PT1446134E - Composição compreendendo extractos orgânicos de geum japonicum thunb var. e sua utilização - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO EXTRACTOS ORGÂNICOS DE GEUM JAPONICUM THUNB VAR. E SUA UTILIZAÇÃO

Campo da Invenção A invenção refere-se a uma utilização do extracto de Geum Japonicum thunb var. (EGJ), particularmente a uma utilização de um EGJ orgânico no tratamento de doenças isquémicas no ser humano ou animais incluindo cardiopatia isquémica e isquemia dos membros, e doenças associadas ao miocárdio lesado.

Antecedentes da Invenção

Geum Japonicum Thunb ver, é uma planta que geralmente cresce na província de Jiangsu, na província de Jiangxi, na província de Guizhou e na província de Yunan, China. Geum é um género de 65 espécies de ervas rizomatosas e subarbustos com folhas simples ou lobulada duma forma pinulada e flores regulares tais como G. borisii, G. chiloense, G. coccineum, G. macrophyllum, G. montanum, G. reptans, G. rivale, G. triflorum, G. urbanum e G. japonicum etc. Geum japonicum Thunb é uma erva perene e planta que dá flor da família Rosaceae. 0 extracto aquoso da planta inteira de Geum japonicum Thunb foi utilizado como um diurético na medicina tradicional Chinesa, Perry, L. M., em Medicinal Plants of East and Southeast Asia, MIT Press, Cambridge, Mass., pp. 343 (1980). Sabe-se que as plantas da espécie Geum são ricas em taninos. Vários taninos hidrolisáveis, tais como gemina A, B, C, D, E e F, foram isolados de Geum japonicum, Dong, H., Chen, S.X., Kini, R.M., e Xu, H.X., J. Nat. Products. 1 61,1356-60 (1998). Além dos taninos, foram isolados triterpenóides incluindo ácido 2-hidroxioleanólico, ácido 2-hidroxiursólico, ácido 2,19-di-hidroxi-ursólico, ácido 2,3,19,23-tetra-hidroxirus-12-en-28-óico 28-O-D-glucopira-nósido, Xu, H.X., Zeng, F.Q., Wan, M., e Sim, K.Y., J. Nat. Products, 59, 643-5 (1996).

No entanto, não foi apresentada informação sobre a utilização de um EGJ no tratamento de doenças isquémicas e miocárdio lesado. As doenças isquémicas, tais como doença coronária, permanece a causa principal de morte no mundo Ocidental, tal como na América e nas regiões desenvolvidas na Ásia, como em Hong Kong, e estão agora também a tornar-se na China, American Heart Association, 2001 Heart and Stroke Statistical Update, Dallas, Texas: American Heart Association, 2000, ΙΟΣ. Actualmente, as abordagens terapêuticas disponíveis podem apenas aliviar sintomas e infelizmente, mesmo com todos os progressos recentes, a cura destes tipos de doenças isquémicas e miocárdio lesado é difícil devido à ausência de um método para fazer crescer novos vasos funcionais numa fase precoce no miocárdio isquémico e a incapacidade de regenerar cardiomiócitos, Uchida, Y., Yanagisawa-Miwa, A., Nakamura, F., Yamada, K., Tomaru, T., Kimura, K., e Morita, T., Am Heart J. 130: 1182-1188 (1995); Lazarous, D.F., Scheinowitz, M., Shou, M., Epstein, S.E., et al, Circulation 91: 145-153 (1995); Pu, L.Q., Sniderman, A.D., Brassard, R., Lachapelle, K.J., Graham, A.M., Lisbona, R., e Symes, J.F., Circulation 88: 208-215 (1993). De acordo com estudos anteriores tanto nos modelos animais de isquemia aguda como de isquemia crónica ou ensaios clínicos, a angiogénese através da utilização de factores de crescimento tais como VEGF, aFGF, bFGF ou PDGF requer tempo (na ordem de 3-9 semanas) e é 2 limitada (8-15) Risau, W., Nature 386: 671-674 (1997); Folkman, J., N. Engl. J. Med. 333: 1757-1763 (1995); Ware. J.A., Angiogenesis and Cardiovascular Disease (J.A. Ware e M. Simons, eds), Oxford University Press, Nova Iorque, Oxford, 30-59 (1999); Ware, J.A., e Simons , M., Nat. Med. 3: 158-164 (1997); Arras, M., Ito, W.D., Scholz , D., Winkler, B., Schaper, J., e Schaper, W., J. Clin. Invest . 101: 40-50 (1998); Banai, S ., Jaklitsch, M.T. , Casscells, W., Shou, M., Shrivastav, S., Corrêa, R., Epstein, S.E. e Unger, E.F., Circ. Res. 69, 76-85 (1991); Arras, M., Mollnau, H., Strasser, R., Ito, W.D., Schaper, J., e Schaper, W., Nat. Biotechnol. 16: 159-162 (1998); Kurz, , H., Wilting, J.,

