CN1367245A

CN1367245A - 一种诱导神经干细胞转化为多巴胺能神经元的技术

Info

Publication number: CN1367245A
Application number: CN01123990A
Authority: CN
Inventors: 谢佐平
Original assignee: Zuo Huancong
Current assignee: Zuo Huancong
Priority date: 2001-08-10
Filing date: 2001-08-10
Publication date: 2002-09-04

Abstract

脑移植是对抗神经退行性疾病的有力武器,关键是制取可供移植的细胞,本技术包括:1,提取人神经干细胞体外培养并大规模增殖约千万倍;2,将人神经干细胞与其他哺乳动物特定组织共同培养,转化为多巴胺能神经元。用于细胞移植治疗帕金森综合症。帕金森病是一种常见于中老年人的黑质及黑质纹状体通路变性的疾病,病理学的变化主要是中脑黑质多巴胺能(DA)神经元的变性和消失,根据目前的临床尝试,一个病人约需要6个以上5.5－9周的人胚黑质中脑才能保证有足够的多巴胺神经元的存活。所以在实践上是不可能的,本发明弥补了这一缺陷。在体外将神经干细胞诱导成多巴胺能神经元,提供用之不尽的细胞源泉。

Description

一种诱导神经干细胞转化为多巴胺能神经元的技术

(一)技术领域：生物技术

(二)背景技术

脑移植是对抗神经退行性疾病的有力武器，关键是制取可供移植的细胞，本技术包括：1，提取人神经干细胞体外培养并大规模增殖约千万倍；2，将人神经干细胞于其他哺乳动物特定组织共同培养，转化为多巴胺能神经元。转化率达40％；用于细胞移植治疗帕金森综合症。

神经退行性疾病是目前威胁人类健康的一大类疾病，包括：早老痴呆、帕金森综合症、舞蹈病等。随着人口老龄化的到来，人们对于生活质量的要求的提高，神经退行性疾病的影响也日益明显。在北美大约有100万帕金森综合症的患者。在即将到来的世纪，我国也不可避免的面临着人口老龄化的问题。

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种较常见于中老年人的黑质及黑质纹状体通路变性的疾病，临床主要表现为静止性震颤、运动减少和肌强直等，有些病人还有神经心理障碍如压抑和痴呆，发病年龄一般始于55岁，发病率随年龄增加而增大。病理学的变化主要是中脑黑质多巴胺能(DA)神经元的变形和消失，导致纹状体内DA能纤维终末变性消失至50％-80％，及多巴胺水平下降。当今，帕金森病的治疗，主要是应用药物治疗。治疗PD的药物，旨在提高多巴胺神经元的抑制作用，降低胆碱能神经元的兴奋性，以重建已失衡的神经递质功能。包括作用于胆碱能系统、多巴胺能系统及其它系统的药物，主要是用左旋多巴(L-DOPA)。L-DOPA能改善症状但不能阻止病情发展，长期使用还会出现开关现象及严重的副作用(如运动障碍等)，因此迫切需要寻找新的疗法。近年来，脑移植治疗PD也进入临床实验阶段。较低等脊椎动物的黑质不太发达，人类的最发达。它是中脑最大的核团，纵贯中脑全长，由脑桥灰质上界延伸至丘脑底核平面，因其细胞中含有黑色素，故新鲜标本呈红竭色。黑质分为背侧的致密部和腹侧的网状部。致密部又名黑带，又大型多角形和锥体形多极神经细胞组成。细胞具长树突，核及核仁明显，胞质中分散有大而深染的尼氏小体并含有黑色素。无色素细胞主要位于致密部的内侧和尾侧。网状部又称红带，它与大脑脚最背侧的纤维混杂，由散在的不规则形小型细胞组成。细胞内含有铁质但无黑色素。也有人认为该带有些细胞含少量黑色素，有的无色素。

黑质是锥外体系的重要核团，它与大脑和脑干有广泛的联系，受丘脑、纹状体和大脑皮质的控制。黑质通过基底节和丘脑实现其调节肌张力和组织运动形式的重要作用。据研究表明，在大鼠的黑质里含有大约7000个多巴胺细胞，而每个细胞与基底节大约250000个靶细胞相连接。PD主要是由于黑质纹状体系统合成DA能力减退引起的，若能将合成DA的组织或细胞植入黑质纹状体系统，理论上讲是能起到治疗PD作用的。1979年Perlow在动物实验中获得成功，1982年Backland与Olson合作，行自体肾上腺髓质脑内移植治疗PD，取得理想疗效，标志着脑移植治疗PD进入临床实验阶段。近二十年来，学者们在移植物的选择，移植部位及技术等方面进行了有益的探索。临床黑质移植治疗PD的进展及方法：鉴于在PD症模型鼠胚黑质移植的实验研究已经证实了多巴胺神经元能存活并分泌多巴胺且和宿主形成突触联系，因而胚脑黑质移植已被认为对PD症病人是一种有效的手段。近年来用胚黑质移植至PD病人脑内的尝试已数以百计。病人的运动症状均有轻度或中度的改善，能改善PD症状，并未见有危险极大的副作用，多数病人可以减少L-dopa的用量或延长其使用间期。移植方法主要有两种：一是在立体定位仪上将悬液注入纹状体，另一种是将脑片在直视下直接植入尾状核头的预置腔中。有的病人单侧移植，有的双侧，有的病人接受一个胚脑，有的悬液来自4个胚脑。胚脑的胚龄也各不相同，从8周到19周，但多数在12周以下，少数有早至6周。术后一般进行追踪随访，最长已达十年。除观察病人的症状以外，唯一能证明移植物在病人脑内存活的方法就是用正电子发射断层扫描(PET)。其方法是将荧光多巴(F-6-Fluorodopa 18F-dopa)注入静脉，在PET像观察18F-dopa的摄取量，移植存活的病人其纹状体18F-dopa的摄取量增加。

