KR100352148B1 - 베타-시토스테롤을 포함하는 혈관형성 촉진 및 관절염예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 베타-시토스테롤을 포함하는 혈관형성 촉진 및 관절염 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 베타-시토스테롤을 포함하는 본 발명의 조성물은 강력한 혈관형성 촉진효과를 나타내어 창상부위나 수술부위 등의 회복을 위해 특히 외과적 영역에서 바람직하게 사용될 수 있으며, 또한 관절염 예방 및 치료용으로도 사용될 수 있다.

Description

베타-시토스테롤을 포함하는 혈관형성 촉진 및 관절염 예방 및 치료용 조성물 {Compositions for angiogenesis and preventing and treating arthritis comprising β-sitosterol}
본 발명은 베타-시토스테롤(β-sitosterol)을 포함하는 혈관형성 촉진 및 관절염 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
혈관형성은 상처받은 피부조직이 재생되기 위해서 필수적인 상처회복(wound repair)과정에 반드시 수반되어야 하는 요건이다. 상처의 초기 단계에는 세포가 죽고 혈관의 파괴로 인한 염증반응이 일어나게 되며, 이 염증반응 이후에 혈액성분의 탈혈관 현상, 혈소판의 활성화, 혈액응고, 칼리크레인, 트롬빈, 플라스민 등과 같은 생물학적 매개물질의 형성이라는 일련의 과정을 거치게 된다. 결국 상처받은 부위에서 새로운 조직이 형성되고 세포의 기질의 합성과 재구성이 일어나 상처 입은 조직은 재기능을 할 수 있도록 치유되는 것이다. 염증의 과정을 살펴보면 내피세포나 면역에 관여하는 과립구, 비만세포 및 혈소판 등의 복잡한 폭상반응 (cascade reaction)을 일으키며 상처부위에의 이물질 침투를 억제하는 방어기작을 수행한다. 이러한 면역학적인 방어기작과 함께 표피세포, 대식세포, 내피세포, 섬유아세포 등이 여러 종류의 성장인자를 분비하여 새로운 조직의 형성을 위한 세포분열의 촉진이 일어나고, 그와 동시에 표피세포, 내피세포, 섬유아세포 등이 분비하는 여러 세포의 기질 단백질에 의한 세포 기질의 재구성이 일어나서 상처의 치유가 완성되고 새로운 조직이 상처부위에 형성된다. 이러한 복잡한 상처치유의 반응과 함께 수반되는 중요한 현상이 혈관생성이다. 혈관생성은 상처치유 과정중에 새로운 조직이 형성되면서 이러한 조직에 적당한 산소와 영양분을 공급해 주어 그 조직이 정상적인 신체의 일부로서 재생이 되고 기능이 수행되도록 해 준다.
혈관형성 과정은 상처받은 세포에서 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor:FGF)가 나와 상처부위 주위에 있는 혈관벽의 혈관내피세포를 자극하여 플라스미노겐 활성화인자와 프로-콜라게나제(pro-collagenase)를 분비하도록 하는 것으로부터 시작된다. 플라스미노겐 활성화인자는 플라스미노겐을 플라스민으로, 프로콜라게나제를 콜라게나제로 활성화시키고, 이 두 효소는 자극받은 혈관내피세포를 둘러싸고 있는 기저막(basement membrane)을 분해시킨다. 상처부위에서 유출된 헤파린이나 피브로넥틴 단편과 같은 혈관내피세포 유도물질이 혈관내피세포를 자극하여 위족을 내어 기저막이 분해된 곳을 통해 연결조직쪽으로 이동하게 된다. 이동이 끝나면 다시 기저막을 재합성하여 새로운 진피에 안정된 구조를 형성한다. 일단 모세혈관이 기존에 있던 혈관에서부터 뻗어 나오게 되면 강(lumen)이 형성되고 혈액이 흐를 수 있게 된다. 계속적인 혈관내피세포의 분열로 모세혈관의 확장은 이루어진다. 새로 형성된 모세혈관에 의해 영양분의 공급과 여러 인자에 의해 상처난 조직은 조직의 재구성을 통해 정상적인 조직으로 회복되는 것이다.
