JP4982665B2

JP4982665B2 - ダイコンソウ（ＧｅｕｍＪａｐｏｎｉｃｕｍｔｈｕｎｂｖａｒ．）の有機抽出物を含む組成物およびその使用

Info

Publication number: JP4982665B2
Application number: JP2003545326A
Authority: JP
Inventors: ミンリー，; ジョンエルスビーサンダーソン，; ジョセフシャオイーサン，; ケネスカーホーリー，; ジャックチュンイーチェン，; エドマンドガイマンチェン，
Original assignee: リードビリオンリミテッド
Priority date: 2001-11-21
Filing date: 2001-11-21
Publication date: 2012-07-25
Anticipated expiration: 2021-11-21
Also published as: CA2467895A1; JP2005514360A; AU2002221499B2; EP1446134B1; CN1558769A; ES2353378T3; AU2002221499A1; WO2003043645A1; CA2467895C; ATE481976T1; CN1258371C; EP1446134A1; US7572467B2; US20050064048A1; HK1068256A1; PT1446134E; DE60143132D1; EP1446134A4

Description

発明の分野

本願発明はダイコンソウ（Geum Japonicum thunb var.、EGJ）の使用であって、特にヒトまたは動物における、虚血性心疾患および虚血性四肢を含む虚血性疾患、ならびに心筋の損傷に関連する疾患の治療への有機EGJの使用を対象とする。

発明の背景
ダイコンソウは、中国の江蘇省、江西省、貴州省、および雲南省に一般に生育する植物である。ダイコンソウ属は、G. ボリシイ、G. キロエンセ、G. コッシキネウム、G. マクロフィルム、G. モンタヌム、G. レプタンス、G. リバレ、G. トリフロルム、G. ウルバヌム、およびダイコンソウ（G. ジャポニクム）などの65種の根茎草本および亜低木の属であって、単純または羽状裂片葉および標準的な花を有する。
ダイコンソウは多年生草で、バラ科の顕花植物である。ダイコンソウの植物全体の水抽出物は、漢方薬の中の利尿剤として用いられてきた。Medical Plants of East and Southeast Asia, MIT Press, Cambridge, Mass., pp. 343 (1980)のPerry, L. M.参照。ダイコンソウ属の植物はタンニンが豊富であることが知られている。ゲミンA、B、C、D、EおよびFなどの数種類の水溶性タンニンが、ダイコンソウから単離されている。Dong, H., Chen, S.X., Kini, R.M., and Xu, H.X., J. Nat. Products. 61, 1356-60 (1998)。タンニンに加えて、2-ヒドロキシオレアノール酸、2-ヒドロキシウルソル酸、2,19-ジヒドロキシ-ウルソル酸、2,3,19,23-テトラヒドロキシウルス-12-エン-28-酸28-O-D-グルコピラノシドを含むいくつかのトリテルペノイドが単離された。Xu, H.X., Zeng, F.Q., Wan, M., and SIm, K.Y., J. Nat. Products, 59,643-5 (1996)。