目前用于移植的组织包括胎脑黑质、自体肾上腺髓质、周围神经组织、神经营养因子、基因工程细胞等。胎脑黑质移植入脑内，能长期存活，还能与宿主神经元发生突触联系，Schwarz将黑质细胞培养纯化成有特殊功能的细胞系，然后再行移植，大大提高了细胞存活率。自体肾上腺髓质的移植近期疗效好，但病人需要额外进行肾上腺髓质切除术。目前存在的问题及解决方向：目前在临床应用胚黑质纹状体移植中存在供体的胚龄和供体的来源的问题。人供体的胚龄最佳时间一般认为是5.5-9周。5.5周时多巴胺神经元刚刚出现，至8周时神经突起开始出现，此时取胚不会形成轴索切断术样的损伤。根据目前的临床尝试，一个病人约需要6个以上5.5-9周的胚黑质中脑才能保证有足够的多巴胺神经元的存活(存活率≤5％)。根据研究估算，人黑质大约有50万个多巴胺神经元，其中投射至壳核的至少有25万个。脑移植手术的现状和前景：面对人数如此众多的神经退行性疾病的患者，脑移植手术势在必行，然而不可能收集到足够的胎儿黑质细胞。以神经干细胞取而代之进行移植，显效率仅及黑质细胞的15％。

综上所述，治疗震颤病的关键是：在体外将神经干细胞诱导成多巴胺能神经元，提供用之不尽的细胞源泉。

(三)发明内容

本发明的一个特点是创造性地应用活组织诱导神经干细胞分化成为多巴胺能神经细胞，产率高，多巴胺能神经细胞占神经细胞的40％.。工艺流程简单，重复性强，结果可靠，成本低廉。材料和方法1，体外中脑脑片培养诱导系统

选用体重100g左右的雌性wistar大鼠，断头后在解剖液中取脑并分离出中脑，然后切成400微米厚的脑片，分别置于孔径为0.4μm的硝酸纤维素膜上(Milipore)，放入有0.8ml培养液的培养皿中，硝酸纤维素膜距离皿的底部为2mm。将神经干细胞置于脑片上方和下方，在95％ O₂与5％ CO₂的混合气体，37℃培养箱中培养，每两天换一次培养基。培养5天。

解剖液(1000ml)的组成为：1mM CaCl₂，5mM MgCl₂，1.802g葡萄糖，0.298gKCl，2.184g NaHCO₃，80g蔗糖，0.01g酚红。用孔径为0.2μm的滤膜过滤除菌。

培养基(1000ml)的组成为：800ml MEM，200ml马血清，1mM谷氨酰胺，2.32g葡萄糖，0.44g NaHCO₃，1mM CaCl₂，2mM MgSO₄，7.16g Hepes，0.012g抗坏血酸，1mg胰岛素。用NaHCO₃和HCl将pH值调至7.2，用孔径为0.2μm的滤膜过滤除菌后加入青霉素(100单位/ml)和链霉素(100μg/ml)。2，免疫组织化学方法标定多巴胺神经元

5天后将脑片弃去，将细胞在4％多聚甲醛的磷酸缓冲液(PB，0.1M pH7.4)中固定。进行多巴胺神经元特殊抗体酪氨酸羟化酶(TH)免疫组化反应，在小鼠的抗TH单克隆抗体溶液中37℃水浴孵育60min，PBS洗涤3次，每次5min，二抗和三抗(北京中山公司SP试剂盒)分别37℃水浴孵育15min，各步骤间用PBS洗涤3次，每次5min，以AEC作为显色底物，将多巴胺神经元标记为粽色，与其它种类的神经元相区分。并计算产率。

