 5.25 (1H, t, J = 4.3 Hz
, H-12), 5.20 (1H, t, J = 4.8 Hz, H-8), 4.69 (1H, m, H-15), 4.16 (1H, q, J = 4.1
Hz, H-4), 2.73 (1H, m, H-17), 2.36 (1H, m , H-14a), 2.31 (1H, m, H-6), 2.29 (1H
, m, H-7a), 2.27 (2H, m, H-3), 2.23 (1H, m, H-14b), 2.19 (1H, m, H-16a), 2.16 (2
H, m, H-11), 2.08 (2H, m, H-10), 2.02 (1H, m, H-7b), 1.98 (1H, m, H-16b), 1.88 (
2H, m, H-2), 1.67 (3H, s, H-20), 1.65 (3H, s, H-21), 1.41 (1H, m, H-5), 1.23 (3H
, d, J = 4.9 Hz, H-19), 1.06 (3H, d, J = 4.3 Hz, H-22); 13C NMR (100 MHz, CD3OD)
δ 213.8 (s, C-1), 182.7 (s, H-18), 137.9 (s, C-9), 131.8 (s, C-13), 129.3 (d,
C-12), 122.7 (d, C-8), 78.8 (d, C-15), 76.2 (d, C-4), 48.6 (d, C-6), 48.2 (d, C-
5), 46.0 (t, C-14), 40.6 (t, C-10), 36.6 (t, C-3), 35.7 (t, C-16), 35.1 (d, C-17
), 32.9 (t, C-7), 29.6 (t, C-2), 27.5 (t, C-11), 16.5 (q, C-20), 16.3 (q, C-21),
16.0 (q, C-19), 11.8 (q, C-22).
, H-12), 5.20 (1H, t, J = 4.8 Hz, H-8), 4.69 (1H, m, H-15), 4.16 (1H, q, J = 4.1
Hz, H-4), 2.73 (1H, m, H-17), 2.36 (1H, m , H-14a), 2.31 (1H, m, H-6), 2.29 (1H
, m, H-7a), 2.27 (2H, m, H-3), 2.23 (1H, m, H-14b), 2.19 (1H, m, H-16a), 2.16 (2
H, m, H-11), 2.08 (2H, m, H-10), 2.02 (1H, m, H-7b), 1.98 (1H, m, H-16b), 1.88 (
2H, m, H-2), 1.67 (3H, s, H-20), 1.65 (3H, s, H-21), 1.41 (1H, m, H-5), 1.23 (3H
, d, J = 4.9 Hz, H-19), 1.06 (3H, d, J = 4.3 Hz, H-22); 13C NMR (100 MHz, CD3OD)
δ 213.8 (s, C-1), 182.7 (s, H-18), 137.9 (s, C-9), 131.8 (s, C-13), 129.3 (d,
C-12), 122.7 (d, C-8), 78.8 (d, C-15), 76.2 (d, C-4), 48.6 (d, C-6), 48.2 (d, C-
5), 46.0 (t, C-14), 40.6 (t, C-10), 36.6 (t, C-3), 35.7 (t, C-16), 35.1 (d, C-17
), 32.9 (t, C-7), 29.6 (t, C-2), 27.5 (t, C-11), 16.5 (q, C-20), 16.3 (q, C-21),
16.0 (q, C-19), 11.8 (q, C-22).
