CN109700973A - 一种促进海马神经元细胞再生的中药组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种促进海马神经元细胞再生的中药组合物，由下列成分组成：刺五加5‑20重量份；巴戟天5‑20重量份；郁金5‑20重量份；远志1‑15重量份；柏子仁5‑20重量份；五味子3‑15重量份；香附5‑20重量份；莲子心1‑10重量份；法半夏3‑15重量份；三七1‑10重量份。该中药组合物可促进海马神经元细胞再生，调节5‑HT1AR介导的CAMP‑CREB‑BDNF通路，进而起到治疗抑郁症的效果。

Description

一种促进海马神经元细胞再生的中药组合物

技术领域

本发明属于中药领域，涉及一种可促进海马神经元细胞再生的中药组合物，具体涉及一种促进海马神经元细胞再生的中药组合物。

背景技术

可增殖的神经祖/神经干细胞在适当的情况下可产生新的神经元并将其整合到现有的神经元环路，这一过程的存在称为神经再生。研究已证实，成年哺乳动物中枢神经系统中存在两个神经干细胞聚集区:侧脑室壁的脑室下层(subventricularzone，SVZ)和海马齿状回的颗粒下层(subgranular zone，SGZ)(Johansson CB,Momma S,Clarke DL,etal.Identificationof a neural stem cell in the adult mamalian centralnervoussystem.Cell,1999,96:25-34.Gage FH.Mammalian neurol stem cells.Science,2000,287:1433-1438.)SVZ的干细胞沿嘴侧迁移路径迁移至嗅球，经历终末分化后发育成新的中间神经元并进一步建立起神经连接；SGZ的干细胞则发育形成颗粒细胞，并与海马齿状回建立突触联系(Bjorklund A,Lindvall O.Self repair in the brain.Science,2000,405:892-895.)。因此，大脑嗅球和海马齿状回两个区域极为特殊，它们会不断地产生新的神经元，终生具有神经再生能力。而海马作为与学习记忆功能密切相关的脑区，在有关神经再生的研究中备受关注。

成熟脑海马神经再生是一个动态的过程，受神经内分泌、环境、神经药理学等各方面因素的影响。然而应激是其中抑制成熟海马神经再生最明确的因素之一。大量研究证实应激可以抑制成熟脑海马神经再生：

1、应激会导致肾上腺皮质酮的分泌增加，皮质酮可调节成熟脑海马整个神经再生过程(Snyder JS,Soumier A,Brewer M,et al.Adult hippocampal neurogenesisbuffers stress responses and depressive behavior.Nature,2012；476:458－461.)；

2、应激也能刺激海马谷氨酸的释放，而增强的兴奋性神经递质可降低成熟脑海马神经前体细胞增殖；

3、应激同时也降低大脑的神经营养因子，如BDNF、NGF、VEGF和NT-1等。

应激可以抑制成熟脑海马神经再生，海马神经再生过程介导了应激造成的损失。各类研究证实应激和抑郁症患者的海马体积发生改变，表现为海马萎缩及神经元的减少(MacQueen G,Campbell S,McEwen BS,et al.Course of ill1ness,hippocampafunction,and hippocampal volume in major depression.Proc Nat AcadSciUSA.2003；100:1387-1392.)。临床研究证实抑郁症患者海马体积减小，同时其他边缘系统结构也出现萎缩，前额叶皮质和杏仁核也出现萎缩。而海马体积的改变可能是因为神经元或胶质细胞的凋亡增加，神经纤维的丧失，齿状回神经再生或神经胶原的降低造成。

抑郁症的神经源性假说是基于应激可以降低成熟海马神经再生和脑内神经源性营养因子的水平，而抗抑郁药治疗可以增加脑源性神经营养因子的表达和促进海马神经再生过程。目前大量研究证实抗抑郁药治疗可以增加神经再生。注射不同类型的抗抑郁药，如SSRI和SNRI类，均可增加海马神经再生。长期的抗抑郁药治疗可以增加海马神经前体细胞的增殖，可以增加新生神经元的存活(Malberg J,Eisch AJ,Nestler EJ,et al.Chronicantidepres sant treatment increases neurogenesis in adult hippocampus.JNeurosci,2000；20:9104-9110.)。抗抑郁治疗增加神经再生可以改善认知能力分辨这种含模糊的状况，从而有助于克服长期高度敏感形成的应激反应及相关的心理障碍。

