CN104971091A - 一种用于制备促进心肌再生药物的提取物的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于制备促进心肌再生药物的提取物的制备方法及其应用，属于中草药技术领域。本发明确证中草药唇形科植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bge)的干燥根及根茎的水或醇的提取物在受损心脏中特异性诱导和促进心肌细胞再生修复取代受损或坏死的心肌组织的作用。在大鼠心肌梗塞动物模型中，该提取物显示出对受损心肌组织中的促心肌再生和心肌组织损伤修复的功效。本发明的所述提取物能够开发为特异性治疗心肌梗塞的特效的治疗性药剂。

Description

一种用于制备促进心肌再生药物的提取物的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于中草药技术领域，具体涉及丹参(Salvia miltiorrhiza Bge)的干燥根及根茎的，丹参干燥根及根茎和华西银腊梅(Potentilla arbusculavar.veitchii)的叶的，以及丹参的干燥根及根茎和蔷薇科(Rosaceae)植物委陵菜Potentilla chinensis Ser.的全草的醇/水提取物，及将所述各种提取物用于在受损的心肌组织中促进心肌再生。本发明还涉及制备提取物的方法，以及在特异性治疗心肌梗塞中的应用。

背景技术

丹参(Salvia miltiorrhiza Bge)又名赤参，紫丹参，红根等，为双子叶植物唇形科(Labiatae)，干燥根及根茎。丹参是多年生直立草本，根肥厚，肉质，外面朱红色，内面白色，长5-15厘米，直径4-14毫米，疏生支根。茎直立，高40-80厘米，四棱形，具槽，密被长柔毛，多分枝。叶常为奇数羽状复叶，叶柄长1.3-7.5厘米，密被向下长柔毛。花期4-8月，花后见果。

丹参喜欢在气候温和，光照充足，空气湿润的环境下生长，年平均气温为17.1℃，平均相对湿度为77％的地区是最优良的种植区。丹参在肥沃的沙质壤土中生长较好，但对土壤酸碱度适应性较广，中性、微酸、微碱均可生长。主要生长于河北、山西、陕西、山东、河南、江苏、浙江、安徽、江西及湖南，日本也有。

丹参的主要功效与作用有：1.强心，加强心肌收缩力、改善心脏功能，不增加心肌耗氧量；2.扩张冠脉，增加心肌血流量；扩张外周血管，血流增加；脑血流量下降；3.抗血栓形成，提高纤溶酶活性，抑制血小板聚集，延长凝血时间，降低血粘度；4.改善微循环。5.促进纤维母细胞分化、促进胶原纤维形成，使愈合时间缩短。6.抗菌，丹参制剂中含有隐丹参酮、二氢丹参酮，对体外的葡萄球菌、大肠杆菌、变性杆菌有抑制作用。但是从未有报道丹参可以在受损的心肌组织中有促进心肌再生的功能。

华西银腊梅，是蔷薇科的一种落叶小灌木，高1～1.5米。花瓣白色，倒卵形或近圆形，长7～10毫米。全株茎秆叶片质地柔软，无臭、无味、无刚毛、叶为羽状复叶，有小叶2对，长0.5-1.2cm，宽0.4-0.8cm，叶具柄长约1.5-3cm，叶背面披白色长柔毛。秦岭山上花期7～8月，花繁叶茂，树形美观，生长于2300～3000米的高山梁灌丛或草地。

华西银腊梅的主要功效与作用有：叶入药，能清热、健胃、调经，干品煎服主治暑热眩晕、胃气不和、滞食及妇女月经不调等症。但是从未有报道华西银腊梅可以在受损的心肌组织中有促进心肌再生的功能。

委陵菜是蔷薇科植物委陵菜的全草。多年生草本，高30～60cm。主根发达，圆柱形。茎直立或斜生，密生白色柔毛。羽状复叶互生，基生叶有15～31小叶，茎生叶有3～13小叶。小叶片长圆形至长圆状倒披针形，长1～6cm，宽6～15mm，边级缺刻状，羽状深裂，裂片三角形，常反卷，上面被短柔毛，下面密生白色绒毛。聚伞花序顶生；副萼及萼片各5，宿存，均密生绢毛；花瓣5，黄色，倒卵状圆形；雄蕊多数；雌蕊多数。瘦果有毛，多数，聚生于被有绵毛的花托上，花萼宿存。花期5～8月，果期8～10月。

委陵菜主要生于向阳山坡、荒地。主产山东、辽宁和安徽。一般春季未抽茎时采挖。主要化学成分为：根含鞣质、蛋白质；嫩苗含维生素C。委陵菜的主要功效与作用有：清热解毒，凉血止痢。用于赤痢腹痛、久痢不止、痔疮出血、痈肿疮毒。但是从未有报道委陵菜可以在受损的心肌组织中有促进心肌再生的功能。

冠心病包括慢性冠心病，心肌梗塞，是美国、欧洲等西方国家及香港等亚洲发达地区的首要死亡因素，在中国也表现出了这个趋向。目前几乎所有的用于冠心病，尤其是急性心肌梗塞的治疗方案只能缓解其症状或支持疗法，根本无特异性有效的药物。冠状动脉堵塞，堵塞动脉所支持的供血区域缺血导致的心肌坏死。坏死的心肌无法再生，只能以无收缩功能的纤维瘢痕组织修复。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种一种用于制备促进心肌再生药物的提取物的制备方法及其应用。

本发明采用的技术方案如下：

本发明中乙醇的浓度，如无特殊说明均为体积百分含量。

一种用于制备促进心肌再生药物的提取物的制备方法，包括如下步骤：

步骤(a)，原料选择及提取：原料可以选择以下三种的任意一种：一、丹参；二、质量比为2∶1的丹参和华西银腊梅的叶；三、质量比为1∶1的丹参和委陵菜全草；

以C1-C4的醇和水中的一种作为提取溶剂，对原料进行提取；

所述的丹参均为丹参干燥根及根茎。

进一步，优选的是所述步骤(a)所述的提取在室温下进行2-3小时，并重复提取5次，所述的提取溶剂为乙醇。

本发明技术方案还包括以下步骤：

步骤(b)，将所述步骤(a)得到的提取液干燥成干粉；

步骤(c)，将所述步骤(b)得到的干粉先用C6烷烃提取，C6烷烃提取液去除后，剩余的部分再用乙酸乙酯进行提取，然后将乙酸乙酯提取液去除，剩余的部分最后用选自C1-C4的醇进行提取，并将不溶性沉淀物去除，得到C1-C4醇的提取物。