実施例３：牛樟芝化合物の置換基修飾
前記牛樟芝化合物の化学構造を分析した後、そのC3とC4置換基を修飾する。その置換基
で改造された産物がC4に水酸基（−OH）で置換されたものは、H1で標識される。その置換
基で改造された産物がC4に水酸基で置換され且つC4にジメトキシ（dimethoxy）で置換さ
れたものは、H2で標識される。
前記牛樟芝化合物の化学構造を分析した後、そのC3とC4置換基を修飾する。その置換基
で改造された産物がC4に水酸基（−OH）で置換されたものは、H1で標識される。その置換
基で改造された産物がC4に水酸基で置換され且つC4にジメトキシ（dimethoxy）で置換さ
れたものは、H2で標識される。
１モル当量のNaOMe （Sodium methoxide)及び無水エタノールを溶剤としてAC012を加水
分解反応させる。加水分解プロセスをTLC(thin layer chromatography)で監視測定し、完
全に反応した後、アンバーライト樹脂（amberlite）を加えて中和反応させ、またamberli
teを濾紙で濾過した後、中間産物を得る。
分解反応させる。加水分解プロセスをTLC(thin layer chromatography)で監視測定し、完
全に反応した後、アンバーライト樹脂（amberlite）を加えて中和反応させ、またamberli
teを濾紙で濾過した後、中間産物を得る。
該中間産物を、順相システムを利用してシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分析し
、シリカゲルで樹脂を分離し、hexane/ethyl acetateを流動相とする。溶出比例はhexane
:ethyl acetate=4:1から1:1まで、溶出プロセスをTLCで監視測定し、AC012-H1とAC012-H2
の混合物はhexane:ethyl acetate=1:1である時点に溶出され、それを収集して濃縮し、濃
縮された産物を得る。
、シリカゲルで樹脂を分離し、hexane/ethyl acetateを流動相とする。溶出比例はhexane
:ethyl acetate=4:1から1:1まで、溶出プロセスをTLCで監視測定し、AC012-H1とAC012-H2
の混合物はhexane:ethyl acetate=1:1である時点に溶出され、それを収集して濃縮し、濃
縮された産物を得る。
濃縮された該産物を逆相HPLCで最後に純化し、C18でステンレス製カラムを分取し、移
動相であるエタノール：0.1％のリン酸緩衝生理食塩水（phosphate buffered saline）＝
75：25を用いて単一比例で溶出する。
AC012-1の保持時間（retention time）は約31minから25minまでである。AC012-H2は39m
inから43minまでである。
動相であるエタノール：0.1％のリン酸緩衝生理食塩水（phosphate buffered saline）＝
75：25を用いて単一比例で溶出する。
AC012-1の保持時間（retention time）は約31minから25minまでである。AC012-H2は39m
inから43minまでである。
AC012-H1及びAC012-H2の化学構造は下記に示すとおりである。
同じ置換基の加水分解方法は本発明が提供する他の牛樟芝化合物にも適用できる。
初期半応物がAC007であれば、AC007-H1の保持時間は36‐43分であり、AC007-H2の保持
時間は47‐53分である。
初期反応物がAC009であれば、AC009-H1の保持時間は27‐32分であり、AC009-H2の保持
時間は35‐40分である。
初期半応物がAC007であれば、AC007-H1の保持時間は36‐43分であり、AC007-H2の保持
時間は47‐53分である。
初期反応物がAC009であれば、AC009-H1の保持時間は27‐32分であり、AC009-H2の保持
時間は35‐40分である。
実施例４：牛樟芝化合物が血管新生を抑制する効果
本発明はSR8試験及び血管形成試験（matrigel capillary tube formation assay）を使
用し、牛樟芝から精製された化合物が血管新生を抑制することを確認する。
SRB試験はヒト内皮前駆細胞（EPC、endothelial progenitor cells）を5*103の細胞/培
養皿ウェル（cell/well）の数量比例で96ウェルの培養皿に置き、且つそれを無血清（ser
um free）の培地に置いて48時間飢餓状態にさせた後、10％のFBS培地及び異なる濃度のAC
012に入れて48時間培養する。AC012の濃度はそれぞれ0.1、0.3、1、3、10と30マイクログ
ラム/ミリリットル（μg/ml）である。処理薬物で培養した後の培地を取り出して、培養
皿のウェルに100マイクロリットル（μl）10％のトリクロロ酢酸（trichloroacetic acid
）（ｗ/ｖ）を加え、4℃で1時間放置することで細胞を固定する。培養皿を脱イオン水で
洗浄して乾燥する。それぞれのウェルに50マイクロリットル0.4％のSulforhodamine B (S
