CN115025137A - 一种外用促进创面愈合的中药提取物及其提取方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明针对现有治疗创面中药疗效受限以及剂量偏大的问题，提供了一种外用中药马勃孢子粉提取物促进创面愈合的技术方案，一方面大幅度减少了传统的马勃子实体或孢子粉的给药剂量，另一方面由于马勃孢子粉提取物具有促进成纤维细胞增殖、迁移、分泌胶原蛋白、抑制细胞炎症，促进胶原纤维新生、推动肉芽组织形成等多重疗效机制而显著提升了创面治疗效果。马勃孢子粉提取物制备方法简便，疗效显著，适用范围广泛，为创面治疗领域提供了新的外用中药原料。

Description

一种外用促进创面愈合的中药提取物及其提取方法和应用

技术领域

本发明涉及中医药领域，具体涉及一种外用中药马勃孢子粉提取物的制备及其在促进创面愈合中的应用。

背景技术

一般情况下，创面愈合会经过凝血、炎症反应、细胞增殖和组织重塑4个有序并且相互交叉影响的连续动态生理过程。增殖期依靠修复细胞的增殖迁移完成再上皮化、肉芽组织生成和新生组织血管化，重建皮肤屏障，是创面愈合的关键时期。增殖期的发生受阻与慢性创面的形成息息相关，病理机制包括皮肤修复细胞发生增殖和迁移障碍及过度凋亡、细胞外基质产生量过少或被过度破坏。成纤维细胞是创面愈合增殖期的主体修复细胞，发挥分泌胶原蛋白、构建细胞外基质、促进肉芽组织形成等作用。报道显示，对于创面尤其是慢性创面而言，愈合延迟甚至不愈主要与成纤维细胞的功能异常相关。当成纤维细胞的增殖能力下降、迁移功能异常则会引发胶原蛋白、纤维蛋白、玻连蛋白构成的细胞外基质形成不足，最终表现为缺乏上皮再生，创面无法进入增殖期，伤口难以愈合。所以，能够恢复成纤维细胞的正常功能，促进成纤维细胞增殖、迁移、分泌胶原蛋白是恢复增殖期功能、促进创面愈合、降低慢性创面患者截肢率和死亡率的重中之重。

目前临床主要治疗手段包括手术植皮和皮瓣移植、应用生物制剂、细胞疗法等，但存在治疗周期长、成本高昂、受医疗条件限制、生物制品易降解失活等问题。临床研究表明，中药外用能够直接作用于创面发挥“扶正黜邪”的功效，具有简、便、廉、验的优势，但目前临床应用以中药复方为主，例如生肌玉红膏、复方白玉散、解毒生肌膏等，但是普遍存在用药剂量大、成分复杂、质量难以控制的问题，复方多为膏剂，容易滋生细菌，高温制备过程中容易造成有效成分损失。因此创面治疗亟需制备工艺简单、用药剂量较小、安全有效的外用中药。

马勃是2020年版《中华人民共和国药典(一部)》收载的为数不多可直接外用治疗创面的中药，具有历史悠久、临床治愈率高、用药操作简单等优势。古代医家认为马勃外用敷疮促愈安全有效。秦汉时期《名医别录》记载(马勃)“味辛，平，无毒，主治恶疮马疥”，南北朝时期著名中医药学家陶弘景认为(马勃)“敷诸疮甚良”，清代《本草从新》则充分肯定马勃创面促愈安全有效“每见用寒凉药敷疮者，虽愈而热毒内攻，变生他病，为害不小，惟马勃辛平而散，甚为稳妥。”马勃具有止血、抗氧化、抑菌、降血糖、促进细胞增殖等药理作用，能够调控创面微环境，促进增殖期进程，促进慢性创面愈合。

然而，马勃的传统用法为采用干燥子实体外敷创面，子实体粉末呈棉絮状，虽然有利于止血，但给药后难以有效附着在创面处，给治疗带来了诸多不便，研究表明，对于创面治疗，可以采用孢子粉给药。但采用马勃孢子粉给药虽然有效但疗效有限且剂量偏大，能否通过提取工艺研究显著降低马勃孢子粉外用的有效剂量并提升疗效，是决定马勃作为创面治疗药物开发前景的关键问题。

