KR100412909B1

KR100412909B1 - 뇌신경세포 보호물질 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR100412909B1
Application number: KR10-2000-0049529A
Authority: KR
Inventors: 윤봉식; 유인자; 곽병주; 유익동
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2000-08-25
Filing date: 2000-08-25
Publication date: 2003-12-31
Also published as: WO2002026937A1; KR20020016279A

Abstract

본 발명은 신규 기능의 뇌신경세포 보호물질 및 그 제조방법에 관한 것으로, 뇌신경세포 보호 활성이 있는 방선균 균주로부터 뇌신경세포 보호물질을 생산하는Streptomycessp. 60910를 동정, 배양하고 그로부터 뇌신경세포 보호 활성이 있는 방향족 펩타이드인 컴플레스타틴 (complestatin)을 추출한 후 상기 화합물의 물리화학적 및 생물학적 활성을 측정한 결과, 신규 기능의 뇌신경세포 사멸을 억제하는 신경세포 보호물질임이 확인되어 이 물질과 함께 그 제조방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

뇌신경세포 보호물질 및 그 제조방법 {Chemical substance for protection of brain nerve cell and method for producing thereof}

본 발명은 신경세포 보호물질 및 그 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 뇌신경세포의 보호 활성이 있는 방향족 펩타이드 화합물인 컴플레스타틴 (complestatin)을 생산하는Streptomycessp. 60910 균주를 분류 및 동정하고 그로부터 생산되는 뇌신경세포 보호 활성 물질을 분리, 정제한 후 그 물질의 물리화학적 구조와 생물화학적 활성을 측정하는, 신규한 기능의 신경세포의 보호 활성이 있는 신경세포 보호물질 및 그 제조방법에 관한 것이다.

일반적으로, 뇌졸중 (중풍, 발작)은 뇌혈류의 갑작스런 차단 혹은 외상 등에 의한 두 개강 내 뇌동맥 부위의 출혈로 인하여 뇌실질조직 및 지주막하강내로의 출혈로 인해 유발된 국소성의 신경장애를 일으키는 질환으로, 후속적인 뇌기능의 결손 및 대응하는 신경적 증상 및 정신적 증상을 수반하는 질환이다. 이러한 뇌졸중의 약 75%는 뇌동맥 부위의 폐색에 의해, 약 11%는 뇌출혈에 의해, 약 5%는 지주막하강 출혈에 의해 야기되는 것으로 보고되었다 [Boulton 등, Neuromethods, Vol.22 (1992)]. 전세계적으로 해마다 많은 뇌졸중 환자가 발생하고, 이들 중 약 1/3 정도가 사망하고 있으나, 허혈성 뇌졸중 치료제의 개발은 미흡한 실정이다.

상기 필요에 따라서 뇌졸중 치료에 대한 연구가 진행된 결과, 지금까지 BFGF (basic fibroblast growth factor)등과 같은 신경영양성 인자 (neurotrophic factor), NMDA (N-methyl-D-aspartate) 또는 non-NMDA 수용체 길항제, 21-아미노스테로이드 (21-aminosteroid)와 같은 라자로이드 (lazaroid)계통의 약물, 유리라디칼 스캐빈저 (free radical scavanger), 나이트릭 옥사이드 (nitric oxide) 억제제, 인터루킨-1, 9 억제제, NMDA 수용체 부위에 존재하는 폴리아민 결합부위의 억제제, 글루타메이트 수용체에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드 (antisense oligonucleotide), 저체온 또는 강글리오사이드 (ganglioside) 등이 뇌졸중의 치료에 효과가 있는 것으로 밝혀졌다. 그 중, 흥분성 아미노산 수용체인 NMDA, non-NMDA는 허혈성 뇌졸중, 지연성 발작, 저혈당 또는 저산소 유발성 허혈 및 급성 뇌외상 등으로 인하여 야기된 뇌신경 세포의 손상과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다.