RB) (w/v)（また1％の酢酸を含む）を加えて室温で5分放置する。次に1％の酢酸で細胞と
結合しないSRBを洗浄してから乾燥する。細胞と結合したSRBを100マイクロリットル10ｍM
のTrisバッファ（ｐHは10.5）で溶解し、且つ光度計で495ｎｍに定量する。
本発明はSR8試験及び血管形成試験（matrigel capillary tube formation assay）を使
用し、牛樟芝から精製された化合物が血管新生を抑制することを確認する。
SRB試験はヒト内皮前駆細胞（EPC、endothelial progenitor cells）を5*103の細胞/培
養皿ウェル（cell/well）の数量比例で96ウェルの培養皿に置き、且つそれを無血清（ser
um free）の培地に置いて48時間飢餓状態にさせた後、10％のFBS培地及び異なる濃度のAC
012に入れて48時間培養する。AC012の濃度はそれぞれ0.1、0.3、1、3、10と30マイクログ
ラム/ミリリットル（μg/ml）である。処理薬物で培養した後の培地を取り出して、培養
皿のウェルに100マイクロリットル（μl）10％のトリクロロ酢酸（trichloroacetic acid
）（ｗ/ｖ）を加え、4℃で1時間放置することで細胞を固定する。培養皿を脱イオン水で
洗浄して乾燥する。それぞれのウェルに50マイクロリットル0.4％のSulforhodamine B (S
RB) (w/v)（また1％の酢酸を含む）を加えて室温で5分放置する。次に1％の酢酸で細胞と
結合しないSRBを洗浄してから乾燥する。細胞と結合したSRBを100マイクロリットル10ｍM
のTrisバッファ（ｐHは10.5）で溶解し、且つ光度計で495ｎｍに定量する。
Matrigel capillary tube formation試験は下記ステップを含む。Matrigelを10μl/wel
lで15ウェルの培養皿に加え、37℃で30min放置してゲル層を形成する。その後、5*103のE
PC細胞、VEGF(vascular endothelia growth factor)及び濃度が異なっているAC012（0、0
.1、0.3、1μg/ml）を培養皿のウェルに入れ、37℃、5％の二酸化炭素という条件で16時
間放置する。その後、位相差顕微鏡（inverted contrast phase microscope (Nikon, Jap
an)）で細胞の生成を観察する。
lで15ウェルの培養皿に加え、37℃で30min放置してゲル層を形成する。その後、5*103のE
PC細胞、VEGF(vascular endothelia growth factor)及び濃度が異なっているAC012（0、0
.1、0.3、1μg/ml）を培養皿のウェルに入れ、37℃、5％の二酸化炭素という条件で16時
間放置する。その後、位相差顕微鏡（inverted contrast phase microscope (Nikon, Jap
an)）で細胞の生成を観察する。
AC012が血管新生を抑制する効果
IC50は29μg/ml；1μg/mlのAC012は31.89％の血管新生を抑制できる。
IC50は29μg/ml；1μg/mlのAC012は31.89％の血管新生を抑制できる。
実施例５ 牛樟芝化合物が癌細胞の増殖を抑制する効果
SRB試験で牛樟芝から精製された化合物及びその誘導体が癌細胞の増殖を抑制する効果
を確認する。
この実施例はすなわちAC006、AC007、AC009、AC011とAC012及びその加水分解で置換基
を改造した生成物が、多種類の癌細胞株の増殖を抑制するかどうかを確認する。
SRB試験で牛樟芝から精製された化合物及びその誘導体が癌細胞の増殖を抑制する効果
を確認する。
この実施例はすなわちAC006、AC007、AC009、AC011とAC012及びその加水分解で置換基
を改造した生成物が、多種類の癌細胞株の増殖を抑制するかどうかを確認する。
それぞれの細胞株を5*103cell/wellsの数量比例で96ウェルの培養皿に置き、且つそれ
を無血清（serum free）の培地で48時間飢餓状態にさせた後、10％のFBS培地及び0.1、0.
3、1、3、10及び30μg/mlなどの濃度のAC006、AC007、AC009、AC011、AC012に入れて48時
間培養する。処理薬物で培養した後の培地を取り出して培養皿のウェルに100マイクロリ
ットル（μl）10％のトリクロロ酢酸（trichloroacetic acid）（ｗ/ｖ）を加え、4℃で1
時間放置することで細胞を固定する。培養皿を脱イオン水で洗浄して乾燥する。それぞれ
のウェルに50マイクロリットル0.4％のSulforhodamine B (SRB) (w/v)（また1％の酢酸を
含む）を加えて室温で5min放置し、次に1％の酢酸で細胞と結合しないSRBを洗浄してから
乾燥する。細胞と結合したSRBを100マイクロリットル10ｍMのTris緩衝液（ｐHは10.5）で
溶解し、且つ光度計で495ｎｍに定量する。
を無血清（serum free）の培地で48時間飢餓状態にさせた後、10％のFBS培地及び0.1、0.