Sandau, K., e Christ, B., Microvasc. Res. 55: 92-102 (1998), enquanto que a necrose do miocárdio devida à oclusão coronária ocorre muito rapidamente (horas), Unger, E.F., Shou, M., Sheffield, C.D., Hodge, E., Jaye, M., & Epstein, S.E., Am. J. Physiol. 264: H1567-1574 (1993); Unger, E.F., Banai, S., Shou, M., Jaklitsch, M., Hodge, E., Corrêa, R., Jaye, M., & Epstein, S.E., Cardiovasc. Res. 27: 785-791 (1993); e Schlaudraff, K., Schumacher, B., von Specht, B.U., Seitelberger, R., Schlosser, V., & Fasol, R., Eur. J. Cardiothorac. Surg. 7: 637-643 (1993). Deste modo, a cardiomiogénese e a angiogénese antecipada terapêutica podem proporcionar a estratégia alternativa mais útil, a qual, se tiver sucesso, pode tornar-se na opção terapêutica principal em muitas doenças isquémicas e no miocárdio lesado.

Até agora, não existe qualquer produto semelhante disponível no mercado global que seja capaz de induzir a angiogénese antecipada no coração e a regeneração do miocárdio é completamente nova. De acordo com estudos prévios tanto nos modelos animais de isquemia aguda como de isquemia crónica ou 3 ensaios clínicos, alguns factores de crescimento tais como VEGF, aFGF, bFGF ou PDGF poderiam aumentar a angiogénese num certo grau, mas tal requer tempo (na ordem de semanas) enquanto que a necrose do miocárdio devida à oclusão coronária ocorre muito rapidamente (num espaço de horas). Assim, a indução da angiogénese antecipada tornou-se um objectivo importante na redução da extensão do enfarte no coração e no salvar do tecido afectado. Além disso, mesmo com todos os mais recentes avanços nos campos das ciências e da investigação, não existe um método ou quaisquer fármacos que poderiam ser utilizados para regenerar miócitos cardíacos.

