KR102150103B1 - 뇌 오가노이드를 기반으로 하는 허혈성 뇌질환 모델의 제조방법 및 이의 용도 - Google Patents
뇌 오가노이드를 기반으로 하는 허혈성 뇌질환 모델의 제조방법 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
뇌 오가노이드를 기반으로 하는 허혈성 뇌질환 모델의 제조방법에 관한 것으로, 상기 방법은 인간 배아줄기세포를 이용하여 뇌 오가노이드를 제작 및 배양하는 기술을 적용한 것으로서, 상기 기술은 전세계적으로 상용화되어 있는 바 뇌 오가노이드를 기반으로 한 허혈성 뇌졸중 모델을 효율적으로 제작할 수 있다.
Description
뇌 오가노이드를 기반으로 하는 허혈성 뇌질환 모델의 제조방법에 관한 것이다.
허혈성 뇌졸중이란 고혈압, 당뇨병, 고지혈증, 흡연 등에 의해 손상된 혈관 내벽에 콜레스테롤이 침착되어 뇌혈관을 점차 좁게 만들어 혈액의 흐름을 방해함으로써 발생하며 혈전에 의해 혈관이 막혀 뇌 조직이 손상될 경우 내과적 치료법이 없는 대표적인 난치성 뇌질환이다.
전 세계적으로 허혈성 뇌졸중 예방 및 치료제 개발의 필요성이 강조되고 있으나 허혈성 뇌졸중 예방 및 치료제를 검증할 수 있는 적절한 허혈성 뇌졸중 동물모델이 없는 실정이다. 현재, 허혈성 뇌졸중 예방 및 치료제 후보물질의 스크리닝에 사용되고 있는 허혈성 뇌졸중 모델은 신경세포(neuron cell)에 산소와 글루코스를 결핍시킨 후 약물을 처리하여 세포사멸을 관찰하는 신경세포 모델(in vitro)과 마우스나 랫트의 뇌에 필라멘트(filament)를 삽입하여 혈류를 차단시키는 동물 모델(in vivo)가 가장 많이 이용되고 있다. 그러나 산소 및 글루코스 결핍 세포 모델은 2차원적인 세포 모델로서 3차원의 뇌조직을 구현하지 못한다는 문제점이 있고, 뇌혈류 차단 동물 모델은 동물의 뇌와 인간의 뇌 사이의 약물 효능 차이점으로 인해 약제를 대량으로 스크리닝 하기에 부적합하다는 문제점이 있다.
따라서, in vivo physiology의 특징을 가지고 있으면서 약제를 대량으로 스크리닝 하기에 적합한 허혈성 뇌졸중 모델을 개발할 필요성이 있다.
일 양상은 줄기세포를 3차원 배양하여 뇌 오가노이드를 제조하는 단계; 및 상기 뇌 오가노이드에서 허혈성 뇌조직의 손상을 발생시키는 단계를 포함하는 허혈성 뇌질환 모델의 제조방법을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 방법에 의해 제조된 허혈성 뇌질환 모델을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 허혈성 뇌질환 모델에 시험 물질을 접촉시키는 단계; 및 상기 시험 물질이 처리된 허혈성 뇌질환 모델에서 LDH(Lactate dehydrogenase) 단백질의 발현 수준을 대조군 모델과 비교하는 단계를 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료제를 스크리닝 하는 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 줄기세포를 3차원 배양하여 뇌 오가노이드를 제조하는 단계; 및 상기 뇌 오가노이드에서 허혈성 뇌조직의 손상을 발생시키는 단계를 포함하는 허혈성 뇌질환 모델의 제조방법을 제공한다.
본 명세서 내 용어, "오가노이드(organoid)"란 3D 입체구조를 가지는 세포덩어리를 의미하며 동물 등에서 수집, 취득하지 않은 인공적인 배양과정을 통해 제조한 축소되고 단순화된 버전의 기관을 의미한다. 상기 오가노이드는 성체줄기세포(adult stem cell, ASC), 배아줄기세포(embryonic stem cell, ESC) 또는 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC) 등의 줄기세포에서 유래될 수 있으며 자가재생 및 분화능력으로 인해 3차원으로 배양될 수 있다. 상기 오가노이드는 세포의 성장 과정에서 주변 환경과 상호 작용하도록 허용되는 환경을 가질 수 있다.
일 양상에 따른 방법은 줄기세포를 3차원 배양하여 뇌 오가노이드를 제조하는 단계를 포함한다. 상기 뇌 오가노이드의 제조는 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 방법은 줄기세포 또는 전구세포를 3차원으로 배양함으로써 오가노이드를 유도하는 것일 수 있다. 이 과정에서 3차원 배양 지지체로는 Engelbreth-Holm-Swarm tumor line에 의해 분비되는 라미닌(laminin)이 풍부한 세포 외 기질인 마트리겔(Matrigel)이 사용된다. 이후 마트리겔에 줄기세포를 삽입하여 배양함으로써 오가노이드를 이루는 유기체를 만들 수 있다. 전분화능 줄기세포(Pluripotent stem cell)가 장기 유사체의 형성을 위해 사용될 때, 세포는 특이적으로 배아체(Embryoid body)를 형성한다. 그리고 이러한 배아체는 장기 형성에 있어 삼배엽 형성(Tree germ layers)에 관여하여 실제 장기와 유사한 특성을 부여한다. 또한 장기 유사체는 타겟 기관에서 추출한 성체줄기세포를 이용하여 만들어지고 3D 마트리겔 지지체에서 배양할 수도 있다.
일 양상에 따른 방법은 상기 뇌 오가노이드에서 허혈성 뇌조직의 손상을 발생시키는 단계를 포함한다.