3、1、3、10及び30μg/mlなどの濃度のAC006、AC007、AC009、AC011、AC012に入れて48時
間培養する。処理薬物で培養した後の培地を取り出して培養皿のウェルに100マイクロリ
ットル（μl）10％のトリクロロ酢酸（trichloroacetic acid）（ｗ/ｖ）を加え、4℃で1
時間放置することで細胞を固定する。培養皿を脱イオン水で洗浄して乾燥する。それぞれ
のウェルに50マイクロリットル0.4％のSulforhodamine B (SRB) (w/v)（また1％の酢酸を
含む）を加えて室温で5min放置し、次に1％の酢酸で細胞と結合しないSRBを洗浄してから
乾燥する。細胞と結合したSRBを100マイクロリットル10ｍMのTris緩衝液（ｐHは10.5）で
溶解し、且つ光度計で495ｎｍに定量する。
実施例5.1：AC006の抑制効果
AC006で4種類の異なる癌をテストする。7種類の異なる癌細胞株が含まれ、それは半数
の癌細胞の増殖を抑制できる有効な濃度、すなわちIC50効果である。
その結果をは表１に示す。
AC006で4種類の異なる癌をテストする。7種類の異なる癌細胞株が含まれ、それは半数
の癌細胞の増殖を抑制できる有効な濃度、すなわちIC50効果である。
その結果をは表１に示す。
実施例5.2：AC007及びその誘導体の抑制効果
AC007で5種類の異なる癌をテストする。7種類の異なる癌細胞株が含まれている。
そのIC50効果を表２及び３に示す。
AC007で5種類の異なる癌をテストする。7種類の異なる癌細胞株が含まれている。
そのIC50効果を表２及び３に示す。
実施例5.3：AC009及びその誘導体の抑制効果
AC009及びその誘導体で4種類の異なる癌をテストしり。10種類の異なる癌細胞株が含ま
れている。そのIC50効果を表４及び５に示す。
AC009及びその誘導体で4種類の異なる癌をテストしり。10種類の異なる癌細胞株が含ま
れている。そのIC50効果を表４及び５に示す。
実施例5.4：AC011の抑制効果
AC011で4種類の異なる癌細胞株をテストする。IC50の結果を表６に示す。
AC011で4種類の異なる癌細胞株をテストする。IC50の結果を表６に示す。
実施例5.4：AC012及びその誘導体の抑制効果
AC012及びその誘導体で5種類の異なる癌をテストする。8種類の異なる癌細胞株が含ま
れる。そのIC50効果を表７及び８に示す。
AC012及びその誘導体で5種類の異なる癌をテストする。8種類の異なる癌細胞株が含ま
れる。そのIC50効果を表７及び８に示す。
実施例から、本発明は牛樟芝化合物及びその抽出方法を提供し、且つその化学構造を分
析し、それが低濃度で血管新生を抑制する効果を開示する。該牛樟芝化合物に基づき、本
発明も化学的に新規な化合物を合成する方法を提供する。本発明に開示された新規な抽出
方法は該化合物を大量に精製することができ、牛樟芝子実体を培養するコストを軽減する
。
本発明は、また、該化合物が癌細胞の増殖を抑制できる効果を有することを開示し、癌
治療用薬物の製造に適用できる。その他、牛樟芝化合物の加水分解により、その置換基を
改造して得る新規な化合物H１は、化合物が癌細胞、特に大腸癌細胞株の増殖を抑制する
効果を効果的に向上させることができる。ここでHCT116は低い表現量を特徴とするBax（W
ang et al. 2012)、及びgrowth factor(TGFα and EGFR)-independent (Howell et al. 1
998)である。更に、本発明で提供される化合物は肝癌細胞にとってもその増殖を抑制する
高度な効果を有し、特にアジア人からの上皮様肝癌細胞株（epithelial-like tumorigeni
c cells）であるHuh-7に対してHFE突然変異を特徴とする（Vecchi et al. 2009）。
本発明は牛樟芝化合物を精製する方法を提供し、その化学構造及びそれが血管新生及び
癌細胞の増殖を抑制する効果に関する。
析し、それが低濃度で血管新生を抑制する効果を開示する。該牛樟芝化合物に基づき、本
発明も化学的に新規な化合物を合成する方法を提供する。本発明に開示された新規な抽出
方法は該化合物を大量に精製することができ、牛樟芝子実体を培養するコストを軽減する
。
本発明は、また、該化合物が癌細胞の増殖を抑制できる効果を有することを開示し、癌
治療用薬物の製造に適用できる。その他、牛樟芝化合物の加水分解により、その置換基を
改造して得る新規な化合物H１は、化合物が癌細胞、特に大腸癌細胞株の増殖を抑制する
効果を効果的に向上させることができる。ここでHCT116は低い表現量を特徴とするBax（W
ang et al. 2012)、及びgrowth factor(TGFα and EGFR)-independent (Howell et al. 1
998)である。更に、本発明で提供される化合物は肝癌細胞にとってもその増殖を抑制する
高度な効果を有し、特にアジア人からの上皮様肝癌細胞株（epithelial-like tumorigeni
c cells）であるHuh-7に対してHFE突然変異を特徴とする（Vecchi et al. 2009）。
本発明は牛樟芝化合物を精製する方法を提供し、その化学構造及びそれが血管新生及び
癌細胞の増殖を抑制する効果に関する。
Claims (14)
- 化合物AC007-H1は下記のように：
- 化合物AC009-H1は下記のように：
- 化合物AC012-H1は下記のように：
- 癌を治療する医薬組成物は、治療に有効な量の化合物、及び少なくとも一つの薬学的に許容されるキャリア、塩類やプロドラッグを含むことを特徴とする；該化合物はAC006、AC007、AC009、AC011、AC012、AC007-H1、AC009-H1、及びAC012-H1からなるグループから選択されるか、又は前記化合物のいずれかの少なくとも二つからなる組成物から選択される。
- 該キャリアは賦形剤、希釈剤、増粘剤、充填剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、油性や非油性の基剤、界面活性剤、懸濁化剤、ゲル化剤、補助剤、防腐剤、酸化防止剤、安定剤、色素や香料を含むことを特徴とする請求項４に記載の医薬組成物。
- 該医薬組成物は癌細胞の増殖を抑制することで治療することを特徴とする請求項４に記載の医薬組成物。
- 該医薬組成物は静脈注射、皮下注射、経口や塗抹の方法で患者に投与することを特徴とする請求項４に記載の医薬組成物。
- 該医薬組成物は溶液、乳剤、懸濁剤、粉末、錠剤、油剤、軟膏剤、経口剤、カプセルを含む剤形をすることを特徴とする請求項４に記載の医薬組成物。
- 癌を治療する方法は、有効な量の請求項４に記載の医薬組成物を投与することを特徴とする。
- 該癌は前立腺癌、肝癌、黒色腫、脳腫瘍、大腸癌からなるグループから選択されることを特徴とする請求項９に記載の方法。
- 該癌は大腸癌と肝癌であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
- 該医薬組成物は静脈注射、皮下注射、経口、や塗抹の方法で患者に投与することを特徴とする請求項９に記載の方法。
- 牛樟芝菌糸体で生物活性を有する化合物及びその誘導体を調製する方法は、以下のステップを含む：
