KR19990018280A - 스트렙토마이세스 속 균주, 이로부터 생산되는 신경세포 보호물질 및 그의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 하기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 페나조스타틴(phenazostatin) A, B 및 C 화합물과 그의 약학적으로 허용되는 무기 또는 유기염, 수화물, 용매화물 및 이성질체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 균주로부터 화학식 1 내지 3의 페나조스타틴 A, B 및 C 화합물을 제조하는 방법과 상기 화합물을 유효성분으로 하는 신경세포 보호용 약학적 조성물에 관한 것이다.
또한. 본 발명은 화학식 1 내지 3의 페나조스타틴계 화합물을 생산하는, 토양에서 분리된 스트렙토마이세스 속 균주에 관한 것이다.
Description
본 발명은 화학식 1 내지 3으로 표시되는 페나조스타틴 A, B 및 C 화합물과 그의 약학적으로 허용되는 무기 또는 유기염, 수화물, 용매화물 및 이성질체에 관한 것이다.
화학식 1
화학식 2
화학식 3
또한, 본 발명은 스트렙토마이세스(Streptomyces sp.) 속 균주로부터 화학식 1 내지 3의 화합물을 제조하는 방법 및 상기 화합물을 유효성분으로 하는 신경세포 보호용 약학적 조성물에 관한 것이다.
또한. 본 말명은 토양에서 분리된, 화학식 1 내지 3의 화합물을 생산하는 스트렙토마이세스 속의 균주에 관한 것이다.
인체의 뇌(cerebrum)가 허혈(ischemia), 고산소혈증(hypoxia), 뇌의 외상(brain trauma), 뇌출혈(hemorrhage), 발작(seizures) 및 급성 고혈압(acute hypertension) 등과 같은 비정상적인 상태에 놓이게 되면 대뇌의 혈관내에 있는 내피세포(endothelium)와 평활근(smooth muscle) 세포에서 초산화물(superoxide), 과산화수소(hydrogen peroxide), 히드록실 라디칼(hydroxyl radical)과 같은 활성산소가 발생되어 대뇌 혈관, 뇌세포(brain parenchyma) 및 뇌 신경세포(cranial nerve cell)를 손상시킨다.
이러한 뇌질환 중에서 특히 뇌졸증(stroke)은 심각한 사회문제로 대두되고 있는데, 미국 국립 위생연구소(NIH)의 보고에 따르면 뇌졸증은 미국 성인의 사망원인 중 세 번째, 신체불구의 첫 번째 원인을 차지하고 있으며 매년 50만명의 환자가 발생되어 발병인의 30%는 사망하고, 20∼30%는 영구 불구자가 되며, 나머지 40∼50%는 신체불구, 마비, 시력감퇴 및 기억력 상실 등의 심각한 후유증을 겪는 질병으로 알려져 있다. 뇌졸증은 뇌동맥의 경화로 인해 대뇌동맥이 폐쇄되어 뇌신경세포가 손상을 입는 것을 말하는데, 이러한 뇌신경세포 손상의 최종적인 원인물질은 활성산소인 것으로 알려져 있으며 뇌졸증의 발생기작(mechanism)은 글루타메이트로 인해 유발된 신경독성(glutamate-induced neurotoxicity)인 것으로 보고되고 있다. 글루타메이트에 의한 엑시토독성(excitotoxicity)은 뇌졸증이나 뇌의 외상과 같은 급성 뇌질환(acute brain disease) 뿐만 아니라 근 위축성 측쇄경화증(amyotrophic lateral sclerosis; ALS), 파킨슨씨 병(Parkin's disease), 알츠하이머 병(Alzheimer's disease) 및 헌팅톤씨 병(Hunting's disease) 등과 같은 만성 뇌질환(chronic brain disease)에도 관여하는 것으로 알려져 있다.
코일 등(Coyle, J. T.et al.)은 신경세포종(neuroblastoma)과 초기 배 망막(primary embryonic retina)의 혼합 세포(hybrid cell)인 N18-RE-105으로 글루타메이트 세포독성의 기작을 연구하여 퀴스-타입 글루타메이트(quis-type glutamate) 세포독성의 기작은 산화 스트레스(oxidative stress)이며, 활성산소를 제거하는 물질을 이용하면 글루타메이트 세포독성이 억제되어 뇌졸증 등의 뇌질환이 치료될 수 있음을 알아내었다.