有研究发现BDNF可影响新生神经元的存活(Sairanen M,Lucas G,Ernfors P,etal.Brain-derived neurotrophic factor and antidepressant drugs have differentbut coordinated effects on neuronal turnover,proliferation,and survival inthe adult dentate gyrus.J Neurosci,2005；25:1089-1094)。VEGF是抗抑郁药影响海马神经再生的重要信号通路，侧脑室注射VEGF可以增加海马神经再生(Jin K,Zhu Y,YunjuanS,et al.Vascular endothelial growth factor(VEGF)stimulates neurogenisis invitro and in vivo.Proc Natl Acad Sci USA.2002；18:11946-11950.)。总之，抗抑郁药可通过VEGF和BDNF两条信号通路增加海马神经干细胞增殖和新生神经元存活。

脑缺血，无论是全脑缺血或是局脑缺血均能够引起成年中枢神经的再生反应。海马受到各种侵害损伤后，SGZ区新生神经元的细胞数可显著増多，说明损伤可促进海马DC的神经元再生。神经退行性疾病如帕金森病(PD)、早老性痴呆(AD)、亨廷顿舞蹈病(HD)等患者的脑内也有神经元再生的现象。成年海马神经再生确实是应激诱导的精神行为紊乱的关键机制，特别是抑郁症和焦虑症。脑海马神经再生是抑郁治疗的新靶点，抗抑郁药诱导脑海马神经再生是治疗抑郁的潜在机制。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种促进海马神经元细胞再生的中药组合物，该中药组合物可促进促进海马神经元细胞再生，调节5-HT1AR介导的CAMP-CREB-BDNF通路，进而起到治疗抑郁症的效果。

本发明的另一目的在于提供上述的促进海马神经元细胞再生的中药组合物的制备方法。

本发明的第三个目的在于提供上述的促进海马神经元细胞再生的中药组合物的用途。

为了实现上述目的，本发明提供一种促进海马神经元细胞再生的中药组合物，由下列成分组成：刺五加5-20重量份；巴戟天5-20重量份；郁金5-20重量份；远志1-15重量份；柏子仁5-20重量份；五味子3-15重量份；香附5-20重量份；莲子心1-10重量份；法半夏3-15重量份；三七1-10重量份。

优选地，刺五加10重量份；巴戟天10重量份；郁金10重量份；远志3重量份；柏子仁10重量份；五味子5重量份；香附10重量份；莲子心3重量份；法半夏10重量份；三七3重量份。

本发明还提供上述的促进海马神经元细胞再生的中药组合物的制备方法，包括如下步骤：

1)将上述中药成分按比例混合均匀，加入冷水浸泡半小时，水量浸过药面1.5-3厘米；

2)第一次煎煮：加热，使药液沸腾后再煎20分钟，过滤，分离一煎药液和一煎药渣；

3)第二次煎煮：一煎药渣加冷水进行第二煎煮，第二次煎于二煎药液沸腾后再煎15分钟，分离二煎药液和二煎药渣；

4)将一煎药液和二煎药液混合均匀即可。

本发明另提供一种上述中药组合物作为制备治疗抑郁症药物中的应用。

本发明所提供中药组合物服用时，每次服用150-200mL，早晚各一次，与饭隔开半小时，温服。

本发明所用中药组合物中刺五加主要归脾、肾、心经，有益气健脾、补肾安神的功效。现代研究(Tohda C，Ichimura M，Bai Y，et al.J Pharmacol Sci,2008,107(3):329-339.)发现能升高大鼠大脑海马组织内BDNF的表达，修复大鼠损伤神经元，重建神经突触，促进损伤海马神经元的修复，进而改善抑郁症状。

巴戟天归肝、肾经，有补肾阳，强筋骨，祛风湿的作用。其主要成分巴戟天寡糖对海马神经可塑性具有调节作用，促进神经细胞的再生(宓为峰，李玲芝，张鸿燕，等.巴戟天寡糖对海马神经细胞再生及神经元生长的影响[J].中国新药杂志，2012(22):2623-2626.)。

郁金归肝、胆、心经。具有活血止痛、行气解郁、凉血、利胆退黄的功效。实验表明(钱海兵，王毅，黄国钧.温郁金水提物对卒中后抑郁大鼠行为及血管新生的影响[J].时珍国医国药，2012，23(7):1709-1711.)温郁金水提物可以明显增加VEGF及其受体FLK-1的表达，促进海马CA3区血管新生，抗抑郁。