한편, 알로에는 백합과(Liliaceae)에 속하는 약용식물로서 위궤양, 화상, 염증, 당뇨병 등의 치료제, 소염제, 면역증강제 등 다양한 약효가 있는 것으로 알려져 고대로부터 민간에서 널리 이용되어 오고 있던 귀중한 생약제이다. 이에 따라 최근에 이르러 알로에에는 어떠한 성분들이 함유되어 있으며, 그 성분들이 어떠한 약물학적 효과를 나타내는지에 대한 연구가 여러 방면에서 이루어지고 있다. 지금까지의 연구결과들에 따르면 알로에에는 크게 분류하여 안트라퀴논 유도체, 다당류 계통의 물질 및 그 밖의 알칼로이드계 물질 등의 3 그룹의 유효성분들이 함유되어 있는 것으로 추정할 수 있다. 그러나, 아직까지 알로에의 성분 중에서 어떠한 성분이 각각의 작용을 나타내는지에 대한 구체적이고 체계적인 연구결과는 보고된 바없다. 따라서 현재는 알로에의 특정성분을 추출하여 이용하기 보다는 주로 알로에의 잎을 절단하여 천연물 그대로 사용하고 있는 실정이다. 이에 따라 그 천연물 중에는 목적하는 효과를 나타내는 성분이외의 성분이 포함될 수 있기 때문에 복용하는 사람에 따라서는 원치 않는 부작용이 발생하는 경우도 빈번하게 발생하고 있다.
이에 본 발명자들은 알로에의 다양한 추출물에 대한 약물학적인 실험을 수행하였으며, 그 결과 알로에 추출물의 특정분획, 즉 알로에의 저분자물질 분획이 우수한 혈관형성 촉진작용을 나타냄을 확인하여 알로에 추출물에 의한 혈관형성 촉진 조성물이 이미 특허등록된 바 있다 (참조 : 대한민국 특허 제 0156593 호).
그러나, 아직까지 알로에의 성분 중에서 어떠한 특정 성분이 고유의 작용을 나타내는지에 대한 구체적이고 체계적인 연구결과는 보고된 바 없다.
이에 본 발명자들은 알로에에 대한 보다 과학적인 접근으로 알로에의 다양한 추출물에 대한 약물학적인 실험을 수행하였으며, 그 결과 알로에 추출물의 특정성분, 즉 알로에에서 분리된 순수 물질인 베타-시토스테롤이 우수한 혈관형성 촉진작용을 나타냄을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
베타-시토스테롤은 가장 널리 분포되어 있는 식물 스테롤로서, 알로에뿐만 아니라, 옥수수(maize,Zea mays(Gramineae)), 맥아(wheat germ,Triticum) 등의 식물로부터도 추출할 수 있으며, 비타민 D의 전구물 즉, 프로비타민 D의 일종이다. 베타-시토스테롤은 콜레스테롤 축적에 의한 동맥경화증, 협심증, 심근경색, 뇌혈관성 질환, 당뇨병, 다발성 황색증, 헤프로시스(hephrosis), 갑상선기능저하증, 과콜레스테롤 혈증에 널리 쓰인다. 그러나 혈관형성 촉진작용을 갖는다는 것은 본 발명자들에 의해 처음으로 발견되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 베타-시토스테롤을 포함하는 혈관형성 촉진 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명에 따른 베타-시토스테롤 조성물이 관절염 억제 효과가 있음을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 베타-시토스테롤을 포함하는 관절염 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
도 1은 알로에로부터 베타시토스테롤을 수득하는 방법을 개략적으로 도식화한 것이다.
도 2는 실험예 1의 CAM 시험방법에 따라 본 발명의 G1분획, G1M1D1M1 분획 및 그 대조군의 계배의 융모요막에서의 혈관형성 작용을 나타낸 사진이다.