Nos nossos estudos recentes, identificámos um extracto de uma erva medicinal Chinesa -geum Japonicum thunb var que apresentou efeitos potentes no estímulo do crescimento antecipado de novos vasos (<48h) e na regeneração de cardiomiócitos no modelo de enfarte do miocárdio agudo de coelho. Em comparação com o período de semanas da angiogénese que ocorre naturalmente e da angiogénese utilizando factores de crescimento, a angiogénese induzida por EGJ no miocárdio demora menos de 48 horas. Esta característica única da angiogénese antecipada induzida pelo EGJ é deste modo muito útil no desenvolvimento de uma nova estratégia para o tratamento eficaz de doenças isquémicas, especialmente importante na redução da extensão do enfarte, salvando os miócitos cardíacos afectados enquanto ocorre o enfarte do miocárdio tal como demonstrado nas nossas experiências com animais. 0 conceito de angiogénese terapêutica através do aumento do processo de revascularização que ocorre naturalmente para o tratamento de doenças vasculares isquémicas é uma ideia muito 4 atraente. Proporciona a oportunidade de conseguir uma revascularização mais completa em pacientes com doenças relacionadas com a isquemia, tais como doença coronária ou enfarte cardíaco. Para a cardiopatia isquémica, para além da prevenção, actualmente, os bloqueios nas artérias coronárias podem apenas ser aliviados por cirurgia ou angioplastia. Não existe qualquer fármaco eficaz que possa estimular o crescimento de novos vasos sanguíneos (angiogénese) numa fase precoce. Além disso, após enfarte do miocárdio, o miocárdio é incapaz de regenerar novos cardiomiócitos para substituir as células do músculo perdidas. Além disso, tecidos cicatrizados, que substituem o miocárdio necrosado, causam uma deterioração na função cardíaca. Deste modo, é claro que é necessária uma estratégia de revascularização alternativa para tratar a isquemia e estimular a substituição de células de músculo cardíaco danificadas ou perdidas. A angiogénese e cardiomiogénese terapêutica seriam a estratégia alternativa mais útil, que poderia tornar-se na opção terapêutica principal no tratamento de muitas doenças isquémicas incluindo doenças coronárias e membros isquémicos, e miocárdio lesado. Pode mesmo ser capaz de substituir algumas das modalidades terapêuticas correntes com uma estratégia menos evasiva, mas muito mais eficaz se for conseguida a angiogénese antecipada. A invenção pretende conseguir o objectivo de fazer crescer novos vasos numa fase precoce e regenerar miócitos cardíacos no miocárdio enfartado para substituir o miocárdio lesado com a utilização de EGJ. 0 EGJ pode ser aplicado por injecção local no miocárdio directamente nas partes distais de um vaso ocludido no coração ou nos membros isquémicos. Pode também ser potencialmente desenvolvido numa administração oral 5 (comprimidos) ou injecção na corrente sanguínea ou nos músculos de pacientes que não suportam uma injecção local no miocárdio e que se provou não apresentarem formação de neoplasias ou tumores. A presente invenção refere-se a um extracto orgânico, particularmente um extracto em metanol de Geum Japonicum thunb var, que estimula a angiogénese antecipada e a regeneração do miocárdio no coração isquémico e no enfarte do miocárdio e que é assim útil no tratamento de doenças isquémicas, tais como cardiopatia isquémica incluindo doença coronária, enfarte do miocárdio, membros isquémicos, miocárdio lesado e regeneração de tecidos.

Resumo da Invenção A primeira implementação da presente invenção é uma composição farmacêutica para utilização no tratamento de doenças associadas com o coração isquémico e o enfarte do miocárdio num indivíduo através do estímulo da angiogénese e miogénese antecipada no coração isquémico e no enfarte do miocárdio compreendendo uma quantidade eficaz de um extracto em solvente orgânico de Geum Japonicum thunb var, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Implementações preferidas da composição farmacêutica são mencionadas nas reivindicações dependentes 2 a 5.

Ainda outra implementação é a utilização de um extracto em solvente orgânico de Geum Japonicum thunb var, na preparação de um fármaco para o tratamento de doenças associadas com um coração isquémico e o enfarte do miocárdio através do 6 estímulo da angiogénese e da miogénese antecipada no coração isquémico e no enfarte do miocárdio.

As implementações preferidas são mencionadas nas reivindicações 7 e 8.

Breve Descrição da Invenção A Fig. 1 mostra que um EGJ de acordo com a invenção aumenta a proliferação de HVEC em cultura com diferentes doses. A Fig. 2 mostra a dimensão da área do enfarte do coração de um coelho após ser tratado com um EGJ de acordo com a invenção. A Fig. 3 mostra que se formam novos vasos cheios com células sanguíneas no interior da área do enfarte de um coelho após ser tratado com um EGJ de acordo com a invenção. A Fig. 4 mostra que cardiomiócitos positivamente corados positivamente com PCNA na área do enfarte são regenerados de novo, e especialmente os aglomerados de células corados positivamente com PCNA na zona central do enfarte são particularmente significativos após tratamento com EGJ de acordo com a invenção.