일 구체예에서, 상기 뇌 오가노이드를 0.5 내지 10% 농도의 산소 챔버(chamber)에서 배양하는 것일 수 있다. 예를 들어, 산소의 농도는 0.5 내지 10%, 0.5 내지 8%, 0.5 내지 6%, 1 내지 10%, 1 내지 8%, 1 내지 6%, 또는 2 내지 3.5%일 수 있다. 이때, 산소의 농도가 상기 범위 미만인 경우, 세포 사멸이 심각하게 발생하여 세포 독성이 나타나는 문제점이 있으며 상기 범위를 초과하는 경우, 허혈성 산소 결핍이 충분히 일어나지 않아 적절한 모델의 구축이 어렵다는 문제점이 있다. 또한, 상기 뇌 오가노이드를 상기 배지에서 4 내지 16시간 동안 배양하는 것일 수 있다. 예를 들어, 배양 시간은 4 내지 16시간, 4 내지 14시간, 4 내지 12시간, 4 내지 10시간, 6 내지 16시간, 6 내지 14시간, 6 내지 12시간, 또는 7 내지 8시간일 수 있다. 이때, 배양 시간이 상기 범위 미만인 경우, 허혈성 산소 결핍이 충분히 일어나지 않아 적절한 모델의 구축이 어렵다는 문제점이 있으며 상기 범위를 초과하는 경우, 세포 사멸이 심각하게 발생하여 세포 독성이 나타나는 문제점이 있다.
다른 구체예에서, 상기 뇌 오가노이드를 글루코스가 포함되지 않은 배지에서 배양하는 것일 수 있다. 상기 글루코스는 세포의 에너지원 역할을 하는데, 글루코스가 포함되지 않은 배지에서 상기 뇌 오가노이드를 배양함으로써, 허혈성 뇌 손상시에 나타날 수 있는 글루코스 결핍 상태를 재현할 수 있다. 또한, 상기 뇌 오가노이드를 상기 배지에서 6 내지 12시간 동안 배양하는 것일 수 있다. 상기 뇌 오가노이드의 배양 시간은 예를 들어, 6 내지 12시간, 6 내지 11시간, 6 내지 10시간, 6 내지 8시간, 6 내지 7시간, 7 내지 11시간, 8 내지 10시간, 또는 8 내지 9시간일 수 있다. 이때, 배양 시간이 상기 범위 미만인 경우, 허혈성 산소 결핍이 충분히 일어나지 않아 적절한 모델의 구축이 어렵다는 문제점이 있으며 상기 범위를 초과하는 경우, 세포 사멸이 심각하게 발생하여 세포 독성이 나타나는 문제점이 있다.
일 양상에 따른 방법은 상기 오가노이드에 재관류 손상(Reperfusion Injury)를 유발하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서 내 용어 "재관류 손상(Reperfusion Injury)"이란 막힌 뇌동맥을 다시 여는 뇌졸중 치료 후, 혈류가 급속히 재개되는 재관류 과정에서 세포와 조직에 손상이 발생하는 것을 의미하며, 허혈성 재관류 손상(Ischemia-reperfusion Injury)이라고도 한다. 상기 손상은 미토콘드리아의 손상, 산화 파괴, 염증 등이 주요 원인이 된다.
상기 재관류 손상은 정상 산소 농도의 CO2 인큐베이터에서 상기 뇌 오가노이드를 배양함으로써 유발시킬 수 있다. 상기 배양은 예를 들어 12 내지 24시간, 12 내지 22시간, 12 내지 20시간, 12 내지 17시간, 12 내지 15시간, 15 내지 24시간, 15 내지 20시간, 또는 17 내지 24시간 동안 수행될 수 있다. 이때, 배양 시간이 상기 범위 미만인 경우, 혀혈성 재관류의 손상을 충분히 재현할 수 없다는 문제점이 있으며 상기 범위를 초과하는 경우, 인 문제점이 있다.
다른 양상은 상기 방법에 의해 제조된 허혈성 뇌질환 모델을 제공한다. 상기 뇌질환은 뇌졸중, 뇌증후군, 뇌혈전증, 뇌출혈 또는 심정지 이후 재혈류에 의한 허혈성 상태에서 나타나는 뇌질환인 것일 수 있다.
상기 허혈성 뇌질환 모델은 종래 신경세포 모델 및 뇌혈류 차단 동물모델의 단점을 극복한 모델로서, 제조과정이 비교적 간단할 뿐만 아니라, 약제의 대량 스크리닝이 가능하므로 허혈성 뇌질환의 예방 및/또는 치료제 개발에 플랫폼으로 사용될 수 있다.
다른 양상은 상기 허혈성 뇌질환 모델에 시험 물질을 접촉시키는 단계; 및 상기 시험 물질이 처리된 허혈성 뇌질환 모델에서 LDH(Lactate dehydrogenase)의 발현 수준 또는 단백질의 활성 수준을 대조군 모델과 비교하는 단계를 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료제를 스크리닝 하는 방법을 제공한다. 상기 허혈성 뇌질환 모델의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
일 양상에 따른 방법은 허혈성 뇌질환 모델에 시험 물질을 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 시험 물질은 허혈성 뇌질환의 치료에 효과를 나타낼 것으로 기대되는 물질로서, 예를 들어, 임의의 물질(substance), 분자(molecule), 원소(element), 화합물(compound), 실재물(entity) 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질, 폴리펩티드, 저분자 유기화합물(small organic molecule), 다당류(polysaccharide), 폴리뉴클레오티드 등을 포함할 수 있다. 또한, 자연 산물(natural product), 합성 화합물 또는 화학 화합물 또는 2개 이상의 물질의 조합일 수 있다.