しかし、虚血性疾患および損傷した心筋の治療へのEGJの使用については、開示されている知見はない。冠状動脈心疾患などの虚血性疾患は、米国などの西洋社会、および香港などのアジアの先進地域では主要な死因となっており、現在では中国でもそのようになってきている。American Heart Association, 2001 Heart and Stroke Statistical Update, Dallas, Texas: American Heart Association, 2000, 1-32。現在利用できる治療アプローチは症状を緩和することしかできず、残念なことに、最近のすべての進歩をもってしても、早期段階において虚血性心筋の新しい機能的な血管を成長させる方法がないことと、心筋細胞を再生することができないことから、この種の虚血生疾患および損傷した心筋の治癒が困難である。UChida, Y., Yanagisawa-Miwa, A., Nakamura, F., Yamada, K., Tomaru, T., Kimura, K., and Morita, T., Am heart J. 130: 1182-1188 (1995); Lazarous, D.F., Scheinowitz, M., Shou, M., Epstein, S.E., and et al., Circulation 91: 145-153 (1995); Pu, L.Q., Sniderman, A.D., Brassard, R., Lachapelle, K.J., Graham, A.M., Lisbona, R., and symes, J.F., Circulation 88: 208-215 (1993)。急性および慢性虚血性動物モデルの両方の過去の研究および臨床試験によると、VEGF、aFGF、bFGF、またはPDGFなどの成長因子を用いた血管新生は時間（3乃至9週間単位）を要し、限界があるが（8乃至15）Risau, W., Nature 386: 671-674 (1997); Folkman, J., N. Engl. J. Med. 333: 1757-1763 (1995); Wre. J. A., Angiogenesis and Cardiovascular Disease (J.A. Ware and M. Simons, eds), Oxford University Press, New York, Oxford, 30-59 (1999); Ware, J.A., and Simons, M., Nat. Med. 3: 158-164 (1997); Arras, M., Ito, W.D., Scholz, D., Winkler, B., Schaper, J., and Schaper, W., J. Clin. Invest. 101: 40-50 (1998); Banai, S., Jaklitsch, M.T., Casscelles, W., Show, M., Shrivstav, S., Correa, R., Epstein, S.E.and Unger, E.F., Circ. Res. 69, 76-85(1991); Arras, M., Mollnau, H., Strasser, R., Ito, W.D., Schaper, J., and Schaper, W., Nat. Biotechnol. 16: 159-162 (1998), Kurz, H., Wilting, J., Sandau, K., and Christ, B., Microvasc. Res. 55: 92-102 (1998)、その一方で、冠動脈閉塞による心筋壊死は非常に急速に（数時間単位）生じるUnger, E.F., Show, M., Sheffield, C.D., Hodge, E., Jaye, M., & Epstein, S.E., Am. J. Physiol. 264: H1567-1574 (1993); Unger, E.F., Banai, S., Shou. M., Jaklitsch, M., Hodge, E., Correa, R., Jaye, M., & Epstein, S.E., Cardiovasc. Res. 27: 785-791 (1993); and Schlaudraff, K., Shumacher, B., von Specht, B.U., Seitelberger, R., Schlosser, V., & Fasol, R., Eur. J. Cardiothorac. Surg. 7: 637-643 (1993)。したがって、治療的な早期の血管新生および心筋新生は最も有用な代替戦略を提供すると考えられ、もし成功すれば、多くの虚血性疾患および損傷した心筋における主要な治療上の選択になると思われる。

現在まで、心臓における早期の血管新生および心筋の再生を誘導することが可能な類似の製品は、世界中の市場になく、完全に新規である。急性および慢性虚血性動物モデルの両方の過去の研究および臨床試験によると、VEGF、aFGF、bFGF、またはPDGFなどの一部の成長因子は、ある程度血管新生を増強することができるが、時間がかかる（数週間単位）一方で、冠動脈閉塞による心筋壊死が非常に急速に（数時間単位）生じる。したがって、早期の血管新生の誘導は、心臓における梗塞の大きさを縮小させ、罹患した組織を救うことが重要な目標となっている。さらに、科学および研究分野の最先端の進歩をもってしても、心筋細胞の再生に用いることができる方法も薬剤もない。

我々の最近の研究では、漢方薬であるダイコンソウの抽出物が、ウサギ急性心筋梗塞モデルにおいて新しい血管の早期の成長（<48時間）および心筋細胞の再生への刺激に強力な作用を示すことを明らかにした。自然発生の血管新生と成長因子を用いた血管新生の週単位の期間と比較すると、EGJが心筋において血管新生を誘発するのに要する時間は48時間未満である。EGJが血管新生を早期に誘発するというこの固有の特徴は、虚血性疾患の効果的な治療の新戦略を開発する上で非常に有用であり、我々の動物実験で立証されたように、心筋梗塞が生じた場合の梗塞のサイズの減少、罹患した心筋細胞の救助において特に重要である。

虚血性血管疾患の治療のための自然発生的な血行再建プロセスを補強することによる治療的血管新生の概念は、非常に魅力的な考え方である。この概念は、冠状動脈性心疾患または心筋梗塞などの虚血関連疾患を罹患する患者における血行再建をより完全に達成する機会を提供する。虚血性心疾患の場合、予防は別として、現在、冠状動脈の閉塞は手術または血管形成術でしか緩和させることができない。初期段階における新しい血管の成長を刺激することができる効果的な医薬品はない。さらに、心筋梗塞後、心筋は新しい心筋細胞を再生して失われた筋細胞を置換することはできない。壊死した心筋に置き換わる瘢痕組織は、さらに心機能を悪化させる。したがって、虚血を治療し、損傷したまたは失われた心筋細胞の置換を刺激するためには、代替的な血行再建戦略が必要であることは明らかである。治療的血管新生および心筋新生は最も有用な代替戦略であり、冠状動脈性心疾患および虚血性四肢を含む数多くの虚血性疾患、および損傷した心筋の治療の主要な治療上の選択になると考えられる。さらに、早期の血管新生が実現できれば、現行の治療方法の一部を侵襲性が低くより効果的な戦略に置換することも可能であると考えられる。