Descrição Detalhada da Invenção

No processo para a preparação de um extracto de uma planta Geum Japonicum thunb var, através de um solvente orgânico, a 7 planta seca é preferentemente utilizada. Neste caso, a planta é preferentemente desfeita num pó. A abreviatura "EGJ" utilizada na invenção, sem qualquer indicação especifica, significa um extracto da planta Geum Japonicum thunb var, por um solvente orgânico descrito abaixo.

Os solventes orgânicos utilizados no processo da invenção estão num estado liquido a 25°C e podem ser seleccionados do grupo que consiste em hidrocarbonetos alifáticos ou hidrocarbonetos aromáticos, cetonas (aldeídos), ácidos carboxílicos, ésteres e éteres, que são não substituídos ou substituídos com um ou mais substituintes, ou uma mistura daqueles. 0 termo "hidrocarboneto(s) alifático(s)" aqui utilizado significa um alcano, um alceno, um alcino e um hidrocarboneto alicíclico, e em geral inclui 4-20 carbonos. 0 termo "substituinte(s)" é seleccionado do grupo que consiste em halo, hidroxilo, alquilo, alcenilo, alcinilo, alcoxilo, alquiltio, alcenoxilo, alceniltio, alcinoxilo, e alciniltio. Dos substituintes, são preferidos alquilo inferior, alcenilo inferior, alcinilo inferior, alcoxilo inferior, alquiltio inferior, alcenoxilo inferior, alceniltio inferior, alcinoxilo inferior, e alciniltio inferior. O número de substituintes pode ser de 1 a 3. O termo "alquilo" refere-se a um hidrocarboneto saturado alifático incluindo grupos de cadeia linear e de cadeia ramificada. Preferentemente, o grupo alquilo tem 1 a 20 átomos de carbono (sempre que aqui se utiliza uma gama numérica, por exemplo "1-20", significa que o grupo a que se refere, neste caso o grupo alquilo, pode consistir em 1 átomo de carbono, 2 átomos de carbono, 3 átomos de carbono, etc. até e incluindo 20 átomos de carbono). O termo "alquilo inferior, alcenilo inferior, alcinilo inferior, alcoxilo inferior, alquiltio inferior, alcenoxilo inferior, alceniltio inferior, alcinoxilo inferior, ou alciniltio inferior" utilizado na invenção contém 1-6 carbonos.

Entre os hidrocarbonetos aromáticos substituídos, são preferíveis aqueles substituídos por cloro e alquilo inferior tais como clorobenzeno, tolueno e xileno.

Entre os solventes da invenção, são preferíveis álcoois, éteres, cetonas, ácidos carboxílicos e seus ésteres contendo 2-18 átomos de carbono. Destes solventes, são preferidos os álcoois de alquilo inferior, mais preferentemente os álcoois Ci_4 e mais preferivelmente o metanol. O passo de molha pode ser conduzido a uma temperatura entre 10° e 100°. Depende do ponto de ebulição de um solvente a ser utilizado. Em geral, o passo pode ser levado a cabo a uma temperatura entre 10° e o ponto de ebulição do solvente. Preferentemente, este passo é levado a cabo a uma temperatura ambiente.

Na composição farmacêutica da invenção, o termo "quantidade eficaz" ou "quantidade terapeuticamente eficaz" é óbvia para os peritos na técnica. Depende da idade, do peso, e da 9 condição do indivíduo a ser tratado, e o modo a ser administrado. Em geral, o extracto na composição varia de 0,01% a 99, 99%, preferentemente de 1% a 99%, mais preferentemente de 10% a 90%, e mais preferivelmente de 30% a 70%, em peso.