进一步，优选的是所述的C6烷烃为正己烷，且所述步骤(c)中所用的醇为正丁醇。

本发明技术方案中，还包括以下步骤：

步骤(d)，将所述步骤(c)得到的C1-C4醇的提取物干燥成干粉，得到粉末。

本发明技术方案中，还包括以下步骤：

步骤(e)，将所述步骤(d)得到的粉末溶解于体积百分浓度为10％的乙醇溶剂中，常压过滤；上样前，用10％乙醇洗脱液平衡层析柱，10％乙醇的加入量为至少两个柱体积，直到基线变得平稳为止；然后湿法上样，将柱体积的1-5％的滤液加入到羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)层析柱中；待滤液均进入柱床后，加洗脱剂，开始洗脱；

步骤(f)，由于Sephadex LH-20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤为主，兼有反相分配作用，所以根据反复分离实验，我们使用反相溶剂洗脱，即渐增浓度梯度的醇和水的混合溶液对所述层析柱进行洗脱，洗脱时间为40分钟；即色谱柱Sephadex LH-20柱(25mm X 400mm)；流动相：流动相A为乙醇，流动相B为10％乙醇水溶液，流速控制在1滴/秒；通过控制流动相A与流动相B的比例，使得洗脱剂中乙醇浓度梯度的上升速率控制在30分钟内由10％达到100％，匀速上升，此后维持100％乙醇浓度，冲洗柱子10分钟；其中20-70％醇/水溶液洗脱部分为制备的促进心肌再生药物的提取物。

接馏分的步骤：看样品的色带还有约20cm就要下来时，开始接馏分；馏分一定要接的细，可1/10，或1/20个保留体积接成一馏分。

进一步，优选的是所述的层析柱为Sephadex LH-20柱，柱子尺寸为25mm X400mm。

进一步，优选的是步骤(b)和步骤(d)中所述的干燥时在减压下进行的。

上述制备方法制备得到的提取物作为用于制备促进心肌再生来取代梗死的心肌的药物的应用。

本发明将丹参的干燥根及根茎醇提取物或水提取物、丹参和华西银腊梅叶醇提取物或水提取物、丹参和委陵菜全草的醇提取物或水提取物、市售的上海新亚药业高邮有限公司生产的丹香冠心注射液和市售的上海绿谷制药有限公司生产的注射用丹参多酚酸盐(冻干粉剂)一起总称为ESMs，本发明发现在大鼠心肌梗死动物模型中具有诱导在心肌梗死区促进心肌再生，来取代梗死心肌的作用。在心肌梗塞动物实验中，用药一个月后，ESMs治疗组别中，发现在心肌梗塞灶内和梗塞灶周围可见许多新再生的心肌细胞。而许多这些新再生的心肌样细胞表现为c-kit或Sca-1阳性，提示ESMs治疗心肌梗塞可能促进了心肌局部的心肌干细胞增生和向成熟心肌细胞分化。对比之下，未治疗的对照组心肌梗塞面积较大，梗塞灶内浸润大量的炎症细胞，没有明显的心肌细胞分裂及再生。结果表明，ESMs能显著刺激心肌梗塞部位的心肌再生，并取代梗死的心肌，从而缩小梗塞病灶面积，促进心肌功能恢复。特别是丹参和华西银腊梅的提取物，以及丹参和委陵菜的提取物，在治疗动物心肌梗塞以及诱导心肌再生的效果上有协同或放大的治疗效果。因此，ESMs有极大的可能发展成为一种新的，并非常有效的治疗心肌梗塞的特效药物。

通过促进心肌内源性修复机理和局部的心肌干细胞增生和向成熟心肌细胞分化，形成新再生的心肌来修复梗死的心肌是一个非常有吸引力的概念。它使我们有机会使心肌梗塞病人重新获得治愈性治疗的效果，这是现代医学还无法达到的，而目前尚无治愈性治疗心肌梗塞的方法和药物。目前，对于缺血性心脏病除采取必要的预防措施外，对于冠状动脉的堵塞，临床大多采用外科手术或动脉搭桥术进行缓解。一般认为，一旦心肌梗死发生，心肌细胞便不能再生。因而无法挽救丢失的心肌细胞，受损心肌的区域只能形成纤维瘢痕来修补，无收缩功能并且僵硬的疤痕组织虽然帮助维持了心脏的结构完整性，但是会进一步加重心脏重构以及功能障碍，甚至导致心衰。显然，要想有效甚至治愈性治疗心肌梗塞的关键是能够诱导心肌再生，并取代由于缺血而死亡丢失的心肌细胞。但是目前无论是从临床治疗性药物还是到医学基础研究，人们尚未发现任何方法及方案来达成这一目标。药物治疗性心肌再生，或作为一种非创伤性、特异性、治愈性治疗策略，对于心肌梗塞的治疗将有不可估量的应用前景和深远的意义。

本发明人发现ESMs在心肌梗塞动物模型中能非常有效地通过诱导心肌再生来治疗心肌梗塞及其引起的心功能不全。

一方面，本发明涉及ESMs用于治疗心肌梗塞。其中所述的ESMs注射液中主要成分为水溶性的多羟基酚酸类化合物。其中主要包含：丹参素(含钠)，原儿茶醛(protocatechuic aldehyde)，迷迭香酸(Rosmarinic acid)，单酚酸B(alvianolic acid B)和单酚酸A(alvianolic acid A)。

另一方面，本发明制备的提取物是用于预防或治疗心肌梗塞的试剂是含有一种或多种赋形剂、载体或填充剂的药物组合物的一部分。所述药物组合物以单位剂量形式包装。所述单位剂量形式能有效治疗心肌梗塞。

在一些实施方案中，使用心肌梗塞的体内模型来评价试剂对个体的治疗效果。合适的体内模型是大鼠冠状动脉结扎引起的心肌梗塞，来研究试剂在治疗动物个体中心肌梗塞的效果，并与相匹配的对照组进行比较。