이러한 목적으로 세토 등(Seto, H.et al.)은 미생물로부터 생산된, 활성산소를 제거하는 물질인 카퀴노스타틴 A(carquinostatin A)이 N18-RE-105의 글루타메이트 세포독성 저해제임을 알아내었으며, N18-RE-105의 글루타메이트 세포독성을 저해하면서 활성산소를 제거하는 작용을 하는 퀴논계(quinones) 화합물인 이데베논(idebenone)은 현재 일본에서 장기이식 후의 뇌대사 부활제로써 임상시험 중이다.
이와 같은 글루타메이트 세포독성에 의한 뇌신경세포의 손상을 방지하기 위한 치료제가 꾸준히 개발되고 있으며, 그 중에서 미국의 업존사(Upjohn co.)가 개발한 U-74006F라는 21-아미노스테로이드(21-aminosteroid)가 주목받고 있으나 뇌졸증에 대한 효과적인 치료제는 아직까지 개발되고 있지 못한 실정이다.
이에 본 발명자들은 N18-RE-105 세포를 생체외 실험 모델(in vitromodel)로 삼아 활성산소 제해활성을 갖는 뇌신경세포 보호물질을 개발하고자 연구를 계속해오던 중, 토양에서 새로운 스트렙토마이세스 속(streptomyces sp.) 균주를 분리하여 동정한 다음 이를 배양하는 방법을 개발하고 이로부터 N18-RE-105 세포의 글루타메이트 세포독성을 강하게 억제하는 화학식 1 내지 3의 신경세포 보호물질을 확인하여 분리·정제함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 활성산소로부터 신경세포를 보호하는 화학식 1 내지 3의 페나조스타틴 A, B 및 C 화합물 및 그의 제조방법, 상기 화합물을 포함하는 약학적 조성물, 그리고 상기 화합물을 생산하는 스트렙토마이세스 속 균주를 제공하는 것이다.
도 1a 은 본 발명의 화학식 1의 화합물인 페나조스타틴 A의 수소 핵자기 공명(1H-NMR) 스펙트럼 결과를 나타낸 것이고,
도 1b 는 본 발명의 화학식 1의 화합물인 페나조스타틴 A의 적외선(IR) 분광 스펙트럼 결과를 나타낸 것이며,
도 2a 는 본 발명의 화학식 2의 화합물인 페나조스타틴 B의 수소 핵자기 공명(1H-NMR) 스펙트럼 결과를 나타낸 것이고,
도 2b 는 본 발명의 화학식 2의 화합물인 페나조스타틴 B의 적외선(IR) 분광 스펙트럼 결과를 나타낸 것이며,
도 3a 는 본 발명의 화학식 3의 화합물인 페나조스타틴 C의 수소 핵자기 공명(1H-NMR) 스펙트럼 결과를 나타낸 것이고,
도 3b 는 본 발명의 화학식 3의 화합물인 페나조스타틴 C의 적외선(IR) 분광 스펙트럼 결과를 나타낸 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 화학식 1 내지 3으로 표시되는 페나조스타틴 A, B 및 C 화합물 및 그의 약학적으로 허용되는 무기 또는 유기염, 수화물, 용매화물 및 이성질체를 제공한다.
또한, 본 발명은 스트렙토마이세스 속의 균주로부터 화학식 1 내지 3의 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1 내지 3의 화합물을 생산하는 스트렙토마이세스 속의 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1 내지 3의 화합물을 유효성분으로 하는 신경세포 보호용 약학적 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 화학식 1 내지 3으로 표시되는 페나조스타틴 A, B 및 C와 그의 약학적으로 허용되는 무기 또는 유기염, 수화물, 용매화물 및 이성질체를 제공한다.
화학식 1
화학식 2
화학식 3
본 발명은 스트렙토마이세스 속의 균주를 이용하여 상기 화학식 1 내지 3의 페나조스타틴 A, B 및 C 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.
먼저, 화학식 1 내지 3의 화합물을 생산하는 균주를 충청북도 예천의 토양으로부터 채집하고, 미생물의 형태, 각종 배지에서의 생육상태, 생리적 특성 등을 조사하여 스트렙토마이세스 속 균주로 동정하였다.