도 3은 실험예 2 의 생쥐를 이용한 마트리겔 플러그(Matrigel plug) 실험방법에 따른 베타-시토스테롤 및 그 대조군의 혈관형성 작용을 나타낸 사진이다.
도 4는 실험예 2 의 생쥐를 이용한 마트리겔 플러그 (Matrigel plug) 실험방법에 따른 베타-시토스테롤 및 그 대조군에서의 헤모글로빈의 양이다.
도 5는 실험예 4에서 A23187에 대한 베타-시토스테롤의 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 베타-시토스테롤을 유효성분으로 포함하는 혈관형성 촉진 및 관절염 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 혈관형성 촉진작용 및 관절염 예방 및 치료효과를 갖는 것으로 확인된 베타-시토스테롤은 여러 식물로부터 추출할 수 있으며, 예를 들어, 알로에에서의 추출 방법은 하기 실시예 1과 같은 방법에 의해 처리함으로써 수득할 수 있다. 이 외에 옥수수, 맥아 등에 대해서도 유사한 방법으로 추출할 수 있다.
본 발명에 따라 수득한 분획들의 혈관형성 촉진작용을 측정하기 위해 계배에 대한 CAM 시험방법(chorioallantoic membrane)을 이용하였다. CAM 시험방법에 따르면 본 발명에 따르는 G1M1D1M1 분획(베타-시토스테롤)은 혈관형성 촉진작용을 나타내는 것을 확인할 수 있었으며 이에 관하여는 이하의 실험예 1 에서 상세히 기술하였다.
혈관형성 촉진효과를 검증할 수 있는 생체내 (in vivo) 실험 모델들-CAM 실험, 생쥐를 이용한 마트리겔 플러그 실험(mouse Matrigel plug assay : Passaniti et al, 1992) 및 토끼 각막 실험(rabit cornea assay : Grant et al, 1993) 등-중에 CAM 실험 모델은 발생하고 있는 조류의 배를 이용한 것인데 비하여, 생쥐를 이용한 마트리겔 플러그 실험은 포유류에서 그 효능을 검증할 수 있는 실험모델이다. 상처치유 효과가 있는 베타-시토스테롤을 인간에게 적용하기 위해서 생쥐를 이용한 마트리겔 플러그 실험은 필수적이다. 이에 관하여는 이하의 실험예 2 에서 상세히 기술하였다.
또한 관절염 예방 및 치료효과를 검증하기 위해 관절염 유발시 활막섬유모세포사망의 원인이 되는 GPE2를 생성시키는 칼슘 이온 운반체 A23187에 대한 베타-시토스테롤의 억제효과를 측정하였다. 이에 관하여는 이하의 실험예 4 에서 상세히 기술하였다.
본 발명에 따른 베타-시토스테롤은 강력한 혈관형성 촉진작용을 가지고 있기 때문에 상처 및 동상부위의 회복, 수술 후 수술부위의 회복, 그리고 위궤양의 회복 등과 같이 혈관형성 촉진작용이 치유를 촉진시킬 수 있는 임상 영역에서 특히 바람직하게 사용될 수 있다. 또한 베타-시토스테롤은 관절염의 예방 및 치료를 위해서 사용될 수 있다. 알로에의 베타-시토스테롤을 임상적으로 이용시에 투여용량은 환부의 크기, 환자의 상태, 연령, 합병증 등의 다양한 요인에 따라 전문가에 의해 결정될 수 있지만, 일반적으로는 인체에 대하여 1일 0.5mg 내지 500mg 의 용량으로, 바람직하게는 1mg 내지 250mg 의 용량으로 투여한다. 본 발명에 따르는 베타-시토스테롤은 상기 1일 용량에서 뿐만 아니라 이를 초과한 대용량의 투여시에도 거의 세포독성을 나타내지 않으므로 안전하게 투여할 수 있는 약제이다.