可以按照本发明所述治疗的个体包括真核生物，例如哺乳动物，例如人、羊、牛、马、猪、犬科动物、猫科动物、非人灵长动物、小鼠和大鼠等。

在本发明的各个实施方案中，进行合适的体外或体内测定来确定本发明试剂(提取物、有效部位和化合物)的效果以及所述试剂的给药是否适用于治疗个体所患疾病或医学疾病状态。这些测定的实例在上文中结合具体疾病或医学治疗进行了描述。

通常，足以实现预防或治疗效果的本发明组合物的有效量为约0.01mg/kg/天至约10，000mg/kg/天。一般情况下，剂量为约0.01mg/kg/天至约1000mg/kg/天。对于试剂给药，剂量范围可以为每天、每两天或每三天约0.01至1000mg/kg宿主体重，更通常为0.1至500mg/kg宿主体重。示例性的治疗方案为每两天一次或每周一次或每月一次给药。通常多次给予所述试剂。单次剂量之间的间隔可以是每天、每周、每月或每年。或者，可以以缓释制剂的形式给予所述试剂，在这种情况下，需要较少的给药频率。剂量和频率根据试剂在个体中的半衰期而不同。给药的剂量和频率可以根据是预防性处理还是治疗性处理而不同。在预防性应用中，以相对低频率的间隔长期给予相对低的剂量。在治疗性应用中，有时需要以相对短的间隔给予相对高的剂量，直至疾病的进展被延缓或停止，直至个体表现出疾病症状的部分或完全改善。

本发明的药物组合物的配制符合其预期的给药途径。本发明的组合物可以通过以下途径给药：静脉内、口服、皮下、真皮内、经皮、腹膜内、肌内途径或作为吸入剂。所述试剂可以任选地与在治疗各种疾病中至少有一定效果的其它试剂联合给药。

通过心肌梗死动物模型实验来证明ESMs具有诱导在心肌梗死区促进心肌再生，来取代梗死心肌的作用。在心肌梗塞动物实验中，用药一个月后，ESMs治疗组别中，发现在心肌梗塞灶内和梗塞灶周围可见许多新再生的心肌细胞。而未治疗的对照组心肌梗塞面积较大，梗塞灶内浸润大量的炎症细胞，没有明显的心肌细胞再生。结果表明，ESMs能显著刺激心肌梗塞部位的心肌再生，并取代梗死的心肌，从而缩小梗塞病灶面积，促进心肌功能恢复。其中丹参和华西银腊梅的提取物、丹参和委陵菜的提取物诱导心肌再生的效果都比仅用丹参、仅用华西银腊梅、或仅用委陵菜治疗的效果要好，提示因此丹参和华西银腊梅组合，或者丹参和和委陵菜的组合具有协同或放大的治疗效果，而不仅仅是叠加的治疗效果。因此，根据丹参，以及其他所述组合物促进心肌再生的特点，ESMs有极大的可能发展成为一种新的，治疗心肌梗塞的特异性药物。

提供以下描述是为了有助于阅读者的理解，并不是承认提供的信息或引用的文献是本发明的现有技术。目前几乎所有的用于冠心病治疗的方案只能缓解其症状，对心肌梗塞更是仅仅能提供支持疗法。如果能有一种可以促进新的心肌再生来取代梗死心肌的药物的话，这将是治疗心肌梗塞的划时代进步，将为心肌梗塞提供治愈性治疗的可能。在我们最近的研究中，通过大鼠急性心肌梗塞模型证实，分别用ESMs治疗心肌梗塞大鼠一个月，可以显著地诱导实验大鼠心肌梗死区内新的心肌再生，并取代已经梗死的心肌，从而显著缩小心肌梗死面积。

通过在心肌梗塞区再生新的心肌来取代梗死的心肌是针对心肌梗塞病理特点治愈性治疗心肌梗塞的一个非常有吸引力的概念。它使我们有机会使心肌梗塞，或有心肌损伤相关疾病的病人获得治愈性治疗，从而治愈或部分治愈目前尚无任何方法治愈的心肌梗塞。一般广为接受的概念认为，一旦心肌梗死发生，心肌细胞便不能再生。因而无法挽救丢失的心肌细胞，损伤或坏死心肌的命运只能是被疤痕组织所取代，虽然瘢痕愈合维持了心脏结构的完整性，但是无收缩功能的瘢痕组织又进一步加重心功能障碍。显然，通过诱导心肌细胞再生来取代由于损伤而失去的心肌细胞是治疗心肌梗塞或心肌损伤性心脏病的关键。但是目前无论是从临床治疗性药物还是到医学基础研究，人们尚未发现任何方法及方案来达成这一目标。因此能够发现可促使心肌细胞再生的药物在特异性治疗各种与心肌损伤有关的心脏病中有深远的意义及前景。

本发明提供特异性治疗哺乳动物个体中的心肌梗塞的方法，包括分别给予所述哺乳动物个体有效量的ESMs，其中ESMs包含：

(1)丹参的干燥根及根茎的水/醇提取物，丹参和华西银腊梅的提取物、丹参和委陵菜的提取物，丹香冠心注射液，丹参多酚酸盐；

(2)用药2-4周，ESMs治疗组别中，发现在心肌梗塞灶内和梗塞灶周围可见许多新再生的心肌细胞。而未治疗的对照组心肌梗塞面积较大，梗塞灶内浸润大量的炎症细胞，没有明显的心肌细胞分裂及再生。结果表明，ESMs能显著刺激心肌梗塞部位的心肌再生，并取代梗死的心肌，从而缩小梗塞病灶面积，促进心肌功能恢复。其中丹参和华西银腊梅的提取物、丹参和委陵菜的提取物在治疗动物心肌梗塞以及诱导心肌再生的效果有协同或放大的治疗效果。因此，ESMs有极大的可能发展成为一种新的，并非常有效药物，用以特异性治疗心肌梗塞。其中所述的ESMs注射液中不含有脂溶性成分，其主要成分为水溶性的多羟基酚酸类化合物。其中主要包含：

(i)丹参素(含钠)；

(ii)原儿茶醛(protocatechuic aldehyde)

(iii)迷迭香酸(Rosmarinic acid)

(iv)单酚酸B(alvianolic acid B)

(v)单酚酸A(alvianolic acid A)