Um "paciente" ou "indivíduo" como aqui utilizado significa um humano ou animal. Em geral, implica um animal ou um humano. 0 animal pode ser um animal doméstico ou um animal selvagem tal como vacas, cavalos, porcos, veados, coelhos, cães e outros que sofrem as doenças aqui mencionadas.

Um "componente activo" mencionado na invenção significa um EGJ por um solvente orgânico apresentado na presente invenção.

Um "veículo" ou "veículo farmaceuticamente aceitável" tal como aqui utilizado significa um componente ou um ingrediente que é aceitável no sentido em que é compatível com outros ingredientes da composição farmacêutica tal como aqui apresentada e não demasiadamente prejudicial para o paciente ao qual a composição é administrado, incluindo qualquer e todos os solventes, diluentes, ou outros veículos líquidos, auxiliares de dispersão ou suspensão, agentes surfactantes, agentes isotónicos, agentes espessantes ou emulsionantes, conservantes, aglutinantes sólidos, lubrificantes e semelhantes, tal como adequado à forma de dosagem particular desejada. Uma vez que o componente activo da composição da invenção é solúvel em lipidos, quando as composições são formadas como formulações líquidas, o componente activo é primeiramente dissolvido naqueles veículos incluindo um álcool C2-12 tal como etanol, n-propanol, i-propanol, n- 10 butanol, e álcool benzílico, glicerol, propileno glicol, N,N-dimetilacetamida, DMSO, azeite, óleo de semente de algodão, óleo de amendoim, óleo de semente de papoila, óleo de sésamo, óleo de soja e outros óleos vegetais, e então, se necessário, preparado na forma das formulações desejadas. 0 veiculo pode também compreender um sólido seleccionado daqueles convencionalmente utilizados na técnica da formulação farmacêutica, tal como gelatina, lactose, estearato de magnésio, talco, carbonato de cálcio, carbonato de magnésio, amido (amido de milho e amido da batata) e aqueles bem conhecidos na técnica anterior. A composição farmacêutica pode também compreender um ou mais componentes tipicamente utilizados na técnica de formulação farmacêutica tais como surfactantes, propulsores, agentes aromatizantes, conservantes, agentes tamponizantes, agentes de enchimento, aglutinantes, agentes de desintegração, lubrificantes e semelhantes, que podem ser determinados por aqueles peritos na técnica de acordo com as formulações a ser preparadas.

Composições farmacêuticas utilizadas na presente invenção incluem formulações sistémicas e tópicas e entre estas são preferidas formulações que são adequadas para administração por inalação, oral, rectal, vaginal, intracavitária, intra-orgânica, tópica, incluindo bucal, sublingual, dérmica e intra-ocular, parenteral, incluindo subcutânea, intra-dérmica, intramuscular, intravenosa e intra-articular, e administração transdérmica.

As composições podem ser apresentadas em formas de unidades de dosagem única ou múltipla, assim como a granel, e podem 11 ser preparadas por qualquer um dos métodos bem conhecidos na técnica farmacêutica. Todos os métodos incluem um passo de associar o componente activo, EGJ, com um veículo que constitui um ou mais ingredientes acessórios. As formulações são geralmente preparadas pela associação uniforme e íntima do composto activo com um veículo líquido, um veículo sólido finamente dividido, ou ambos, e então, se necessário, formando o produto em formulações desejadas.

Composições adequadas para administração oral podem ser apresentadas em unidades discretas, tais como cápsulas, pastilhas, ou comprimidos, cada uma contendo uma quantidade predeterminada do componente activo; como um pó ou grânulos; como uma solução ou uma suspensão num liquido aquoso; ou como uma emulsão óleo-em-água ou água-em-óleo. Uma composição para administração oral pode opcionalmente incluir revestimentos entéricos conhecidos na técnica para prevenir a degradação das composições no estômago e proporciona a libertação do componente activo no intestino delgado. As composições adequadas para administração bucal incluem pastilhas compreendendo o componente activo numa base inerte tal como gelatina e glicerina ou sacarose e acácia.