일 양상에 따른 방법은 상기 시험 물질이 처리된 허혈성 뇌질환 모델에서 LDH의 발현 수준 또는 단백질의 활성 수준을 대조군 모델과 비교하는 단계를 포함한다. 이때, 상기 LDH 단백질의 활성 수준이 대조군에 비해 감소한 경우, 상기 시험 물질이 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료제인 것으로 판단할 수 있다. 상기 활성 수준의 변화는 상기 허혈성 뇌질환 모델에서의 단백질 활성 수준이 대조군 모델이 비하여 유사한 수준 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% 및 1000% 이상 감소하는 것을 포함할 수 있다.
상기 LDH의 발현 수준을 측정하는 단계는 당업계에서 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있으며, 예를 들어, 웨스턴 블롯팅(western blotting), 닷 블롯팅(dot blotting), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay), 방사능 면역분석법(RIA), 방사면역확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역 전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전법(immunoprecipitation), 보체 고정 분석법, 유세포 분석법(FACS) 또는 단백질 칩 방법 등이 사용될 수 있다.
또한, 상기 LDH 단백질의 활성 수준을 측정하는 단계는 당업계에서 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있으며, 예를 들어, 역전사 중합효소 연쇄반응 (reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응 (real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블롯팅, 노던 블롯팅, 효소면역분석법, 방사면역확산법 (radioimmunodiffusion) 및 면역침전법 등이 사용될 수 있다.
상기 스크리닝 방법을 통해 얻은, 허혈성 뇌질환 모델에서의 LDH의 발현 수준을 증가시키고 및/또는 LDH 단백질의 활성 수준을 증가시키는 시험 물질은 허혈성 뇌질환의 치료를 위한 유효 물질이 될 수 있다. 이와 같은 허혈성 뇌질환의 치료를 위한 후보 물질은 이후 허혈성 뇌질환 치료제의 개발 과정에서 선도물질 (leading compound)로서 작용하게 되며, 상기 선도물질이 보다 유효한 허혈성 뇌질환의 치료 효과를 나타낼 수 있도록 그 구조를 변형시키고 최적화함으로써, 새로운 허혈성 뇌질환의 치료제를 개발할 수 있다.
일 양상에 따른 방법은 인간 배아줄기세포를 이용하여 뇌 오가노이드를 제작 및 배양하는 기술을 적용한 것으로서, 상기 기술은 전세계적으로 상용화되어 있는 바 뇌 오가노이드를 기반으로 한 허혈성 뇌졸중 모델을 효율적으로 제작할 수 있다.
또한, 상기 방법에 의해 제조된 허혈성 뇌졸중 모델은 종래 신경 세포 및 뇌혈류 차단 동물 모델의 단점을 극복한 것으로서 뇌졸중 예방 또는 치료제를 대량으로 스크리닝할 수 있을 뿐만 아니라, 뇌졸중 예방 또는 치료제의 개발을 위한 플랫폼으로 활용될 수 있다.
도 1a는 인간 배아 줄기세포 유래 뇌 오가노이드의 제조과정을 나타낸 사진이다.
도 1b는 인간 배아 줄기세포 유래 뇌 오가노이드를 활용한 허혈성 뇌졸중 모델의 제조 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2a 및 도 2b는 인간 배아 줄기세포 및 뇌 오가노이드에서 발현하는 유전자를 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 3은 뇌 오가노이드에서 발현하는 신경조직을 염색한 사진이다.
도 4a 내지 도 4e는 성숙한 뉴런 세포, 증식 세포 및 뉴런 전구 세포를 나타내는 Tuj1, TH, DCX, p-Histon, PSA-NCAM에 대한 마커를 사용하여 면역조직 화학 염색 결과를 나타낸 사진이다(좌: 4배, 중: 10배, 우: 20배).
도 5a는 산소-글루코스 결핍을 0, 2, 6, 및 12시간 동안 유도한 뇌 오가노이드의 Calcein AM 및 PI 형광 염색 결과를 나타낸 사진이다.
도 5b는 산소-글루코스 결핍을 1 및 2일 동안 유도한 뇌 오가노이드와 정상 조건의 뇌 오가노이드의 Calcein AM 및 PI 형광 염색 결과를 나타낸 사진이다.
도 6a는 1% 산소-글루코스 결핍을 12시간 동안 유도하고, 24시간 동안 재관류를 유도한 뇌 오가노이드의 Calcein AM 및 PI 형광 염색 결과를 나타낸 사진이다.
도 6b는 정상 산소 상태의 뇌 오가노이드 및 1% 산소-글루코스 결핍을 2시간 및 6시간 동안 유도하고, 1일 동안 재관류를 유도한 뇌 오가노이드의 Calcein AM 및 PI 형광 염색 결과를 나타낸 사진이다.
도 6c는 정상 산소 상태의 뇌 오가노이드 및 1% 산소-글루코스 결핍을 12시간 및 24시간 동안 유도하고, 1일 동안 재관류를 유도한 뇌 오가노이드의 Calcein AM 및 PI 형광 염색 결과를 나타낸 사진이다.
도 6d는 정상 산소 상태의 뇌 오가노이드, 1% 산소-글루코스 결핍을 2, 6 12 및 24시간 동안 유도하고, 1일 동안 재관류를 유도한뇌 오가노이드에서의 LDH의 발현 수준을 나타낸 그래프이다.
도 7a는 정상 산소 상태의 뇌 오가노이드, 1% 산소-글루코스 결핍(글루코스 공급)을 12시간 유도한 뇌 오가노이드의 Calcein AM 및 PI 형광 염색 결과 및 1% 산소-글루코스 결핍 (글루코스 공급)을 12시간 유도하고 1일 동안 재관류를 유도한 뇌 오가노이드의 Calcein AM 및 PI 형광 염색 결과를 나타낸 사진이다.