其中，所述心肌损伤是由以下引起的：高血压；缺血性心脏病；暴露于心脏毒性化合物；心肌炎；甲状腺疾病；病毒感染；急性心肌梗塞。在一个实施方案中，所述个体是人。

在一个实施方案中，所述组合物是口服给药、静脉内给药、腹膜内给药或肌内给药。在一个实施方案中，所给予的组合物的量为0.1mg/kg/天至1000mg/kg/天。

在一个实施方案中，所述有效量的组合物是包含所述组合物和药学可接受的载体的制剂的形式。

另一方面，预防或治疗哺乳动物个体中的心肌损伤的方法，所述方法包括给予有需要的个体有效量的ESMs。

在一个实施方案中，所给予的ESMs的量为约0.1mg至约1000mg/kg/天。在一个实施方案中，所述提取物是口服给药。

在一个实施方案中，所述提取物是通过皮下注射、肌内注射或静脉输注进行给药。

(i)在一个实施方案中，所述ESMs包含丹参素、原儿茶醛(protocatechuicaldehyde)、迷迭香酸(Rosmarinic acid)、单酚酸B(alvianolic acid B)和单酚酸A(alvianolic acid A)。

另一方面，本发明提供用于特异性预防或治疗哺乳动物个体中的心肌损伤的药物组合物，其包含有效量的ESMs和药学可接受的载体。

在一个实施方案中，所述提取物是乙醇提取物或水提取物。

在一个实施方案中，所述提取物是水提取物。

附图说明

图1为正丁醇提取物Sephadex LH-20柱层析的丹参洗脱物的HPLC图；

图2为超声心动图测量实验动物心功能变化的曲线；“Baseline”是实验大鼠在LAD结扎前的正常心功能；“Ligation”是LAD结扎3天后迅速下降的心功能；“2W”治疗后2周；“4W”治疗后4周；“Sham”表示进行开胸手术但不进行LAD结扎；“Ctrl”是溶剂治疗对照组大鼠的超声心动图；“ESM1、ESM2、ESM3、ESM4和ESM5”分别是丹参、丹参(2/3)和华西银腊梅(1/3)、丹参(1/2)和委陵菜(1/2)的提取物、丹香冠心注射液和丹参多酚酸盐治疗组；

图3为大鼠心肌梗塞的外观图；白色圆(A，B)是LAD结扎处；A(i)是溶剂治疗对照组的心脏；A(ii)是心脏A(i)的延心脏短轴切开观；B(i)是ESM1、ESM2、ESM3、ESM4、ESM5治疗组的具有代表性的心脏外观；B(ii)是心脏B(i)的延心脏短轴切开观；

图4为大鼠心肌梗塞的光学显微镜镜组织学图；Ctrl是溶剂治疗对照组，蓝色虚线包括的细胞是原有的未坏死的心肌细胞.C-f是Ctrl切片在紫外光显微镜下观察到的图像，白色虚线包括的细胞是原有的未坏死的心肌细胞。Mt是代表性的ESMs治疗的梗塞心脏，蓝色箭头所指处可见许多体积较原有的心肌细胞小的新再生的心肌细胞。黄色虚线下部的细胞是原有的未坏死的心肌细胞。Mtf是Mt切片在紫外光显微镜下的图像，白色箭头所指的是新再生的心肌样细胞，白色虚线下部的细胞是原有的未坏死的心肌细胞；

图5为纤维瘢痕组织特异性的Masson三色染色显微镜观察图；T-c是具有代表性的ESMs治疗组的心肌梗塞区的显微镜下的图像，T-cf是T-c切片在紫外光显微镜下的图像，两条白色虚线之间的区域内可见许多新再生的心肌样细胞。C-ct是溶剂治疗对照组的心肌梗塞区的Masson三色染色切片图像，可见梗塞区内基本完全被蓝染的纤维组织取代(Fib)。T-ct是代表性的ESMs治疗的心肌梗塞区的Masson三色染色切片的图像，黄色虚线围绕的区域可观察到许多新再生的心肌样细胞岛。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

本发明是制备及应用丹参的干燥根及根茎醇提取物或水提取物、丹参和华西银腊梅叶醇提取物或水提取物、丹参和委陵菜全草的醇提取物或水提取物、市售的上海新亚药业高邮有限公司生产的丹香冠心注射液和市售的上海绿谷制药有限公司生产的注射用丹参多酚酸盐(ESMs)促进在心肌梗死区诱导和促进心肌再生，用以取代受损的心肌组织。可望用于特异性治疗心肌梗塞和其它心肌受损的心脏病。其中丹参和华西银腊梅的提取物、丹参和委陵菜的提取物在治疗动物心肌梗塞以及诱导心肌再生的效果上有协同或放大的治疗效果。主要地，本发明提供特异性治疗哺乳动物个体中的心肌梗塞的方法。

在各个方面，本发明提供了用于在心肌损伤区促进心肌再生，来取代丢失的心肌细胞，因此可以特异性有效地治疗心肌损伤的丹参化合物、提取物和方法。本文提供的化合物可以配制为可用于公开的方法的药物组合物和药物。还提供了所述化合物和提取物在制备药物制剂和药物中的用途。

应当理解，为了提供对本发明的实质性理解，下文以不同详细程度描述了本发明的某些方面、模式、实施方案、变化和特征。以下术语在全文中按下文所述使用，除非上下文明确指明另外情况。

本文中，试剂、药物或化合物组合物对个体的“给药”包括将化合物引入或递送至个体以行使化合物预期功能的任何途径。可以通过任何合适的途径进行给药，包括口服、静脉内、肌内、腹膜内或皮下注射等。给药包括自给药和由他人给药。

本文所用的术语“心肌损伤”可能与多种病症有关，包括心肌梗塞、高血压、心肌病或心肌炎。

本文所用的术语组合物的“有效量”或“药学有效量”或“治疗有效量”是足以实现所需治疗和/或预防效果的量，例如，实现了与待治疗疾病相关的症状的预防或减少的量。给予个体的本发明组合物的量取决于疾病的类型、严重程度以及个体的特征，例如一般健康状况、年龄、性别、体重和对药物的耐受性。本领域技术人员根据这些因素以及其它因素能确定合适的剂量。本发明的组合物也可以与一种或多种其它化合物联合给药治疗。

本文所用的术语“个体”是指哺乳动物，例如人，但也可以是动物，例如，家畜(例如，狗、猫等)，农畜(例如，牛、羊、猪、马等)和实验室动物(例如，猴、大鼠、小鼠、兔、豚鼠等)。