远志有安神益智、祛痰、消肿的功效。远志皂苷元可显著增加神经干细胞数目，促进体外培养的人神经细胞的增殖与分化，促进神经元突起生长(皮婷，薛小燕，林炼峰，等.远志皂苷元对新生大鼠皮质神经元的营养作用[J].中国药理学与毒理学杂志，2011，25(1):40-43.)。

柏子仁归心、肾、大肠经。有养心安神，敛汗，润肠通便之功。现代研究证实对鸡胚背根神经节生长具有一定的作用。

五味子敛肺，滋肾，生津，收汗，涩精。其主要成分五味子木脂素可保护神经细胞，拮抗细胞的毒性损伤，部分恢复神经突起，增加有突起的细胞数目，提高细胞活性及保护神经网络的作用(王国丽，祝洪艳，郜玉钢，等.五味子木脂素对中枢神经系统作用的研究进展[J].上海中医药杂志，2014(11):99-101.)。

香附归肝、三焦经，能理气解郁、调经止痛，现代药理研究在中枢神经系统的动态平衡中，神经元细胞和星形胶质细胞的相互作用发挥着十分重要的作用。

莲子心归心、肾经，能清心安神、益肾涩精，现代药理研究能保护中枢神经系统。

法半夏，归脾、胃、肺经，有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结之功,现代药理研究能改善小鼠的学习和记忆功能，可能与半夏生物碱有抗氧化作用及抑制乙酰胆碱酯酶(AchE)的活性有关。

三七归肝、胃经，能散瘀止血，消肿定痛。

本发明的有益效果在于：

本发明提供一种促进海马神经元细胞再生的中药组合物，该中药组合物可促进海马神经元细胞再生，调节5-HT1AR介导的CAMP-CREB-BDNF通路，进而起到治疗抑郁症的效果。