发明内容

本发明目的是针对现有高效治疗创面药物缺乏且现有药物剂量偏大、疗效不强的问题，提供了一种外用中药马勃孢子粉提取物在促进创面愈合的应用，具体为应用马勃孢子粉提取物外用治疗创面显著提升疗效和安全性并降低有效剂量。将富含多酚和黄酮类成分的马勃孢子粉提取物应用于慢性创面愈合增殖期修复细胞，促进成纤维细胞的增殖、迁移、分泌胶原蛋白和抑制炎症的功能水平；将马勃孢子粉提取物应用于糖尿病小鼠背部创面，促进胶原纤维新生、推动肉芽组织形成而加快创面愈合，研究马勃孢子粉提取物在制备促进创面愈合药物中的应用。一种促进创面愈合的外用中药提取物及其制备方法与应用是采取以下技术方案实现：

一种外用促进创面愈合的中药提取物，其为马勃孢子粉醇提物；所述马勃孢子粉优选大马勃Calvatiagigantea(Batsch ex Pers.)Lloyd的孢子粉；所述醇提物优选采用65％～100％乙醇作为提取溶剂提取所得的提取物及其混合物。

作为进一步的改进，所述醇提物采用95％乙醇作为提取溶剂提取所得。

作为更进一步的改进，所述马勃孢子粉的提取方法为超声提取法。

更进一步，马勃孢子粉醇提物按照如下方法制备而成：取马勃饮片，除去外壳，粉碎，将粉末过五、六号筛，除去棉絮状部分，即为马勃孢子粉，加入15倍量提取溶剂，搅拌均匀，室温浸渍24小时，期间不断搅拌摇匀，45千赫兹、30℃超声提取2小时，抽滤，以4500转 /分钟离心10分钟，取上清，获得马勃孢子粉醇提液，置于4℃避光储存。取上述马勃孢子粉醇提液，50℃旋转蒸发浓缩，将浓缩液置于棕色西林瓶中，真空干燥，即得马勃孢子粉醇提物，置于-20℃冰箱保存。

本发明同时提供上述中药提取物在制备用于促进创面愈合的药物或外用制剂的应用，所述药物或外用制剂包括凝胶剂、乳膏剂、油膏；所述创面包括静脉性溃疡、缺血性溃疡、压力性溃疡、代谢性溃疡、感染性溃疡、恶性溃疡、创伤性溃疡，优选缺血性溃疡和压力性溃疡，其中缺血性溃疡优选糖尿病溃疡。

有益效果

研究表明，马勃孢子粉65-100％乙醇提取物中有效成分黄酮和多酚含量显著高于水提物、石油醚提取物和35％乙醇提取物，并且以95％乙醇提取物的含量为最高。细胞实验研究发现，马勃孢子粉65-100％乙醇提取物对成纤维细胞(MSF)具有显著的促增殖作用，而水提物和石油醚提取物则呈现出一定的细胞毒性，35％乙醇提取物则没有促增殖作用，上述作用以95％乙醇提取物作用最为显著。细胞实验研究表明，马勃孢子粉95％乙醇提取物通过促进成纤维细胞增殖、迁移、改善细胞周期、分泌胶原蛋白和抑制炎症而发挥创面愈合作用，其作用显著优于马勃子实体95％乙醇提取物和阳性对照药物。在体动物实验研究发现，马勃孢子粉65％-100％乙醇提取物具有显著的创面促愈效果，并且显著优于马勃孢子粉、子实体以及马勃孢子粉水提物、石油醚提取物和35％乙醇提取物，同时能够显著降低有效剂量。此外，马勃孢子粉95％乙醇提取物还有显著的治疗糖尿病创面的效果。因此，本发明提供的马勃孢子粉提取物可制备成一种治疗创面的外用药物及制剂，在创面治疗领域可提供新的外用中药原料。

附图说明

以下将结合附图对本发明作进一步说明：

图1马勃子实体和孢子粉不同溶剂提取物对MSF的划痕愈合影响(注：A.空白组；B.马勃孢子粉95％乙醇提取物组；C.马勃子实体95％乙醇提取物组；D.血竭素高氯酸盐组)

图2马勃子实体和孢子粉不同溶剂提取物对MSF的细胞周期的影响(注：A.空白组；B.马勃孢子粉95％乙醇提取物组；C.马勃子实体95％乙醇提取物组；D.血竭素高氯酸盐组)

图3马勃孢子粉和子实体95％乙醇提取物对LPS诱导的炎症型MSF的抗炎作用比较(注：与造模组比较，^**P<0.01，^***P<0.001，^****P<0.0001，

n＝6)