本文所用的术语“治疗”或“缓解”是指治疗性处理措施，其目的是延缓或减轻所针对的病理疾病状态或病症。如果个体按照本文所述方法接受了治疗量的ESMs治疗后，该个体一种或多种心肌损伤的指征和症状表现出可观察到的和/或可检测出的改善，则个体的心肌损伤被成功地“治疗”了。本文所用的治疗心肌损伤还指治疗任何一种或多种可能引起心肌损伤的疾病状态，包括但不限于肺充血、心肌梗死或凋亡、降低的心肌收缩能力、降低的心搏量和降低的心输出量。

虽然丹香注射液还含有降香，但可能不是用于再生心肌细胞的主要成分，因为不含降香的丹参提取物和丹参多酚酸盐也有等效地在心肌梗塞区促进心肌再生的功效。

本发明用于制备促进心肌再生药物的化合物中，在一些实施方案中，所述化合物是丹参干燥根及根茎的提取物，所述提取物例如有机提取物或水的提取物。在具体实施方案中，所述化合物是丹参干燥根及根茎的乙醇或水提取物或其活性部位。在一些实施方案中，所述化合物是丹参和华西银腊梅的提取物，或丹参和委陵菜的提取物。在一些实施方案中，所述化合物是市售的丹香注射液和丹参多酚酸盐注射液。在一些实施方案中，所述化合物是丹参和干燥根及根茎的乙醇/水提取物或其活性部位。

丹参、丹参和华西银腊梅，或丹参和委陵菜提取物的制备。提供了制备所述提取物的方法。该方法包括以下步骤：(a)用醇/水分别提取丹参干燥根及根茎、丹参和华西银腊梅叶，或丹参和委陵菜全草，所述醇选自C1-C4醇。该步骤可以室温下重复3-6次，通常5次。在进行步骤(a)之前，可以将植物材料切成小段，切碎或制成粉末。C1-C4醇包括甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇和叔丁醇。通常，添加的醇的重量是待提取的材料重量的1-10倍。

所述方法还可以包括以下步骤：(b)将获自步骤(a)的提取物干燥为干燥粉末；和(c)用C6烷、EtOAc和选自C1-C4醇的醇依次提取获自步骤(b)的粉末。C6烷包括具有6个碳原子的环状和非环状烷，包括，例如，环己烷、正己烷和新己烷等。C1-C4醇包括甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇和叔丁醇。所用的有机溶剂的重量通常是待进一步提取的粉末重量的1-10倍。

在一个实施方案中，本发明的提取物、部位和化合物是利用水和/或有机溶剂从植物原材料提取得到的，包括以下过程：

1.将水和/或有机溶剂添加到植物材料，将整体进行诸如浸泡/浸滤、超声或微波的处理而进行提取；

2.在提取过程之前或之后，利用石油醚、己烷或氯仿类型的溶剂进行脱脂；

3.任选地，利用乙酸乙酯或乙醚类型的有机溶剂对回收的提取物进行进一步提取；

4.任选地，将获得的粗提取物浓缩，并根据需要将其冻干。

因此，本领域技术人员能根据所需纯化的提取物的性质选择最合适的溶剂。这些不同的提取物，即粗提取物或富集的提取物，也在本发明的范围内。实施其它分离过程允许分离这些富集了一种或多种化合物的提取物。使用合适溶剂的按照适合于所选择的分离的比例的混合物，可以对从粗提取物富集的部分或对粗提取物自身进行这些分离。

通过以下实施例进一步阐述本技术，但这些实施例不应解释为以任何方式进行限制。

实施例1.丹参、丹参和华西银腊梅叶、或丹参和委陵菜全草的醇/水提取物的制备

主要成分：丹参：唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎，由上海新亚药业高邮有限公司提供，华西银腊梅叶购于陕西太白山、委陵菜全草购于山东。提取方法主要包括以下步骤：

步骤(a)，原料选择及提取：原料可以选择以下三种的任意一种：一、丹参；二、质量比为2∶1的丹参和华西银腊梅的叶；三、质量比为1∶1的丹参和委陵菜全草；

以C1-C4的醇和水中的一种作为提取溶剂，对原料进行提取；

所述的丹参均为丹参干燥根及根茎。

该步骤可以室温下重复3-6次，通常5次。在进行步骤(a)之前，可以将植物材料切成小段，切碎或制成粉末。C1-C4醇包括甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇和叔丁醇。通常，添加的醇的重量是待提取的材料重量的1-10倍。

所述方法还可以包括以下步骤：

步骤(b)，将所述步骤(a)得到的提取液干燥成干粉；

步骤(c)，将所述步骤(b)得到的干粉先用C6烷烃提取，C6烷烃提取液去除后，剩余的部分再用乙酸乙酯进行提取，然后将乙酸乙酯提取液去除，剩余的部分最后用选自C1-C4的醇进行提取，并将不溶性沉淀物去除，得到C1-C4醇的提取物。

步骤(d)，将所述步骤(c)得到的C1-C4醇的提取物干燥成干粉，得到粉末。

步骤(e)，将所述步骤(d)得到的粉末溶解于体积百分浓度为10％的乙醇溶剂中，过滤，然后将滤液加入层析柱中；

步骤(f)，使用渐增浓度梯度的醇和水的混合溶液对所述层析柱进行洗脱，洗脱时间为60分钟，其中所述醇为C1-C4醇中的一种，所述的混合溶液中醇所占的体积为10％-100％，其中20-70％醇/水溶液洗脱部分为制备的促进心肌再生药物的提取物。

步骤(b)和步骤(d)中所述的干燥时在减压下进行的。

C6烷包括具有6个碳原子的环状和非环状烷，包括，例如，环己烷、正己烷和新己烷等。C1-C4醇包括甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇和叔丁醇。所用的有机溶剂的重量通常是待进一步提取的粉末重量的1-10倍。

在一个实施方案中，本发明的提取物、部位和化合物是利用水和/或有机溶剂从植物原材料提取得到的，包括以下过程：

1.将水/乙醇(50％乙醇水)添加到植物材料，将整体进行诸如浸泡/浸滤、超声或微波的处理而进行提取。其中提取物主要含有丹参素纳，原儿茶醛，迷迭香酸，单酚酸B，单酚酸A(图1)；

图1提供的数据显示了正丁醇提取物Sephadex LH-20柱层析的20-70％的乙醇/水丹参洗脱物的主要成分。其中主要含有丹参素纳，原儿茶醛，迷迭香酸，单酚酸B，单酚酸A。