附图说明

图1为本发明所提供中药组合物在大鼠药效学实验中脑组织病理切片图。

图2为本发明所提供中药组合物在大鼠药效学实验中5-HT1ar免疫组化图。

图3为本发明所提供中药组合物在大鼠药效学实验中5-HT1ar免疫组化OD值统计图。

图4为本发明所提供中药组合物在大鼠药效学实验中BDNF免疫组化图。

图5为本发明所提供中药组合物在大鼠药效学实验中BDNF免疫组化OD值统计图。

图6为本发明所提供中药组合物在大鼠药效学实验中CREB免疫组化图。

图7为本发明所提供中药组合物在大鼠药效学实验中CREB免疫组化OD值统计图。

图8为本发明所提供中药组合物在大鼠安全性实验中肝脏病理切片结果图。

图9为本发明所提供中药组合物在大鼠优效性实验中造模前各组动物体重统计图。

图10为本发明所提供中药组合物在大鼠优效性实验中CREB免疫组化图。

图11为本发明所提供中药组合物在大鼠优效性实验中BDNF免疫组化图。

具体实施方式

实施例1

本发明所提供配方：刺五加10g；巴戟天10g；郁金10g；远志3g；柏子仁10g；五味子5g；香附10g；莲子心3g；法半夏10g；三七3g。

制备方法为：

1)将上述中药成分混合均匀，加入冷水浸泡半小时，水量浸过药面1.5-3厘米；

2)第一次煎煮：加热，使药液沸腾后再煎20分钟，过滤，分离一煎药液和一煎药渣；

3)第二次煎煮：一煎药渣加冷水进行第二煎煮，第二次煎于二煎药液沸腾后再煎15分钟，分离二煎药液和二煎药渣；

4)将一煎药液和二煎药液混合均匀即可。

上述一剂药物可获得300-400mL，将其混匀后均分为两份，早晚各一次，与饭隔开半小时，每次一纸杯，温服。

实施例2药效学实验

1材料与方法：

1.1材料：

1.1.1动物：SPF级SD雄性大鼠，体重200g-210g，周龄：7周，40只。

1.2方法：

1.2.1动物分组：适应性的喂养1周后，将大鼠随机分为四组，为空白组、模型组、阳性对照组和核心处方组，每组各10只。

1.2.2动物造模：除空白组外，其余三组均造模。造模方式按照慢性利血平诱导的动物模型造模，大鼠每天腹腔注射利血平注射液0.2mg/kg，连续21天。

1.2.3分组给药：空白组不予任何刺激，正常饮水饮食，其余组大鼠腹腔注射前30min给药。核心处方组灌胃给药核心处方水煎液，给药剂量为1ml/100g，给药浓度为0.917g/ml(以刺五加为例，刺五加每天的用量为10g，则70kg成人的用量为10g，人的用量为0.14g/kg，用系数转换成大鼠的用量为0.14*6.3＝0.882/kg，假设大鼠重量为500g，则每只大鼠每天用量为0.441g，乘以10只，乘以21天，可知一组大鼠21天的用量为92.61g，其余依次计算总和为688g，大鼠总共的服药量为5ml*10*21＝1050ml)。阳性对照组灌胃氟西汀溶液(将胶囊粉末溶于饮用水中混匀)，给药剂量为1ml/100g，给药浓度为0.66g/ml；模型组灌胃等量饮用水，给药天数均为21天，每周监测大鼠体重的变化。

1.2.4取脑：

将脑组织暴露，取一侧海马置于1％福尔马林溶液固定，一侧的海马和皮层置于冻存管中-80℃保存。

1.2.5ELISA检测、海马的HE染色、免疫组化检测检测脑内海马的再生情况。

1.3结果：

1.3.1脑组织病理结果：

如图1所示，其中，从空白组x10和空白组x20图中可以看出海马细胞层数4-5层，排列有序、整齐、紧密，细胞胞浆饱满，染色质细颗粒，间质内未见小胶质细胞浸润；从模型组x10和模型组x20图中可以看出海马细胞层数减少至2-3层，排列疏松、无序，细胞数量明显减少细胞空泡变性或萎缩，间质内少量小胶质细胞浸润；从核心处方组x10和核心处方组x20图中可以看出海马细胞层数3-4层，排列较有序，疏松，细胞轻度变性或萎缩，间质内极少量小胶质细胞浸润；从西药组x10和西药组x20图中可以看处海马细胞减少至2-4层，细胞排列不规则，变性神经元较多，少量小胶质细胞浸润。

从上述图1中可以看出，模型组与空白组相比，海马的细胞层数减少、疏松、排列紊乱，细胞变、萎缩，间质小胶质细胞增生，均提示造模成功。与模型组相比，西药组和核心处方组都在一定程度上改善了海马的结构和排列，神经细胞数增加，可见西药组和核心处方组都可以改善大鼠的抑郁状态，促进其海马细胞的再生，间质小胶质细胞增生不明显。核心处方组的效果较好，细胞层数多，排列有序，细胞变性较少，促进海马神经元细胞再生。

1.3.2免疫组化结果：

(1)5-HT1ar：

从图2的光镜下可见5-HT1ar免疫标记阳性表达，在海马区主要集中于CA1、CA3区和齿状回颗粒细胞和锥体细胞，反应物呈棕褐色，5-HT1ar阳性反应存在于细胞浆和树突中，胞核不着色。由图3的图像分析所得平均光密度值可知，模型组和空白组相比，有极显著统计学差异(P<0.001)。核心处方组和模型组相比，有极显著统计学差异(P<0.001)。西药组和模型组相比，无统计学差异(P>0.05)。

(2)BDNF:

如图4所示，光镜下可见BDNF免疫标记阳性表达，在海马区主要集中于CA1、CA3区和齿状回颗粒细胞和锥体细胞，反应物呈棕褐色，BDNF阳性反应存在于细胞浆和树突中，胞核不着色。由图5的图像分析所得平均光密度值可知，造模后，模型组和空白组相比，有极显著统计学差异(P<0.001)。核心处方组和模型组相比，有极显著统计学差异(P<0.001)。西药组和模型组相比，有极显著统计学差异(P<0.001)。

(3)CREB：

如图6所示，光镜下可见CREB免疫标记阳性表达，在海马区主要集中于CA1、CA3区和齿状回颗粒细胞和锥体细胞，反应物呈棕褐色，CREB阳性反应存在于胞核，细胞浆和树突不着色。由图7的图像分析所得平均光密度值可知，模型组和空白组相比，有极显著统计学差异(P<0.001)。核心处方组和模型组相比，有统计学差异(P＝0.023)。西药组和模型组相比，有统计学差异(P＝0.030)。