图4马勃孢子粉、子实体及孢子粉不同溶剂提取物对BALB/c小鼠背部全层皮肤缺损性创面 day14的创面愈合率(注：与空白组比较，^*P<0.05，^***P<0.001，

n＝4)

图5马勃孢子粉95％乙醇提取物对db/db糖尿病小鼠背部全层皮肤缺损性创面的治疗作用，图中A为空白组，B为马勃孢子粉95％乙醇提取物组

图6马勃孢子粉95％乙醇提取物对db/db糖尿病小鼠背部全层皮肤缺损性创面治愈率比较(注：与马勃孢子粉95％乙醇提取物组比较，^**P<0.01，^*P<0.05，

n＝6)

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术解决方案，不是对本技术方案的限制。本发明中的生物材料来源如下：马勃购于安徽省万生中药饮片有限公司(批号：190801)，经南京中医药大学药学院中药鉴定学教研室刘圣金教授鉴定为灰包科真菌大马勃Calvatiagigantea (Batsch ex Pers.)Lloyd的干燥子实体。

实施例1一种促进慢性创面愈合的中药提取物的制备

取适量马勃饮片，除去外壳，粉碎，即得马勃子实体粉末。将粉末过五、六号筛，除去棉絮状部分，对细粉要求为100％过五号筛，95％过六号筛粉末，即得马勃孢子粉。

称取马勃孢子粉适量，精密称定，加入15倍量溶剂(100％乙醇、95％乙醇、65％乙醇、 35％乙醇、水或石油醚)，搅拌均匀，室温浸渍24h(期间不断搅拌摇匀)，以45kHz、30℃超声提取2h，抽滤，以4500r·min^-1离心10min，取上清，获得马勃子孢子粉的提取液，避光密封，置于4℃冰箱储存。

将提取液旋转蒸发浓缩(50℃)，浓缩液置于棕色西林瓶中，真空干燥，即得马勃孢子粉提取物，置于-20℃冰箱保存。

实施例2采用紫外-可见分光光度法对实施例1制得的马勃孢子粉100％乙醇提取物、95％乙醇提取物、65％乙醇提取物、35％乙醇提取物、水提物和石油醚提取物进行提取率得率，及总多酚、总黄酮含量测定

(1)提取率测定

精密量取马勃孢子粉的不同提取物，分别置于已干燥至恒重的称量瓶中，于105℃干燥3 h，置于干燥器中冷却30min，重复干燥至恒重，精密称定，按照烘干后提取物固体质量与生药质量的比值计算样品提取率。

(2)总多酚含量测定

采用Folin-Ciocalteu比色法，建立没食子酸对照品的标准曲线，考察精密度、稳定性、重复性和加样回收率，由于酚类易溶于乙醇，所以以马勃子实体和孢子粉95％乙醇提取物作为供试品溶液，采用紫外-可见分光光度法测定总多酚含量，以没食子酸当量计。

(3)总黄酮含量测定

NaNO₂-Al(NO₃)₃-NaOH比色法和AlCl3比色法是测定总黄酮的常用方法，但是前者不能排除非黄酮物质的干扰，专属性较差，所以选择AlCl₃比色法测定。建立芦丁对照品的标准曲线，考察精密度、稳定性、重复性和加样回收率，由于黄酮难溶于水，所以以马勃子实体和孢子粉的95％乙醇提取物作为供试品溶液，采用紫外-可见分光光度法测定总黄酮含量，以芦丁当量计。

提取率实验结果表明，马勃孢子粉100％乙醇提取物、95％乙醇提取物、65％乙醇提取物、 35％乙醇提取物、水提物和石油醚提取物的提取率分别为2.47±0.20％、2.86±0.24％、3.05±0.15％、 4.79±0.13％和0.32±0.06％(n＝3)。可见，石油醚提取物提取率过低，而其他提取溶剂的提取率能够满足需要。

多酚和黄酮的含量测定结果如表1所示，可见，95％乙醇提取物中多酚和黄酮含量显著高于其他提取物，并且35％乙醇提取物、水提物和石油醚提取物中有效成分多酚和黄酮含量显著低于65-100％乙醇提取物(P<0.01)。

表1不同马勃孢子粉提取物中多酚、黄酮成分含量(

n＝6)

实施例3马勃孢子粉提取物对小鼠皮肤成纤维细胞(MSF细胞)增殖率的影响

MSF细胞培养于DMEM高糖培养液中(含青霉素100U/mL，链霉素100μg/mL，15％胎牛血清)，置于37℃，5％CO₂的恒温培养箱中培养，每3d传代1次，取对数期细胞进行实验。细胞分为空白对照组、药物组和阳性对照组。药物组为马勃孢子粉提取物(100％乙醇提取物、95％乙醇提取物、65％乙醇提取物、35％乙醇提取物、水提物和石油醚提取物)，分别以少量DMEM高糖培养液、DMSO稀释成一定浓度母液，临用前以无血清培养基稀释成50μg/mL。每个浓度均设置5个复孔。

取对数生长期的MSF以1×10⁵个/mL的密度接种至96孔板中，每孔100μL，置于37℃， 5％CO₂的恒温培养箱中培养24h(细胞生长率80％～90％)，换成含有不同药物的无血清培养基处理24h，弃去旧培养基，PBS清洗2次，加入无血清培养基100μL，再加入CCK-8试剂10μL，于恒温培养箱中孵育2h，置于低速振摇床上震荡5min，于450nm处检测各孔吸光度 A，计算细胞增殖率，计算公式如下：细胞增殖率＝(A_药物组-A_调零组)/(A_空白组-A_调零组)×100％

通过CCK-8法比较实施例1制得的50μg/mL马勃孢子粉不同提取物(100％乙醇提取物、 95％乙醇提取物、65％乙醇提取物、35％乙醇提取物、水提物和石油醚提取物)对于小鼠皮肤成纤维细胞MSF细胞增殖率的影响，结果发现水提物和石油醚提取物有明显的细胞毒性，细胞增殖率仅为77.26±1.99％和69.34±1.78％(n＝5)，显著低于空白对照(P<0.01)。而100％乙醇提取物、95％乙醇提取物、65％乙醇提取物则表现出显著的促进细胞增殖作用，细胞增殖率分别达到138.26±3.69％、155.44±2.75％和126.81±3.03％(n＝5)，显著高于空白对照(P<0.01)，而35％醇提物组则对细胞增殖影响不大，细胞增殖率仅为105±4.11％(n＝5)，与空白组相比没有显著性差异。

总之，小鼠皮肤成纤维细胞(MSF细胞)增殖率结果表明，95％乙醇提取物具有最高的细胞增殖率，与其他各组提取物都存在显著性差异，65-100％乙醇提取物具有显著的促进细胞增殖作用，35％乙醇提取物对细胞作用不大，而水提物和石油醚提取物具有明显的细胞毒性，能够抑制细胞增殖。

实施例4马勃孢子粉和子实体95％乙醇提取物的制备

取适量马勃饮片，除去外壳，粉碎，即得马勃子实体粉末。将粉末过五、六号筛，除去棉絮状部分，对细粉要求为100％过五号筛，95％过六号筛粉末，即得马勃孢子粉。

称取马勃子实体或孢子粉适量，精密称定，加入15倍量95％乙醇，搅拌均匀，室温浸渍 24h(期间不断搅拌摇匀)，以45kHz、30℃超声提取2h，抽滤，以4500r·min^-1离心10min，取上清，获得马勃子子实体或孢子粉的提取液，避光密封，置于4℃冰箱储存。

将提取液旋转蒸发浓缩(50℃)，浓缩液置于棕色西林瓶中，真空干燥，即得马勃子实体或孢子粉提取物冻干粉，置于-20℃冰箱保存。

按实施例2方法测定了提取率和多酚、黄酮含量。结果表明马勃子实体和孢子粉提取率分别为2.46±0.08％和2.86±0.24％(n＝3)，而有效成分多酚和黄酮含量如表2所示，孢子粉醇提物组显著高于子实体。

表2 95％乙醇提取物中多酚、黄酮成分含量(

n＝6)

注：与子实体组相比，^**P<0.01

实施例5划痕损伤实验考察马勃子孢子粉和子实体95％乙醇提取物对MSF细胞迁移的影响采用实施例4制得的马勃孢子粉和子实体95％乙醇提取物比较对MSF细胞迁移的影响。

采用划痕损伤实验。种板前用马克笔在12孔板背面划等间距横线标记，取对数生长期的 MSF以5×10⁵个/mL的密度接种至12孔板中，每孔1mL，置于37℃，5％CO₂的恒温培养箱中培养至细胞完全融合。用200μL微量移液头垂直孔板制造细胞划痕，PBS清洗2次，以含有不同药物的培养基处理一段时间，分别于0，12，24，48h在显微镜下观察拍照，采用ImageJ1.53软件分析划痕面积，计算细胞迁移率，计算公式如下：

细胞迁移率(％)＝迁移面积/0h划痕面积×100％

实验结果见附图1和表3，结果表明，随着时间增长，各组的细胞迁移率不断增加，其中马勃孢子粉95％乙醇提取物的迁移效果最佳，在48h达到(47.91±8.69)％，与子实体95％乙醇提取物(34.08±5.44)％相比具有显著性差异(P<0.05)。推测，马勃95％乙醇提取物通过促进成纤维细胞迁移而加快创面上皮化进程，促进创面愈合，孢子粉效果优于子实体。

表3马勃子实体和孢子粉95％乙醇提取物对MSF的迁移作用比较(

n＝5～6)

注：与马勃孢子粉95％乙醇提取物组比较，^*P<0.05

实施例6马勃子实体和孢子粉95％乙醇提取物对MSF细胞周期的影响

采用实施例4制得的马勃孢子粉和子实体95％乙醇提取物比较对MSF细胞周期的影响。

取对数生长期的MSF以5×10⁵个/mL的密度接种至6孔板中，每孔2mL，置于37℃，5％CO₂的恒温培养箱中培养过夜(细胞生长率为80％～90％)。采用含有不同药物的培养基孵育24h，吸出旧培养液至离心管中备用，PBS清洗贴壁细胞，以不含EDTA的胰酶消化液消化细胞，显微镜下观察至细胞皱缩，吹打混匀成单细胞并转移至离心管中，离心(转速为1 500r·min^-1，时长5min，离心半径为16cm)，弃上清，以预冷的70％乙醇固定细胞，吹打均匀，置于4℃冰箱固定12h。PBS清洗乙醇，离心(转速为1 500r·min^-1，时长5min，离心半径为16cm)，弃上清，加入适量DNA染色液，37℃避光孵育30min，采用流式细胞仪测定细胞周期，计算细胞增殖指数。以G₀/G₁期细胞作为静止细胞，S期和G2/M期细胞作为增殖期细胞，计算公式如下：

细胞增殖指数＝(S期细胞比例+G₂/M期细胞比例)/(G₀/G₁期细胞比例+S期细胞比例+G₂/M

期细胞比例)×100％

实验结果见附图2、表4，孢子粉95％乙醇提取物处理MSF后能减少G₀/G₁期占比，与空白组和子实体95％乙醇提取物组相比差异极显著(P<0.01)，同时孢子粉95％乙醇提取物组能增大S期和G₂/M期占比，其中对S期的影响与空白组和子实体95％乙醇提取物组相比具有显著性差异(P<0.05，P<0.01)，对G₂/M期的影响显著高于空白组(P<0.05)。孢子粉95％乙醇提取物的增殖指数最高(48.05±5.26)％，与空白组(6.73±0.66)％和子实体95％乙醇提取物 (26.90±1.75)％相比具有显著性差异(P<0.01)。细胞周期结果与细胞增殖结果一致，推测马勃孢子粉95％乙醇提取物通过改变细胞周期，促进G₀/G₁期的静止细胞进入S期和G₂/M期的增殖状态，实现对细胞周期的推动和转化，促进MSF增殖，加快创面愈合，并且孢子粉95％乙醇提取物效果显著优于子实体95％乙醇提取物。

表4马勃子实体和孢子粉95％乙醇提取物对MSF的细胞周期的作用(

n＝3)

注：与马勃孢子粉95％乙醇提取物组比较，^*P<0.05，^**P<0.01

实施例7马勃子实体和孢子粉95％乙醇提取物对MSF细胞生成胶原蛋白的影响

采用实施例4制得的马勃孢子粉和子实体95％乙醇提取物比较对MSF细胞生成胶原蛋白的影响。

取上述实施例6项下药物处理细胞24h的“旧培养液”，20 000r/min离心20min，取上清液，按照ELISA试剂盒说明书操作，通过酶标仪检测CollagenⅠ和CollagenⅢ含量。

实验结果见表5，马勃孢子粉和子实体95％乙醇提取物都能增高CollagenⅠ、CollagenⅢ的分泌，CollagenⅢ的生成量高于CollagenⅠ，其中孢子粉95％乙醇提取物组的胶原生成量都显著高于空白组(P<0.05)，马勃孢子粉95％乙醇提取物组的CollagenⅠ和CollagenⅢ均高于马勃子实体95％乙醇提取物组，但是无显著性差异。

CollagenⅠ、CollagenⅢ是正常皮肤组织中最主要的胶原成分，通过促进血小板聚集发挥止血功效，CollagenⅢ可以协助成纤维细胞、角质形成细胞、内皮细胞的迁移定植，调控Collagen Ⅰ的生成及纤维直径。当CollagenⅢ生成较高时，不仅能够促进全层皮肤创面愈合，而且能改善创面愈合质量，使新生组织弹性和柔韧性增高，避免瘢痕形成。推测，马勃95％乙醇提取物通过促进CollagenⅠ、CollagenⅢ的生成加快形成细胞外基质，调控新生组织弹性及柔韧性，提高创面愈合质量，促进创面愈合，孢子粉效果优于子实体。

表5马勃孢子粉和子实体95％乙醇提取物对MSF细胞分泌胶原蛋白的影响

注：与孢子粉95％乙醇提取物组相比，^*P<0.05

实施例8马勃子实体和孢子粉95％乙醇提取物对MSF细胞抑制炎症的影响

采用实施例4制得的马勃孢子粉和子实体95％乙醇提取物比较对MSF细胞抑制炎症的影响。

将细胞分为空白组、造模组、药物组和阳性药组(盐酸小檗碱)。空白组用无血清培养基，造模组用LPS溶液，LPS以无血清培养基稀释成10μg/mL。药物组为马勃子实体和孢子粉95％乙醇提取物，95％乙醇提取物和盐酸小檗碱以少量DMSO稀释成一定浓度母液(空白组、造模组、阳性药组中DMSO浓度平行)，临用前均以无血清培养基稀释成20μg/mL。LPS以无血清培养基稀释成20μg/mL。给药时，不同药物20μg/mL与LPS溶液20μg/mL等体积混合，使不同药物与LPS浓度均为10μg/mL。

取对数生长期的MSF以2×10⁵个/mL的密度接种至12孔板中，每孔1mL，置于37℃，5％CO₂的恒温培养箱中培养24h(细胞生长率80％～90％)，换成含有不同药物和LPS的无血清培养基处理24h，吸取上清液，离心(转速为20 000r·min^-1，时长20min，离心半径为16cm)，取上清液，按照ELISA试剂盒说明书操作，通过酶标仪检测IL-1β和IL-6含量。

实验结果见附图3，LPS溶液10μg/mL造模成功，成功诱导促炎表型成纤维细胞，造模组的IL-1β和IL-6生成量均高于空白组，具有显著性差异(P<0.01，P<0.001)。马勃孢子粉95％乙醇提取物处理的促炎表型成纤维细胞能够显著抑制炎症细胞因子IL-1β和IL-6的生成量，与造模组相比具有显著性差异(P<0.01，P<0.001)，证明了马勃孢子粉95％乙醇提取物具有抑制过度炎症反应的功效，是有效的抗炎药物，有利于调节创面炎症，加快创面愈合。

实施例9马勃子实体、孢子粉和孢子粉不同浓度乙醇提取物对BALB/c小鼠背部全层皮肤缺损性创面治疗作用

按照实施例1制备马勃子实体、孢子粉和孢子粉不同浓度乙醇提取物。

所有小鼠适应性喂养1周后，使用吸入式麻醉法，以气体麻醉剂异氟烷麻醉，麻醉成功后用小动物电推剪脱去小鼠背部毛发，并用生理盐水擦拭干净，于小鼠背部脊椎两侧脱毛处标记四个相同的方形区域(每个大小约为1cm×1cm)，沿标记剪去皮肤及皮下组织深至筋膜层，四个切除部分由完整的皮肤分开。为减少小鼠背部皮肤收缩愈合的干扰，将创面四个方向的皮肤与肌肉缝合固定。采用随机分组法对小鼠背部四个创面进行分组，分别为空白组、马勃孢子粉组、马勃子实体组、马勃孢子粉水提物组、马勃孢子粉石油醚提取物组、马勃孢子粉35％乙醇提取物组、马勃孢子粉65％乙醇提取物组、马勃孢子粉95％乙醇提取物组和马勃孢子粉 100％乙醇提取物组。空白组给予无菌生理盐水；马勃孢子粉组和马勃子实体组分别取制备的孢子粉和子实体，精密称量，每次给药剂量为50mg孢子粉/cm²，粉末能完全覆盖创面；马勃孢子粉水提物组、马勃孢子粉石油醚提取物组、马勃孢子粉35％乙醇提取物组、马勃孢子粉 65％乙醇提取物组、马勃孢子粉95％乙醇提取物组和马勃孢子粉100％乙醇提取物组分别给予浓度为100μg/mL的马勃孢子粉不同溶剂提取物100μL/cm²，其中马勃孢子粉95％乙醇提取物组剂量相当于给药剂量为0.35mg孢子粉/cm²。造模后小鼠单笼饲养，分别在第0，3，7，14d 于各组创面给予相应等量药物，使药物完全覆盖创面，给药后以纱布、IV3000透明敷料、弹性绷带和缝线固定，以上操作均在无菌操作台内完成。分别于不同时间点观察并拍摄各组创面，采用Image J 1.53软件测量创面面积，计算创面愈合率，计算公式如下：

创面愈合率(％)＝(治疗前创面面积-治疗后创面面积)/治疗前创面面积×100％

实验结果见附图4，给药后第14天，马勃孢子粉95％乙醇提取物组创面愈合速率最快，与空白相比具有显著性差异，马勃孢子粉组、孢子粉水提物组、孢子粉石油醚组、孢子粉35％乙醇提取物促进创面愈合效果显著低于孢子粉95％乙醇提取物组，而马勃孢子粉65％乙醇提取物组和100％乙醇提取物组则略低于马勃孢子粉95％乙醇提取物组。必须指出的，95％马勃孢子粉乙醇提取物组的愈合率显著高于孢子粉和孢子粉水提物组(P<0.05)。

考虑到马勃孢子粉95％乙醇提取物治疗创面的有效剂量仅为孢子粉的0.7％，且马勃孢子粉95％乙醇提取物促进创面愈合速率更高，综合药材用量和创面愈合结果，证明马勃孢子粉 95％乙醇提取物的促愈疗效优于马勃孢子粉，有效剂量减低140倍以上。

实施例10马勃孢子粉95％乙醇提取物对db/db糖尿病小鼠背部全层皮肤缺损性创面治疗作用

所有小鼠适应性喂养1周后，使用吸入式麻醉法，用异氟烷麻醉，麻醉成功后用小动物电推剪脱去小鼠背部毛发，并用生理盐水擦拭干净，于小鼠背部脊椎脱毛处标记单个方形区域(大小约1cm×1cm)，沿标记剪去皮肤及皮下组织深至筋膜层。采用随机分组法对小鼠背部创面进行分组，分别为空白组和马勃孢子粉95％乙醇提取物组。空白组给予无菌生理盐水100μL，马勃孢子粉95％乙醇提取物组给予马勃孢子粉95％乙醇提取物冻干粉配制的溶液，95％乙醇提取物冻干粉用少量DMSO使溶解(空白组中DMSO浓度平行)，用无菌生理盐水配成质量浓度为100mg·L^-1的溶液100μL/cm²，反算至生药给药剂量为0.35mg孢子粉/cm²。造模后小鼠单笼饲养，分别在第0、3、7、14d于各组创面给予等量相应药物，给药后用纱布、IV3000 透明敷料、弹性绷带和缝线固定，以上操作均在无菌操作台内完成。用药后第3，7，14，21 天采用简单随机抽样法采集小鼠背部创面肉芽组织标本，每组各取6份，小鼠吸入式麻醉后在无菌条件下沿创面边缘约1mm切下完整的创面组织，将组织用10％福尔马林固定24h，用于石蜡包埋后切片，小鼠取材后采用颈椎脱臼法处死。观察员分别于第0，3，7，14，21天观察拍摄各组创面，采用Image J 1.53软件测量创面面积，计算创面愈合率。

实验结果见附图5、6，造模后第3天糖尿病创面还处于过度炎症阶段，导致空白组创面愈合率为负值，而马勃孢子粉95％乙醇提取物组能够显著促进该时间点创面缩小，与LPS诱导的炎症创面模型结果一致，再一次证明马勃孢子粉95％乙醇提取物有显著的抑制过度炎症的作用。造模后第7天，马勃孢子粉95％乙醇提取物组可见创面周围新生表皮组织，肉芽组织从缺损的创面边缘及底部长出，向创面中央及表面伸展迁移。造模后第14天，部分马勃孢子粉 95％乙醇提取物组创面完全愈合，创面处新生长出的完整皮肤组织颜色与正常皮肤一致，而空白组虽然在该时间点创面缩小明显，但是仍有少量渗出，愈合效果较差。db/db糖尿病小鼠皮肤创面研究证明了马勃孢子粉95％乙醇提取物具有治疗糖尿病溃疡的功效，尤其在抑制过度炎症、促进创面肉芽组织新生等方面具有优势。

实施例11马勃孢子粉乙醇提取物凝胶的制备

取3g卡波姆940撒于40g蒸馏水上，室温放置过夜，充分溶胀，再加入4g三乙醇胺，搅匀，备用。另取马勃孢子粉95％乙醇提取物1g，加入20mL无水乙醇，混匀，备用。将后者缓慢加入前者中，边加边搅拌，再加蒸馏水至100g，搅匀，分装，即得。

实施例12马勃孢子粉乙醇提取物凝胶的制备

取3g卡波姆940撒于40g蒸馏水上，室温放置过夜，充分溶胀，再加入4g三乙醇胺，搅匀，备用。另取马勃孢子粉65％乙醇提取物1g，加入20mL无水乙醇，混匀，备用。将后者缓慢加入前者中，边加边搅拌，再加蒸馏水至100g，搅匀，分装，即得。

实施例13马勃孢子粉乙醇提取物凝胶的制备

取3g卡波姆940撒于40g蒸馏水上，室温放置过夜，充分溶胀，再加入4g三乙醇胺，搅匀，备用。另取马勃孢子粉100％乙醇提取物1g，加入20mL无水乙醇，混匀，备用。将后者缓慢加入前者中，边加边搅拌，再加蒸馏水至100g，搅匀，分装，即得。

实施例14马勃孢子粉乙醇提取物油膏的制备

取十八醇70g，凡士林30g，硬脂酸20g，羊毛脂4g，液状石蜡5g，加热至80℃搅匀，立即加入马勃孢子粉95％乙醇提取物1.3g，边加边搅拌放冷至室温，即得。

实施例15马勃孢子粉乙醇提取物乳膏的制备

取凡士林24g，羊毛脂3g，十八醇15g，单硬脂酸甘油酯2g，加热至70℃搅匀，制成油相；另取十二烷基硫酸钠2g，甘油15g，尼泊金乙酯0.4g，纯化水150g，加热至70℃搅匀，制成水相。将水相加入油相中搅拌均匀，边搅拌边放冷至室温，即得O/W型乳膏剂基质，取马勃孢子粉95％乙醇提取物2.1g，混匀，然后加入上述基质中搅匀，即得。

Claims (10)

1.一种外用促进创面愈合的中药提取物，其特征在于：为马勃孢子粉醇提物。

2.如权利要求1所述的中药提取物，其特征在于：所述马勃孢子粉为大马勃Calvatiagigantea（Batsch ex Pers.）Lloyd的孢子粉。

3.如权利要求1所述的中药提取物，其特征在于：所述马勃孢子粉为大马勃Calvatiagigantea（Batsch ex Pers.）Lloyd的孢子粉；所述醇提物为采用65%~100%乙醇作为提取溶剂提取所得的提取物及其混合物。

4.如权利要求3所述的中药提取物，其特征在于：所述醇提物采用95%乙醇作为提取溶剂提取所得。

5.权利要求1~4任一项所述的中药提取物，其特征在于：所述马勃孢子粉的提取方法为超声提取法。

6.如权利要求5所述的中药提取物，其特征在于按照如下方法制备而成：取马勃饮片，除去外壳，粉碎，将粉末过五、六号筛，除去棉絮状部分，即为马勃孢子粉，加入15倍量提取溶剂，搅拌均匀，室温浸渍24 小时，期间不断搅拌摇匀，45 千赫兹、30 ℃超声提取2小时，抽滤，以4500 转/分钟离心10 分钟，取上清，获得马勃孢子粉醇提液，置于4 ℃避光储存，取上述马勃孢子粉醇提液，50 ℃旋转蒸发浓缩，将浓缩液置于棕色西林瓶中，真空干燥，即得马勃孢子粉醇提物，置于-20 ℃冰箱保存。

7.权利要求1~6中任一项所述的中药提取物在制备用于促进创面愈合的药物或外用制剂的应用，所述药物或外用制剂包括凝胶剂、乳膏剂、油膏。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述创面包括静脉性溃疡、缺血性溃疡、压力性溃疡、代谢性溃疡、感染性溃疡、恶性溃疡、创伤性溃疡。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述创面指缺血性溃疡和压力性溃疡。

10.如权利要求8或9所述的应用，其特征在于：所述缺血性溃疡为糖尿病溃疡。

Images