牛樟芝菌糸体をｎ-ヘキサンで二回に還流抽出し、それぞれ一時間から三時間まで行った後、二回の抽出液を混合して濾過する；
７０−３２０ウェルのシリカゲル（silica gel）（７０−２３０ｍesh）を取り菌糸体と１：１（ｗ／ｗ）の重量比でカラムに充填し、ｎ-Hexane／酢酸エチル（Ethyl acetate）で勾配溶出し、溶出物はF1、F2とF3という割合に分けられ、それぞれの勾配は１７−２２％のEthyl acetate、２３−２７％のEthyl acetate及び２８−３３％のEthyl acetateであり、F3を保持時間（retention time）の順序に基づいて三つの段階F3-1~F3-3に分ける；
F3-1を取って移動相であるジクロロメタン／アセトン（CH2Cl2/Acetone）を用いて、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し（極性は50：1から20：1まで勾配溶出する）、40：1−15：1という段階を取り、更に順相MPLCでカラムを半分取しｎ-Hexane／Ethyl acetate（4：1）で分離純化してから化合物AC006を得る；
F3-2を順相MPLCシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、移動相であるCH2Cl2/Acetoneを用いてに勾配分離し（100％：0％ to 70%:30%）、95％:5％から85％:15％までの段階を取ってF3-2-1からF3-2-3まで三つの段階に分ける；
F3-2-3を更に分離純化し、移動相であるn-hexane/Acetoneを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し（100%:0% to 0%:100%）、n-hexane/Acetone=90/10から70/30までの段階を取って移動相であるn-hexane/Acetoneを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し続けて（100%:0% to 0%:100%)、n-hexane/Ethyl acetate=60/40にAC007を得る；
F-3-3を順相MPLCシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、移動相であるCH2Cl2/Acetoneを用いて勾配溶出分離し（100％：0％ to 0%:100%）、90％:10％から70％:30％までの段階を取ってF3-3-1からF3-3-5まで五つの段階に分ける；F-3-3-5（CH2Cl2/Acetone=73/27の段階）を更に分離純化し、移動相であるn-hexane/Acetoneを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離して（95%:5% to 50%:50%）、85%:15% to 70%:30%段階を取ってF3-3-5-1からF3-3-5-5まで五つの段階に分ける；
F3-3-5-1（n-hexane/Acetone=90/10-80/20）を更に逆相MPLC C-18カラムクロマトグラフィーで分離純化し、移動相である1％のメタノール／Methanol＝35％／65％から20％／80％まで勾配溶出し、28%/72%-22%/78%の段階を取って移動相であるn-hexane/Ethyl acetate=80%:20%から50%:50%までシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し、n-hexane/Ethyl acetate=75%:25%-65%:35%にAC012を得る；
F3-3-5-3を更に逆相MPLC C-18シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離純化し、移動相である1％のメタノール／Methanol＝25／75などの勾配で15ｍL／minの流速で溶出し、AC009が主とする段階（保持時間は130‐170min）を取って更に純化し、移動相であるCH2Cl2/Ethyl acetateを用いて（silica gel）シリカゲルカラムクロマトグラフィーで勾配溶出し（90%:0% to 0%:100%）、CH2Cl2/Ethyl acetate=80%/20%- 60%/40%にAC009を得る；
F3-3-5-4（n-hexane/Acetone=76/24)を取って逆相MPLC C-18カラムクロマトグラフィーで分離純化し、移動相である1％のメタノール／Methanol＝25％:75％などまで勾配溶出し、純化産物はAC011である；
ここにおいて、該AC006、AC007、AC009、AC011、AC012はすなわち生物活性を有する化合物である。 - 該生物活性を有する化合物は更にC4が水酸基である誘導体の調製に適用でき、以下のステップを含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法：１モル当量のメタノールで該生物活性を有する化合物を加水分解させる；加水分解反応が終わった後アンバライト樹脂を加えて濾紙で濾過した後中間産物を得る；シリカゲルカラムクロマトグラフィーで該中間産物を分離し、n-ヘキサンと酢酸エチルを移動相とし、勾配比例をn-ヘキサンと酢酸エチル4:1から1:1までとして、勾配比例が1:1である時点に産物を収集する；該産物を逆相HPLC及びC18によりカラムを半取分し純化し、メタノール／FAバッファで75:25で勾配溶出し、C4がヒドロキシル基である誘導体を得ることができる。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201462098177P | 2014-12-30 | 2014-12-30 | |
| US62/098,177 | 2014-12-30 | ||
| PCT/CN2015/099894 WO2016107582A1 (en) | 2014-12-30 | 2015-12-30 | Compounds from antrodia camphorata, method for preparing the same and use thereof |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2018507175A true JP2018507175A (ja) | 2018-03-15 |
| JP2018507175A5 JP2018507175A5 (ja) | 2021-03-18 |
| JP6896630B2 JP6896630B2 (ja) | 2021-06-30 |
Family
ID=56163420
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2017535086A Active JP6896630B2 (ja) | 2014-12-30 | 2015-12-30 | 牛樟芝化合物、その製造方法及び用途 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9884801B2 (ja) |
| EP (1) | EP3240772B1 (ja) |