5-HT1AR属于G蛋白偶联受体，5-羟色胺(5-HT)通过5-HT1AR介导cAMP/PKA/CREB信号通路，参与抑郁症的病理过程。众多研究提示，BDNF在中枢神经系统(CNS)的表达水平最高，分布区域最广，并且对一系列CNS神经元都有促进生存的作用，包括海马和皮质神经元、胆碱能神经元、黑质多巴胺能神经元。此外，BDNF几乎调控所有层面的神经元发育和功能，包括前体细胞増殖与分化、轴突和树突发育、膜运输、突触形成和功能、神经胶质细胞分化以及神经元的相互作用。BDNF是神经系统发育过程中的关键信号分子，对神经系统的发育非常重要。其异常表达也可影响轴突和树突分支的生长和突触的功能，以及神经元基因的表达和功能，导致神经元功能奈乱或神经系统疾病，如神经损伤、神经退行性疾病、疼痛、局部缺血、低血糖、抑郁症等。通过诱导神经元的生长、提高神经元新陈代谢、增强功能，BDNF可保护受损和病变的神经元免于死亡。此外，BDNF可减少神经元丢失，促进生物体内神经元的再生重新调整神经环路。BDNF可提高各种中枢神经元(包括海马神经元、皮层神经元、胆碱能神经元和黑质多巴胺能神经元)的生存率。BDNF通过特异性结合和激活CREB，或P75NTR发挥作用。目前认为BDNF-CREB信号可激活酪氨酸激酶，降低谷氨酸受体蛋白和钙结合蛋白的表达，减少钙离子内流，在神经再生中起重要作在大脑的不同区域，BDNF或CREB通过遗传或化学方法发生功能性变化积极参与神经再生的过程。

核心处方组的5-HT1AR、BDNF、CREB在海马内的含量较模型组明显增加，提示核心处方能通过5-HT1AR介导的CAMP-CREB-BDNF通路来起作用的，促进海马神经元细胞再生。

1.4结论：

慢性利血平模型造模成功，大鼠海马内新生神经元减少，核心处方可以促进促进海马神经元细胞再生，调节5-HT1AR介导的CAMP-CREB-BDNF通路，且促进海马再生的能力比西药组要好。

实施例3安全性实验

1材料与方法：

1.1材料：

1.1.1动物：SPF级SD大鼠，雌雄各半，体重200g-210g，周龄：7周，40只。

1.2方法：

1.2.1动物分组：适应性的喂养1周后，将大鼠随机分为四组，为对照组、核心处方低、中、高剂量组，每组各10只

1.2.2分组给药：核心处方低剂量组灌胃给药核心处方水煎液，给药剂量为1ml/100g，给药浓度为0.66g/ml(浓度为正常给药浓度，计算方法同前)。核心处方中剂量组灌胃给药核心处方水煎液，给药剂量为1ml/100g，给药浓度为1.31g/ml(药物用量为正常用量的2倍，浓度也就是之前2倍)。核心处方高剂量组灌胃给药核心处方水煎液，给药剂量为1ml/100g，给药浓度为2.64g/ml(药物用量为正常用量的4倍，浓度也就是之前4倍)。对照组灌胃等体积饮用水。每日一次，连续灌胃28天。每天观察动物精神状态、行为、活动、毛发、粪便情况，每周监测大鼠的体重。

1.2.3取血：

抽取约6ml血后放入试管中。部分血样放入放入EP管中，测血常规。

部分血样放入离心机中，3000转/min，离心10min，取上清液测肝肾功等指标。

1.2.4取材、肝脏的HE染色：

剪开腹部皮肤，暴露腹腔，按照取材单取出脏器，并置于精密称重仪上的称重记录。减取相同部分的肝脏、肾脏放入1％福尔马林溶液中。

1.3结果：

1.3.1临床症状及体重：

大鼠一般状况：各组大鼠给药期间行为、步态、毛色、粪便性状与对照组相比，未见异常变化，说明核心处方对于SD大鼠一般状况无明显不良影响

体重：由表1可知，各组大鼠在实验期间体重均有增加，各给药组大鼠体重增长略低于对照组，但与对照组比较无显著性差异(P>0.05)，可见长期灌胃给药对SD大鼠体重无不良影响。

表1体重的变化

其中，^*表示与对照组相比，有统计学差异(0.01≤P<0.05)。^**表示与对照组相比，有显著的统计学差异(0.001≤P<0.01)。^***表示与对照组相比，有极显著的统计学差异(p<0.001)。未标实的，表示与对照组相比，无统计学差异(P>0.05)。