베타-시토스테롤을 임상적으로 이용하고자 하는 경우에 이 성분은 약제학적 분야에서 통상적인 방법에 따라 통상적인 약제학적 제제로 제형화시켜 이용할 수 있다. 이러한 목적에 바람직한 약제학적 제제에는 정제, 경질 또는 연질캅셀제, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제, 주사용 용액, 연고제, 크림제, 겔제, 로숀 등과 같은 국소투여용 외용제 등이 있다. 이들 약제학적 제제는 약제학적으로 허용되는 통상의 담체, 예를들어 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제, 주사제의 경우에는 안정제, 보존제, 용해보조제, 완충제, 등장화제 등, 또는 외용제의 경우에는 수성 또는 유성 연고기제, 산화방지제, 방부제, 증량제 등을 이용하여 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 베타-시토스테롤을 포함하는 혈관형성 촉진제 또는 관절염 예방 및 치료제에는 단위 제형당 상기 언급된 1일 용량 또는 그의 1/2, 1/3, 1/4, 1/5 또는 1/6 의 용량이 포함되도록 하여, 이러한 단위 제형을 1일 1 내지 6회 투여한다.
본 발명은 이하의 실시예 및 실험예에 의해 더욱 상세히 설명되나 본 발명이 이들에 의해 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.
실시예 1 : 베타-시토스테롤의 분리정제
신선한 알로에의 전체 잎 15kg 을 취하여 깨끗이 수세한 후, 외피를 기계적으로 제거하고 알로에의 겔부분을 10kg 분리하였다. 분리된 알로에의 겔 부분을 동결건조시켜 G1 분획 500g 을 수득하고, 이것을 뜨거운 메탄올 500ml 를 가하여 두 층으로 분리한 후, 메탄올 층만 취하여 세 차례 필터로 걸러내고 메탄올을 증발시켜 G1M1 분획 100g 을 수득하였다. 이것을 증류수 100ml 에 용해시킨 후, 디클로로메탄 100ml 를 가하여 격렬하게 섞은 다음 두 층으로 분리한 후, 디클로로메탄 층만 취하여 디클로로메탄을 증발시켜 G1M1D1 분획 50g 을 수득하였다. 이것을 다시 헥산/90% 메탄올 50ml 로 재분획한 후, 90% 메탄올층만 취하여 메탄올을 증발시켜 G1M1D1M1 분획 20g 을 수득하였다.
이를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(용리액:디클로로메탄)를 실시하여 그 용출액을13C-NMR 과1H-NMR 을 이용하여 용출액에 포함된 성분들의 구조를 동정하였다. 그 결과 베타-시토스테롤, 알로에-에모딘 및 베타-시토스테롤 글루코사이드를 분리하였다.
(1) 베타-시토스테롤
MeOH 용액에서 백색 침상 결정.
융점 128 ~ 131℃
IR(KBr, cm-1) ; 3400(OH), 790~840(트리(tri)-치환된 이중 결합)
1H-NMR(피리딘-d5) δ : 0.67~1.14 (6 × -CH3), 3.83(1H, m, H-3), 5.43(1H, brs, 올레핀)
(2) 알로에-에모딘
MeOH 용액에서 황색 침상결정
융점 220 ~ 222℃
(3) 베타-시토스테롤 글루코사이드
MeOH 용액에서 백색 분말
융점 282 ~ 283℃
리버만-부샤르트(Libermann-Burchard) 및 몰리쉬(Molisch) 테스트에서 양성
IR (KBr, cm-1) ; 3400(OH), 1100~1000 (글리코사이드)
1H-NMR(피리딘-d5) δ : 0.67~1.00 (6 × -CH3), 4.99(1H, d, J=7.7Hz, 아노머(anomer)), 5.35(1H, m, 올레핀)
13C-NMR(피리딘-d5) δ : 당(sugar); 102.62 (C-1'), 75.30(C-2'), 78.57(C-3'), 71.71(C-4'), 78.35(C-5'), 62.90(C-6')
본 발명에 따른 알로에의 베타-시토스테롤을 수득하는 상기의 방법을 개략적으로 도식화하면 도 1과 같다.