한편, 뇌졸중과 같은 뇌질환에서 나타나는 뇌신경세포의 사멸은 신경전달 물질인 글루타민산염 (glutamate)에 의하여 유발된다. 정상 상태에서는 적정 농도로 분비되는 글루타민산염이 신경 전달 물질로서의 기능을 수행하지만 비정상적인 상태, 즉 뇌허혈 상태에서는 과잉 발현되어 신경세포의 사멸을 유발하는 흥분독성 (excitotoxicity)을 일으켜 결국 뇌졸중과 같은 병적인 상태를 유발한다. 즉, 뇌졸중으로 인하여 뇌신경세포는 글루타민산염을 과다 분비하고 이는 NMDA 수용체 및 non-NMDA 수용체와 연계된 이온채널을 활성화시켜 세포밖의 Ca²⁺을 세포 내로 유입시킴으로써, 신경세포를 죽음에 이르게 하는 것으로 알려져 있다. 흥분독성은 과잉 발현된 글루타민산염이 신경세포에 존재하는 글루타민산염-수용체 (glutamate-rec -eptor, NMDA 및 AMPA/Kainate receptor)를 활성화시키고, 활성화된 이들 수용체를통하여 세포 내부로 다량의 Ca²⁺가 유입됨으로써 발생된다. 즉, 과다유입된 세포내의 Ca²⁺이온은 세포 내의 phospholipase A₂(PLA₂), nitric oxide synthetase (NOS) , protease, endonuclease 등의 Ca²⁺의존성 효소들을 활성화시키고 활성화된 이들 효소는 세포 내에 과산화물 (superoxide), 수산기 (hydroxyl radical)와 같은 활성 산소 (active oxigen)를 과다하게 생성하여 세포 내의 산화, 환원 균형을 깨트리고, 결국 이러한 활성 산소에 의하여 DNA, 단백질, 지질 등이 비선택적으로 파괴되어 뇌신경세포가 사멸하게 되는 것이다.

이같은 사실을 바탕으로 하여, 뇌질환으로부터 뇌신경세포를 보호하는 물질에 관한 연구가 다수 수행되어 NMDA형 수용체 길항제 (receptor antagonist)로서 MK-801 (Buchan 등, Stroke 21:9, 1990), Ketamine, PCP, D-AP5, CPP등이, AMPA/KA형 수용체 길항제로서 CNQX, DNQX, NBQX, LY215490 등이, 대사조절형 수용체 길항제로서 L-AP3등이 보고되었고, 이중 몇몇 화합물에 대한 전임상연구가 수행되었으나 MK-801은 안정성에 문제가 있어 임상적 사용으로 부적합하고, 모두 심각한 독성을 유발하였기 때문에 개발이 중단되었다.

따라서, 뇌신경세포의 흥분독 (excitotoxin)에 의해 유발되는 뇌질환의 치료제를 개발하기 위해서는 독성이나 부작용이 전혀 없는 뇌신경세포 보호물질 및 글루타민산염 수용체 길항제 (glutamate-receptor antagonist)를 개발해야 할 필요가 있다. 이와 같은 필요에 의하여 현재 뇌질환으로부터 뇌신경세포를 보호하는 물질을 탐색하고 있으며, 이는 크게 두 가지 방법이 제시되고 있다. 첫째는 신경세포의 흥분독성을 직접적으로 차단하는 방법으로 차단물질인 글루타민산염-수용체 길항제 (glutamate receptor antagonist)를 찾는 것이며, 둘째는 세포 내에서 유발된 산화적 독성을 차단하는 방법으로 항산화 화합물을 탐색하는 것이다. 본 발명은 상기 방법 중 뇌신경세포의 흥분독성을 동반하는 뇌질환의 치료제를 개발하기 위하여 쥐의 대뇌피질 신경세포 (mouse cortical neuron)를 초대배양하여 뇌신경세포 보호물질 즉, 글루타민산염-수용체 길항제를 탐색한 것이다. 특히, 지금까지 밝혀져 있는 글루타민산염-수용체 길항제들은 대부분 합성 화합물로 독성이 강하기 때문에 뇌졸중 치료제로 개발하기에는 많은 문제점을 지니고 있었으나, 본 발명자들은 미생물 대사 산물 또는 천연물 유래의 저독성 혹은 무독성의 뇌신경세포 보호물질 및 글루타민산염-수용체 길항제 (glutamate-receptor antagonist)는 쥐의 대뇌피질 신경세포 (mouse cortical neuron) 및 닭의 종뇌 신경세포 (chick telencephalic neuron)를 초대배양한 후 주입하여 탐색해 본 결과, 방선균 배양액으로부터 강력한 글루타민산염-수용체 길항제를 발견하였고 이 물질의 화학구조 및 이화학적 특성을 규명하고 제조방법을 확립하여 약리활성을 규명함으로써 본 발명 화학물질이 컴플레스타틴 (complestatin)임을 밝혔으며, 이 화합물이 새로운 작용기전에 의하여 무독하게 NMDA 및 AMPA/KA등의 흥분독 (excitotoxin)에 의하여 유발된 뇌신경세포의 사멸 및 저산소, 무산소증에 의하여 유발된 뇌신경세포의 사멸을 억제하는 특성이 있음을 밝힌 것이다.

본 발명에서 글루타민산염에 의해 유발된 뇌신경세포사멸을 새로운 작용기전에 의하여 무독성으로 완벽하게 저해하는 특성을 지닌 컴플레스타틴 [Kaneko, I., Kamoshida, K. and Takahashi, S. J.Antibiotics, 42:236-241, (1989)]은 항보체활성, 항 HIV 항생물질 및 신생혈관 생성 억제 활성을 지닌 화합물로 보고된 바 있는 방향족 펩타이드이다 .

본 발명은 뇌신경세포 보호 활성이 있는 방선균으로부터 뇌신경세포 보호물질인 컴플레스타틴 (complestatin)을 효과적으로 분리하고 활성기작을 규명한 결과, 글루타민산염-수용체인 NMDA 및 AMPA/KA 수용체 모두에 길항제로 작용하며, 저산소, 무산소증에 의하여 유발된 뇌신경세포의 사멸도 막아주는, 현재까지 보고된 바 없는 새로운 기작의 저독성 뇌신경세포 보호물질인 컴플레스타틴을 분리, 정제하는데 성공한 것이다.

본 발명 컴플레스타틴 화합물을 유효성분으로 한 의약품을 제조할 경우, 주사제 또는 경구투여를 위한 제제로서는 정제 (錠劑), 환제 (丸劑), 과립제 (顆粒劑), 연·경 캡슐제, 산제, 세립제, 분제, 유탁제 (乳濁濟), 시럽제, 펠렛제 등으로 제조할 수 있으며, 본 발명의 컴플레스타틴 유효성분을 제제화하기 위해서는 상법에 따라서 실시하면 용이하게 제제화 할 수 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 뇌신경세포 보호물질을 생산하는Streptomycessp. 60910 균주를 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기Streptomycessp. 60910가 생산하는 뇌신경세포 보호물질 및 그 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 상기 목적은 뇌신경세포 보호활성을 나타내는 방선균 균주Streptomycessp. 60910를 동정하고 배양한 후 이 균주로부터 생산되는 뇌신경세포 보호물질을 원심분리한 상등액과 균체로부터 분리하여 구조 및 특성을 분석하고, 쥐의 대뇌피질 신경세포 및 닭 수정란 배아의 종뇌 세포를 이용하여 이 활성물질이 NMDA (N-methyl-D-aspartate), AMPA (μ-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionate), 카이네이트 (Kainate) 등의 흥분독 (excitotoxin)에 의하여 유발된 신경세포사멸과 허혈성 뇌질환 모델로서 산소-포도당 결핍에 의하여 유발된 뇌신경세포사멸에 대한 억제 효과를 측정함으로써 달성하였다.

이하, 본 발명의 구성을 상세히 설명한다.

도 1은 쥐의 대뇌피질 신경세포를 배양한 후 20 μM NMDA, 40 μM 카이네이트 (kainate, KA), 30 μM AMPA를 처리하고 동시에 본 발명 뇌신경세포 보호물질을 처리하여 24시간 후 쥐의 뇌신경세포의 사멸 정도를 LDH 측정법에 의하여 산출한 그래프이다.

도 2a는 쥐의 대뇌피질 신경세포를 배양한 후 10-1000 μM NMDA를 처리하고 동시에 본 발명 뇌신경세포 보호 활성 물질을 처리하여 24시간 후 쥐의 뇌신경세포의 사멸 정도를 LDH 측정법에 의하여 산출한 그래프이다.

도 2b는 쥐의 대뇌피질 신경세포를 배양한 후 10-100 μM 카이네이트를 처리하고 동시에 본 발명 뇌신경세포 보호 활성 물질을 처리하여 24시간 후 쥐의 뇌신경세포의 사멸 정도를 LDH 측정법에 의하여 산출한 그래프이다.

도 2c는 쥐의 대뇌피질 신경세포를 배양한 후 10-100 μM AMPA를 처리하고 동시에 본 발명 뇌신경세포 보호 활성 물질을 처리하여 24시간 후 쥐의 뇌신경세포의 사멸 정도를 LDH 측정법에 의하여 산출한 그래프이다.

도 3a는 실험실 (in vitro) 상에서 신경세포 배양시에 산소-포도당을 제거하고 이들 배양주에 본 발명 신경세포 보호물질 110 μM, NMDA 수용체 길항제 (receptor antagonist) MK-801 10 μM, 또는 AMPA/kainate 수용체 길항제 CNQX 20 μM을 첨가한 후 80분동안 배양하여 세포독성을 측정한 그래프이다.

도 3b는 실험실 (in vitro) 상에서 내피세포를 배양한 후 산소를 제거 (hypoxia)하여 세포사멸을 유도하고 여기에 본 발명 신경세포 보호물질 0.1, 1, 5, 10 μM 및 아폽토시스 억제제 Z-VAD를 첨가하여 24시간 배양한 후 세포독성을 측정한 그래프이다.

도 4a는 쥐의 대뇌피질 신경세포를 배양한 후 100 μM NMDA를 처리하여 세포 내에 Ca²⁺의 유입을 유도한 후 Ca²⁺의 세포내 유입량을 fura-2 발색시약에 의하여 측정한 결과를 나타낸다.

도 4b는 쥐의 대뇌피질 신경세포를 배양한 후 100μM NMDA를 처리하여 세포 내에 Ca²⁺의 유입을 유도한 후, 본 발명 뇌신경세포 보호물질을 동시 처리하여 Ca²⁺의 세포내 유입량을 fura-2 발색시약에 의하여 측정한 결과를 나타낸다.

도 4c는 쥐의 대뇌피질 신경세포를 배양한 후 100μM NMDA를 처리하여 세포 내에 Ca²⁺의 유입을 유도한 후, 본 발명 뇌신경세포 보호물질을 NMDA 처리 전에 처리하여 Ca²⁺의 세포내 유입량을 fura-2 발색시약에 의하여 측정한 결과를 나타낸다.

본 발명은 뇌신경세포 보호 활성을 나타내는 방선균 균주를 분류 및 동정하여 뇌신경세포 보호물질을 생산하는 신규한Streptomycessp. 60910 균주를 동정하고 그 균주의 배양 상태, 특성 등을 분석하는 단계; 뇌신경세포 보호물질을 생산하는 상기Streptomycessp. 60910를 G.S.S (glucose 10g, soluble starch 20g, soybean meal 25g, 육 추출물 1g, 효모 추출물 4g, NaCl 2g, K₂HPO₄0.25g, CaCO₃2g, pH 7.2, D.W 1L) 배지에서 배양한 후 원심분리하여 취한 상등액 및 균체로부터 활성물질을 분리하는 단계; UV, IR spectrum등의 흡광도를 조사하고, FAB 및 ESI-mass의 측정에 따라 상기 활성물질의 분자량을 결정하고, NMR spectrum에 따라 분자구조를 결정하여, 상기 뇌신경 보호 활성 물질이 방향족성 펩타이드인 컴플레스타틴 (complestatin)임을 확인하는 단계; 닭 수정란의 배아로부터 분리한 종뇌 세포와 쥐의 태아로부터 분리한 대뇌피질 신경세포를 배양하여 급성독성이 있는 NMDA와 지연성 신경독성의 non-NMDA 일종의 흥분독인 AMPA 및 카이네이트 (kainate)를Streptomycessp. 60910 균주가 생산하는 상기 뇌신경세포 보호물질과 함께 처리한 후 lactate dehydrogenase (LDH)의 양을 정량함으로써 뇌신경세포 보호물질의 흥분독성 억제능력을 조사하는 단계; 실험실적 허혈 모델 (in vitro ischemia model)인 산소-포도당 결핍 (oxygen-glucose derivation) 실험과 생체의 쥐 망막 허혈 모델 (in vivo mouse retinal ischemia model)을 실시하여 상기 뇌신경세포 보호물질의 신경세포 보호활성을 측정하는 단계; 초대 배양 쥐의 대뇌피질 조직에 Fe²⁺50 μM, H₂O₂150 μM, BSO 10 mM를 처리한 후 항산화 활성을 측정함으로써 본 발명 화합물의 신경세포 보호활성이 항산화 활성에 의한 것인지 조사하는 단계; Ca²⁺결합 염색제인 Fura-2를 사용하여 상기 뇌신경세포 보호물질이 NMDA 등의 흥분독에 의한 세포내의 Ca²⁺축적에 미치는 효과를 조사하는 단계로 구성된다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리 범위는 이들에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 뇌신경세포 보호물질 생산 균주의 분류 및 동정

뇌신경세포 보호 활성을 나타내는 방선균 균주의 배양적 특성, 형태적 특성, 생리적 특성을 조사하여 분류 및 동정하였다. 즉, 배양적 특성은 효모-맥아 추출물 한천 배지 (yeast extract-malt extract agar medium), 오트밀 한천 배지 (oatmeal agar medium), 무기 염-녹말 한천 배지 (inorganic salts-starch agar medium), 글리세롤-아스파라긴 한천 배지 (glycerol-asparagine agar medium), 펩톤-효모 추출물-철 한천 배지 (peptone-yeast extract-iron agar), 타이로신 한천 배지 (tyrosine agar medium), 글루코오스-아스파라긴 한천 배지 (glucose-asparagine agar medium), 베넷츠 한천 배지 (Bennet's agar medium), 영양 한천 배지 (nutrient's agar medium)에 21일간 배양하며 매 7일마다 생육정도, 기균사의 색깔, 기저균사의 색깔 및 생육정도, 수용성 색소의 생성여부를 조사하였다. 형태적 특성은 광학현미경 및 전자현미경을 이용하여 포자의 형태 및 크기, 포자표면의 모양, 포자사슬의 모양등을 조사하였고 생리적 특성으로 멜라닌 색소 생성능, 젤라틴 액화능, 전분가수분해능, 탄소원 이용성등을 조사하였다.

뇌신경세포 보호물질 생산 균주는 효모-맥아 추출물 한천 배지 (yeast extract-malt extract agar medium), 오트밀 한천 배지 (oatmeal agar medium), 무기 염-녹말 한천 배지 (inorganic salts-starch agar medium), 글리세롤-아스파라긴 한천 배지 (glycerol-asparagine agar medium), 타이로신 한천 배지 (tyros -ine agar medium), 글루코오스-아스파라긴 한천 배지 (glucose-asparagine agar medium), 베넷츠 한천 배지 (Bennet's agar medium), 영양 한천 배지 (nutrient'sagar medium) 등에서 잘 자라고 재색의 기중균사도 풍부히 형성하였다. 기저균사의 색은 연노랑이며 수용성 색소는 생성하지 않았다. 포자모양은 원통형이고, 크기는 0.7-0.8 ×0.8-0.9 ㎛로 표면은 매끄러운 형태 (smooth type)였다. 포자 사슬은 나선 (spiral) 모양이며 약 10-20개의 비운동성 포자를 형성하였다. 멜라닌 색소는 생성하지 않았으며 우유의 펩톤화, 질산의 환원 등에는 음성반응을 나타내었으나, 우유의 응집, 전분 및 스킴 밀크의 가수분해에서는 양성을 나타내었다. 세포벽의 다이아미노피메릭산은 엘,엘 (L,L) 형이며, 탄소원 이용성을 조사한 결과 D-글루코오스 (D-glucose), D-만니톨 (D-mannitol), 라피노오스 (raffinose), D-갈락토오스 (D-galactose)등은 매우 잘 이용하고, D-크실로오스 (D-xylose), L-람노스 (L-rha -mnose), 수크로오스 (sucrose), 셀룰로오스 (cellulose)등은 보통으로 이용하며, L-아라비노오스 (L-arabinose), 이노시톨 (inositol), D-프록토오스 (D-fructose)등은 이용하지 못하였다.

이상의 분류학적 특성에 근거하여 상기 동정 균주는 스트렙토마이세스 (Streptomyces)속에 속하는 균주임을 알 수 있었다. 본 발명자들은 이 균주를 유전자 은행 (KCTC)에 2000년 7월 28일자로 기탁번호 KCTC 0843 BP로 균주기탁하고Streptomycessp. 60910으로 명명하였다.

실시예 2 : 뇌신경세포 보호물질을 생산하는 상기 Streptomyces sp. 60910의 배양 및 뇌신경세포 보호물질의 분리와 정제

제 1단계. 뇌신경세포 보호물질을 생산하는 Streptomyces sp. 60910의 배양상기 실시예 1의 뇌신경세포 보호 활성 물질 생산 균주Streptomycessp. 60910을 배양하기 위하여 G.S.S (glucose 10g, soluble starch 20g, soybean meal 25g, beef extract 1g, yeast extract 4g, NaCl 2g, K₂HPO₄0.25g, CaCO₃2g, pH 7.2, D.W 1L) 배지를 사용하였다. 500㎖ 삼각 플라스크에 G.S.S 배지 100㎖를 분주하고 상기 뇌신경세포 보호물질 생산 균주Streptomycessp. 60910를 접종하여 2일간 (28℃, 150 rpm) 전배양하였다.

상기 전배양액 3㎖를 동일배지 100㎖를 분주한 30개의 500㎖ 베플 삼각 플라스크 (baffle Erlenmeyer flask)에 접종한 후 상기와 동일한 조건에서 5일간 배양하였다.

제 2단계. 뇌신경세포 보호물질의 분리 및 동정

상기Streptomycessp. 60910으로부터 뇌신경세포 보호 활성 물질을 분리, 정제하였다.

제 2단계의 배양액 3L를 원심분리하여 상등액과 균체로 나누었다. 상등액을 1N의 HCl을 사용하여 pH 4로 조절한 후 에틸 아세테이트로 추출하고 용매층을 농축한 후 CHCl₃-MeOH (10:1∼1:4)을 전개 용매로 하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (silica gel column chromatography)를 실시하였다. 그 활성분획을 저온에서 1일 유지한 후 생성된 침전물을 여과한 후 정제하여 활성물질을 분리하였다. 상기 원심분리하여 획득한 균체는 70% 아세톤으로 추출한 후 감압농축하고 1N의 HCl을 이용하여 pH 4로 조절한 후, 에틸 아세테이트로 용매추출하고 에틸 아세테이트층을 감압농축하여 MeOH에 녹인 후 저온에서 유지한 결과, 흰색의 침전물이 생성되었으며 이 침전물을 여과한 후 정제하여 상기 상등액에서 분리한 화합물과 동일한 활성물질을 분리하였다.

실시예 3 : Streptomyces sp. 60910이 생산하는 뇌신경세포 보호물질 컴플레스타틴 (complestatin)의 물리화학적 특성

상기 실시예 2의 화합물은 다음과 같은 물리화학적 특성을 나타내었다. FAB 및 ESI-mass의 측정에 의하여 분자량이 1325로 결정된 노란색 분말이고, Mass data와¹H,¹³C NMR spectrum 및 기타 구조해석을 위한 NMR spectrum에 따라 분자식은 C₆₁H₄₅N₇O₁₅Cl₆로 결정되었다. MeOH을 용매로 하여 UV spectrum을 측정한 결과, 280 및 290 nm 부근에서 최대흡수치를 나타내었다. 또한, 용해도를 조사한 결과, DMSO에서는 잘 용해되나 그 이외의 용매에는 난용이었다. 40% ACN과 60% 시르트르산염 완충용액 (citrate buffer, 0.05M, pH6.0)을 전개용매로 하여 TLC상에서의 Rf 값을 조사한 결과, 0.09로 나타났다.

실시예 4 : Streptomyces sp. 60910이 생산하는 뇌신경세포 보호물질의

화학 구조

상기 뇌신경세포 보호물질의 화학구조를 규명하기 위하여¹H,¹³C 및 DEPT를포함한 1차원 NMR 및 COSY, HMBC를 포함한 2차원 핵자기공명 스펙트럼 (NMR spectrum)을 측정하였다. 이들 NMR 데이터와 실시예 3의 물리화학적 특성을 근거로 상기 뇌신경세포 보호 활성 물질의 화학구조를 해석한 결과, 상기 뇌신경 보호 활성 물질은 방향족성 펩타이드인 컴플레스타틴 (complestatin)으로 규명되었고 그 구조도는 하기 일반식 [Ⅰ]과 같다.

...[Ⅰ]

실시예 5 : Streptomyces sp. 60910이 생산하는 뇌신경세포 보호물질의 생물활성 조사

제 1단계. LDH assay를 이용한 Streptomyces sp. 60910 생산 뇌신경세포 보호물질의 활성 측정

상기 실시예 1의Streptomycessp. 60910이 생산한 뇌신경세포 보호물질의 활성을 측정하기 위하여 닭의 수정란의 배아로부터 분리한 종뇌세포 (telencephal -ic neuron)와 쥐의 태아로부터 분리한 대뇌피질 신경세포 (cortical neuron)를 배양하였다. 즉, 닭 수정란의 배아로부터 종뇌세포 (chick telencephalic neuron)를분리하고 이를 5×10⁵cell의 농도로 48 well microplate에 5일간 배양한 후 뇌신경세포의 사멸을 유발하는 300 μM 카이네이트 (kainate)를 처리하고 여기에 상기 뇌신경세포 보호 활성 물질인 컴플레스타틴 (complestatin)을 동시에 처리하여 24시간 후 신경세포의 사멸 억제 정도를 광학현미경하에서 관찰하여 단위면적당 생존 세포 수를 조사하였다. 또한, 임신 15일째되는 쥐의 태아로부터 대뇌피질 신경세포 (cortical neuron)를 분리하여 12-14일 동안 배양한 후 여기에 신경세포의 사멸을 유도하는 NMDA (N-methyl-D-aspartate), AMPA (μ-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionate), 카이네이트 (Kainate)를 처리함과 동시에 뇌신경세포 보호 활성 물질인 컴플레스타틴을 처리하고 24시간 후 신경세포의 사멸여부를 광학현미경하에서 관찰하고, lactate dehydrogenase (LDH)의 양을 정량하는 LDH assay를 실시하여 그 결과를 도 1및 도 2에 나타내었다.

초대배양한 쥐의 대뇌피질 신경세포 (primary mouse cortical neuron)에 NMDA, 카이네이트 등의 흥분독 (excitotoxin)과 컴플레스타틴을 처리하여 뇌신경세포 보호 활성 물질인 컴플레스타틴의 독성억제능력을 조사한 결과, 20μM 의 NMDA 와 40μM 의 카이네이트에 의한 대뇌피질 신경세포의 부종 (종대, swelling)이 10μM 의 뇌신경세포 보호물질에 의해서 완전히 저해되었음을 알 수 있었다 (도 2a, 도 2b 및 도 2c). 또한, NMDA 및 AMPA/ kainate의 흥분독성에 대한 본 발명 신경세포 보호물질의 활성을 조사한 결과, NMDA 및 kainate/ AMPA에 의하여 유도된 신경세포사를 3-20 μM 농도에서 억제하였으며, NMDA 및 kainate/AMPA에 의한 신경독성을 완전히 저해할 수 있는 농도는 30μM이었다 (도 1). 본 화합물은 초대배양 쥐의 대뇌피질 신경세포의 배양 (primary mouse cortical neuronal culture)에 있어서 지금까지 보고된 다른 NMDA, AMPA/kainate 수용체 길항제 (receptor antagonist)들에 비하여 세포 독성이 현저히 낮았다.

본 발명 뇌신경세포 보호물질에 의한 신경세포 보호활성이 경쟁적 (competit -ive) 유형인지 비경쟁적 (non-competitive) 유형인지를 규명하기 위하여 10-1000μM의 NMDA (short term), 10-1000μM의 카이네이트 및 3-1000μM AMPA를 처리하여 24 시간 후 신경세포 보호물질의 활성을 측정하였다. 그 결과, 본 물질은 다양한 농도의 NMDA, 카이네이트, AMPA에 대하여 동일하게 강한 신경세포 보호활성을 나타내었으며, 이같은 결과로부터 본 화합물의 뇌신경세포 보호 물질의 활성은 비경쟁적 (non-competitive) 유형에 의한 것임을 알았다.

제 2단계. 실험실적 ( In vitro) 및 생체적 ( in vivo) 허혈 모델 (ischemia)을 이용한 Streptomyces sp. 60910 생산 뇌신경세포 보호물질의 활성 측정

흥분독성 억제효과가 있는 본 발명 뇌신경세포 보호물질이 실제적인 허혈 모델 (ischemia model)에서 뇌신경세포를 보호할 수 있는지를 알아보기 위하여, 실험실적 (in vitro) 허혈 모델로 사용되고 있는 산소-포도당 결핍 (oxygen-glucose deprivation) 실험을 실시하였다.

일반적으로, 뇌신경세포는 60-80 분간의 산소-포도당 결핍상태에 놓이면 허혈 (ischemia) 유형에 의하여 대부분의 신경세포가 사멸한다. 그러나, 10μM의 컴플레스타틴을 첨가한 경우에는, 산소-포도당 결핍에 의한 신경세포사멸이 억제되었으며, 이러한 억제능력은 MK-801 (NMDA antagonist)과 CNQX (AMPA/kainate antagonist)의 동시처리 효과와 유사한 강한 신경세포 보호활성을 나타낸 것이다 (도 3a). 또한, 본 화합물은 신경세포뿐 아니라 저산소에 의하여 유도된 내피세포 (endothelial cell)의 사멸도 10μM에서 완벽하게 억제하였다 (도 3b).

쥐의 망막 허혈 모델 (retinal ischemia model)을 사용하여 생제적 (in vivo)실험을 실시하였다. 쥐의 안압을 160-180 mmHg로 높인 후, 90분간 유지하여 허혈을 유도하고 본 발명 화합물을 처리한 결과, 본 발명 뇌신경세포 보호물질이 농도 의존적으로 세포사멸을 억제하였다. 즉, 쥐에 망막 허혈을 유발시킨 후, 내핵층 (inner nuclear layer)과 강글리온 세포층 (ganglion cell layer)에 대한 신경세포 보호 활성을 조사한 결과, 본 발명 뇌신경세포 보호물질을 투입하지 않은 대조군은 망막 허혈에 의하여 약 50-60%의 신경세포 사멸이 유도된 반면, 0.5-1 nM의 뇌신경세포 보호물질을 주사 (intravitreal injection)한 실험군은 90% 이상의 신경세포가 약물에 대하여 농도 의존적으로 생존하였다.

제 3단계. 세포 내의 산화적 독성에 대한 Streptomyces sp. 60910 생산 뇌신경세포 보호물질의 항산화 활성 측정

상기 뇌신경세포 보호물질이 세포내의 산화적 독성을 억제함에 의하여 신경 세포의 보호 효과를 나타내는지 조사하기 위하여 쥐의 초대 배양 대뇌피질 세포(primary mouse cortical culture)에 각각 Fe²⁺50μM, H₂O₂150μM, BSO 10mM를 처리한 후 항산화 활성을 측정하였다. 그 결과 본 발명 화합물은 Fe²⁺, H₂O₂, 및 BSO의 처리에 의한 산화적 신경세포사를 억제하지 못하였으므로, 본 발명 화합물의 신경세포 보호 활성은 항산화 활성에 의한 것이 아님을 알 수 있다.

글루타민산염-수용체 (Glutamate-receptor)의 활성화는 세포내 Ca²⁺의 축적을 야기하고 증가된 세포내의 Ca²⁺은 다른 이온의 증가와 더불어 물분자의 유입을 촉진하며, 결국 산화적 독성에 의하여 신경세포사를 유발하게 된다. 상기의 결과에 의하면 본 화합물은 흥분독성에 대하여 특이적인 보호 효과를 나타내었음을 알 수 있다.

이같은 특이적 기작을 밝히기 위하여, NMDA에 의한 세포내의 Ca²⁺축적에 본 화합물이 어떠한 영향을 미치는지를 조사하였다. NMDA에 의한 세포내 Ca²⁺의 축적을 알아보기 위하여 세포내의 Ca²⁺결합 염색제 (Ca²⁺-binding dye) 인 Fura-2를 사용하였는데, 이 방법은 세포내 에스테르 분해효소 (esterase)에 의해 분해되어 Ca²⁺와 결합된 Fura-2와 결합되지 않은 Fura-2가 각각 340 nm, 380 nm의 UV에서 흥분되면 그 비율로 세포내의 Ca²⁺축적 상태를 알아보는 방법이다. Fura-2로 염색된 대뇌피질 신경세포에 100μM NMDA를 첨가하였더니 몇 분 이내에 세포내 Ca²⁺의 축적이 야기되었다 (도 4a). 그러나, 본 발명 화합물과 NMDA와의 동시처리 또는 본 화합물의 전처리는 이러한 NMDA에 의한 Ca²⁺의 축적을 상당량 또는 완전히 저해하였다 (도 4b 및 도 4c).

전기생리학적 검사에 의하여 본 발명 화합물이 가역성의 수용체 길항제 (receptor antagonist)로서 작용하는 것을 밝혔으며, 또한 현재까지 보고된 글루타민산염-수용체 길항근 (glutamate-receptor agonist)인 AMPA, 카이네이트, NMDA, 글리신(glycine), 펜시클리딘 (phencyclidine), 폴리아민 (polyamine)등을 대상으로 수용체 결합 활성 (receptor binding activity)을 행한 결과 활성을 나타내지 않았으므로, 신경세포 수용체에 본 발명 화합물 특유의 결합 부위가 존재하는 것으로 추정된다.

이상의 실시예를 통하여 설명한 바와 같이, 본 발명은 컴플레스타틴(complestatin)의 신규한 용도, 즉, NMDA, AMPA, 카이네이트 (kainate) 등의 흥분독에 의하여 유도된 뇌 신경세포의 사멸을 억제하는 등 신경세포 보호 활성을 확인하고, 이를 뇌졸중 치료용으로 제공하는 효과가 있다. 또, 본 발명 화합물은 기존에 밝혀진 화합물과는 다른 작용기전에 의한 것이며, 약제에 독성이 없으므로 뇌졸중과 같은 뇌질환의 예방 및 치료 의약품, 식품 및 뇌신경세포 관련 연구의 시약으로 이용할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 국민건강증진 및 의약품제조산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

신경세포 보호물질을 생산하는Streptomycessp. 60910 균주 (KCTC 0843 BP).
삭제
스트렙토마이세스(Streptomyces) 속 60910 (KCTC 0843 BP) 균주가 생산하는 하기 화학식으로 표시되는 방향족 펩타이드 화합물 컴플레스타틴을 유효 성분으로 함유하는 뇌졸중 예방 및 치료용 조성물.
Streptomycessp. 60910 균주 (KCTC 0843 BP)를 G.S.S 배지에서 배양한 배양액을 원심분리하고 그 상등액을 pH 4로 조절한 후 에틸 아세테이트로 추출, 농축한 다음, CHCl₃-MeOH를 전개용매로 하여 실리카겔크로마토그래피한 그 활성분획을 저온 유지 후 침전물을 여과, 정제하여 생산하는 것을 특징으로 하는 신경세포 보호 및 신경세포 사멸 억제 기능의 방향족 펩타이드 화합물 제조방법.
Streptomycessp. 60910 균주 (KCTC 0843 BP)를 G.S.S 배지에서 배양한 배양액을 원심분리하고 그 원심분리한 균체를 아세톤으로 추출, 감압농축한 다음, pH를 4로 조절한 후 에틸 아세테이트로 용매추출하고 감압농축하여 MeOH에 녹인 후 저온에 유지하여 생산하는 것을 특징으로 하는 신경세포 보호 및 신경세포 사멸억제 기능의 방향족 펩타이드 화합물 제조방법.