1.3.2血常规的影响：

如表2所示核心处方低、中、高剂量服用28天，大鼠的血常规各项指标与对照组相比，无统计学差异，核心处方对大鼠的WBC、RBC、HGB、PLT、NEUT、LYMP、MONO无明显影响。

表2血常规的变化

其中，^*表示与对照组相比，有统计学差异(0.01≤P<0.05)。^**表示与对照组相比，有显著的统计学差异(0.001≤P<0.01)。^***表示与对照组相比，有极显著的统计学差异(p<0.001)。未标实的，表示与对照组相比，无统计学差异(P>0.05)。

1.3.3肝功能的影响：

如表3所示，核心处方低、中、高剂量服用28天，大鼠的肝功能各项指标与对照组相比，无统计学差异，核心处方对大鼠的ALT、AST、TBIL、ALP、TO、ALB、G无明显影响。

表3肝功能的变化

其中，^*表示与对照组相比，有统计学差异(0.01≤P<0.05)。^**表示与对照组相比，有显著的统计学差异(0.001≤P<0.01)。^***表示与对照组相比，有极显著的统计学差异(p<0.001)。未标实的，表示与对照组相比，无统计学差异(P>0.05)。

1.3.4肾功能、血脂及血糖的影响：

如表4所示，核心处方低、中、高剂量服用28天，大鼠的肾功能各项指标、血糖、血脂各项指标与对照组相比，无统计学差异，核心处方对大鼠的UREA、BUN、CREA、UA、GLU、TCH无明显影响。

表4肾功能、血脂、血糖的变化

其中，^*表示与对照组相比，有统计学差异(0.01≤P<0.05)。^**表示与对照组相比，有显著的统计学差异(0.001≤P<0.01)。^***表示与对照组相比，有极显著的统计学差异(p<0.001)。未标实的，表示与对照组相比，无统计学差异(P>0.05)。

1.3.5脏器指数的影响：

如表5所示，核心处方低、中、高剂量服用28天，大鼠的心、肝、脾、肺、肾、胃等重要脏器指数与对照组相比，无统计学差异，核心处方对大鼠的心、肝、脾、肺、肾、胃等重要脏器无明显影响。

表5脏器指数的变化

其中，^*表示与对照组相比，有统计学差异(0.01≤P<0.05)。^**表示与对照组相比，有显著的统计学差异(0.001≤P<0.01)。^***表示与对照组相比，有极显著的统计学差异(p<0.001)。未标实的，表示与对照组相比，无统计学差异(P>0.05)。

1.3.6病理切片结果：

如图8所示，对照组中肝小叶清晰完整，肝细胞索排列规整，肝细胞未见变性，肝窦未见充血、扩张，汇管区未见胆小管及纤维组织增生。低剂量组中肝小叶清晰完整，肝细胞索排列规整，肝细胞未见变性，肝窦未见充血、扩张，汇管区未见胆小管及纤维组织增生。中剂量组中肝小叶清晰完整，肝细胞索排列规整，肝细胞未见变性，肝窦未见充血、扩张，汇管区未见胆小管及纤维组织增生。高剂量组肝小叶清晰完整，肝细胞索排列规整，局部肝细胞可见凋亡，肝窦轻度充血，扩张不明显，汇管区未见胆小管及纤维组织增生，可见小灶炎细胞浸润。从上述图可以看出核心处方组中低、中、高剂量对于大鼠的肝脏无明显影响。

1.4结论：

由上述安全性实验的结果可得，核心处方低、中、高剂量连续服用28天，对大鼠的行为表现、体重、血常规、肝功能、肾功能、血脂、血糖均无明显的影响，对心、肝、脾、肺、肾、胃等重要脏器指数均无明显影响，核心处方无明显的毒副作用，口服安全。

实施例4优效性实验：

研究背景：目前已经上市的抗抑郁天然药物和复方，其作用机制均有促进海马神经元细胞再生，我们选取了三个促进海马神经元细胞再生效果较好的有代表性的三个药物路优泰其主要成分为贯叶金丝桃提取物，巴戟天寡糖胶囊核心为为巴戟天提取物，疏肝解郁胶囊为巴戟天和贯叶金丝桃组成的中药复方。因此我们选取以上几组，其用量与核心处方的用量相同。替代组选取每味药所起到的作用与核心处方相同或相近但却没有明确药理研究支撑其有促进海马细胞再生效果的药物进行替代，从而进一步证明核心处方的最优疗效。替代组的组成柴胡12g、川芎12g、酸枣仁15g、石菖蒲6g、麦冬10g、黄连3g、陈皮12g。