실험예 1 : CAM 실험
본 발명에 따라 상기 실시예 1에서 수득된 분획들의 혈관형성 촉진작용을 측정하기 위해 다음과 같이 CAM 시험방법을 이용하였다.
CAM 시험방법은 계배의 융모요막에 대한 혈관형성 촉진작용을 시험하는 것이다. 계배의 융모모막(chorioallantoic membrane)은 발생 이틀째에 원장미부(tail gut)에서 융모막강(chorion cavity)으로 뻗어나간 작은 게실(diverticulum)로부터 비롯된다. 이 게실, 즉 요막의 바깥쪽은 혈관이 많은 중배엽층 (vascularized mesodermal layer)과 안쪽은 내배엽층으로 구성되어 있다. 발생 4일째에 요막의 바깥에 위치한 중배엽층은 외피막(shell membrane) 아래에 놓인 융모막(chorion membrane)과 융합되게 되고 요막은 외배엽막을 얻게 된다. 융모막과 융합한 요막을 융모요막(chorioallantois)이라고 하며 혈관의 형성과 분화는 이 융모요막의 발생과 밀접한 연관이 있다. 모세혈관의 성장은 발생 11일째까지 계속되고 이 때 혈관내피세포는 증식을 멈춘다. 또한 융모요막의 거의 완전한 확장이 이루어진다. CAM의 성장이 거의 완성된 약 9일 배의 CAM에 여러물질이 도포된 터마녹스 커버슬립(thermanox coverslip)을 얹음으로써 혈관생성 촉진활성을 조사할 수 있는 것이다.
이 시험에서 알로에 추출물로는 본 발명에 따르는 G1분획, G1M1분획, G1M1D1분획, G1M1D1M1분획을 각각 사용하였으며, 양성 대조군으로는 공지의 혈관형성 촉진제인 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)를 사용하였으며, 음성대조군으로는 물질이 도포되어 있지 않은 커버슬립을 사용하였다.
수정란을 45시간 동안 18℃에 놓아둔 다음 90% 의 습도가 유지되는 37℃의 배양기에 놓아 이를 0일배로 하여 배양하였다. 3일배가 되면 계란의 끝부분에 구멍을 내어 주사기로 알부민을 2ml 뽑아내었다. 4일배가 되면 계란의 공기주머니가 있는 쪽을 요오드팅크로 소독한 후 메스를 이용하여 지름 3cm 크기의 원형창문을 만들었다. 공기 주머니 아래에 있는 막을 핀셋으로 제거한 후 유리테이프로 구멍을 막았다. 이것을 계속 배양기에서 키워 9일배가 되면 터마녹스 커버슬립에 시험하고자 하는 혈관형성 촉진제 2㎕ 를 도포한 후 이를 말렸다. 다 마른 것을 확인하고 9일배의 유리테이프를 떼어낸 후, 이 커버슬립을 발생중의 태자(embryo) CAM 표면에 놓고 다시 유리 테이프로 창문을 막았다. 이를 배양기에서 3일 동안 배양시킨 후, 10% 지방 에멀젼(fat emulsion:Intralipid )을 CAM 막 안쪽에 주입하여 해부 현미경(8배율)으로 혈관형성이 유도되었는지를 관찰하고 CAM의 사진을 찍었다. 그 결과는 첨부된 도면 중의 도 2 및 다음 표 1,2,3 에 나타내었다.
(1) 각 분획들과 양성대조군 및 음성대조군의 혈관형성 촉진 비교
9일배 유정란의 CAM 위에 약물을 점적하여 커버슬립을 올리고 3일 후 약물에 의한 혈관신생이 일어났는지 현미경으로 관찰하는 실험이다.
약물을 점적하지 않은 커버슬립만을 CAM 위에 올려 3일 후 관찰하면 정상적인 혈관 형태를 관찰할 수 있다. 그러나 강력한 혈관형성 촉진제로 알려져 있는 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate) (60ng/알)를 처리하면 자전거 바퀴살과 비슷한 형태로 새로운 혈관들이 다량 형성되어 있는 것을 관찰할 수 있다(도 2).