| JP (1) | JP6896630B2 (ja) |
| CN (1) | CN105732381B (ja) |
| ES (1) | ES2869904T3 (ja) |
| MY (1) | MY173104A (ja) |
| PL (1) | PL3240772T3 (ja) |
| TW (1) | TWI648257B (ja) |
| WO (1) | WO2016107582A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2022523521A (ja) * | 2019-02-25 | 2022-04-25 | アージル・バイオテック・ホールディング・カンパニー・リミテッド | ウイルス感染を阻害するための方法および組成物 |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106063800B (zh) * | 2016-08-01 | 2020-02-18 | 上海交通大学 | 牛樟芝在抗前列腺增生药物中的应用 |
| JP7104989B2 (ja) * | 2016-11-18 | 2022-07-22 | ゴールデン バイオテクノロジー コーポレーション | アトピー性皮膚炎を処置するための方法および組成物 |
| CN108409571A (zh) * | 2018-03-23 | 2018-08-17 | 中国药科大学 | 从金刚纂中提取的用于治疗癌症的化合物 |
| CN113831221B (zh) * | 2021-09-18 | 2023-04-07 | 云南民族大学 | 一种倍半萜类化合物及其制备方法与应用 |
| CN114487252B (zh) * | 2021-12-28 | 2024-03-26 | 陕西嘉禾生物科技股份有限公司 | 一种用于区别牛樟芝和牛樟木的薄层色谱鉴别方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009102286A (ja) * | 2007-10-19 | 2009-05-14 | Golden Biotechnology Corp | ベニクスノキタケ抽出物から分離させた新化合物 |
| CN103570531A (zh) * | 2012-07-25 | 2014-02-12 | 丽丰实业股份有限公司 | 樟芝菌丝体的化合物及其用途 |
| JP2014181233A (ja) * | 2013-03-20 | 2014-09-29 | Hui Ling Tseng | ベニクスノキタケより分離した化合物、抽出物及びその用途 |
| US20150336918A1 (en) * | 2014-05-20 | 2015-11-26 | Hui Ling Tseng | Use of compounds from antrodia camphorata in manufacturing medicaments for treating kidney diseases |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6247838B1 (en) | 1998-11-24 | 2001-06-19 | The Boc Group, Inc. | Method for producing a liquid mixture having a predetermined concentration of a specified component |
| US7531627B2 (en) | 2003-12-19 | 2009-05-12 | Po-Jung Chien | Protein ACA1 of Antrodia camphorata |
| US7109232B2 (en) | 2004-03-08 | 2006-09-19 | Simpson Biotech Co., Ltd. | Compounds from Antrodia camphorata having anti-inflammatory and anti-tumor activity |
| EP1634877B1 (en) | 2004-08-17 | 2011-06-22 | Simpson Biotech Co., Ltd. | Mixture and compounds from mycelia of antrodia camphorata and use thereof |
| US7601854B2 (en) | 2006-10-25 | 2009-10-13 | Kang Jian Biotech Corp., Ltd. | Diterpenes from the fruiting body of Antrodia camphorata and pharmaceutical compositions thereof |
| TW200829234A (en) | 2007-01-08 | 2008-07-16 | Golden Biotechnology Corp | Antrodia camphorata isophorone extract |
| CN101417934B (zh) * | 2007-10-24 | 2012-04-18 | 国鼎生物科技股份有限公司 | 分离自牛樟芝萃取物的化合物 |
| TW201000112A (en) | 2008-06-18 | 2010-01-01 | Mackay Memorial Hospital | Use of dehydrosulphurenic acid for inhibiting the growth of cancer cells |
| US8309611B2 (en) * | 2010-09-20 | 2012-11-13 | Golden Biotechnology Corporation | Methods and compositions for treating lung cancer |
| US20130158113A1 (en) * | 2011-06-10 | 2013-06-20 | Golden Biotechnology Corporation | Methods and compositions for treating brain cancer |
| TWI583376B (zh) * | 2013-03-20 | 2017-05-21 | Hui-Ling Zeng | Compounds isolated from Antelroxicus and their use |
| CN104177240B (zh) * | 2013-05-28 | 2016-10-19 | 曾卉菱 | 分离自牛樟芝的化合物、萃取物及其用途 |
| CN104211627A (zh) * | 2013-05-29 | 2014-12-17 | 曾卉菱 | 牛樟芝化合物、萃取物及其用途 |
-
2015
- 2015-12-30 PL PL15875258T patent/PL3240772T3/pl unknown
- 2015-12-30 CN CN201511023602.XA patent/CN105732381B/zh active Active
- 2015-12-30 JP JP2017535086A patent/JP6896630B2/ja active Active