1材料与方法：

1.1材料：

1.1.1动物：SPF级SD雄性大鼠，体重200g-210g，周龄：7周，90只。

1.2方法：

1.2.1动物分组：适应性的喂养1周后，大鼠随机分为八组，为空白组、模型组、阳性对照组、核心处方组、巴戟天组、贯叶金丝桃组、疏肝解郁组、替代组，每组各10只

1.2.2动物造模：除空白组外，其余各组均造模。造模方式按照慢性利血平动物模型造模，大鼠每天腹腔注射利血平注射液0.2mg/kg，连续28天。

1.2.3分组给药：空白组不予任何刺激，正常饮水饮食，其余组大鼠腹腔注射前30min给药。核心处方组灌胃给药核心处方水煎液，给药剂量为1ml/100g，给药浓度为0.66g/ml。阳性对照组灌胃氟西汀溶液(将胶囊粉末溶于饮用水中混匀)，给药剂量为1ml/100g，给药浓度为0.21g/ml。巴戟天组组灌胃给药巴戟天水煎液，给药剂量为1ml/100g，给药浓度为0.135g/ml。贯叶金丝桃组灌胃给药贯叶金丝桃水煎液，给药剂量为1ml/100g，给药浓度为0.081g/ml。疏肝解郁组灌胃给疏肝解郁水煎液，给药剂量为1ml/100g，给药浓度为0.216g/ml。替代组灌胃给药替代水煎液，给药剂量为1ml/100g，给药浓度为0.9g/ml。模型组灌胃等量饮用水，给药天数均为28天，每周监测大鼠体重的变化。

1.2.4取脑：

将脑组织暴露，取一侧海马置于1％福尔马林溶液固定，一侧的海马和皮层置于冻存管中-80℃保存。

1.2.5海马的HE染色、免疫组化检测脑内海马的再生情况。

1.3结果：

1.3.1海马病理切片：

从图9可以看出：空白组的海马细胞层数4-5层，排列有序、整齐、紧密，细胞胞浆饱满，染色质细颗粒状，间质内未见小胶质细胞浸润。模型组的海马细胞层数减少至2-3层，排列疏松、无序，细胞数量减少，细胞空泡变性或萎缩，间质内少量小胶质细胞浸润。核心处方组的海马细胞层数3-4层，排列较有序，紧密，细胞轻度变性，偶见萎缩，间质内极少量小胶质细胞浸润。西药组的海马细胞层数3-4层，排列较有序，疏松，细胞轻度变性或萎缩，间质内极少量小胶质细胞浸润。巴戟天组的海马细胞层数3-4层，排列较有序，疏松，细胞轻度变性或萎缩，间质内少量小胶质细胞浸润。贯叶金丝桃组的海马细胞层数2-3层，排列较无序，疏松，细胞变性或萎缩，间质内少量小胶质细胞浸润。疏肝解郁组的海马细胞层数3-4层，排列较有序，疏松，细胞轻度变性或萎缩，间质内少量小胶质细胞浸润。替代组的海马细胞层数3-4层，排列较有序，疏松，细胞变性或萎缩，间质内少量小胶质细胞浸润。

模型组与空白组相比，海马的细胞层数减少、疏松、排列紊乱，细胞变、萎缩，间质小胶质细胞增生，均提示造模成功。与模型组相比，其余各组都在一定程度上改善了海马的结构和排列，神经细胞数增加，可见各服药组都可以改善大鼠的抑郁状态，促进海马神经元细胞再生，间质小胶质细胞增生不明显。其中核心处方组的效果最好，细胞排列最为整齐紧密，细胞变性恢复好，坏死及凋亡细胞罕见，小胶质细胞浸润不明显。

1.3.2免疫组化结果：

CREB、BDNF：

如图10和图11所示，光镜下可见CREB免疫标记阳性表达，在海马区主要集中于CA1、CA3区和齿状回颗粒细胞和锥体细胞，反应物呈棕褐色，CREB阳性反应存在于胞核，细胞浆和树突不着色。光镜下可见BDNF免疫标记阳性表达，在海马区主要集中于CA1、CA3区和齿状回颗粒细胞和锥体细胞，反应物呈棕褐色，BDNF阳性反应存在于细胞浆和树突中，胞核不着色。