As composições adequadas para administração parenteral compreendem soluções para injecção aquosas e não aquosas do componente activo, cujas preparações são preferentemente isotónicas com o sangue do receptor pretendido. Estas preparações podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostatos e solutos que tornam as composições isotónicas com o sangue do receptor pretendido. As suspensões estéreis aquosas e não aquosas podem conter agentes de suspensão e agentes espessantes. As composições podem ser apresentadas em 12 recipientes de dose única ou de dose múltipla tais como ampolas e frascos selados, e podem ser armazenadas num veiculo liquido estéril tal como tampão salino ou água para injectáveis imediatamente antes da utilização. Podem ser preparadas soluções e suspensões para injecção na altura da aplicação a partir de pós, grânulos e comprimidos estéreis.

Composições de acordo com a invenção adequadas para a aplicação tópica à pele tomam preferentemente as formas de um unguento, creme, loção, pasta, gel, spray, aerossol, ou óleo. Composições adequadas para administração transdérmica podem ser apresentadas como emplastros discretos adaptados para permanecerem em contacto intimo com a epiderme do recipiente durante um período de tempo prolongado. Composições adequadas para administração transdérmica podem também ser administradas por iontoforese, e tomam tipicamente a forma de uma solução aquosa opcionalmente tamponizada do componente activo. 0 componente activo é preferentemente formulado em forma de dosagem única para facilitar a administração e a uniformidade da dosagem. "Forma de dosagem unitária" como aqui utilizado refere-se a uma unidade fisicamente discreta da composição farmacêutica apropriada para o paciente a ser tratado. Cada dosagem deveria conter a quantidade do componente activo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado seja por si, ou em associação com o veículo farmacêutico seleccionado. Tipicamente, o componente activo será administrado em unidades de dosagem contendo de cerca de 0,1 mg a cerca de 500 mg em peso na composição, preferindo-se uma gama de cerca de 1 mg a cerca de 100 mg. 13 0 componente activo da invenção pode ser administrado a níveis de dosagem de cerca de 0,001 a cerca de 120 mg/kg de peso corporal do indivíduo por dia e preferentemente de desde 0,01 a cerca de 30 mg/kg do peso corporal do indivíduo por dia, uma ou mais vezes por dia, para obter o efeito terapêutico desejado. A título de exemplo, uma dose adequada para administração oral seria da ordem de 30 mg/kg de peso corporal por dia, enquanto que uma dose típica para administração intravenosa seria na ordem de 1-10 mg/kg de peso corporal por dia. A composição farmacêutica de acordo com a invenção pode ser utilizada para tratar as doenças associadas com isquemia tal como cardiopatia isquémica. Para o tratamento de distúrbios do coração, é recomendado que seja utilizada a injecção local com soluções, de modo que a concentração local do fármaco seja elevada e funciona melhor e de forma mais eficaz. No entanto, se o paciente sofre simultaneamente de um tumor ou neoplasia maligna, não se recomenda que seja levada a cabo injecção sistémica ou administração oral, e a injecção local deveria ser uma via mais segura.

Num processo para o fabrico de uma composição farmacêutica por um EGJ para o tratamento de doenças associadas com isquemia, lesões nos tecidos e regeneração dos tecidos uma quantidade eficaz de EGJ é misturada com um ou mais veículos indicados acima. Na composição farmacêutica, o EGJ é geralmente de desde 0,01% a 99,99% em peso. Preferentemente, o EGJ é de 1-99% em peso da composição. 14

EXEMPLOS

Durante o curso do rastreio de reagentes angiogénicos da medicina Chinesa, o extracto em metanol de Geum Japonicum thunb var, foi identificado como apresentando efeitos duais no estimulo do crescimento antecipado (menos de 48 horas) de novos vasos tanto em músculos do coração isquémico e nos músculos do coração enfartado, e na promoção da regeneração do miocárdio no enfarte do miocárdio.

Exemplo 1

Pulverizou-se 1 kg de planta inteira seca de Geum Japonicum thunb var recolhida da Província de Guizhou de China. 0 pó da planta foi então ensopado em metanol (8 L) à temperatura ambiente durante 2-3 horas. 0 material resultante foi filtrado e o filtro foi evaporado à secura sob vácuo (50°C) para resultar num pó (50 g).

Uma análise por cromatografia e RMN mostrou que EGJ contém principalmente taninos, triterpenos incluindo ácido 2-alfa, 19-alfa-di-hidroxi-3-oxo-12-ursen-28-óico, ácido ursólico, ácido epimólico, ácido maslínico, ácido euscáfico, ácido tormêntico, 28-beta-D-glucósido do ácido tormêntico etc.

Exemplo 2 EGJ em pó obtido no Exemplo 1 0,4 g

Solução de DMSO a 5% em água 100 mL

Dissolveu-se EGJ em pó em 100 mL de solução de DMSO a 5% em água para obter uma solução de trabalho. 15

Exemplo 3 0,1 g 0,5 g 1,87 g EGJ do Exemplo 1 Amido milho

Lactose

Estearato de magnésio 0,03 g

Misturou-se uniformemente pó de EGJ do exemplol, amido de milho e lactose. Adicionou-se à mistura um pouco de água. Os materiais resultantes foram filtrados e secos. Adicionou-se estearato de magnésio à mistura e misturou-se uniformemente. O resultante foi formado num comprimido. Cada comprimido pesa 250 mg e compreende 10 mg do composto activo.

Exemplo 4 EGJ do Exemplo 1 80 mg

Cloreto de Sódio 8 mg EDTA 1 mg

Tampão (pH 6,5) de fosfato de sódio 10 mg Água destilada adicionada para perfazer 2 ml

Todos os componentes foram dissolvidos em água destilada e depois adicionou-se à mistura água destilada para perfazer 2 mL. A solução resultante foi filtrada com um filtro estéril para formular uma inalação nasal. EXPERIÊNCIA 1

Uma solução de EGJ em DMSO a 5% (Exemplo 2) foi testada para as suas actividades angiogénica e miogénica especificas para estimular a proliferação de células endoteliais vasculares 16 humanas (HVEC) e células miogénicas (C2C12), tal como mostrado na Fig. 1. Na Fig. 1, as referências com os números 1, 2 e 3 indicam, respectivamente, placas de cultura diferentes nas mesmas condições. Mostra-se que EGJ pôde aumentar significativamente a proliferação de HVEC em cultura de um modo dependente da dose em comparação com a solução controlo de DMSO a 5%. Também se demonstrou que esta solução EGJ apresentou efeitos duais potentes tanto na angiogénese como na miogénese no miocárdio enfartado de acordo com as nossas experiências animais. Na determinação por cromatografia, o EGJ foi solubilizado em solvente e aplicado uma coluna de Sephadex LH-20 equilibrada com 10% de metanol e eluida com um gradiente H20-metanol (quantidade crescente de metanol). Foram eluidas 12 fracções e testadas para as suas actividades duais no aumento da proliferação de células HVEC e C2C12 em cultura. Este extracto em metanol (EGJ) com as actividades duais especificas foi ainda testado em experiências in vivo subsequentes. Utilizou-se RMN para determinar as identidades dos compostos contidos na fracção activa. EXPERIÊNCIA 2

Este EGJ dissolvido em DMSO a 5% foi investigado de forma suplementar no modelo de enfarte do coração de coelho para investigar os seus efeitos nos músculos do coração. A razão para a escolha do coelho como modelo do enfarte do coração é que os coelhos têm artérias terminais sem ligações a arteriolas de modo que a oclusão arterial coronária aguda poderia conduzir ao rápido enfarte transmural. O circunflexo esquerdo (LCX) ou artéria descendente anterior esquerda (LAD) dos animais experimentais foram respectivamente ligados. 17

Directamente após a ligação, aplicou-se uma única injecção de EGJ (uma solução saturada de ECJ em 5% de DMSO, 0,5 mL) ou solução controlo (5% DMSO), respectivamente nas extremidades distais das artérias ligadas. No dia 4 ou no dia 7 após a ligação, os animais foram sacrificados e os corações foram removidos para estudos histológicos. A Fig. 2 mostrou que a dimensão da área de enfarte foi 3-5 vezes menor que nos animais tratados com EGJ (a) como indicado pelas setas azuis do que no controlo (b) . Mostra-se na Fig. 3 que se observam muitos vasos sanguíneos formados de novo cheios com células sanguíneas nos segmentos do enfarte do miocárdio (a & c) tal como indicado por setas azuis em animais tratados com EGJ. Pelo contrário, muitos menos vasos foram observados no controlo (b & d).

No dia 7, encontraram-se numerosos núcleos de cardiomiócitos corados positivamente com PCNA regenerados de novo à volta das margens do enfarte, com alguns organizados na forma de aglomerados no interior da área do enfarte de corações tratados com ECJ, e foram também encontrados numerosos vasos tal como indicado pelas setas pretas, tal como ilustrado na Fig. 4, (b). Pelo contrário, encontraram-se apenas poucos cardiomiócitos regenerados de novo corados positivamente com PCNA ao longo das margens do enfarte e não se encontraram cardiomiócitos regenerados de novo agrupados centralmente no coração controlo, e foram sobretudo fibroblastos que ocuparam a área do enfarte, tal como ilustrado na Fig. 4, (a) . As secções foram ainda coradas por imunohistoquímica com anticorpos monoclonais para a miosina de cadeia pesada (MF20) para confirmar que os núcleos corados positivamente com PCNA eram cardiomiócitos. Na Fig. 4, (c) apresenta-se a ampliação 18 máxima da área rodeada por setas azuis em (b), em (d), foram também encontrados cardiomiócitos regenerados de novo à volta dos contornos do enfarte de corações tratados com EGJ tal como indicado pelas setas azuis.

Através da utilização de coloração imunohistoquimica com anticorpos monoclonais contra PCNA, apenas puderam ser corados positivamente os núcleos dos cardiomiócitos regenerados de novo. Utilizando o procedimento de coloração imunohistoquímico anti-MF20, apenas foram corados positivamente cardiomiócitos. Com a combinação destes procedimentos de coloração imunohistoquimicos duplos e da análise morfológica, puderam ser identificados com fiabilidade cardiomiócitos regenerados de novo. Os núcleos de cardiomiócitos intactos não danificados à volta da área do enfarte foram corados negativamente com PCNA mas o citoplasma foi corado positivamente para MF20 (células coradas de castanho). 10-12-2010 19

Claims (8)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Uma composição farmacêutica para utilização no tratamento de doenças associadas ao coração isquémico e ao enfarte do miocárdio num indivíduo através do estímulo da angiogénese e da miogénese antecipada no coração isquémico e no enfarte do miocárdio compreendendo uma quantidade eficaz de um extracto num solvente orgânico de Geum Japonicum thunb var, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
2. 2. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, em que a referida composição compreende o referido extracto de 0,01% a 99,99% em peso.
3. 3. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, em que o referido indivíduo é um ser humano.
4. 4. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, em que o referido solvente orgânico é seleccionado do grupo que consiste em álcoois alquílicos inferiores compreendendo de 1 a 6 átomos de carbono.
5. 5. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 4, em que o referido solvente orgânico é metanol.
6. 6. Utilização de um extracto de solvente orgânico de Geum Japonicum thunb var, na preparação de um fármaco para o tratamento de doenças em associação com o coração isquémico e o enfarte do miocárdio através do estímulo da angiogénese e da miogénese antecipadas no coração isquémico e no enfarte do miocárdio. 1
7. 7. A utilização da reivindicação 6, em que as referidas doenças são aquelas associadas a danos no miocárdio.
8. 8. A utilização da reivindicação 6, em que as referidas doenças são aquelas associadas a danos ou perdas de miócitos cardíacos. 10-12-2010 2