도 7b는 정상 산소 상태의 뇌 오가노이드, 1% 산소-글루코스 결핍(글루코스 결핍)을 12시간 유도한 뇌 오가노이드의 Calcein AM 및 PI 형광 염색 결과; 및 1% 산소-글루코스 결핍(글루코스 결핍)을 12시간 유도하고 1일 동안 재관류를 유도한 뇌 오가노이드의 Calcein AM 및 PI 형광 염색 결과를 나타낸 사진이다.
도 7c는 정상 산소 상태의 뇌 오가노이드, 1% 산소-글루코스 결핍을 12시간 유도한 뇌 오가노이드, 및 1% 산소-글루코스 결핍을 12시간 유도한 후, 1일 동안 재관류를 유도한 뇌 오가노이드의 배지상에서의 글루코스 결핍 유무에 따라 나타나는 LDH 발현 수준을 나타낸 그래프이다.
도 8은 정상 산소 상태의 뇌 오가노이드 및 1% 산소-글루코스 결핍을 12시간 유도하고 24시간 재관류를 유도한 뇌 오가노이드의 Calcein AM 및 PI 형광 염색 결과를 나타낸 사진이다.
도 9a는 MK-801(1 및 5 μM) 및 에다라본(5 및 50 μM)을 처리하고, 5% 산소-글루코스 결핍을 12시간 유도한 뇌 오가노이드의 LDH의 발현 수준을 나타낸 그래프이다.
도 9b는 MK-801(1 및 5 μM) 및 에다라본(5 및 50 μM)를 처리한 후, 1% 산소-글루코스 결핍을 12시간 유도하고 24시간 동안 재관류를 유도한 뇌 오가노이드의 Calcein AM 및 PI 형광 염색 결과를 나타낸 사진이다.
도 9c는 MK-801(1 및 5 μM) 및 에다라본(5 및 50 μM)을 처리한 후 1% 산소-글루코스 결핍을 12시간 유도하고 24 시간 재관류를 유도한 뇌 오가노이드에서의 LDH 발현 수준을 나타낸 그래프이다.
도 1b는 인간 배아 줄기세포 유래 뇌 오가노이드를 활용한 허혈성 뇌졸중 모델의 제조 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2a 및 도 2b는 인간 배아 줄기세포 및 뇌 오가노이드에서 발현하는 유전자를 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 3은 뇌 오가노이드에서 발현하는 신경조직을 염색한 사진이다.
도 4a 내지 도 4e는 성숙한 뉴런 세포, 증식 세포 및 뉴런 전구 세포를 나타내는 Tuj1, TH, DCX, p-Histon, PSA-NCAM에 대한 마커를 사용하여 면역조직 화학 염색 결과를 나타낸 사진이다(좌: 4배, 중: 10배, 우: 20배).
도 5a는 산소-글루코스 결핍을 0, 2, 6, 및 12시간 동안 유도한 뇌 오가노이드의 Calcein AM 및 PI 형광 염색 결과를 나타낸 사진이다.
도 5b는 산소-글루코스 결핍을 1 및 2일 동안 유도한 뇌 오가노이드와 정상 조건의 뇌 오가노이드의 Calcein AM 및 PI 형광 염색 결과를 나타낸 사진이다.
도 6a는 1% 산소-글루코스 결핍을 12시간 동안 유도하고, 24시간 동안 재관류를 유도한 뇌 오가노이드의 Calcein AM 및 PI 형광 염색 결과를 나타낸 사진이다.
도 6b는 정상 산소 상태의 뇌 오가노이드 및 1% 산소-글루코스 결핍을 2시간 및 6시간 동안 유도하고, 1일 동안 재관류를 유도한 뇌 오가노이드의 Calcein AM 및 PI 형광 염색 결과를 나타낸 사진이다.
도 6c는 정상 산소 상태의 뇌 오가노이드 및 1% 산소-글루코스 결핍을 12시간 및 24시간 동안 유도하고, 1일 동안 재관류를 유도한 뇌 오가노이드의 Calcein AM 및 PI 형광 염색 결과를 나타낸 사진이다.
도 6d는 정상 산소 상태의 뇌 오가노이드, 1% 산소-글루코스 결핍을 2, 6 12 및 24시간 동안 유도하고, 1일 동안 재관류를 유도한뇌 오가노이드에서의 LDH의 발현 수준을 나타낸 그래프이다.
도 7a는 정상 산소 상태의 뇌 오가노이드, 1% 산소-글루코스 결핍(글루코스 공급)을 12시간 유도한 뇌 오가노이드의 Calcein AM 및 PI 형광 염색 결과 및 1% 산소-글루코스 결핍 (글루코스 공급)을 12시간 유도하고 1일 동안 재관류를 유도한 뇌 오가노이드의 Calcein AM 및 PI 형광 염색 결과를 나타낸 사진이다.
도 7b는 정상 산소 상태의 뇌 오가노이드, 1% 산소-글루코스 결핍(글루코스 결핍)을 12시간 유도한 뇌 오가노이드의 Calcein AM 및 PI 형광 염색 결과; 및 1% 산소-글루코스 결핍(글루코스 결핍)을 12시간 유도하고 1일 동안 재관류를 유도한 뇌 오가노이드의 Calcein AM 및 PI 형광 염색 결과를 나타낸 사진이다.
도 7c는 정상 산소 상태의 뇌 오가노이드, 1% 산소-글루코스 결핍을 12시간 유도한 뇌 오가노이드, 및 1% 산소-글루코스 결핍을 12시간 유도한 후, 1일 동안 재관류를 유도한 뇌 오가노이드의 배지상에서의 글루코스 결핍 유무에 따라 나타나는 LDH 발현 수준을 나타낸 그래프이다.
도 8은 정상 산소 상태의 뇌 오가노이드 및 1% 산소-글루코스 결핍을 12시간 유도하고 24시간 재관류를 유도한 뇌 오가노이드의 Calcein AM 및 PI 형광 염색 결과를 나타낸 사진이다.
도 9a는 MK-801(1 및 5 μM) 및 에다라본(5 및 50 μM)을 처리하고, 5% 산소-글루코스 결핍을 12시간 유도한 뇌 오가노이드의 LDH의 발현 수준을 나타낸 그래프이다.
도 9b는 MK-801(1 및 5 μM) 및 에다라본(5 및 50 μM)를 처리한 후, 1% 산소-글루코스 결핍을 12시간 유도하고 24시간 동안 재관류를 유도한 뇌 오가노이드의 Calcein AM 및 PI 형광 염색 결과를 나타낸 사진이다.
도 9c는 MK-801(1 및 5 μM) 및 에다라본(5 및 50 μM)을 처리한 후 1% 산소-글루코스 결핍을 12시간 유도하고 24 시간 재관류를 유도한 뇌 오가노이드에서의 LDH 발현 수준을 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 뇌 오가노이드의 제조
1-1. 인간 배아 줄기세포 유래 뇌 오가노이드
인간배아줄기세포를 지지세포 없는 매트릭스(feeder free matrix) 상에서 5일 동안 배양하였다. 이후, 37℃에서 10분 동안 아큐타제(accutase)에 노출시켜 단일 세포 단위로 분리한 후, ultralow attachment 96 well plate의 각 웰 당 9,000~10,000개의 세포를 첨가하여 배상체(Embryoid Body)의 형성을 유도한 후 5일 동안 배양하였다. 이후, 신경 유도 배지(Neural induction media)로 교체하여 5일 동안 분화시키고, 파라필름(parafilm) 위에서 마트리겔(matrigel) 안에 상기 배상체를 1개씩 심어서 인큐베이터에서 20분 동안 굳혔다. 굳혀진 마트리겔 덩어리를 뇌 분화 배지(Cerebral differentiation media)에 넣고 지속적으로 신경상피(Neuroepithelium)를 유도하였다. 이후, 45일 차까지 성장시켜 뇌 오가노이드를 제조하였다.
1-2. 허혈성 뇌졸중 모델 오가노이드의 제조
상기 실시예 1-1에서 제조한 뇌 오가노이드를 산소 농도가 1%로 설정된 저산소증 챔버(Hypoxia chamber)에 넣고 글루코스가 포함되지 않은 Neurobasal medium/DMEM 배지에서 12시간 동안 배양하였다. 이후, 정상 산소 농도의 CO2 인큐베이터에 24시간 동안 노출시켜 재관류 손상(Reperfusion Injury)을 유발하여 허혈성 뇌졸중 모델 오가노이드를 제조하였다.
실시예 2. 뇌 오가노이드의 특성 확인
2-1. 배아줄기세포 마커 및 뇌 뉴런 마커의 발현 확인
상기 실시예 1-2에서 제조한 뇌 오가노이드의 배아줄기세포 마커 및 대뇌 뉴런 마커를 확인하였다. 구체적으로, 인간 배아줄기 세포에서 주로 발현하는 전분화능 마커(Pluripotency marker)인 Oct4, Sox2, Nanog, Myc, Klf4의 발현 양상을 배아줄기세포와 상기 실시예 1-2에서 제조한 뇌 오가노이드에서 각각 관찰하였다. 더 유의적인 비교를 위하여 2가지의 배아줄기세포(CHA15 및 CHA6)를 사용하였다. 실험에 사용한 프라이머를 하기 표 1에 나타냈다.
그 결과, 도 2a에 나타난 바와 같이 배아줄기세포 CHA15 및 CHA6과 비교하여 뇌 오가노이드에서 Oct4, Sox2, Nanog, Myc가 유의적으로 적게 발현되는 것을 확인할 수 있었다.
2-2. 신경세포 마커의 발현 확인
상기 실시예 1-2에서 제조한 뇌 오가노이드의 신경세포에서 발현되는 마커 유전자를 확인하였다. 구체적으로, 뇌 오가노이드에서 주로 발현하는 뉴런 마커인 LHX2, FOXG1, PAX6 및 SOX1의 발현 양상을 배아줄기세포와 상기 실시예 1-2에서 제조한 뇌 오가노이드에서 각각 관찰하였다. 더 유의적인 비교를 위하여 2가지의 배아줄기세포(CHA15 및 CHA6)를 사용하였다. 실험에 사용한 프라이머를 하기 표 1에 나타냈다.
그 결과, 도 2b에 나타난 바와 같이, 배아줄기세포 CHA15 및 CHA6과 비교하여 뇌 오가노이드에서 LHX2, FOXG1, PAX6, SOX1가 유의적으로 높게 발현되는 것을 확인할 수 있었다.
| 유전자 | 서열번호 | 방향 | 염기서열 |
| Oct4 | 서열번호 1 | 정방향 | 5'-GGA GAA GCT GGA GCA AAA C -3' |
| 서열번호 2 | 역방향 | 5'-ACC TTC CCA AAT AGA ACC CC -3' | |
| SOX2 | 서열번호 3 | 정방향 | 5'- AGC TAC AGC ATG ATG CAG GA -3' |
| 서열번호 4 | 역방향 | 5'- GGT CAT GGA GTT GTA CTG CA -3' | |
| MANOG | 서열번호 5 | 정방향 | 5'- TGA ACC TCA GCT ACA AAC AG -3' |
| 서열번호 6 | 역방향 | 5'- TGG TGG TAG GAA GAG TAA AG -3' | |
| MYC | 서열번호 7 | 정방향 | 5'- ACT CTG AGG AGG AAC AAG AA -3' |
| 서열번호 8 | 역방향 | 5'- TGG AGA CGT GGC ACC TCT T -3' | |
| KLF4 | 서열번호 9 | 정방향 | 5'- TCT CAA GGC ACA CCT GCG AA -3' |
| 서열번호 10 | 역방향 | 5'- TAG TGC CTG GTC AGT TCA TC -3' | |
| LHX2 | 서열번호 11 | 정방향 | 5'- TCG GGA CTT GGT TTA TCA CCT -3' |
| 서열번호 12 | 역방향 | 5'- GTT GAA GTG TGC GGG GTA CT -3' | |
| FOXG1 | 서열번호 13 | 정방향 | 5'- CCA GAC CAG TTA CTT TTT CCC -3' |
| 서열번호 14 | 역방향 | 5'- TGA AAT AAT CAG ACA GTC CCC C -3' | |
| PAX6 | 서열번호 15 | 정방향 | 5'-TGT CCA ACG GAT GTG TGA GTA -3' |
| 서열번호 16 | 역방향 | 5'- CAG TCT CGT AAT ACC TGC CCA -3' | |
| SOX1 | 서열번호 17 | 정방향 | 5'- TCC TGG AGT ATG GAC TGT CCG -3' |
| 서열번호 18 | 역방향 | 5'- GAA TGC AGG CTG AAT TCG G -3' |
2-3. 신경세포의 구조 확인
상기 실시예 1-2에서 제조한 뇌 오가노이드의 신경세포 구조를 확인하기 위하여, 뉴런 마커로 상기 뇌 오가노이드를 면역염색한 후 Rapiclear에 노출시켜 조직의 투명화를 유도하였다.
도 3은 뇌 오가노이드에서 발현하는 신경조직을 염색한 사진이다. 도 3에 나타난 바와 같이 뇌 오가노이드에서 신경 전구 마커(Neural progenitor marker)인 Tuj1과, 미성숙 신경 마커(Immature neuron marker)인 DCX가 발현되는 것을 확인할 수 있었다.
도 4a 내지 도 4e는 성숙한 뉴런 세포(좌), 증식 세포(중) 및 뉴런 전구 세포(우)를 나타내는 Tuj1, TH, DCX, p-Histon, PSA-NCAM에 대한 마커를 사용하여 면역조직 화학 염색을 실시한 결과이다. Tuj11은 신경전구세포 마커를 나타내고, DCX는 미성숙 뉴런 마커를 나타내며 Hoechst는 핵을 염색한 결과이다. 또한, p-Histon는 세포증식마커를 나타내고 PSA-NCAM는 뉴런전구세포 마커를 나타낸다. 도 4a 내지 도 4e에 나타난 바와 같이, 뉴런 전구세포에서부터 도파민 뉴런까지 다양한 뉴런세포들의 존재가 확인 되었다. 특히, 도 4e의 경우 대뇌 피질의 구조를 관찰할 수 있었다.
실시예 3. 1% 산소-글루코스 결핍 조건에서 뇌 오가노이드의 생존율 확인
상기 실시예 1-2에서 제조한 뇌 오가노이드의 1% 산소-글루코스 결핍(Oxygen-Glucose Deprivation, OGD) 조건에서의 생존율을 측정하였다. 먼저, 상기 뇌 오가노이드를 산소의 농도가 1%로 설정된 저산소증 챔버(Hypoxia chamber)에서 각각 2, 6, 12,24 및 48 시간 동안 노출시켰다. 이후, 상기 오가노이드를 Calcein AM 및 PI로 염색하였다. 24시간 및 48시간 동안 노출시킨 뇌 오가노이드에 대한 대조군은 정상 산소 상태(Normoxia)에서 쉐이킹(shaking) 유무 조건으로 하였다.
도 5a는 산소-글루코스 결핍을 1, 2, 6, 및 12시간 동안 유도한 뇌 오가노이드의 Calcein AM 및 PI 형광 염색 결과를 나타낸 사진이다. 도 5a에 나타난 바와 같이, 정상 산소 농도에 노출된 뇌 오가노이드의 경우, Calcein AM의 발현이 전반적으로 나타났으며, 일부 내부에서만 작은 부피로 PI가 염색되는 양상이 나타났다. 반면, 1% 산소 농도에서 저산소 손상을 유도한 뇌 오가노이드의 경우, Calcein AM의 발현이 상대적으로 적게 나타났으며, PI가 전반적으로 염색되는 것을 확인할 수 있었다.
도 5b는 산소-글루코스 결핍을 1 및 2일 동안 유도한 뇌 오가노이드와 정상 조건의 뇌 오가노이드의 Calcein AM 및 PI 형광 염색 결과를 나타낸 사진이다. 도 5b에 나타난 바와 같이 1% 산소-글루코스 결핍 조건에서의 뇌 오가노이드는 1일차부터 세포사멸이 일어나는 것을 관찰할 수 있었다. 반면, 대조군의 경우 세포사멸이 상대적으로 적게 발생하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예
4. 1% 산소-포도당 결핍 및
재관류
조건에서 뇌
오가노이드의
생존율 확인
4-1. 재관류에 의한 독성 확인
상기 실시예 1-2에서 제조한 뇌 오가노이드의 재관류에 의한 독성 차이를 측정하였다. 구체적으로, 상기 오가노이드를 12시간 동안 1% 산소-포도당 결핍을 유도한 후, 정상 산소 상태(20%)에서 24시간 동안 추가로 노출시켜 재관류를 유도하였다. 뇌 오가노이드를 배양한 배지를 수거한 후 96 웰 플레이트에 10㎕/웰 씩 첨가하고 LDH 반응용액(EZ-LDH Cell cytotoxicity assay kit)을 추가로 첨가하여 30분 동안 LDH의 반응을 유도하였다. 이후, 450 ㎚의 파장에서 OD 값을 측정하였다. 상기 오가노이드를 Calcein AM 및 PI로 염색하여 살아있는 세포 및 죽은 세포를 관찰하고, 상기 오가노이드에서 LDH(Lactate dehydrogenase)의 발현을 측정하였다. 이때, 정상 산소 상태(20%)에 노출된 뇌 오가노이드를 대조군으로 하였다.
그 결과, 도 6a에 나타난 바와 같이, 대조군에 비하여 1% 산소-글루코스 결핍이 유도된 뇌 오가노이드에서 LDH의 발현이 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다(상단). 또한, 대조군에 비하여 1% 산소-글루코스 결핍 및 재관류가 추가로 유도된 뇌 오가노이드에서 LDH의 발현이 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다(하단). 특히, 1% 산소-글루코스 결핍이 유도된 뇌 오가노이드에 비하여 재관류가 추가로 유도된 오가노이드에서 LDH의 발현의 현저하게 증가한 것으로 보아 재관류를 추가로 유도할 경우 허혈성 뇌졸중 모델로서 더욱 적합함을 확인할 수 있다.
4-2. 1% 산소-글루코스 결핍 유도 시간에 따른 세포 생존율 확인
상기 1-2에서 제조한 뇌 오가노이드의 1% 산소-글루코스 결핍 유도에 따른 세포 생존율을 측정하였다. 구체적으로, 상기 오가노이드를 1% 산소-글루코스 결핍을 각각 2, 6, 12, 및 24시간 동안 유도하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 4-1과 동일한 방법으로 수행하였다. 이때, 정상 산소 상태(20%)에 노출된 뇌 오가노이드를 대조군으로 하였다.
그 결과, 도 6b에 나타난 바와 같이, 2 및 6시간 동안 1% 산소-글루코스 결핍을 유도한 뇌 오가노이드에서 PI 염색이 두드러지게 나타나는 것을 확인할 수 있었으며, 도 6c에 나타난 바와 같이 12 및 24시간 동안 1% 산소-글루코스 결핍을 유도한 뇌 오가노이드에서 Calcein AM 염색이 감소되는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 6d에 나타난 바와 같이, 대조군에 비하여 1% 산소-글루코스 결핍 및 재관류가 유도된 뇌 오가노이드에서 LDH의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 1% 산소-글루코스 결핍을 유도한 시간 의존적으로 LDH의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
4-3. 글루코스 결핍에 따른 세포 독성 확인
상기 실시예 1-2에서 제조한 뇌 오가노이드의 1% 산소-글루코스 결핍 조건에서 글루코스의 공급 유무에 따른 세포 독성 차이를 측정하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1-2에서 제조한 뇌 오가노이드를 1% 산소-글루코스 결핍을 글루코스의 공급 또는 공급 없이 유도하였다. 이후, 정상 산소 상태(20%)에서 24시간 동안 추가로 노출시켜 재관류를 유도하였다. 상기 오가노이드를 Calcein AM 및 PI 형광 염색으로 살아있는 세포 및 죽은 세포를 관찰하고, 상기 오가노이드에서 LDH(Lactate dehydrogenase)의 발현을 측정하였다. 이때, 정상 산소 상태(20%)에 노출된 뇌 오가노이드를 대조군으로 하였다.
그 결과, 도 7a에 나타난 바와 같이, 글루코스가 공급될 경우 PI 염색 증가 또는 Calcein AM 발현의 감소가 유의적으로 나타나지 않음을 확인할 수 있었다. 그러나, 글루코스가 결핍된 도 7b의 경우,, Calcein AM의 염색이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 7c에 나타난 바와 같이 대조군에 비하여 1% 산소-글루코스 결핍이 유도된 오가노이드에서 LDH의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 1% 산소-글루코스 결핍 및 재관류를 추가로 유도한 뇌 오가노이드에서 LDH의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 포도당을 공급하지 않은 조건에서 LDH의 발현이 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 글루코스를 공급하지 않은 1% 산소-글루코스 결핍 및 재관류를 추가로 유도한 오가노이드에서 LDH의 발현이 유의적으로 증가하였는바, 허혈성 뇌졸중의 진단 모델로 이용할 수 있다.
실시예 5. 허혈성 뇌졸중 오가노이드에 대한 신경보호제의 효과 확인
5-1. 5% 산소-글루코스 결핍 조건
상기 실시예 1-2에서 제조한 뇌 오가노이드에 대한 신경보호제의 효과를 확인하였다. 먼저, 상기 뇌 오가노이드에 MK-801(1 및 5μM) 및 Edaravone(5 및 50μM)을 농도별로 처리한 후, 5% 산소-글루코스 결핍을 12시간 동안 유도하였다. 이후, 상기 오가노이드에서 LDH(Lactate dehydrogenase)의 발현을 측정하였다. 이때, 정상 산소 상태(20%)에 노출된 뇌 오가노이드를 대조군으로 하였다.
그 결과, 도 9a에 나타난 바와 같이, 대조군에 비하여 5% 산소-글루코스 결핍이 유도된 뇌 오가노이드에서 LDH의 발현이 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 특히, MK-801 및 Edaravone을 처리한 경우, 농도 의존적으로 LDH의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
5-2. 1% 산소-글루코스 결핍 및 재관류 조건
상기 실시예 1-2에서 제조한 뇌 오가노이드의 재관류 조건에서 신경보호제에 대한 효과를 확인하였다. 먼저, 상기 뇌 오가노이드에 MK-801(1 및 5μM) 및 Edaravone(5 및 50μM)을 농도별로 처리한 후 1% 산소-글루코스 결핍을 12시간 동안 유도하였다. 이후, 상기 뇌 오가노이드를 정상 산소 상태(20%)에서 24시간 동안 노출시켜 재관류를 유도하였다. 상기 오가노이드를 Calcein AM 및 PI로 염색하여 살아있는 세포 및 죽은 세포를 관찰하고, 상기 오가노이드에서 LDH(Lactate dehydrogenase)의 발현을 측정하였다. 이때, 정상 산소 상태(20%)에 노출된 뇌 오가노이드를 대조군으로 하였다.
그 결과, 도 9b에 나타난 바와 같이. 각각의 신경보호제를 처리한 뇌 오가노이드에서 Calcein AM의 발현 감소가 유의적이지 않음을 확인할 수 있었다.
또한 9c에 나타난 바와 같이, 대조군에 비하여 1% 산소-글루코스 결핍 이 유도된 뇌 오가노이드에서 LDH의 발현이 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 그러나, MK-801 및 Edaravone을 처리하고 1% 산소-글루코스 결핍 및 재관류를 유도한 뇌 오가노이드에서 LDH의 발현이 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다. 즉, 일 양상에 따른 뇌 오가노이드는 1% 산소-글루코스 결핍 및 재관류 유도 조건에서 신경보호제에 의한 LDH 발현이 감소하는 바, 허혈성 뇌졸중 치료제의 스크리닝에 이용될 수 있다.
<110> SUNGKWANG MEDICAL FOUNDATION
<120> Method for preparing ischemic brain disease model based on brain
organoid and use thereof
<130> PN123980
<160> 18
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<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer of Oct4
<400> 1
ggagaagctg gagcaaaac 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer of Oct4
<400> 2
accttcccaa atagaacccc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer of SOX2
<400> 3
agctacagca tgatgcagga 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer of SOX2
<400> 4
ggtcatggag ttgtactgca 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer of MANOG
<400> 5
tgaacctcag ctacaaacag 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer of MANOG
<400> 6
tggtggtagg aagagtaaag 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer of MYC
<400> 7
actctgagga ggaacaagaa 20
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer of MYC
<400> 8
tggagacgtg gcacctctt 19
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer of KLF4
<400> 9
tctcaaggca cacctgcgaa 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer of KLF4
<400> 10
tagtgcctgg tcagttcatc 20
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer of LHX2
<400> 11
tcgggacttg gtttatcacc t 21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer of LHX2
<400> 12
gttgaagtgt gcggggtact 20
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer of FOXG1
<400> 13
ccagaccagt tactttttcc c 21
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer of FOXG1
<400> 14
tgaaataatc agacagtccc cc 22
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer of PAX6
<400> 15
tgtccaacgg atgtgtgagt a 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer of PAX6
<400> 16
cagtctcgta atacctgccc a 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer of SOX1
<400> 17
tcctggagta tggactgtcc g 21
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer of SOX1
<400> 18
gaatgcaggc tgaattcgg 19
Claims (9)
- 줄기세포를 지지세포 없는 매트릭스(freeder free matrix) 상에서 배양하는 단계;
상기 줄기세포를 배상체(Embryoid body)로 형성시키는 단계;
상기 배상체를 신경 유도 배지에서 배양하는 단계;
상기 배양된 배상체를 뇌 분화 배지(Neural induction media)에 넣고 신경상피(Neuroepithelium)를 유도하는 단계;
상기 줄기세포를 3차원 배양하여 뇌 오가노이드를 제조하는 단계;
상기 뇌 오가노이드를 0.5 내지 10% 농도의 저산소 조건 및 글루코스가 포함되지 않은 조건에서 6 내지 12시간 동안 배양하여 뇌 오가노이드에 허혈성 뇌조직의 손상을 발생시키는 단계; 및
상기 뇌 오가노이드를 정상 산소 농도에서 12 내지 24시간 동안 재관류 손상(Reperfusion Injury)시키는 단계를 포함하는 허혈성 뇌질환 모델의 제조방법. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 청구항 1의 방법에 의해 제조된 허혈성 뇌질환 모델.
- 청구항 6에 있어서, 상기 뇌질환은 뇌졸중, 뇌증후군, 뇌혈전증 또는 뇌출혈 인 것인 허혈성 뇌질환 모델.
- 청구항 6의 허혈성 뇌질환 모델에 시험 물질을 접촉시키는 단계; 및
상기 시험 물질이 처리된 허혈성 뇌질환 모델에서 LDH(Lactate dehydrogenase)의 발현 수준 또는 단백질의 활성 수준을 대조군 모델과 비교하는 단계를 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료제를 스크리닝 하는 방법. - 청구항 8에 있어서, 상기 LDH의 발현 수준 또는 단백질의 활성 수준이 대조군에 비해 감소한 경우, 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료제인 것으로 판단하는 것인 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료제를 스크리닝 하는 방법.
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| KR100412909B1 (ko) * | 2000-08-25 | 2003-12-31 | 한국생명공학연구원 | 뇌신경세포 보호물질 및 그 제조방법 |
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| CNS Neurosci Ther., vol.23, pp.771~778(2017)* |
| Neurosurgery, vol.37(4), pp.750~757(1995)* |
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