- 2015-12-30 EP EP15875258.4A patent/EP3240772B1/en active Active
- 2015-12-30 MY MYPI2017702368A patent/MY173104A/en unknown
- 2015-12-30 US US14/984,442 patent/US9884801B2/en active Active
- 2015-12-30 TW TW104144385A patent/TWI648257B/zh active
- 2015-12-30 WO PCT/CN2015/099894 patent/WO2016107582A1/en active Application Filing
- 2015-12-30 ES ES15875258T patent/ES2869904T3/es active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009102286A (ja) * | 2007-10-19 | 2009-05-14 | Golden Biotechnology Corp | ベニクスノキタケ抽出物から分離させた新化合物 |
| CN103570531A (zh) * | 2012-07-25 | 2014-02-12 | 丽丰实业股份有限公司 | 樟芝菌丝体的化合物及其用途 |
| JP2014181233A (ja) * | 2013-03-20 | 2014-09-29 | Hui Ling Tseng | ベニクスノキタケより分離した化合物、抽出物及びその用途 |
| US20150336918A1 (en) * | 2014-05-20 | 2015-11-26 | Hui Ling Tseng | Use of compounds from antrodia camphorata in manufacturing medicaments for treating kidney diseases |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| COMPREHENSIVE ORGANIC NAME REACTIONS AND REAGENTS, JPN6019035486, 2010, pages 3123 - 3128, ISSN: 0004114204 * |
| YEN, I-CHUAN ET AL.: "Anti-cancer agents derived from solid-state fermented Antrodia camphorata mycelium", FITOTERAPIA, vol. 102, JPN6018025120, 2015, pages 115 - 119, ISSN: 0004114203 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2022523521A (ja) * | 2019-02-25 | 2022-04-25 | アージル・バイオテック・ホールディング・カンパニー・リミテッド | ウイルス感染を阻害するための方法および組成物 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105732381A (zh) | 2016-07-06 |
| US9884801B2 (en) | 2018-02-06 |
| CN105732381B (zh) | 2021-07-20 |
| TWI648257B (zh) | 2019-01-21 |
| MY173104A (en) | 2019-12-26 |
| EP3240772A1 (en) | 2017-11-08 |
| US20160185703A1 (en) | 2016-06-30 |
| WO2016107582A1 (en) | 2016-07-07 |
| EP3240772B1 (en) | 2021-03-03 |
| PL3240772T3 (pl) | 2021-06-28 |
| TW201623208A (zh) | 2016-07-01 |
| EP3240772A4 (en) | 2018-08-29 |
| ES2869904T3 (es) | 2021-10-26 |
| JP6896630B2 (ja) | 2021-06-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6896630B2 (ja) | 牛樟芝化合物、その製造方法及び用途 | |
| KR20010030746A (ko) | 스테로이드성 사포닌을 이용한 치매의 예방 치료와스테로이드성 사포닌 화합물 | |
| JP2012522022A (ja) | 新規サルビアノール酸化合物ｌ、その調製方法及び使用 | |
| JP6549544B2 (ja) | ガンおよび他の疾患を治療するための新規化合物 | |
| JP6302102B2 (ja) | ベニコウジカビ（ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ）から単離された化合物、その調製方法及び使用 | |
| JP2018507175A5 (ja) | ||
| TWI280881B (en) | Use of hederagenin 3-O-alpha-L-rhamnopyranosyl((1->2)-[beta-D-glucopyranosyl(1->4)]-alpha-L-arabinopyranoside or an extract from pulsatillae radix containing the same as a therapeutic agent for solid tumors | |
| CN103880856B (zh) | 没药烷型倍半萜类衍生物及其药物组合物和其在制药中的应用 | |
| JP2007063244A (ja) | トリテルペン化合物、その製造方法及びそれを有効成分として含有する発癌プロモーション抑制組成物 | |
| CN115894418A (zh) | 蒙古蒿内酯a-f及其药物组合物和其制备方法与应用 | |
| CN111233808A (zh) | 一种新双黄酮类化合物及其制备方法和用途 | |
| KR101780939B1 (ko) | 인삼 유래 화합물 분리방법 및 이를 이용한 항염증 조성물 | |
| WO2005116042A1 (en) | Treatment and prevention of cancer with new ginsenoside derivatives | |
| CN110934877A (zh) | 过氧麦角甾醇和egfr靶点抗体组合物及其在头颈部鳞状细胞癌上应用 | |
| CN110812479A (zh) | 没食子酸和egfr靶点抗体组合物及其在肺癌上应用 | |
| CN109180632A (zh) | 一种从雷公藤中分离出的新化合物及其制备方法和医药用途 | |
| JP4810642B2 (ja) | 癌転移抑制用トリテルペン誘導体及び該トリテルペン誘導体を用いた癌転移抑制用組成物 | |
| CN117586214A (zh) | 乌药烷型倍半萜二聚体及其制备方法和用途 | |