2.任选地，在提取过程之前或之后，利用石油醚、己烷或氯仿类型的溶剂进行脱脂；

3.任选地，利用乙酸乙酯或乙醚类型的有机溶剂对回收的提取物进行进一步提取；

4.任选地，将获得的粗提取物浓缩，并根据需要将其冻干。

在一个实施方案中，丹参醇/水提液制备本发明的提取物、取丹参药材适量，加10倍量醇/水提取2次，每次2小时，将提取液过滤。丹酚酸B对照品溶液的制备精密称取丹酚酸B对照品5mg置10mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，分别灌封于2mL安瓶中。丹酚酸B含量测定按照中华人民共和国药典(国家药典委员会.中华人民共和药典：一部[M].2005版，北京：化学工业出版社，205：52)中丹参[含量测定]项下操作。

在一个实施方案中，丹参(2/3)和华西银腊梅(1/3)醇/水提液制备本发明的提取物、取适量丹参和华西银腊梅药材，加10倍量醇/水提取2次，每次2小时，将提取液过滤。

在一个实施方案中，丹参(1/2)和委陵菜(1/2)醇/水提液制备本发明的提取物、取适量丹参和委陵菜药材，加10倍量醇/水提取2次，每次2小时，将提取液过滤。

在一个实施方案中，丹参注射液由上海新亚药业高邮有限公司提供的丹香冠心注射液(10毫升国药准字Z32021087)。

在一个实施方案中，丹参多酚酸盐(冻干粉剂)来源于市购(上海绿谷制药有限公司生产的注射用丹参多酚酸盐(每瓶200毫克含160毫克丹参乙酸镁，国药准字Z20050249)。人静脉滴注。一次200毫克，用5％葡萄糖注射液250-500毫升溶解后使用，一日1次，疗程2周。

本领域技术人员能根据所需纯化的提取物的性质选择最合适的溶剂。这些不同的提取物，即粗提取物或富集的提取物，也在本发明的范围内。实施其它分离过程允许分离这些富集了一种或多种化合物的提取物。使用合适溶剂的按照适合于所选择的分离的比例的混合物，可以对从粗提取物富集的部分或对粗提取物自身进行这些分离。

实施例2.ESMs在心肌梗塞动物模型中的特异性治疗效果

心脏的某支冠状血管完全堵塞，将引起缺血性心肌梗塞，该堵塞的冠状血管支配区的心肌组织将坏死，坏死的心肌组织将由纤维瘢痕组织修复。由纤维瘢痕组织修复的梗塞心脏经历不断的左心室重构，包括几何学、结构和功能的改变。尽管不断的重构在最初是代偿性的，但最终会促使心脏的失代偿，导致心力衰竭。心力衰竭的最常见原因是心肌梗塞。因此，我们首先测试了ESMs在急性心肌梗塞动物模型中的治疗效果。

在本实施例中，我们在SD大鼠中用冠状动脉左前降支(LAD)的永久性结扎来制造左心室大面积梗塞的模型。利用该大鼠模型，我们分别研究了ESMs对心肌梗塞的治疗作用。LAD结扎后，由于结扎动脉的支配区心肌缺血，导致心肌坏死、实验大鼠的心功能显著降低。表现为左心室射学分数(EF)和左室短轴缩短率(FS)显著降低。实验大鼠的EF和FS在LAD结扎前分别为EF＝58-68％，FS＝45-55％。LAD结扎后3天，EF降至47.3±7.1％，FS降至37.9±5.8％。(P＜0.01，结扎组与假手术组相比)(图2)。图2中显示由于LAD结扎迅速降低的心功能，结扎后2-4周，心功能持续降低，但是经过2-4周的上述药物的治疗，心功能逐渐恢复。EF(A)和FS(B)逐渐升高。其中ESM2和ESM3治疗组的心脏功能表现出了比ESM1、EMS4和EMS5更显著的改善。

假手术大鼠的平均左室舒张末期容积(LVEDV)为0.385ml。相比之下，MI对照组(溶剂治疗组)的LVEDV在术后第1周、第2周、和第4周分别增至0.41±0.05、0.48±0.06、0.53±0.07ml，与假手术组的LVEDV相比显著升高(P＜0.01)，并且左室舒张末期压力在所有时间点都升高。然后将心功能下降类似的、合格的LAD结扎大鼠随机分成六组包括ESM1、ESM2、ESM3、ESM4、ESM5和对照治疗组。

将溶解于注射用水或3％乙醇(0.5ml，2g/kg/天)的丹参提取物(图1)(ESM1)、或丹参和华西银腊梅叶(0.5ml，2g/kg/天)的提取物(ESM2)、或丹参和委陵菜全草(0.5ml，2g/kg/天)的提取物(ESM3)、或将0.56ml丹香冠心注射液/kg/天、稀释4-5倍(ESM4)；或将5％葡萄糖注射液溶解28mg丹参多酚酸盐/kg/天(ESM5)；分别通过尾静脉注射，给予LAD结扎后3天的各个不同的治疗组MI大鼠，每天给药，给药4周。将各相应的等量的溶剂给予对照溶剂处理组的MI大鼠(n＝8)。对于假手术大鼠(n＝8)，进行胸廓切开术但不进行LAD结扎。我们发现，4周丹参提取物(ESM1)、丹香冠心注射液(ESM4)和丹参多酚酸盐(ESM5)的治疗，各治疗组的心脏功能都表现出了类似程度的改善。其中显著增加的LVEDV和降低的心输出量(130±15ml/分钟/kg)分别恢复至第二周的0.44±0.06ml和第4周的0.41±0.06ml，以及治疗后第二周的142±16ml/分钟/kg和第4周的151±18ml/分钟/kg。同样，显著降低的EF和FS从治疗前的47.3±7.1％和37.9±5.8％增加至2周治疗后的48.0±5.6％和39.0±4.6％，以及治疗4周后的51.1±6.0％和41.9±4.8％。相比之下，4周丹参和华西银腊梅叶(0.5ml，2g/kg/天)的提取物(ESM2)、或丹参和委陵菜全草(0.5ml，2g/kg/天)的提取物(ESM3)治疗后，两组的心脏功能表现出了比ESM1、EMS4和EMS5更显著的改善。在丹参和华西银腊梅叶提取物治疗组中，由于心肌梗塞而显著增加的LVEDV和降低的心输出量，分别恢复至第二周的0.42±0.05ml和第4周的0.39±0.05ml，以及治疗后第二周的148±15ml/分钟/kg和第4周的155±17ml/分钟/kg。同样，显著降低的EF和FS从治疗前的47.3±7.1％和37.9±5.8％增加至2周治疗后的51.3±5.5％和42.8±5.0％，以及治疗4周后的55.1±6.3％和45.1±5.2％。而在丹参和委陵菜全草提取物治疗组，LVEDV和心输出量分别恢复至第二周的0.415±0.06ml和第4周的0.40±0.06ml，以及治疗后第二周的147±14ml/分钟/kg和第4周的153±16ml/分钟/kg。EF和FS则增加至2周治疗后的49.8±5.9％和41.5±5.6％，以及治疗4周后的53.3±6.3％和43.6±5.1％。这些治疗结果比单独用丹参、或华西银腊梅叶、或委陵菜全草提取物治疗的效果要好，这就提示了丹参和华西银腊梅叶或丹参和委陵菜全草提取物治疗心肌梗塞有协同效应。