(四)具体实施方案

按本发明技术规模化生产多巴胺能神经元，分装后经自动程序降温并在液氮中长期保存；

取得细胞治疗许可的医院可应用该产品治疗帕金森震颤综合症。市场前景预测

神经退行性疾病是目前威胁人类健康的一大类疾病，包括：早老痴呆、帕金森综合症、舞蹈病等。随着人口老龄化的到来，人类对于生活质量要求的提高，神经退行性疾病的影响也日益明显。Ineichen(1987)综合20项研究后作出了一个保守的估计，即65-74岁人口中早老痴呆发病率为1％，75岁以上人口中占10％。在日本和美国，65岁以上老人的痴呆发病率分别为4.5％和9％。在北美大约有近400万的早老痴呆患者，3万亨廷顿患者和15万有50％的发病可能性的基因携带者以及100万帕金森综合症的患者。其他一些神经系统疾病如中风、老年痴呆、脑损伤、脑出血、脑缺血、神经性耳聋、植物性生存、偏头疼等疾病的发病率占人口比例在10％以上。这些神经疾病在中国的发病率同北美比较只高不低，因为在中国，大部分患者由家人照顾，而成为隐性病人，无法列入统计数据。

下面对该药品的国内市场空间作一保守的估算。据有关统计各类神经系统疾病在中国的总发病率为10％，即1.3亿患者，若其中每年有5％即650万患者使用该制剂，每个患者用药2个疗程共6000元人民币，即意味着每年390亿元的市场空间。上述估算尚未考虑到每年的新增患者。综合各种因素该项目若能成功实施充分发挥其技术优势，经营得当，相信年销售额达到39亿元人民币即市场总额的10％是不成问题的。可见，该制剂的国内市场潜力是非常可观的，若能推向世界，其市场空间更为巨大。项目经费概算

该药品目前尚未获得正式药批，需先申报新药批号或收购同类药批，方能进行生产。下面分两种情况概算该项目的费用支出。(一)申报I类生物新药批号并生产。该方式需时较长，要两年方能获得批号并批量生产。

支出科目	支出金额(万元)	支出科目	支出金额万元
支出科目	支出金额(万元)	支出科目	支出金额万元	临床前报批	120	原液车间及实验室建设	500
I期临床	200	标本、材料消耗	800	临床前报批	120	原液车间及实验室建设	500
I期临床	200	标本、材料消耗	800	II期临床	250	工资支出	150
I类生物新药药号	100	分装车间(租用)	450	II期临床	250	工资支出	150
I类生物新药药号	100	分装车间(租用)	450	审批业务费	100	软件制作	30
		经营性支出	800	审批业务费	100	软件制作	30
		经营性支出	800			不可预见费用	50
总计	3550					不可预见费用	50

附；项目发明人情况

谢佐平教授，男，1944年生，1969年毕业于北京大学生物系，1982年北大生物系研究生毕业，获硕士学位。1982年起在清华大学任教。1989年任副教授，1995年任教授，1997年任博士生导师。

1984年美国加州大IRVINE分校访问学者一年；

1985年美国耶鲁大学访问学者一年；

1991年美国哥伦比亚大学访问学者一年；

1992年美国ROCHE分子生物学研究所工作半年；

1997年美国冷泉港实验室工作一年。

1986年回国后建立了国内较早的离子通道实验室，主要从事离子通道基本理论、药理学及发育神经生物学与基因表达；突触发育形成过程等方面的研究工作。现已在NATURE，NEURON，PANS，中国科学，科学通报等杂志上发表论文30多篇。

左焕宗教授，主任医师，男1945年生，1968年毕业于北京医学院，现任北京中日友好医院副院长兼神经外科主任，是国际著名神经外科专家

王岳男 1958年生，1984年毕业于中国人民解放军第四军医大学，现任北京华日民安生物工程科技有限公司总经理。

二十一世纪是知识经济时代，生物工程业为其两大支柱产业之一。到2005年，随着基因文库建立及其蛋白功能鉴定这两大历史工程的届时完成。人类将在分子和基因水平上更深刻地理解各种疾病的发病机制及其中心环节。基因治疗将成为人类征服疾病的新的有效手段，二十一世纪的医疗革命将取决于基因治疗研究的成功。

本项目研制的细胞制剂，做为一种高科技产品、一种全新概念和疗效的神经系统类新药，具有科技含量高、生产成本少、生产工艺简单、临床应用简便、投入/产出比高的诸多优势。尤其，与同类产品相比，在疗效与价格上具有绝对优势，能满足中国国情下广大患者的医疗费用承受力。

综上所述，本项目的成功实施可集科学性、社会效益和经济效益等多重目的于一体，具有极其重要的现实意义和长远的战略意义。

Claims

一种诱导神经干细胞转化为多巴胺能神经元的技术，其特征是应用特定脑区的生物活组织将神经干细胞诱导成所需要的特定神经元。与常规采用的化学诱导相比较，具有产率高，成本低，实用性强的特征。

本发明要求保护的技术特征是：

1，应用特定脑区的生物活组织将神经干细胞诱导成所需要的特定神经元的技术；
2，应用中脑脑片与神经干细胞共同培养并将之诱导成多巴胺能神经元的技术；