알로에 베라 겔을 CAM 위에 처리하기 위하여 동결건조시켜 가루로 만든 것 (G1분획)을 여러 농도로 CAM 실험을 실시하였다. 실험 결과, 100㎍/알 이상의 농도로 처리하였을 때 혈관들이 자전거 바퀴살 모양으로 생성되는 것을 관찰할 수 있었다. 한편, 알로에의 다양한 분획인 G1M1분획, G1M1D1분획, G1M1D1M1분획을 각각의 해당량에 따라 2㎕ 로 처리한 터마녹스 커버슬립의 경우에는 표 1과 같은 결과가 나타났다.
CAM 시험방법에 따른 알로에 추출 분획들의 혈관형성 촉진 활성
시험화합물 용량 (㎍/알) 처리된 CAM 총수 양성율 %
음성대조군 - 141 16
양성대조군(PMA) 0.15 16 81
G1 100 84 42
500 137 77
1000 83 94
G1M1 250 19 42
500 13 100
G1M1D1 50 50 60
250 50 86
500 50 94
G1M1D1M1 50 50 72
100 50 82
200 50 90
즉 G1M1분획은 500㎍/알의 농도에서 100%가 혈관형성을 유도하였고, G1M1D1분획은 500㎍/알의 농도에서 94%가 혈관형성을 유도하였으며, G1M1D1M1분획은 200㎍/알의 농도에서 90%가 혈관형성을 유도하였다.
(2) G1M1D1M1 분획에서 순수분리된 물질들의 혈관형성 촉진 비교
G1M1D1M1분획에서 순수분리된 물질인 베타-시토스테롤, 베타-시토스테롤 글루코사이드, 알로에-에모딘의 혈관형성 촉진효과를 각각 확인한 결과 표 2와 같았다.
CAM 시험방법에 따른 순수분리 물질들의 혈관형성 촉진활성
시험화합물 용량 (㎍/알) 양성군 수/처리된 CAM 총수 양성율 %
음성대조군 - 0/16 0
양성대조군(PMA) 0.12 12/15 80
알로에-에모딘 2 0/11 0
베타-시토스테롤 글루코사이드 10 4/15 27
베타-시토스테롤 2 4/10 40
10 7/14 50
베타-시토스테롤+ 알로에-에모딘 1010 6/12 50
베타-시토스테롤+ 베타-시토스테롤 글루코사이드 1010 9/14 64
즉, 알로에-에모딘 2㎍ 을 CAM에 처리한 결과 혈관신생 효과가 전혀 없었다. 베타-시토스테롤 글루코사이드 10㎍ 을 CAM 에 처리한 결과 27% 의 혈관형성 효과를 보였으나 이것으로 혈관형성 효과가 있다고 간주하기에는 미약하다. 이들에 비하여 베타-시토스테롤 2㎍ 과 10㎍ 을 CAM 에 처리한 결과 각각 40% 와 50% 의 혈관신생 효과를 보였다. 서로들 간의 상승효과가 있는지 조사한 결과 표 2 에서 보는 바와 같이 상승효과는 없었다.
(3) 여러 농도의 베타-시토스테롤의 혈관형성 촉진 비교
베타-시토스테롤을 여러 농도로 처리하였더니 농도 의존적으로 혈관형성 촉진효과가 증가하였다 (표 3).