而在溶剂治疗的对照中，LVEDV增加至治疗2周后的0.48±0.06和治疗4周后的0.53±0.07ml，EF分别降低至45.8±5.2％(治疗后2周)和44.7±4.2％(治疗后4周)，以及FS降低到36.3±4.7％(治疗后2周)和34.9±4.3％(治疗后4周)(与EMSs各治疗治疗组的均值相比P＜0.05)(图2)。

在LAD结扎治疗4周后，处死动物。取出处死的大鼠的心脏，并用PBS洗涤。将所有获得的样本切片用于组织学和免疫组化分析或用于Western印迹和PCR研究。如图3所示，白色圆(A，B)是LAD结扎处；A(i)是溶剂治疗对照组的心脏，可见左心室呈现灰白色、表面凹凸不平(虚线圈出处)，心室扩大；A(ii)是心脏A(i)的延心脏短轴切开观，可见心室壁变薄苍白色的纤维瘢痕区(虚线圈出处)。对比之下，B(i)是ESM1、ESM2、ESM3、ESM4、ESM5治疗组的具有代表性的心脏外观。心室前壁可见表面凹凸不平的梗塞区(虚线圈出处)，但是该区域的面积较小，并且该区域的颜色也比较红。B(ii)是心脏(B：i)的延心脏短轴切开观，可见较小的纤维瘢痕区(虚线圈出处)。

我们观察到，与介质处理的梗塞区心室壁薄、有凹陷、苍白色的左心室前壁相比，各组ESMs治疗心脏的左室前壁梗塞区呈现斑块状红色并且梗塞区的心室壁较厚(图3)。将心脏的左心室分离，并从心尖至心底切成3个横向薄块，并包埋在石蜡中，然后进行组织切片和染色，并进行显微镜观察，测量左室的梗塞面积的大小。我们发现，溶剂治疗组中，梗塞面积较大，并且左室壁厚度显著变薄(图3)，整个梗塞区全部被苍白色的\凹凸不平的纤维瘢痕所取代(图3)。相比之下，在ESMs各治疗组中，梗塞区面积较小，左心室前壁较厚并呈现斑块状红色(图3)。更重要的是组织学分析表明，在ESMs治疗各组中，在心肌梗塞区有许多新再生的岛状、广泛分布于心肌梗塞区的心肌样组织(图4)。图4中Ctrl是溶剂治疗对照组的心肌梗塞区的显微镜下的图像，可见梗塞区的部位已经被成纤维细胞和其分泌的胶原纤维组成的纤维组织取代。C-f是在紫外光显微镜下可见梗塞区内已经被大量的黄绿色荧光外观的胶原纤维所覆盖，未见新再生的心肌样细胞。Mt是代表性的ESMs治疗的梗塞心脏，可见在梗塞区除了纤维瘢痕组织外，还可见许多新再生的、形状和外观特点和心肌细胞相符，但是体积较原有的心肌细胞小的细胞(箭头所指)，这些心肌样细胞取代了梗死的心肌组织，使心肌梗塞面积缩小。黄色虚线下部的细胞是原有的未坏死的心肌细胞，细胞的体积比新再生的心肌细胞大。Mtf是在紫外光显微镜下可见梗塞区内黄绿色荧光外观的胶原纤维所覆盖的区域显著减少，并在梗塞区内可见许多新再生的心肌样细胞，取代了梗死的心肌(白色箭头所示)。这就提示了ESMs治疗可以显著诱导在心肌梗塞区心肌细胞再生，来替换已经死掉的心肌细胞，从而达到治愈性、或病理修饰性治疗心肌梗塞。

这些新再生的心肌样组织主要分布于梗塞区的血供较好的边缘区，并取代了梗死的心肌组织，从而显著缩小了各治疗组的梗塞面积(图4)，而未治疗的对照组梗塞区主要由纤维瘢痕组织修复，很少见新再生的心肌组织(图4)(P＜0.01)。

用纤维瘢痕组织特异性的Masson三色染色显微镜观察，如图5所示，T-c是具有代表性的ESMs治疗组的心肌梗塞区的显微镜下的图像，在梗塞中心区内除了可观察到纤维瘢痕组织外(Fib)，还可见许多新再生的、形状和外观特点和心肌细胞相似，并且与心肌细胞一样红染的细胞(两条虚线之间的区域内)，这些心肌样细胞取代了梗死的心肌组织，使心肌梗塞面积缩小。T-cf是在紫外光显微镜下可见与T-c相同区域内，除了白色虚线上下两边可见黄绿色荧光外观的胶原纤维覆盖的梗塞区域外，两条白色虚线之间的区域内可见许多新再生的心肌样细胞，取代了梗死的心肌。C-ct是溶剂治疗对照组的心肌梗塞区的Masson三色染色切片，可见梗塞区内坏死的心肌组织基本完全被蓝染的纤维瘢痕组织取代，基本观察不到新再生的心肌样细胞(Fib)。T-ct是代表性的ESMs治疗的心肌梗塞区的Masson三色染色切片，可见梗塞区内坏死的心肌组织除了被蓝染的纤维瘢痕组织(Fib)取代以外，还可以观察到许多新再生的心肌样细胞岛(黄色虚线围绕的区域)。这就提示了ESMs治疗可以显著诱导在心肌梗塞区心肌细胞再生，减少梗塞面积，从而改善心脏功能，并达到治愈性、或病理修饰性治疗心肌梗塞。