| CN110959851A (zh) | 圆孢蘑菇没食子酸在功能食品中的应用 | |
| KR20060086781A (ko) | 진세노사이드 유도체 및 그의 용도 | |
| KR101873607B1 (ko) | 암 및 다른 질환들을 치료하기 위한 화합물 | |
| WO2011016351A1 (ja) | Ｄｎａ合成酵素阻害剤 | |
| JPH0341076A (ja) | ビス―テトラヒドロフラン型新規化合物類および該化合物類を有効成分とする抗腫瘍剤 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170921 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20170921 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20171130 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20180621 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180703 |
|
| A524 | Written submission of copy of amendment under article 19 pct |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A524 Effective date: 20181003 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20190212 |
|
| A524 | Written submission of copy of amendment under article 19 pct |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A524 Effective date: 20190611 |
|
| C60 | Trial request (containing other claim documents, opposition documents) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C60 Effective date: 20190611 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20190611 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20190704 |
|
| C21 | Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C21 Effective date: 20190709 |
|
| A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20190913 |
|
| C211 | Notice of termination of reconsideration by examiners before appeal proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C211 Effective date: 20190924 |
|
| C22 | Notice of designation (change) of administrative judge |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C22 Effective date: 20200225 |
|
| C22 | Notice of designation (change) of administrative judge |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C22 Effective date: 20200414 |
|
| C13 | Notice of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C13 Effective date: 20200609 |
|
| A524 | Written submission of copy of amendment under article 19 pct |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A524 Effective date: 20200908 |
|
| C22 | Notice of designation (change) of administrative judge |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C22 Effective date: 20201027 |
|
| C13 | Notice of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C13 Effective date: 20201104 |
|
| A524 | Written submission of copy of amendment under article 19 pct |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A524 Effective date: 20210201 |
|
| C22 | Notice of designation (change) of administrative judge |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C22 Effective date: 20210413 |
|
| C23 | Notice of termination of proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C23 Effective date: 20210420 |
|
| C03 | Trial/appeal decision taken |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C03 Effective date: 20210525 |
|
| C30A | Notification sent |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C3012 Effective date: 20210525 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20210609 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6896630 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |