CN107551095B

CN107551095B - 一种利用干细胞提取物和中药提取物混合制备的银屑病皮肤修复剂

Info

Publication number: CN107551095B
Application number: CN201710812387.4A
Authority: CN
Inventors: 童强; 汪佳祺
Original assignee: Shanghai Arachna Biological Technology Co ltd
Current assignee: Shanghai Arachna Biological Technology Co ltd
Priority date: 2017-09-11
Filing date: 2017-09-11
Publication date: 2020-12-25
Anticipated expiration: 2037-09-11
Also published as: CN107551095A

Abstract

本发明涉及一种使用干细胞提取物和中药提取物制备的银屑病皮肤修复剂，并使用该制剂对银屑病进行创伤性修复的方法，包括(1)用脐带间充质干细胞进行培养，并利用超滤等技术进行制备提取物；(2)将无菌的提取物与特殊的中药提取物进行混合封装；(3)将该制剂以喷涂、浅表注射等方法作用于银屑病发病部位，通过促皮肤组织新生和杀伤成纤维细胞对银屑病进行治疗。本方法安全、高效、副作用小，而且生产简单、成本低廉。

Description

一种利用干细胞提取物和中药提取物混合制备的银屑病皮肤修复剂

技术领域

本发明涉及医疗药物技术领域，具体地说，是一种利用干细胞提取物和中药提取物混合制备的银屑病皮肤修复剂。

背景技术

银屑病是一种常见的、易反复发作的慢性皮肤病。在我国，银屑病的发病率约0.5％，是目前最为常见的皮肤病之一。银屑病对患者具有极大的危害，因为银屑病会造成皮肤的反复破损，极难治愈，并且往往会伴有大量炎症症状，严重时甚至会造成类风湿关节炎等关节损伤。但是目前，对于银屑病的治疗尚无万全的治疗方法，因为银屑病的发病机制较为复杂，单一的治疗方法很难照顾到所有治疗方法。

银屑病本质上是一种与免疫相关的皮肤反复破损，因此从源头上说，只要调节好破溃部位的局部免疫环境，同时对皮肤破损进行修复，就有可能治疗甚至治愈银屑病。干细胞是一类具有自我复制的多潜能细胞，间充质干细胞是其中被认为最具有医学价值的干细胞种类。这种细胞一方面具备干细胞自我复制分化的能力，另一方面富含各种类型的细胞因子，不仅可以调节局部免疫水平，促进血管等机体组织新生，从而有效治疗各种组织损伤和自身免疫疾病。而脐带间充质干细胞被认为是其中功能最强的细胞类型，这种细胞不仅来源简便、组织相容性更好并且增殖能力更强。目前已有大量研究表明，脐带间充质干细胞的提取物对组织再生具有良好的促进作用。有研究指出，这种细胞的提取物富含各种促进组织和血管新生的细胞因子，例如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、干细胞生长因子等。而文献和我们的动物实验也指出，当这种因子被注射到破损皮肤表面后，大大促进了皮肤的再生，而进一步研究也发现，这种提取液对多种器官及组织损伤例如骨折、关节劳损、冠心病、肝硬化及神经系统损伤具有良好的修复效果。

治愈银屑病，单纯修复皮肤破损是不够的，因为银屑病患病部位往往伴随炎性因子浸润和免疫环境异常。因此要治疗银屑病，需要在对皮肤破损修复的同时完成对免疫系统调节。中国专利201210002647.9公开了充质干细胞及其提取方法在制备银屑病的药物中的应用，充质干细胞在炎症环境中有选择地抑制致病性效应T细胞应答并诱导调节性T细胞发生而达到治疗效果。然而现有技术中，关于本发明利用干细胞提取物和中药提取物混合制备的皮肤修复剂，目前还未见报道。

发明内容

本发明的第一个目的是针对现有技术中的不足，提供一种利用干细胞提取物和中药提取物混合制备的银屑病皮肤修复剂。

本发明的第二个目的是，提供如上所述银屑病皮肤修复剂的制药用途。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

1.一种利用干细胞提取物和中药提取物混合制备的银屑病皮肤修复剂，所述皮肤修复剂制备方法如下：

(1)干细胞提取物的制备：将华通氏块碎块用含胶原酶II的DMEM培养基消化，过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基传代培养，再换用无血清DMEM培养基传代培养，2天传代一次，收集传代3-5代的细胞进行后续处理；用含EDTA的DMEM培养基消化细胞，并用PBS溶液清洗，再用无血清DMEM培养基重悬，超声波裂解破碎细胞，破碎产物离心后取上清；将上清用孔径为5000埃的滤器过滤；

(2)中药提取物的制备：按重量份取充分干燥的中药原料：木槿花4-10份、甘草2-5份、荷叶10-15份、石菖蒲5-10份，粉碎后过40目筛，加入体积分数70-80％的乙醇配成料液比为1:20～40g/mL的溶液，选择提取温度30-40℃、提取时间20-30min、超声波功率120-240W进行提取，提取液于6000r/min下离心20min，取上清液，用乙醇定容；用和定容液等体积的水饱和正丁醇进行萃取，共萃取4-6次；将回收的正丁醇溶液用负压离心机抽干，残留物用无水乙醇溶解；其总黄酮含量不小于20mg/L；

(3)皮肤修复剂的制备：将干细胞提取物和中药提取物混合。

作为本发明的一个优选实施方案，步骤(1)中所述的超声波裂解破碎细胞，其具体参数是100-150W，10-20S*15-25次，10-20S间隔。

作为本发明的一个优选实施方案，步骤(1)中所述的EDTA浓度为0.04-0.06M。

作为本发明的一个优选实施方案，步骤(1)中所述的用孔径为5000埃的滤器过滤，具体是使用超滤管超滤提纯和浓缩，时间为25-40min，压力为0.25-0.35MPa。

作为本发明的一个优选实施方案，步骤(2)中的中药原料为木槿花7份、甘草3份、荷叶12份、石菖蒲8份。

作为本发明的一个优选实施方案，所述的中药提取物和干细胞提取物的体积比为1:12-30。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

如上任一所述皮肤修复剂在制备治疗银屑病的药物中的应用。

作为本发明的一个优选实施方案，所述皮肤修复剂以单独使用或者以药物组合物的形式使用，所述药物组合物包含治疗有效量的如上所述银屑病皮肤修复剂，以及药学上的载体，赋形剂，稀释剂，辅剂和媒介物的至少一种。

本发明还提供了一种利用如上所述修复剂进行疤痕治疗的方法，包括(1)从脐带分离间充质干细胞后，将细胞破碎并提取富含细胞因子的提取物；(2)在干细胞提取物中添加特殊的中药提取物以调节局部免疫功能的聚集；(3)将该混合物注入到银屑病发病处的浅表皮下，并沾取液体涂抹表皮，每2治疗一次，反复即可缓解或治愈疤痕。

本发明的银屑病皮肤修复剂注入到皮肤浅表和涂抹以治疗银屑病，包括(1)从脐带分离间充质干细胞后，将细胞破碎并提取富含细胞因子的提取物；(2)在干细胞提取物中添加中药提取物以调节局部免疫功能的聚集；(3)将该混合物通过喷涂、浅表注射等方法作用于银屑病发病部位，通过促皮肤组织新生和杀伤成纤维细胞以治疗银屑病。本发明的修复剂即能加速伤口代谢，又能调节局部免疫环境，可有效治疗银屑病。本发明中所有原料均简便易得，制备快速，且在制备完成后可封装长期保存，保存时间经检测可达到16个月，其生产成本和周期均远远低于国外同类产品，有利于本发明对于银屑病治疗的临床应用。

本发明的银屑病皮肤修复剂，一方面通过对脐带间充质干细胞分离提纯来获取富含多种细胞因子的细胞制剂，促进创口部位生长。另一方面，通过特殊的中药提取物促进调节性T细胞功能，有效改善患处局部微环境。

本发明优点在于：

1、本发明提出了治疗银屑病的新方案，一方面通过对脐带间充质干细胞分离提纯来获取富含多种细胞因子的细胞制剂，促进创口部位生长；另一方面，通过特殊的中药提取物调节T细胞功能，有效改善患处免疫环境，降低银屑病患病部位的炎症反应，从而有效治疗银屑病。

2、细胞证实，本发明皮肤修复制剂可以有效激活在银屑病中异常的免疫系统，尤其是调节性T细胞，STAT3通路有了显著1的上升。而对于其他相关细胞，例如表皮细胞，血管内皮细胞有良好的促进效果。其细胞周期实验显示起G2/M比率提升了3.9倍。而长期培养实验则显示本产品对细胞无毒副作用。致癌实验则显示无致癌性。这说明本方法产生的制剂不仅安全，而且有效。

3、本发明的皮肤修复剂可以有效抑制成纤维细胞的生长，而对于其他相关细胞，例如表皮干细胞、血管内皮细胞有良好的促进生长效果。

4、动物实验证实，本发明的皮肤修复剂可以有效促进皮肤组织的再生，尤其是血管再生，皮肤愈合速度加快，并且后期测量和HE染色实验显示几乎没有疤痕组织。而对愈伤组织的免疫荧光实验证实，治疗组的愈伤组织血管较为丰富，平均血管密度相比于模型组显著提高，且成纤维细胞较少。

5、采用用特殊方法对脐带间充质干细胞分离提纯，保证了提取物中含有大量具有关键作用的细胞因子。

6、本发明的中药提取物中原料的选择、提取方法及实验参数是经过大量对比试验筛选获得的，且不同中药提取成分之间具有显著的协同作用，显著提高了修复剂对于银屑病疤痕的治疗效果。

7、对细胞无毒副作用，不仅有效，而且安全。

8、所有原料均简便易得，且生产高效，制备快速。

9、本发明的皮肤修复剂均可在制备完成后长期保存，制备产物可在封装后长期保存，保存时间经检测可达到16个月。因此其生产成本和周期均远远低于国外同类产品，从而提升干细胞治疗的临床应用。

附图说明

附图1是表皮干细胞的CCK8实验。可以见到该银屑病皮肤修复剂在10％以下无细胞毒性，而4％的银屑病皮肤修复剂具有最佳的细胞修复效果(从博来霉素)。

附图2是皮肤创伤小鼠的治疗实验，左侧：对照组，右侧：皮肤修复剂治疗组。可见到治疗组的愈伤组织比较薄且充满皱褶。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1本发明皮肤修复剂的制备

步骤一：脐带间充质干细胞提取物的制备

(1)将新生儿脐带组织取出，去除血管、皮膜和血块，分离出华通氏块，剪成1mm³大小后，放入10cm无菌培养皿；用含0.1％胶原酶II的DMEM培养基进行消化；过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养，第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次；取传代3代的一瓶细胞进行后续处理；

(2)用含0.05M EDTA的DMEM培养基消化细胞，并用PBS溶液清洗；

(3)将细胞用无血清DMEM培养基重悬，并用超声波裂解破碎(120W，15S*20次，15S间隔)，将破碎产物用12000rpm离心15分钟，取上清；

(4)将上清用美国Millipore的孔径5000埃的YM-50超滤管进行超滤提纯和浓缩，时间为35min，压力为0.3MPa；

(5)用Elisa试剂盒对提纯产物中TGFB1进行定量，将提纯产物用无血清DMEM培养基稀释至TGFB1浓度为40mg/ml；

(6)将产物置于-80摄氏度长期保存。

步骤二：中药提取物的制备

按重量份取充分干燥的中药原料：木槿花7份、甘草3份、荷叶12份、石菖蒲8份，粉碎后过40目筛，加入体积分数75％的乙醇配成料液比为1:30g/mL的溶液，选择提取温度35℃、提取时间25min、超声波功率200W进行提取，提取液于6000r/min下离心20min，取上清液，用乙醇定容；用和定容液等体积的水饱和正丁醇进行萃取，共萃取5次；将回收的正丁醇溶液用负压离心机抽干(-30mm Hg，45摄氏度)，残留物用无水乙醇溶解；取1ml产物，用石油醚萃取后定容，以荷叶黄酮标准品制作标准曲线，用吸光度法对产物进行精确定量，用无菌水对剩余产物进行稀释，稀释至总黄酮含量为20mg/L。如无法达到此浓度，视为提取失败，产物应当废弃。

步骤三：皮肤修复剂的制备

(1)取1ml上述中药提取物与24ml脐带间充质干细胞提取物，加入25ml无菌水混合；

(2)将上述混合液用0.7μm滤器除菌过滤并封装，每支1.5ml。

实施例2本发明皮肤修复剂的制备

1、实验方法

(1)原代培养脐带间充质干细胞；

(2)将脐带间充质干细胞以2*10⁵个/ml铺入12孔板进行实验，贴壁培养至少24h；

(3)加入本发明实施例1制备的皮肤修复剂(质量浓度分别为0％、0.5％、1％、2％、4％、10％和15％)，并加入细胞损伤剂博来霉素作为对照；

(4)对细胞进行流式细胞检测，检测细胞凋亡、细胞活力(CCK8法)。

2、实验结果

对于间充质干细胞的CCK8实验证实，本发明的皮肤修复剂在4％浓度下的细胞毒性为6.0％，10％浓度下的细胞毒性为15.2％，表明其细胞毒性小，并选用4％质量浓度进行后续的细胞实验。

实施例3本发明皮肤修复剂抑制成纤维细胞生长、促进表皮干细胞和血管内皮细胞生长的细胞实验

1、实验方法

(1)原代培养不同的细胞，包括成纤维细胞、表皮干细胞和血管内皮细胞；

(2)将细胞以2*10⁵铺入12孔板进行实验，每种细胞4个孔，贴壁培养至少24h；

(3)每种细胞分别加入本发明所述的皮肤修复剂(质量浓度4％)，并加入博来霉素(终浓度为2μg/ml)作为细胞损伤剂，具体加样方式为：

(4)对所有细胞进行流式细胞检测，检测细胞凋亡、细胞活力(CCK8法)。

2、实验结果

各组细胞凋亡率结果见表1。从表1中结果可以看出：在4％皮肤修复剂存在的情况下，成纤维细胞出现12.6％的凋亡，相比于对照组的凋亡率差异均具有统计学意义(P<0.05)，而表皮干细胞和血管内皮细胞的凋亡率相比于对照则有所下降，细胞活力较好；博来霉素对所有细胞都产生了显著的杀伤作用，相比于对照组的凋亡率差异均具有统计学意义(P<0.05)；在4％皮肤修复剂和博来霉素同时存在的情况下，成纤维细胞的凋亡率相比于只有博来霉素存在的组别又显著提高，而表皮干细胞和血管内皮细胞组别的凋亡率却出现了显著的下降，与只有博来霉素存在的组别的凋亡率相比，差异均具有统计学意义(P<0.05)。

表1各组细胞凋亡率

实施例4本发明皮肤修复剂促进皮肤组织再生和减少疤痕的动物实验

1、实验方法

(1)购买C57/BL6J小鼠20只，雄性6周龄，放入无菌室饲养1周，随机分为4组，分别为对照组(5只)、干细胞提取物治疗组(5只)、中药提取物治疗组(5只)和皮肤修复剂治疗组(5只)；

(2)将小鼠麻醉后，在右背部剃毛，并割去直径1cm的圆形皮肤，用无菌缝线固定创口以防止伤口收缩，用敷料覆盖创口；

(3)皮肤修复剂治疗组往敷料底侧注射实施例1的皮肤修复剂，每次200μl，干细胞提取物治疗组往敷料底侧注射实施例1的干细胞提取物，每次200μl，中药提取物治疗组往敷料底侧注射实施例1的中药提取物，每次200μl，共3次。对照组注射安慰剂生理盐水，但剂量相同，每3天一次；

(4)10天后取出敷料，观察新生皮肤，并计算创面愈合率，计算公式为：(1－未愈合创面面积/原创面面积)×100％；

(5)再于第30天后观察小鼠创面愈合情况和疤痕形成情况，计算疤痕体积；

(6)对新生皮肤取样进行免疫荧光实验，观察血管生成和成纤维细胞数量。

2、实验结果

给药后第10天各组小鼠创面愈合率见表2。结果表明，干细胞提取物治疗组和皮肤修复剂治疗组的伤口恢复均显著快于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，皮肤修复剂治疗组的伤口修复速度最快。从结果还可以分析得出，皮肤修复剂对皮肤创伤的修复速率显著高于干细胞提取物，将干细胞提取物和中药提取物组合使用可更好的发挥促修复作用。

表2给药后第10天各组小鼠创面愈合率

注：*P<0.05，vs对照组。

给药后第30天各组小鼠皮肤均已修复完整，疤痕体积统计结果见表3。结果表明，中药提取物治疗组和皮肤修复剂治疗组的疤痕体积均小于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，且皮肤修复剂治疗组的疤痕最小。从结果还可以分析得出，皮肤修复剂减少疤痕的效果显著高于中药提取物单用，将干细胞提取物和中药提取物组合使用可更好的发挥抑制疤痕形成的作用。

表3给药后第30天各组大鼠疤痕体积

组别	疤痕体积(cm<sup>3</sup>)
		对照组	1.12±0.14
干细胞提取物治疗组	1.06±0.11
		中药提取物治疗组	0.52±0.06*
皮肤修复剂治疗组	0.16±0.05*

注：*P<0.05，vs对照组。

对愈伤组织的免疫荧光实验证实，治疗组的愈伤组织血管较为丰富，成纤维细胞较少。光密度值定量分析表明，皮肤修复剂治疗组愈伤组织平均血管密度(MVD)比对照组高2.2倍，比干细胞提取物治疗组高1.6倍，比中药提取物治疗组高1.9倍。

实施例5本发明皮肤修复剂对调节性T细胞的促进作用

(1)取银屑病患者1名，在治疗前抽取1ml外周血进行流式细胞实验，检测Treg细胞的三种标记物：CD4、CD25、FOXP3；

(2)采用实施例1制备的皮肤修复剂进行治疗，每周治疗1次，持续治疗4周；

(3)治疗完成后，取患者外周血，进行同样流式细胞实验。

结果显示与治疗前比较，本发明的皮肤修复剂可有效改善调节性T细胞的作用，降低银屑病患病部位的炎症反应，激活银屑病中异常的免疫系统，有效治疗银屑病。

实施例6影响本发明皮肤修复剂治疗效果的因素考察

本申请发明人结合经验，利用细胞实验对可能影响皮肤修复剂疗效的因素进行了初步考察。设置的组别包含以下四组：

实验组1：制备皮肤修复剂，方法同实施例1，不同之处在于，脐带间充质干细胞的提纯方法为：

(1)将新生儿脐带组织取出，去除血管、皮膜和血块，分离出华通氏块，剪成1mm³大小后，放入10cm无菌培养皿；用含0.1％胶原酶II的DMEM培养基进行消化；过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养，第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次；取传代7代的一瓶细胞进行后续处理；

(2)用含0.05M EDTA的DMEM培养基消化细胞，并用PBS溶液清洗；

(6)将产物置于-80摄氏度长期保存。

实验组2：制备皮肤修复剂，方法同实施例1，不同之处在于，脐带间充质干细胞的提纯方法为：

(1)将新生儿脐带组织取出，去除血管、皮膜和血块，分离出华通氏块，剪成1mm³大小后，放入10cm无菌培养皿；用含0.1％胶原酶II的DMEM培养基进行消化；过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养，第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次；取传代5代的一瓶细胞进行后续处理；

(2)用含0.05M EDTA的DMEM培养基消化细胞，并用PBS溶液清洗；

(6)将产物置于-80摄氏度长期保存。

按照实施例3细胞实验的方法检测各实验组制备的皮肤再生剂对成纤维细胞、表皮干细胞和血管内皮细胞生长的影响，结果如下表所示。分析表中结果可以看出：相比于实施例1制备的皮肤修复剂，实验组1制备的皮肤修复剂抑制表皮干细胞和血管内皮细胞凋亡的能力均出现了显著下降，促进成纤维细胞凋亡的能力有所下降，表明脐带间充质干细胞传代培养的代数对提取物中关键活性成分产生了较显著的影响；相比于实施例1制备的皮肤修复剂，实验组2制备的皮肤修复剂促进成纤维细胞凋亡的能力和抑制表皮干细胞和血管内皮细胞凋亡的能力均无明显下降，表明脐带间充质干细胞传至第5代其细胞中包含有大量能够抑制表皮干细胞和血管内皮细胞凋亡的活性物质；

表4实验组1细胞凋亡率

表5实验组2细胞凋亡率

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种利用干细胞提取物和中药提取物混合制备的皮肤修复剂在制备加快创口愈合并减少创口愈合时疤痕形成的药物中的应用，所述皮肤修复剂制备方法如下：

(3)皮肤修复剂的制备：将干细胞提取物和中药提取物混合。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(1)中所述的超声波裂解破碎细胞，其具体参数是100-150W，10-20S*15-25次，10-20S间隔。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(1)中所述的EDTA浓度为0.04-0.06M。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(1)中所述的用孔径为5000埃的滤器过滤，具体是使用超滤管超滤提纯和浓缩，时间为25-40min，压力为0.25-0.35MPa。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(2)中的中药原料为木槿花7份、甘草3份、荷叶12份、石菖蒲8份。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的中药提取物和干细胞提取物的体积比为1:12-30。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述皮肤修复剂以单独使用或者以药物组合物的形式使用，所述药物组合物包含有效量的权利要求1-6任一所述皮肤修复剂，以及至少一种药学上的载体。