CAM 시험방법에 따른 베타-시토스테롤의 혈관형성 촉진 활성
시험화합물 용량 (㎍/알) CAM 시험 총수 양성율 %
음성대조군 - 30 0
베타-시토스테롤 5 27 56
10 75 76
20 32 76
40 26 86
양성대조군(PMA) 0.12 39 92
실험예 2 : 생쥐를 이용한 마트리겔 플러그 실험
생쥐를 이용한 마트리겔 플러그 실험에는 SPF (특정병원체감염방지조건, specific pathogen free) 쥐인 수컷 C57BL/6 (6~7주령) 을 사용한다. 혈관형성 촉진활성을 조사하고자 하는 물질을 마트리겔 500㎕ 에 굳지 않게 4℃에서 섞어 쥐의 복부에 피하주사한다. 주사 후 마트리겔은 중합작용(polymerization)을 일으켜 플러그를 형성한다. 7일 후 쥐의 피부를 벗겨내고 마트리겔 플러그를 끄집어내어 사진을 찍는다. 혈관형성 촉진정도를 정량하기 위해서 헤모글로빈의 양을 드랍킨 시약 키트(Drabkin reagent kit 525, Sigma)를 사용하여 측정한다.
에탄올에 녹인 베타-시토스테롤 (30㎍/ml) 을 500㎕ 의 마트리겔에 굳지 않게 4℃에서 균등하게 섞은 다음 C57/BL 마우스(수컷, 6주령) 복부의 피부와 복강막 사이로 주사기를 이용하여 주입시켰다. 주입된 마트리겔은 체온에 의하여 겔을 형성하게 되고 마트리겔 내부에 있던 베타-시토스테롤이 서서히 방출되어 복강막으로흡수되며, 흡수된 베타-시토스테롤은 주위의 혈관들로부터 새로운 혈관들을 형성하기 시작한다. 마트리겔을 주입하고 5일 후에 마우스의 복부 피부를 제거하여 마트리겔 플러그를 끄집어내어 혈관이 얼마나 형성되었는지 정량하기 위하여 마트리겔 플러그가 함유하고 있는 전체 헤모글로빈의 양을 측정하였다. 그리고 bFGF 를 양성 대조군으로 사용하였다. 각각에는 혈관형성 촉진인자는 아니지만 다른 혈관형성 촉진인자를 도와 혈관형성 촉진을 더욱 증대시켜 주는 역할을 하는 헤파린을 첨가하였다.
실험 결과 혈관형성 촉진인자로 알려져 있는 bFGF (100ng/ml) 보다는 약하지만 마트리겔만 주입한 것보다는 약 7배 이상 헤모글로빈의 양이 증가하였다(도 4). 즉 마트리겔 내부로 새로 형성된 혈관들이 많이 존재한다는 것을 의미한다. 베타-시토스테롤 및 그 대조군의 혈관형성 작용을 나타낸 사진을 도 3으로 나타내었다.
실험예 3 : 혈관형성 억제 실험
물질에 따라서는 농도에 따라서 두 가지 상반된 기능을 가질 수 있으므로(예 : PMA), 베타-시토스테롤을 여러 농도로 하여 CAM 실험과 생쥐를 이용한 마트리겔 플러그 실험을 실시하여 혈관형성 억제 효과를 실험하였다.
실험 결과 혈관 형성 억제 효과는 나타나지 않았다.
실험예 4 : 관절염 억제 효과
200g 의 스프라그 돌리(Sprague Dawley) 래트의 대퇴부 관절을 노출시켜 슬개골 아래의 활막을 도려낸 다음 콜라게나제(collagenase, 4.0mg/ml)로 처리하여 37℃에서 2시간 동안 활막섬유모세포(rat synovial fibroblast, RSF)를 분리하고, 10% 소 태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)과 스트렙토마이신, 페니실린이 들어있는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)으로 배양하여 실험에 사용하였다.
활막섬유모세포를 6웰-플레이트에 한 웰 당 1×105세포/ml 씩 가해 CO2인큐베이터(37℃, 5% CO2)에서 24시간 부착시키고, 관절염 유발시 활막섬유모세포사망의 원인이 되는 PGE2를 생성시키는 칼슘 이온운반체(ionophore) A23187(5㎍/ml)과 베타-시토스테롤(50㎍/ml)을 함께 처리한 것을 실험군으로 하고, (1)아무것도 처리하지 않은 것, (2)A23187 만을 처리한 것, (3)용매인 에탄올만을 처리한 것, 및 (4)베타-시토스테롤만을 처리한 것을 대조군으로 하여, 5시간 배양한 다음 세포수를 세어 세포독성 (cytotoxicity, %)을 측정하였다(도 5 참조).