这表明，ESMs治疗组的心肌梗塞的中心区内除了可观察到蓝染的纤维瘢痕组织外，还可见许多新再生的、形状和外观特点和心肌细胞相似，并且与心肌细胞一样红染的细胞岛(图5)。这些新再生的心肌样细胞取代了梗死的心肌组织，使心肌梗塞面积缩小。对比之下，溶剂治疗对照组的心肌梗塞区内可见梗死的心肌组织基本完全被蓝染的纤维瘢痕组织取代，基本观察不到新再生的心肌样细胞(图5)。这就证明了ESMs治疗可以显著诱导在心肌梗塞区心肌细胞再生，减少梗塞面积，从而改善心脏功能，并达到治愈性、或病理修饰性治疗心肌梗塞。

进一步将脱蜡的组织切片进行免疫组化染色，首先用兔抗c-kit抗体(稀释1∶100，Santa Cruz)液体覆盖切片，并在4度下培育过夜，然后切片清洗后用结合FITC的鼠抗兔IgG(稀释1∶250)覆盖切片，并在25度下培育2小时.免疫组化染色完成后，用荧光显微镜观察.结果显示，在各组ESMs治疗组动物心脏的梗塞区内，有较多的c-kit阳性的细胞，并且有些新再生的心肌样细胞也呈c-kit阳性.对心肌梗塞区的组织进行Western Blot，也证实了各治疗组有比对照未治疗组有较高的c-kit表达.这些结果提示，ESMs可能通过促进心肌组织局部的心肌干细胞(CSCs)，再生新的心肌组织，来取代梗死的心肌组织(7)。

实验结果的说明

实验结果显示，本发明的ESMs，其中分别包括丹参的干燥根及根茎、丹参和华西银腊梅叶、丹参和委陵菜全草的醇/水提取物、市售的上海新亚药业高邮有限公司生产的丹香冠心注射液、以及市售的上海绿谷制药有限公司生产的注射用丹参多酚酸盐(冻干粉剂)，可以通过促进在心肌梗塞区内新的心肌组织再生来取代梗死的心肌组织，从而达到对心肌梗塞恢复病理改变的治愈性治疗。并且实验结果显示，用ESMs治疗4周的治疗效果，要好于治疗两周的效果。

本发明的应用性

所述ESMs在心肌梗塞区促进新生心肌再生，来取代梗死心肌的独特特征使其非常适用于治疗心肌梗塞、和各种致使心肌组织损伤的心脏病。所述ESMs还可与其它治疗性药剂结合形成更好的药剂，例如将所述ESMs与促进血管生成的药物结合治疗心肌损伤性疾病会取得更好的治疗效果。因此，ESMs很有可能发展为特异性治疗心肌梗塞或其它治疗心肌损伤疾病的第一代治愈性治疗性药剂。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (9)

1.一种用于制备促进心肌再生药物的提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤(a)，原料选择及提取：原料可以选择以下三种的任意一种：一、丹参；二、质量比为2∶1的丹参和华西银腊梅的叶；三、质量比为1∶1的丹参和委陵菜全草；

以C1-C4的醇和水中的一种作为提取溶剂，对原料进行提取；

所述的丹参均为丹参干燥根及根茎。

2.根据权利要求1所述的用于制备促进心肌再生药物的提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)所述的提取在室温下进行2-3小时，并重复提取5次，所述的提取溶剂为乙醇。

3.根据权利要求1所述的用于制备促进心肌再生药物的提取物的制备方法，其特征在于，还包括以下步骤：步骤(b)，将所述步骤(a)得到的提取液干燥成干粉；

步骤(c)，将所述步骤(b)得到的干粉先用C6烷烃提取，C6烷烃提取液去除后，剩余的部分再用乙酸乙酯进行提取，然后将乙酸乙酯提取液去除，剩余的部分最后用选自C1-C4的醇进行提取，并将不溶性沉淀物去除，得到C1-C4醇的提取物。

4.根据权利要求3所述的用于制备促进心肌再生药物的提取物的制备方法，其特征在于，所述的C6烷烃为正己烷，且所述步骤(c)中所用的醇为正丁醇。

5.根据权利要求3所述的用于制备促进心肌再生药物的提取物的制备方法，其特征在于，还包括以下步骤：

步骤(d)，将所述步骤(c)得到的C1-C4醇的提取物干燥成干粉，得到粉末。

6.根据权利要求5所述的用于制备促进心肌再生药物的提取物的制备方法，其特征在于，还包括以下步骤：步骤(e)，将所述步骤(d)得到的粉末溶解于体积百分浓度为10％的乙醇溶剂中，常压过滤；上样前，用10％乙醇洗脱液平衡层析柱，10％乙醇的加入量为至少两个柱体积，直到基线变得平稳为止；然后湿法上样，将滤液加入到羟丙基葡聚糖凝胶层析柱中，滤液的加入量为柱体积的1-5％；待滤液均进入柱床后，加洗脱剂，开始洗脱；

步骤(f)，使用反相溶剂洗脱，即渐增浓度梯度的乙醇和水的混合溶液对所述层析柱进行洗脱，洗脱时间为40分钟，色谱柱为Sephadex LH-20柱；流动相A为乙醇，流动相B为10％乙醇水溶液，流速控制在1滴/秒；；通过控制流动相A与流动相B的比例，使得洗脱剂中乙醇浓度梯度的上升速率控制在30分钟内由10％达到100％，匀速上升，此后维持100％乙醇浓度，冲洗柱子10分钟；其中20-70％醇/水溶液洗脱部分为制备的促进心肌再生药物的提取物。

7.根据权利要求6所述的用于制备促进心肌再生药物的提取物的制备方法，其特征在于，所述的层析柱为Sephadex LH-20柱，柱子尺寸为25mm×400mm。

8.根据权利要求6所述的用于制备促进心肌再生药物的提取物的制备方法，其特征在于，步骤(b)和步骤(d)中所述的干燥时在减压下进行的。

9.基于权利要求1-8任意一项所述的用于制备促进心肌再生药物的提取物的制备方法制备得到的提取物作为用于制备促进心肌再生来取代梗死的心肌的药物的应用。