본 발명은 상기 화학식 1 내지 3의 화합물을 생산하는 모든 스트렙토마이세스 속 균주를 포함한다.
방선균(actinomyces)은 그 제반성질이 일정하지 않아서 균주의 성상이 자연적 또는 인공적으로 용이하게 변화되기 쉽다. 즉, 본 발명의 스트렙토마이세스 속 균주는 일반 방선균주의 경우에서와 같이 그 성상이 변화되기 쉬우며, 따라서 본 발명은 상기 화학식 1 내지 3의 화합물을 생산하는 균주 즉, 스트렙토마이세스 속 833과 이 균주에서 유래된 자연 돌연변이 또는 인공 돌연변이주, 형질전환체 및 유전공학적인 방법에 의하여 얻을 수 있는 인공 변이주 등을 포함한다.
상기 균주 중 하나를 스트렙토마이세스 속 833 균주로 명명하고, 이를 1997년 4월 1일에 한국 과학기술 연구원 부설 생명공학 연구소 유전자원 센터에 기탁하였다 (수탁번호: KCTC 8796 P).
본 발명은 상기 스트렙토마이세스 속 균주를 배양한 다음 그의 대사산물로 터 분리·정제하여 화학식 1 내지 3의 화합물을 얻는다. 구체적으로, 화학식 1 내지 3의 화합물은 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 균주를 배양하고, 균체 및 배양액을 유기용매로 추출한 다음 감압농축하여 얻은 조추출물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(silica gel chromatography) 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)하여 얻는다.
우선 본 발명의 화합물들은 스트렙토마이세스 속 균주를 통상의 미생물이 사용할 수 있는 탄소원 및 질소원이 함유된 영양배지(nutrition medium)에 접종하여 호기적 조건에서 배양하면 상기 미생물 내에서 합성될 수 있다.
이 때 탄소원으로는 글루코오스(glucose), 물엿, 전분(starch), 당밀(molasses), 동물유 또는 식물유(vegitable oil) 등을 사용할 수 있으며, 질소원으로는 대두박, 소맥, 맥아, 면실박, 어박, 콘스팁리커, 육즙, 효모 추출액, 황산암모늄(ammonium sulfate), 질산소다(sodium nitrate) 또는 요소(urea) 등을 사용할 수 있다.
또한, 상기 배지에는 식염, 칼륨, 마그네슘, 코발트, 염소, 인산, 황산 및 기타 이온생성을 촉진하는 무기염류와 균의 생육을 촉진시키고 벤자마이드(benzamides) 및 테트라히드로퀴놀린계(tetrahydroquinolines) 화합물의 생산을 촉진시키기 위하여 유기물 및 무기물을 첨가할 수 있다.
상기 화학식 1 내지 3의 화합물을 대량으로 생산하기 위해서는 통기식 교반 배양법을 사용하는 것이 바람직하며, 소량으로 생산하기 위해서는 플라스크를 이용한 진탕 배양법이 바람직하다. 배양은 대략 20∼37℃에서 실시하는데, 통기식 교반 배양법 또는 진탕 배양법에 따라 약간의 차이가 있지만 대개 26∼30℃에서 배양하는 것이 바람직하다. 또한 진탕배양 및 통기식 교반 배양법을 이용할 때, 배양시간은 배양조건과 그 양에 따라 각각 다르지만 통상적으로 4일 내지 7일 동안 배양하는 것이 바람직한데, 4일 내지 7일 동안 배양하였을 때 균주로부터 페나조스타틴 A, B 및 C 화합물을 가장 많이 얻을 수 있다.
상기에서 배양한 미생물로부터 본 발명의 페나조스타틴 화합물을 분리하기 위해서는 유기용매를 사용하여 효율적으로 추출한 후 정제하는 것이 바람직하다.