本願発明は初期段階において血管を成長させ、梗塞した心筋における心筋細胞を再生させて損傷した心筋を置換するという目的を、EGJの使用によって実現する。EGJは、虚血心または四肢の閉塞した血管の遠位部に直接、局所心筋注射することによって投与することができる。また、局所心筋注射に耐えられない患者で新生物形成または腫瘍がないと証明された患者において、経口投与（丸剤）または血流内もしくは筋肉への注射の剤形に開発することも可能である。

本願発明は、虚血心および心筋梗塞における早期の血管新生および心筋再生を刺激し、冠状動脈性心疾患を含む虚血性心疾患、心筋梗塞、虚血性四肢、損傷した心筋および組織などの虚血性疾患の治療に有用な、ダイコンソウの有機抽出物、とくにメタノール抽出物に関連する。

発明の概要
本願発明の目的は、患者が罹患する虚血、組織損傷および組織治癒に関する疾患の治療のための有機EGJを含む薬学的組成物を対象とする。本願発明による薬学的組成物は、有効量のEGJおよび薬学的に許容な担体を含む。

本願発明の別の目的は、ヒトを含む対象における虚血、組織損傷、および組織治癒に関連する疾患を治療する医薬品を製造するための有機EGJの使用であって、有効量の前記有機EGJを薬学的に許容な担体、または骨損傷および疾患の治療用の骨形成タンパク質などのその他の治療用試薬と混合するステップを含む、使用を提供することである。

本願発明のさらなる目的は、対象における虚血、組織損傷、および組織治癒に関連する疾患の治療のための、ダイコンソウからの有機溶媒による抽出物を調製する方法を提供することである。前記方法は、前記植物を断片に粉砕するステップと、前記断片を有機溶媒に浸すステップと、得られたものをろ過するステップと、そのフィルターを蒸発させて乾燥させるステップとを含む。

本願発明のさらなる目的は、対象における虚血、組織損傷、および組織治癒に関連する疾患を治療するための方法であって、前記対象に治療上有効な量の前記有機EGJを投与するステップを含む、方法を提供することである。

発明の詳細な説明
ダイコンソウからの有機溶媒による抽出物を調製するプロセスにおいて、この植物は好ましくは乾燥したものを用いる。その場合、前記植物は、好ましくは粉末状に粉砕する。

本願発明で用いられる「EGJ」という略語は、特に指示のない限り、後述の、ダイコンソウからの有機溶媒による抽出物を意味する。

本願発明のプロセスに用いられる有機溶媒は25°において液体状態のもので、置換されていないかまたは1つ以上の置換基で置換されている、脂肪族炭化水素もしくは芳香族炭化水素、ケトン（アルデヒド）、カルボン酸、エステル、およびエーテル、またはそれらの混合物からなるグループから選択されてよい。

本願明細書に用いられる「脂肪族炭化水素」という用語は、アルカン、アルケン、アルキン、および脂環式炭化水素を意味し、一般に4乃至20炭素を含む。

「置換基」という用語は、ハロ、ヒドロキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシル、アルキルチオ、アルケノキシル、アルケニルチオ、およびアルキニルチオからなるグループから選択される。置換基のうち、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、低級アルコキシル、低級アルキルチオ、低級アルケノキシル、低級アルケニルチオ、低級アルキノキシル、および低級アルキニルチオが好ましい。置換基の数は1乃至3個であってよい。

「アルキル」という用語は、直鎖および分岐鎖基を含む飽和脂肪族炭化水素を意味する。好ましくは、前記アルキル基は1乃至20個の炭素原子を有する（たとえば「1乃至20」などの数値の範囲が本願明細書に用いられる場合にはいつでも、対象の化学基、この場合アルキル基は炭素原子1個、炭素原子2個、炭素原子3個、など、最高20個を含む炭素原子からなる可能性があることを意味する）。

本願発明に用いられる「低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、低級アルコキシル、低級アルキルチオ、低級アルケノキシル、低級アルケニルチオ、低級アルキノキシル、または低級アルキニルチオ」という用語は、1乃至6個の炭素を含有する。

置換芳香族炭化水素の中では、クロロベンゼン、トルエンおよびキシレンなどの、塩素および低級アルキルで置換されたものが好ましい。

本願発明の溶媒の中では、2乃至18個の炭素原子を含有するような、アルコール、エーテル、ケトン、カルボン酸およびエステルが好ましい。これらの溶媒の中で、低級アルキルアルコールが好ましく、より好ましくはC_1-4アルコール、最も好ましくはメタノールである。

本願発明の浸漬のステップは、10°乃至100°の温度で行ってよい。使用される溶媒の沸点によって変化する。一般に、このステップは10°乃至その溶媒の沸点の温度で行ってよい。好ましくは、このステップは周囲温度で行われる。

本願発明の薬学的組成物では、「有効量」または「治療上有効量」という用語は当業者には明らかである。治療する対象の年齢、体重、および状態、ならびに投与される方法によって変化する。一般に、この組成物中の抽出物は、重量による0.01%乃至99.99%、好ましくは1%乃至99%、さらに好ましくは10%乃至90%、および最も好ましくは30%乃至70%の範囲で変化する。

本願明細書に用いられる「患者」または「対象」は、ヒトまたは動物を意味する。一般に、それは動物またはヒトを示唆する。前記動物は、本願明細書に記載の疾患を罹患するウシ、ウマ、ブタ、シカ、ウサギ、およびイヌなどの家畜動物または狩猟動物であってよい。

本願発明に記載の「活性成分」は、本願発明に開示される有機溶媒によるEGJを意味する。

本願明細書に用いられる「担体」または「薬学的に許容な担体」は、望ましい特定の投与剤形に好適なあらゆる溶媒、希釈剤、またはその他の液体賦形剤、分散または懸濁補助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、保存剤、固体結合剤、および潤滑剤などを含む、本願明細書に開示される薬学的組成物のその他の成分と適合性があり、前記組成物が投与される患者に過度に有害ではないという意味で許容である、構成要素または成分を意味する。本願発明の組成物の活性成分は脂溶性であるために、前記組成物を液体状の剤形に調合する場合には、前記活性成分を、エタノール、n-プロパノール、i-プロパノールn-ブタノール、およびベンジルアルコールなどのC_2-12アルコール、グリセロール、プロピレングリコール、N,N-ジメチルアセトアミド、DMSO、オリーブ油、菜種油、ピーナツ油、ケシ油、ゴマ油、大豆油、およびその他の植物性油を含む担体の中にまず溶解し、その後、必要であれば、望ましい剤形に調製する。前記担体は、ゼラチン、乳糖、ステアリン酸マグネシウム、タルク、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、デンプン（トウモロコシデンプンおよびバレイショデンプン）、および製薬業に公知のものなど、製薬業に従来から用いられるものから選択された固体も含んでよい。

前記薬学的組成物はまた、製剤業に典型的に用いられる、界面活性剤、高圧ガス、香味料、保存剤、緩衝剤、充填剤、結合剤、崩壊剤、および潤滑剤など、調製される剤形によって当業者が決定することができる1つ以上の成分を含んでもよい。

本願発明に用いられる薬学的組成物には全身および局所剤形が含まれ、その中でも好ましいのは、吸入、経口、直腸、経膣、腔内、臓器内、ならびに口腔内、舌下、皮膚、および眼内を含む局所、ならびに皮下、皮内、筋肉内、静脈内、および動脈内を含む非経口、ならびに経皮投与に好適な剤形である。

前記組成物は、単一または複数単位投与剤形であってもよく、バルク状のままであってもよく、製薬業界に公知の任意の方法で調製してよい。それらすべての方法には、前記活性成分であるEGJを、1つ以上の副成分を構成する担体と合わせるステップが含まれる。前記剤形は、一般に前記活性化合物を液体担体、粉砕した固体担体、またはその両方と均一および密接に合わせるステップと、必要であれば、その生成物を望ましい剤形に成型するステップによって調製される。

経口投与に好適な組成物は、予め決められた量の前記活性成分をそれぞれが含有するカプセル（capsule）、カプセル（cachet）、トローチ剤、または錠剤などの離散した単位、粉末もしくは顆粒、水溶性の溶液中に入った溶液もしくは懸濁液、または水中油もしくは油中水乳剤であってよい。経口投与用の組成物には、胃の中での前記組成物の劣化を防止し、小腸において前記活性成分を放出するための当業に知られる腸溶コーティングが任意で含まれる。口腔内投与に好適な組成物には、通常はショ糖およびアカシアまたはトラガカントなどの香味ベースに入った活性成分を含むトローチ剤（lozenge）、ならびにゼラチンおよびグリセリンまたはショ糖とアカシアなどの不活性ベースに入った前記活性成分を含むトローチ剤（pastille）が含まれる。

非経口投与に好適な組成物には、前記活性成分の滅菌水溶性および非水溶性注射溶液が含まれ、その調製物は好ましくは投与を意図する対象の血液と等張である。これらの調製物は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および前記組成物を投与を意図する対象の血液と等張にする溶質が含まれてよい。水溶性および非水溶性滅菌懸濁液は、懸濁剤および増粘剤を含んでよい。前記組成物は、密封されたアンプルおよびバイアルなどの単回投与または複数回投与用容器に入っていてよく、食塩水または注射の即時調合用水などの滅菌液体担体中に保存してよい。即時調合用注射溶液および懸濁液は滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製されてよい。

皮膚への局所投与に好適な本願発明による組成物は、好ましくは、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾル、または油の形状である。経皮投与に好適な組成物は、投与対象者の皮膚に、長時間密接に接触した状態を保てるような離散したパッチにしてよい。経皮投与に好適な組成物はまた、イオン導入法によって送達してよく、典型的には前記活性成分の任意に緩衝化した水溶液の形状であってよい。

前記活性成分は、投与の簡便性と投与量の均一化のために、好ましくは投与単位剤形に調剤する。本願明細書に用いられる「投与単位剤形」とは、治療対象の患者に適切な薬学的組成物の物理的に離散した単位を意味する。各投与量は、所定の薬学的担体などの望ましい治療効果か、または所定の薬学的担体に関連する望ましい治療効果のいずれかを生じるように計算された量の活性成分を含有すべきである。典型的には、前記活性成分は前記組成物中に約0.1mg乃至約500mg、好ましくは約1mg乃至100mgの範囲内の重量を含有する投与単位で投与されるであろう。

本願発明の活性成分は、望ましい治療効果を得るために、1日あたり、対象の体重1kgあたり約0.001乃至約120mg、好ましくは1日あたり対象の体重1kgあたり約0.01乃至約30mgを、1日に1回以上投与してよい。

例として、経口投与に好適な投与量は、1日あたり体重1kgあたり30mg程度であって、静脈投与に典型的な投与量は、1日あたり体重1kgあたり1乃至10mg程度であろう。

本願発明の薬学的組成物は、虚血性心疾患および虚血性四肢などの虚血、軟組織または硬組織の損傷、手術創傷、および大腿骨頭（頸）骨折または頸骨1/3下端骨折などの血管新生を要する組織治癒などの組織損傷に関連する疾患の治療に用いられると考えられる。

骨格筋損傷、皮膚損傷、手術創傷およびその他の軟組織損傷を治療する場合、局所投与用の形成が好ましい。しかし、ペースト、軟膏、または粉末は、火傷など外部投与による損傷用に調合されることが好ましい。心疾患の治療の場合には、薬物の局部濃度が高く、よりよくより効果的に機能するように、溶液の局部注射を使用することが推奨される。しかし、もし患者が腫瘍または悪性新生物を同時に罹患している場合、全身投与または経口投与を行うことは推奨されず、局部注射のほうが安全である。

本願発明に従った、虚血、組織損傷および組織治癒に関連する疾患を治療するための、EGJによる薬学的組成物の製造プロセスでは、有効量のEGJを上述の1種類以上の担体に混合する。その薬学的組成物において、EGJは通常、重量で0.01%乃至99.99%である。好ましくは、前記EGJは組成物中に重量で1乃至99%である。

漢方に由来する血管形成試薬をスクリーニングする経過中において、ダイコンソウのメタノール抽出物は、虚血心筋および心筋梗塞の両方において新しい血管の早期（48時間未満）の成長を刺激し、心筋梗塞における心筋の再生を引き起こすという2重の強力な作用を示すことが明らかになった。

例１
貴州省で採集したダイコンソウの植物全体を乾燥させたもの1kgを粉末にした。それから、前記植物の粉末を室温で2乃至3時間メタノール（8L）に浸した。得られたものをろ過し、ろ紙を減圧下で蒸発乾燥させて（50℃）粉末（50g）を得た。クロマトグラフィー及びNMRによる分析の結果、EGJが主にタンニンと2-α、19-α-dihydroxy-3-oxo-12-ursen-28-oic acid, ウルソル酸（ursolic acid）、エピモル酸（epimolic acid）、マスリン酸（maslinic acid）、ユースカフィック酸（euscaphic acid）、トルメント酸（tormentic）、トルメン酸の28-β-D-グルコシド等を含むことが明らかとなった。

例２
例１で得たEGJ粉末 0.4g
5%DMSO水溶液 100ml
EGJ粉末を100mlの5%DMSO水溶液に溶解し、使用液を得た。

例３
例１のEGJ 0.1g
トウモロコシデンプン 0.5g
乳糖 1.87g
ステアリン酸マグネシウム 0.03g
例１のEGJ粉末、トウモロコシデンプン、および乳糖を均一に混合した。その混合物に、少量の水を加えた。得られた物質をろ過して乾燥させた。その混合物にステアリン酸マグネシウムを加え、均一に混合した。得られたものを、ペレタイザでペレットにした。各ペレットの重さは250mgで、活性成分を10mg含んでいる。

例４
例１のEGJ 80mg
塩化ナトリウム 8mg
EDTA 1mg
リン酸ナトリウムバッファ（pH6.5） 10mg
ポリエチレングリコールエーテル 10mg
蒸留水総量が2mlになるように加える
すべての成分を蒸留水に溶解し、その混合物に蒸留水を2mlになるまで加えた。得られた溶液を滅菌フィルターでろ過し、吸入式点鼻薬を調合した。

実験１
図１に示すように、EGJの5%DMSO溶液（例２）を、培養したヒト血管内皮細胞（HVEC）および筋原細胞（C2C12）の増殖を刺激する特異的な血管形成および筋形成活性について調べた。図１の参照番号1、2および3はそれぞれ同一条件における異なる培養プレートを示す。EGJは、5%DMSO対照と比較して、投与量に依存する形で、培養物中のHVECの増殖を有意に増加させることができた。我々の動物実験では、このEGJ溶液が梗塞した心筋において血管形成および筋形成の両方に2重の強力な作用を示すことも実証した。クロマトグラフィによる測定では、EGJを溶媒に溶解し、10%メタノールで平衡化したセファデックスLH-20のカラムに装填して、勾配H₂O-メタノール（メタノールの量を増やす）で溶出した。12フラクションを溶出して、培養HVECおよびC2C12細胞の増殖を増加させる2つの活性について調べた。この特異的な2重の活性を有するこのメタノール抽出物（EGJ）を、さらに引き続きin vivo実験でテストした。NMRを用いて、活性フラクション中に含有される成分を決定した。

実験２
さらに、5%DMSOに溶解したこのEGJの心筋への作用を調べるために、ウサギ心筋梗塞モデルにおいて調べた。心筋梗塞モデルとしてウサギを選択した理由は、ウサギは、細動脈連結のない終動脈を持っており、急性冠動脈閉塞が急速な貫壁性梗塞を引き起こす可能性があるからである。実験動物の左旋回（LCX）動脈または左動脈前下行枝（LAD）をそれぞれ結紮した。結紮の直後、EGJ（EGJ の5%DMSO飽和溶液、0.5ml）または対照溶液（5%DMSO）の単回注射を、それぞれの結紮した動脈の遠位端に適用した。結紮後、第4日および第7日に、その動物を屠殺して心臓を取り出し組織学的に調査した。

図2は、青い矢印で示されるEGJで処理した動物（a）の梗塞領域の大きさが、対照（b）の大きさの3乃至5分の1だったことを示した。図3では、血液細胞で満たされた新しく形成された血管が、青い矢印で示されるEGJで処理した動物の心筋梗塞セグメント（aおよびc）においてたくさん観察された。反対に、対照（bおよびd）で観察された血管ははるかに少なかった。

第7日に、PCNA陽性染色核を有する新しく再生された心筋細胞が梗塞の辺縁においてたくさん認められ、一部はECJで処理した心臓の梗塞領域の中でクラスターとして組織化されており、図４（b）に示されるように、黒い矢印で示されるとおり多数の血管も認められた。反対に、図4（a）に示されるように、対照の心臓では、梗塞の辺縁にはPCNA陽性染色核を有する新しく再生された心筋細胞は少ししか認められず、新しく再生された心筋の中心部クラスターはまったく認められず、梗塞領域を占めているのは主に線維芽細胞だった。このセクションをさらに免疫組織化学的にモノクローナルミオシン重鎖（MF20）抗体で染色し、PCNA陽性染色核が心筋細胞であることを確認した。図4では、（c）は（b）における青い矢印で囲まれた領域の拡大図で、（d）では、青い矢印で示されるように、いくつかの新しく再生した心筋細胞もEGJ処理心の梗塞の辺縁に認められた。

PCNAに対するモノクローナル抗体での免疫組織化学的染色を用いると、新しく再生された細胞の核だけを陽性に染色することができる。抗MF20免疫組織化学染色法を用いて、心筋細胞だけを陽性に染色することができる。これらの2つの免疫組織化学染色法と、形態解析をあわせて、新しく再生された心筋細胞を確実に同定することができる。梗塞領域辺縁の無傷で損傷のない心筋細胞の核はPCNA染色では陰性になったが、MF20では細胞質は陽性に染色された（褐色に染色された細胞）。

本願発明はいくつかの好ましい実施態様に関して説明し例示したが、その他の実施態様も当業者に明らかであろう。したがって、本願発明は説明され例示された特定の実施態様に限定されることなく、本願発明の精神であって添付の特許請求の範囲によって描かれる全容から逸脱しない改良または変更が可能である。

本願発明のEGJが、さまざまな投与量で培養物中のHVECの増殖を増加させることを示す。本願発明のEGJで処理した後のウサギの心筋梗塞領域の大きさを示す。血液細胞で満たされた新しい血管が、本願発明のEGJで処理した後のウサギの梗塞領域内で形成されることを示す。梗塞領域におけるPCNA陽性染色心筋細胞が新しく再生され、特に、梗塞の中心領域にあるPCNA陽性染色細胞培養物が本願発明のEGJで処理した後に最も顕著であることを示す。

Claims

有機溶媒によるダイコンソウ抽出物（ＥＧＪ）を有効成分とする血管新生刺激剤。
対象において虚血および組織損傷の疾患を血管新生を刺激することによって治療するための薬学的組成物であって、ＥＧＪの治療上有効量および薬学的に許容な担体を含む、薬学的組成物。
請求項２に記載の薬学的組成物であって、当該組成物が重量で０．０１％乃至９９．９９％の前記抽出物を含む、薬学的組成物。
請求項２に記載の薬学的組成物であって、当該組成物において前記対象がヒトである、薬学的組成物。
請求項２に記載の薬学的組成物であって、当該組成物において前記有機溶媒が低級アルキルアルコールからなるグループから選択される、薬学的組成物。
請求項５に記載の薬学的組成物であって、当該組成物において前記低級アルキルが１乃至６個の炭素原子を含む、薬学的組成物。
請求項６に記載の薬学的組成物であって、当該組成物において前記有機溶媒がメタノールである、薬学的組成物。
請求項２乃至７のいずれかに記載の薬学的組成物であって、当該組成物において前記疾患が虚血性心疾患、虚血性四肢、軟組織もしくは硬組織損傷、手術創傷、大腿骨頭（頸）骨折または頸骨１／３下端骨折を含む、薬学的組成物。
血液供給の再構成のために血管新生を刺激することによって、虚血および組織損傷の疾患を治療するための薬剤の調製におけるＥＧＪの使用。
請求項９に記載の使用において、前記疾患が冠動脈性心疾患および心筋梗塞である。
請求項９に記載の使用において、前記疾患が心筋損傷である。
請求項９に記載の使用において、前記疾患が心筋細胞損傷または欠損である。
請求項９に記載の使用において、前記疾患が、血液供給の再構成を要する軟組織および硬組織損傷である。
請求項９に記載の使用において、前記疾患が虚血性四肢である。