그 결과 5㎍/ml A23187 만을 처리한 대조군에서는 35.5±1.0%의 세포독성이 나타난 반면, 베타-시토스테롤 50㎍/ml 과 A23187 을 병용처리한 실험군에서는 15.6±3.5% 로 세포독성이 구제되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2 : 조성물 실시예
이하의 조성물 실시예에서 활성성분은 상기 실시예 1에 따라 수득된 알로에의 베타-시토스테롤을 의미하는 것이다.
조성물 1 : 정제
다음 성분들을 이용하여 대한 약전 제제총칙중의 정제의 제조방법에 따라 정제 1개 당 활성성분 10mg 을 함유하는 정제를 제조한다.
성 분 함 량(mg/정)
베타-시토스테롤 10
락토즈 285
마그네슘 스테아레이트 5
칼슘 카복시메틸셀룰로오즈 25
경질 무수규산75
총량 400mg
조성물 2 : 연질캅셀제
다음 성분들을 이용하여 대한 약전 제제총칙중의 캅셀제의 제조방법에 따라 캅셀 1개 당 활성성분 10mg 을 함유하는 연질캅셀제를 제조한다.
성 분 함 량(mg/캅셀)
베타-시토스테롤 10
젤라틴 140
글리세린 60
파라옥시메틸벤조에이트 0.3
파라옥시프로필벤조에이트 0.3
대두유적 량
총량 400mg
조성물 3 : 주사제
다음 성분들을 이용하여 대한 약전 제제총칙중의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플 당 활성성분 2mg 을 함유하는 연질캅셀제를 제조한다.
성 분 함 량(mg/앰플)
베타-시토스테롤 2
나트륨 시트레이트 500
주사용 증류수적 량
총량 5 ml
조성물 4 : 연고제
다음 성분들을 이용하여 대한 약전 제제총칙중의 연고제의 제조방법에 따라 1g 당 활성성분 10mg 을 함유하는 연질캅셀제를 제조한다.
성 분 함 량(mg/캅셀)
베타-시토스테롤 10
경질 유동파라핀 100
스테아릴 알콜 80
세토스테아릴 알콜 13
프로필렌글리콜 50
모노스테아르산 소르비탄 30
모노스테아르산 폴리옥시에틸소르비탄 40
부틸화 하이드록시톨루엔 0.4
파라옥시벤조산 메틸 에스테르 0.9
파라옥시벤조산 부틸 에스테르 0.9
정제수적 량
총량 1g
CAM 실험과 생쥐를 이용한 마트리겔 플러그 실험 결과를 통하여 베타-시토스테롤이 혈관형성 촉진효과가 있음을 확인하였다. 그리고 베타-시토스테롤이 혈관신생 억제효과가 있을 수 있기 때문에 CAM 실험과 생쥐를 이용한 마트리겔 플러그 실험을 방법을 달리하여 억제효과를 실험한 결과 혈관형성 억제효과는 없었다.
또한 관절염 억제 효과 실험에서 베타-시토스테롤이 칼슘 이온운반체 A23817 에 대하여 억제효과가 있음을 확인하였다. 따라서 본 발명의 조성물은 관절염 예방 및 치료효과가 있음을 알 수 있다.

Claims (4)

  1. 삭제
  2. 베타-시토스테롤을 유효성분으로 포함하는 관절염 치료 및 예방용 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서, 베타-시토스테롤이 알로에, 옥수수 또는 맥아로부터 분리된 조성물.
  4. 제 2 항에 있어서, 추가로 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 제제 형태인 조성물.
KR1019990052939A 1999-11-26 1999-11-26 베타-시토스테롤을 포함하는 혈관형성 촉진 및 관절염예방 및 치료용 조성물 KR100352148B1 (ko)

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