본 발명의 페나조스타틴 화합물은 배양액 뿐만 아니라 균체부분에도 존재하므로 하기의 방법에 따라 효율적으로 추출 및 정제하는 것이 바람직하다. 즉, 배양액에 아세톤(acetone) 등과 같은 유기용매를 가하고 교반하여 균체로부터 유효성분을 추출한 뒤 용매를 증발시키고 추출액과 배양액을 다시 헥산(hexane) 등의 용매를 이용하여 추출한다. 이와 같은 방법으로 얻어진 유효성분을 함유하는 헥산 용매층은 감압농축하여 헥산을 제거한 후 조추출물을 얻는데, 조추출물은 헥산-에틸아세테이트(ethyl acetate) 혼합용매(헥산: 에틸아세테이트=4:1∼1:1)로 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography)를 실시하고, 이때 얻어진 활성분획은 재차 고성능 액체크로마토그래피(high performance liquid chromatography; HPLC)를 통하여 본 발명의 화합물을 순수한 상태로 얻을 수 있다.
상기 스트렙토마이세스 속 균주 및 그의 배양액에서 생산된 화합물의 신경세포를 보호활성을 조사하기 위하여, 본 발명에서는 N18-RE-105 신경세포주를 이용하여 그의 L-글루타메이트 세포독성의 저해활성을 분석하였다.
그 결과 본 발명의 페나조스타틴 화합물은 상기 세포주에 대해 탁월한 L-글루타메이트 세포독성의 저해활성을 나타내므로 이들 성분이 신경세포 보호제로 유용함을 확인하였다.
상기 과정을 통하여 제조된 본 발명의 화합물이 치료용 약제로 이용되기 위해서는 약제학적 분야에서 공지의 방법에 의하여 제조될 수 있으며, 그 자체 또는 약학적으로 허용되는 담체(carrier), 부형제(forming agent), 희석제(diluent) 등과 혼합하여 분말, 과립, 정제, 캡슐제 또는 주사제 등의 제형으로 제조되어 사용될 수 있다.
이하, 하기 실시예에서 본 발명을 상세히 설명한다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
〈실시예 1〉화학식 1 내지 3의 화합물의 분리 및 정제
(단계 1) 스트렙토마이세스 속 균주의 배양
스트렙토마이세스 속 833 균주를 배양하기 위하여 pH가 7.3으로 조절된 하기 조성의 생산배지를 제조하여 100㎖ 크기의 삼각 플라스크에 배양액 20㎖를 담아 121℃에서 약 20분 동안 멸균처리 하였다.
배지조성
가용성 전분 1%
글루코오스 2%
대두박 2.5%
육즙 0.1%
효모 추출액 0.4%
소금 0.2%
인산칼륨(Ⅱ) 극소량
멸균 처리된 배지에 상기 스트렙토마이세스 속 833 균주(수탁번호: KCTC 8796 P)를 1 백금이량을 접종하여 28℃에서 3일 동안 진탕배양하여 이것을 1차 종 배양액으로 사용하였다.
500㎖ 크기의 삼각 플라스크에 상기 배양액 100㎖를 담아 121℃에서 약 20분 동안 멸균처리된 배양액에 1차 종배지 5㎖를 접종하여 28℃에서 3일 동안 진탕배양하여 이것을 2차 종배양액으로 사용하였다.
다음, 30ℓ용량의 발효조에 18ℓ의 생산배지를 담아 멸균처리한 후 상기의 제 2차 종배양액 800㎖를 접종하여 28℃에서 통기 18ℓ/분, 초기 각반은 200rpm, 후기 각반은 300rpm인 배양조건에서 5일 동안 배양하였다.
(단계 2) 페나조스타틴 화합물의 분리 및 정제
상기 (단계 1)을 통하여 얻은 스트렙토마이세스 속 833 균주의 배양액(28ℓ)에 30ℓ의 아세톤을 가하고 교반하여 균체로부터 유효성분을 추출하였다. 상기 추출액에서 아세톤을 제거하고 3ℓ의 헥산(hexane)으로 유효성분을 3회 추출한 후 1ℓ의 헥산으로 다시 추출하였다. 이와 같은 방법으로 얻어진, 유효성분이 함유된 헥산용매층은 감압농축하여 헥산을 제거한 후 헥산-에틸아세테이트 혼합용매(헥산: 에틸아세테이트 = 4:1∼1:1)를 전개액으로 사용하여 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 실시하여 헥산-에틸아세테이트(3:1) 혼합용매에서 용출된 활성분획 Ⅱ를 얻었다. 얻어진 활성분획은 감압농축하여 유성의 조유효성분을 얻은 뒤 메탄올 용매로 세파덱스 LH-20 칼럼 크로마토그래피를 실시하여 활성분획을 얻었다.
이 활성분획은 다시 메탄올-증류수(8:2) 혼합용매에서 오디에스 칼럼 크로마토그래피하여 3개의 활성분획으로 분리되었으며, 각각의 활성분획을 메탄올에서 재결정하여 노랑색 결정의 순수한 페나조스타틴 A(0.8㎎), B(8.5㎎) 및 C(2.4㎎)를 얻었다.
〈실시예 2〉벤자스타틴 화합물의 이화학적 특성
실시예 1에서 분리 및 정제된 화학식 1 내지 3의 페나조스타틴 A, B 및 C 화합물의 이화학적 성질을 다음과 같이 규명하였다.
1) 페나조스타틴 A
(1) 물질의 성상 : 노란색 결정
(2) 분자량 : 461
(3) 분자식 : C28H20N4O3
(4) 자외선 흡수 스펙트럼(메탄올 중) UV λmaxnm(ε):
252(86000), 365(18000)
(5) 적외선 흡수 스펙트럼[IR(KBr) ν㎝-1]:
1730, 1440, 1270, 1190
상기 결과는 도 1b 에 나타난 바와 같다.
(6) 수소 핵자기 공명 스펙트럼(1H NMR)
클로로포름(CDCl3)을 용매로, 테트라메틸실란(TMS)를 표준물질로 사용하여 측정하여 도 1a 에 나타난 바와 같은 결과를 얻었다.
(7) 화학식 1
2) 페나조스타틴 B
(1) 물질의 성상 : 노란색 결정
(2) 분자량 : 531
(3) 분자식 : C32H26N4O4
(4) 자외선 흡수 스펙트럼(메탄올 중) UV λmaxnm(ε):
253(89,000), 366(19,000)
(5) 적외선 흡수 스펙트럼[IR(KBr) ν㎝-1]:
1735, 1530, 1280, 1265, 1240, 1190
상기 결과는 도 2b 에 나타난 바와 같다.
(6) 수소 핵자기 공명 스펙트럼(1H NMR)
클로로포름(CDCl3)을 용매로, 테트라메틸실란(TMS)를 표준물질로 사용하여 측정하여 도 2a 에 나타난 바와 같은 결과를 얻었다.
(7) 화학식 2
3) 페나조스타틴 C
(1) 물질의 성상 : 노란색 결정
(2) 분자량 : 502
(3) 분자식 : C30H22N4O4
(4) 자외선 흡수 스펙트럼(메탄올 중) UV λmaxnm(ε):
249(109,000), 365(26,000)
(5) 적외선 흡수 스펙트럼[IR(KBr) ν㎝-1]:
1734, 1435, 1284, 1194, 1240, 1029
상기 결과는도 3b에 나타난 바와 같다.
(6) 수소 핵자기 공명 스펙트럼(1H NMR)
클로로포름(CDCl3)을 용매로, 테트라메틸실란(TMS)를 표준물질로 사용하여 측정하여도 3a에 나타난 바와 같은 결과를 얻었다.
(7)화학식 3
〈실시예 3〉페나조스타틴 A, B 및 C 화합물의 신경세포 보호활성
본 발명의 벤자스타틴 화합물에 대한 신경세포 보호활성은 코일 등의 방법(Coyle, J. T.et al.,J. Pharmacol. Exp. Ther.,1989, 250,1132∼1140)을 이용하여 N18-RE-105 신경세포주에 대한 L-글루타메이트 세포독성을 조사하여 실시하였다. 즉, N18-RE-105 세포는 HAT[티미딘(thymidine) 0.14mM, 아미노프테린(aminopterin) 40mM, 하이포크산틴(hypoxantin) 0.1mM]과 송아지의 태아 혈청(fetal calf serum)이 함유된 DMEM 배지를 공기(95%)와 이산화탄소(CO2, 5%)의 상태를 유지시키면서 37℃에서, 미국의 팰콘사에서 시판되는 T-25 플라스크[T-25 flask(falcon , USA)]에 배양하였다.
N18-RE-105 신경세포의 활성을 측정하기 위하여, 1㎖당 N18-RE-105 세포수가 200,000이 되도록 조절한 뒤 96개의 웰 플레이트[well plate (falcon, USA)]에 웰 당 100㎕씩 분주하여 24시간 동안 배양한 후 각각의 웰에 글루타메이트와 페나조스타틴 A, B 및 C, 비타민 E와 이데베논을 첨가하였다. 시료를 24시간 동안 배양시킨 후 락테이트 디히드로게나아제(lactate dehydrogenase; LDH)의 활성을 측정하여 세포독성을 조사하였다. LDH의 활성은 프로메가(Promega) 사의 시판용 키트를 사용하여 하기와 같이 세포 사멸(cell death)을 계산하여 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
세포 사멸(%) =
A: 상등액의 LDH 활성, B: 조세포액(cell lysates)의 LDH 활성
| 물질 | EC50(μM) |
| 페나조스타틴 A | 0.34 |
| 페나조스타틴 B | 0.33 |
| 페나조스타틴 C | 0.37 |
| 비타민 E | 3.5 |
| 이데베논(idebenone) | 0.7 |
| EC50: N18-RE-105에 대한 글루타메이트 세포독성 저해활성을 나타내는 유효농도(μM) |
상기 표 1에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 페나조스타틴 A, B 및 C는 잘 알려진 항산화물질인 비타민 E와 현재 뇌 신경세포 보호물질로 사용되는 이데베논에 비해 N18-RE-105에 대한 글루타메이트 세포독성 저해활성이 우수함을 알 수 있다.
〈실시예 4〉 페나조스타틴 A, B 및 C 화합물의 지질과산화 저해활성
본 발명의 벤자스타틴 화합물의 지질과산화 저해활성은 비효소적인 측정방법인 Fe++/아스코르베이트법 (Fe++/ascorbate methods, Ohkawa, H.et al.,Anal. Biochem., 1979,95, 351)에 따라 생후 6개월된 웅성 흰쥐(male Sprague-Dawley)의 간으로부터 분리된 마이크로좀을 웰 플레이트에 분주하여 항산화물질이 처리되지 않은 대조군과 각각의 웰에 페나조스타틴 A, B 및 C, 비타민 E와 이데베논이 첨가된 비교군을 제조하고, 마이크로좀의 불포화지방산이 Fe++/아스코르베이트에 의해 산화되어 생성되는 말론디 알데히드의 양을 티오바르비투르산(thiobarbituric acid; TBA)과 반응시킨 뒤 530nm에서 흡광도를 측정하여 각 시료의 항산화활성을 처리되지 않은 대조군과 비교하여 상대적 저해율을 백분율(%)로 나타내어 50%가 저해될 때의 유효농도(EC50)로 표시하였다. 그 결과는 하기 표 2에 나타낸 바와 같다.
| 물질 | EC50(μM) |
| 페나조스타틴 A | 0.51 |
| 페나조스타틴 B | 0.44 |
| 페나조스타틴 C | 0.46 |
| 비타민 E | 3.5 |
| 이데베논(idebenone) | 0.7 |
| EC50: 웅성흰쥐의 마이크로좀에 대한 지질과산화 저해활성을 나타내는 유효농도(μM) |
상기 표 2에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 페나조스타틴 A, B 및 C는 잘 알려진 항산화물질인 비타민 E와 현재 뇌 신경세포 보호물질로 사용되는 이데베논에 비해 세포의 지질과산화 저해활성이 우수함을 알 수 있다.
〈실시예 5〉 토양에서 분리한 미생물의 동정
본 발명의 화합물을 생산하는데 사용된 스트렙토마이세스 속 균주는 충청북도 예천의 토양에서 보통의 방법으로 미생물을 채취하여 분리하였다.
본 발명의 스트렙토마이세스 속 균주의 균학적 특성을 살펴보면 다음과 같다.
(1) 형태적특성
ISP(International Streptomyces Project) 규정에 따라 28℃에서 균주를 14일 동안 배양한 후 광학 현미경 및 전자현미경을 이용하여 균주의 형태적 특성을 조사한 결과, 포자의 연쇄상은 레티나컬티아페르티(retinacultiaperti) 형태를 나타내었으며, 포자의 표면은 매끈하고, 기균사의 성장분기가 비교적 잘 되었으며, 통상의 조건에서는 분단하지 않는 특성이 있었다.
기균사는 글리세롤-아스파라진 한천배지, 펩톤-효모 한천배지, 티로신 한천배지 및 글루코오스-아스파라진 한천배지를 제외한 모든 배지에서 생육이 양호하였으며, 착생 포자의 형성정도도 매우 풍부하였다. 또한, 포자는 실린더형으로 크기는 0.6∼0.7㎛ × 0.9㎛로 보통 10개 정도의 연쇄상으로 구성되었다.
(2) 각종 배지조건에 따른 배양학적 특성
각종 ISP 배지에 본 발명의 균주를 넣고 28℃의 온도조건에서 14일 동안 배양한 후 균주의 배양학적 특성을 조사하여 하기 표 3에 나타내었다. 본 발명의 균주의 생육정도는 글리세롤-아스파라진한천 배지, 펩톤-효모 한천배지, 티로신 한천배지 및 글루코오스-아스파라진 한천배지를 제외한 모든 배지에서 양호한 것으로 나타났다. 또한, 기균사는 대부분의 배지에서 흰색 또는 회백색 빛을 띄었고, 배지 뒷면은 갈색 빛을 띄었으며, 수용성 색소는 모든 배지에서 무색을 나타냈다.
각종 배지조건에 따른 배양학적 특성
| 배지의 종류 | 기생균사의 생육 및 색상 | 기질균사의 생육 및 색상 | 배지뒷면의 색상 | 수용성 색소 | ||
| 생육정도 | 색상 | 생육정도 | 색상 | |||
| 효모-맥아한천 배지(ISP2) | 양호 | 회백색 | 양호 | 연노랑 | 갈색 | 무색 |
| 오트밀 한천 배지(ISP3) | 양호 | 흰색 | 양호 | 연노랑 | 연갈색 | 무색 |
| 무기염류-전분 한천 배지(ISP4) | 양호 | 흰색 | 양호 | 연갈색 | 갈색 | 무색 |
| 글리세롤-아스 파라진한천 배지(ISP5) | 불량 | 회백색 | 보통 | 갈색 | 연갈색 | 무색 |
| 펩톤-효모 한천배지(ISP6) | - | - | 보통 | 연노랑 | 갈색 | 무색 |
| 티로신 한천배지(ISP7) | 불량 | 회백색 | 보통 | 연갈색 | 갈색 | 무색 |
| 글루코오스-아스파라진 한천배지 | 불량 | 회백색 | 보통 | 연갈색 | 갈색 | 무색 |
| 벤넷 한천배지 | 양호 | 회백색 | 양호 | 갈색 | 진한 갈색 | 무색 |
(3) 균주의 생리적 특성
본 발명의 균주의 생리적 특성은 쉴링-거트리브 한천배지를 사용하여 28℃의 온도에서 14일 동안 균주를 배양한 후 전분 가수분해능, 젤라틴 액화능, 수용성 색소 생성능, 밀크 펩톤화, 나이트레이트 환원력, 멜라닌 색소의 형성능, 스킴밀크 가수분해능, 식염내성 및 생육온도 등을 조사하여 하기 표 4에 나타낸 바와 같은 결과를 얻었다.
| 조사항목 | 특성 |
| 전분 가수분해 | 양성 |
| 젤라틴 액화 | 양성 |
| 수용성 색소생성 | 음성 |
| 밀크 펩톤화 | 음성 |
| 나이트레이트 환원력 | 양성 |
| 멜라닌 색소생성 | 음성 |
| 스킴밀크 가수분해 | 양성 |
| 식염내성 | 7% 이하 |
| 생육온도 | 10∼34℃ |
| 최적생육온도 | 25∼28℃ |
| 세포벽 DAP 분석 | L,L형 |
(4) 균주의 탄소 이용성
본 발명의 균주의 탄소 이용성은 쉴링-거트리브 한천배지를 사용하여 28℃의 온도에서 14일 동안 균주를 배양한 후 조사하여 하기 표 5에 나타낸 바와 같은 결과를 얻었는데, 본 발명의 균주는 14 종류의 탄소원 중에서 D-글루코오스, 셀로비오스, 갈락토오스, 이노시톨, D-만니톨, 라피노스 및 D-자이로스를 이용하는 것으로 나타났다.
| 당(susar) | 탄소 이용성 |
| D-글루코오스(D-glucose) | 양성 |
| L-아라비노오스(L-arabinose) | 음성 |
| 셀로비오스(cellobiose) | 양성 |
| D-프룩토오스(D-fructose) | 음성 |
| 갈락토오스galactose) | 양성 |
| 이노시톨(inositol) | 양성 |
| D-만니톨(D-mannitol) | 양성 |
| 라피노오스(raffinose) | 양성 |
| 람노오스(rhamnose) | 음성 |
| 수크로오스(sucrose) | 음성 |
| D-자이로스(D-xylose) | 양성 |
| 셀룰로오스(cellulose) | 음성 |
(5) 균체의 성분
본 발명에 포함되는 균주의 균체 세포벽 성분을 벡커의 방법(Becker, B.et al.,Applied Microbiology, 12, 1964, 421∼423)에 의해 조사한 결과 본 발명에 포함되는 균체의 가수분해 성분인 디아미노피멜린산(diaminopimellic acid)은 L,L형이었다.
상기한 본 발명에 포함되는 균주의 형태학적, 배양학적, 생리학적 특성, 탄소 이용성 및 균체 성분 등을 조사한 결과, 본 균주를 스트렙토마이세스 속 균주로 동정하고 본 발명의 균주를 스트렙토마이세스 속 833 균주로 명명하여 한국과학기술연구원 생명공학 연구소 유전자원센터에 1997년 4월 1일자로 기탁하였다 (수탁번호: KCTC 8796 P).
본 발명의 스트렙토마이세스 속 833 균주는 일반 방선균주와 같이 인공적 또는 자연적으로 그 제반성질이 용이하게 변화될 수 있다. 따라서, 본 발명에는 스트렙토마이세스 속 833 균주와 이 균주에서 유래된 자연 돌연변이 또는 인공 돌연변이주, 형질전환체 또는 유전공학적인 방법에 의하여 새롭게 만들어진 균주가 포함된다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 화학식 1 내지 3의 화합물 및 그의 약학적으로 허용되는 무기 또는 유기염, 수화물, 용매화물 및 이성질체는 신경세포 보호활성이 우수한 물질로서, 뇌졸증 등의 뇌질환으로 인해 손상되기 쉬운 뇌신경세포를 보호하고 손상된 뇌신경세포를 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 제조방법에 따라 스트렙토마이세스 속 균주를 배양하고 분리하면 본 발명의 화합물을 효율적으로 제조할 수 있다.
Claims (8)
- 화학식 1로 표시되는 페나조스타틴(phenazostatin) A 화합물 및 그의 약학적으로 허용되는 무기 또는 유기염, 수화물, 용매화물 및 이성질체.화학식 1
- 화학식 2로 표시되는 페나조스타틴 B 화합물 및 그의 약학적으로 허용되는 무기 또는 유기염, 수화물, 용매화물 및 이성질체.화학식 2
- 화학식 3으로 표시되는 페나조스타틴 C 화합물 및 그의 약학적으로 허용되는 무기 또는 유기염, 수화물, 용매화물 및 이성질체.화학식 3
- 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 균주를 배양하고, 균체 및 배양액을 유기용매로 추출한 다음 감압농축하여 얻은 조추출물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(silica gel chromatography) 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)하여 화학식 1 내지 3의 화합물을 얻는 페나조스타틴 A, B 및 C 화합물의 제조방법.
- 제 4항에 있어서, 균체를 아세톤(acetone) 및 헥산(hexane)으로 추출한 다음 다시 추출액을 배양액과 함께 헥산으로 추출하여 얻은 조출물은 헥산-에틸아세테이트(ethyl acetate) 혼합용매(헥산: 에틸아세테이트 = 4:1∼1:1)를 이용하여 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 실시하는 것을 특징으로 하는 페나조스타틴 A, B 및 C 화합물의 제조방법.
- 토양에서 분리된 제 1항의 화합물을 생산하는 스트렙토마이세스 속 균주.
- 제 6항에 있어서, 스트렙토마이세스 속 833 균주(수탁번호: KCTC 8796 P).
- 제 1항의 페나조스타틴 A, B 및 C 화합물을 유효성분으로 함유하는 신경세포 보호용 약학적 조성물.
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