由图像分析所得平均光密度值可知，与空白组相比，模型组的CREB有极显著统计学差异(P≤0.001)。与模型组相比，核心处方组(P＝0.023)和西药组(P＝0.030)有统计学差异。其余组没有统计学差异(P≥0.05)。与核心处方组相比，各组均无统计学差异。

由图像分析所得平均光密度值可知，与空白组相比，模型组的BDNF有极显著统计学差异(P≤0.001)。与模型组相比，核心处方组和西药组有极显著统计学差异(P≤0.001)。贯叶金丝桃组和疏肝解郁组有统计学差异。其余组没有统计学差异(P≥0.05)。与核心处方组相比，西药组无统计学差异。其余组均有统计学差异。

表6 CREB、BDNF免疫组化OD值

其中，^*表示与对照组相比，有统计学差异(0.01≤P<0.05)。^**表示与对照组相比，有显著的统计学差异(0.001≤P<0.01)。^***表示与对照组相比，有极显著的统计学差异(p<0.001)。未标实的，表示与对照组相比，无统计学差异(P>0.05)。

^△表示与模型组相比，有统计学差异(0.01≤P<0.05)。^△△表示与模型组相比，有显著的统计学差异(0.001≤P<0.01)。^△△△表示与模型组相比，有极显著的统计学差异(p<0.001)。a表示与模型组相比，无统计学差异(P>0.05)。

^□表示与核心处方组相比，有统计学差异(0.01≤P<0.05)。^□□表示与核心处方组相比，有显著的统计学差异(0.001≤P<0.01)。^□□□表示与核心处方组相比，有极显著的统计学差异(p<0.001)。b表示与核心处方组相比，无统计学差异(P>0.05)。

由上可看出，模型组较空白组，海马内的CREB、BDNF含量明显减低。

与模型组比较，核心处方组和西药组的CREB含量有所恢复，其余组无明显不同。提示核心处方可增加海马内的CREB含量，CREB的OD值增加了6.5，。促进海马神经元细胞再生

与模型组比较，核心处方组、西药组、贯叶金丝桃组和疏肝解郁组的BDNF含量明显恢复，西药组和核心处方组恢复的效果最好。核心处方组的BDNF含量与模型组相比，OD值增加了478.84。核心处方可以相较于其他组可以更好的对抗海马神经元的凋亡，促进海马神经元细胞再生

1.4结论：

核心处方相较于其余的处方可以更好的对抗海马神经元的凋亡，促进海马神经元细胞再生进而起到抗抑郁的作用。

从上述实施例可以看出，本发明提供的中药组合物可治疗抑郁症；促进海马神经元细胞再生，调节5-HT1AR介导的CAMP-CREB-BDNF通路，并且比现有药物的效果更好。

Claims (4)

1.一种促进海马神经元细胞再生的中药组合物，其特征在于，由下列成分组成：刺五加5-20重量份；巴戟天5-20重量份；郁金5-20重量份；远志1-15重量份；柏子仁5-20重量份；五味子3-15重量份；香附5-20重量份；莲子心1-10重量份；法半夏3-15重量份；三七1-10重量份。

2.如权利要求1所述的促进海马神经元细胞再生的中药组合物，其特征在于，由下列成分组成：刺五加5-20重量份；巴戟天5-20重量份；郁金5-20重量份；远志1-15重量份；柏子仁5-20重量份；五味子3-15重量份；香附5-20重量份；莲子心1-10重量份；法半夏3-15重量份；三七1-10重量份。

3.如权利要求1或2所述的促进海马神经元细胞再生的中药组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将上述中药成分按比例混合均匀，加入冷水浸泡半小时，水量浸过药面1.5-3厘米；

2)第一次煎煮：加热，使药液沸腾后再煎20分钟，过滤，分离一煎药液和一煎药渣；

3)第二次煎煮：一煎药渣加冷水进行第二煎煮，第二次煎于二煎药液沸腾后再煎15分钟，分离二煎药液和二煎药渣；

4)将一煎药液和二煎药液混合均匀即可。

4.一种如权利要求1或2所述中药组合物作为制备治疗抑郁症药物的应用。