KR100663188B1 - 신규한 헵타트리에노산으로 치환된 이중환 케톤 유도체 및이를 포함하는 약제학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 헵타트리에노 산으로 치환된 이중환 케톤 유도체 및 이를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 항혈관신생 활성을 나타내는 신규한 헵타트리에노산 (heptatrienoic acid)으로 치환된 이중환 케톤 유도체 및 이를 포함하는 비조절된 혈관신생-관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

신규한 헵타트리에노산으로 치환된 이중환 케톤 유도체 및 이를 포함하는 약제학적 조성물{NOVEL HEPTATRIENOIC ACID SUBSTITUTED BICYCLIC KETONE DERIVATIVE AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS COMPRISING THE SAME}

본 발명은 신규한 헵타트리에노산 (heptatrienoic acid)으로 치환된 이중환 케톤 유도체 (bicyclic ketone derivative)및 이를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 항혈관신생 활성을 나타내는 신규한 헵타트리에노산으로 치환된 이중환 케톤 유도체 및 이를 포함하는 비조절된 혈관신생-관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

혈관신생, 즉, 새로운 혈관의 성장은 다수의 생리학적 과정 예컨대 배아 발생, 상처의 치유 및 조직 또는 기관의 재생에 매우 중요하다 (Iwaguchi, T. 1993. Angiogenesis and its regulation. Gan To Kagaku Ryoho20:1-9.; Kuwano, M. et al., 2001. Angiogenesis factors. Intern. Med.40:565-572.; & Tobelem G. 1990. Endothelial cell growth: biology and pharmacology in regulation to angiogenesis. Blood Coagul. Fibrinolysis1:703-705.). 하지만, 지속적인 비조 절된 혈관신생은 혈관신생성 질환 예컨대 류마티스 관절염, 당뇨성 망막증, 고형 종양, 혈관종 및 건선을 초래한다 (Andre, T., et al., 1998. Tumoral angiogenesis: physiopathology, prognostic value and therapeutic perspectives. Rev. Med. Interne.19:904-9134; Battegay, E. J. 1995. Angiogenesis: mechanistic insights, neovascular diseases, and therapeutic prospects. J. Mol. Med. 73: 333-346; Carmeliet, P. and R. K. Jain. 2000. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature 407:249-257; & Fidler, I. J. 2000. Angiogenesis and cancer metastasis. Cancer J. Sci. Am. 2:134-141).

혈관신생 과정은 다단계로 구성되며, 종양 사이토카인, 혈관내피성장인자 (VEGF) 및 염기성섬유아세포성장인자 (bFGF)에 의한 내피 성장 자극 단계, 메탈로프로테이나아제 (metalloproteinases)에 의한 세포외 매트릭스 단백질의 분해 단계, 세포막 접착분자에 의하여 매개되는 내피세포의 이동 단계, 내피세포 증식 단계 및 관 형성 단계와 같은 단계로 구성된다 (Bussolino, F. et al., 1997. Molecular mechanisms of blood vessel formation. Trends Biochem. Sci. 22:251-256; Kuwano, M. et al., 2001. Angiogenesis factors. Intern. Med. 40:565-572; & Risau, W. 1994. Angiogenesis and endothelial cell function. Arzneimittelforschung 44:416-417). 따라서, 상기 과정의 억제는 암 및 혈관신생과 관련된 기타의 인간 질환의 치료를 위한 유망한 새로운 전략으로 대두되고 있다.

신규한 다양한 종류의 혈관신생 억제제가 이와 같은 목적을 위하여 개발되고 있다. 천연에서 유래된 또는 합성된 억제제들로는 프로테아제 억제제, 티로신 키나아제 억제제, 케모킨, 인터루킨 및 매트릭스 단백질의 단백질분해성 단편 등이 있다 (Abedi, H. and I. Zachary. 1997. Vascular endothelial growth factor stimulates tyrosine phosphorylation and recruitment to new focal adhesions of focal adhesion kinase and paxillin in endothelial cells. J. Biol. Chem. 272: 15442-15451; Cao, Y. 2001. Endogenous angiogenesis inhibitors and their therapeutic implications. Int. J. Biochem. Cell Biol. 33: 357-369; Fong, T. A et al., 1999. SU5416 is a potent and selective inhibitor of the vascular endothelial growth factor receptor (Flk-1/KDR) that inhibits tyrosine kinase catalysis, tumor vascularization, and growth of multiple tumor types. Cancer Res.59:99-106; & Kwon, H. J. et al., 2001. Anti-angiogenic activity of acalycixenolide E, a novel marine natural product from Acalycigorgia inermis. J. Microbiol. Biotechnol. 11:656-662). 이러한 항혈관신생성 분자들은 복수의 경로에 작용을 하며, 내피세포 증식, 이동, 프로테아제 활성 및 혈관 형성 등에 대한 억제 작용뿐만 아니라 세포자살 (apoptosis)의 유도에도 작용한다 (Folkman, J. and D. Ingber. 1992. Inhibition of angiogenesis. Semin. Cancer Biol. 3:89-96; Kishi, K. et al., 2000. Recent studies on anti-angiogenesis in cancer therapy. Nippon Rinsho 58:1747-1762; & Marme, D. 2001. Tumor angiogenesis: new approaches to cancer therapy. Onkologie 1:1-5). 이 분자들 중 많은 수에 대한 항혈관신생 기능이 인 비트로 및 인 비보에서 충분히 보고되고 있으며, 일부 는 임상실험 단계에서 시험되고 있다 (Deplanque, G. and A. L. Harris. 2000. Anti-angiogenic agents: clinical trial design and therapies in development. Eur. J. Cancer 36:1713-1724; Liekens, S. E. D. Clercq, and J. Neyts. 2001. Angiogenesis: regulators and clinical applications. Biochem. Pharmacol.61:253-270; & Mross, K. 2000. Anti-angiogenesis therapy: concepts and importance of dosing schedules in clinical trials. Drug Resist. Updat. 3: 223-235). 예를 들어, 마리마스타트, 네오바스타트 및 AG-3340은 세포 침입 (cell invasion)에 대한 합성 억제제이고 (Jia, M. C. et al., 2000. Suppression of human microvascular endothelial cell invasion and morphogenesis with synthetic matrixin inhibitors. Targeting angiogenesis with MMP inhibitors. Adv. Exp. Med. Biol.476:181-194), 비타신은 세포접착을 억제하며, TNP-470, 탈리도미드 및 콤브레타스타틴 A-4는 세포 증식을 억제하고 (Damato, R. et al., 1994. Thalidomide is an inhibitor of angiogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4082-4085; & Stern, J. W. et al., 2001. Angiogenesis inhibitor TNP-470 during bone marrow transplant: safety in a preclinical model. Clin. Cancer Res. 7:1026-1032), 인터페론-알파, 수라민 및 이의 유도체는 혈관신생 성장인자들을 억제하며, SU6668 및 SU5416은 상기 인자들의 수용체를 억제하고 (Ingber, D. et al., 1990. Synthetic analogues of fumagillin that inhibit angiogenesis and suppress tumor growth. Nature 348:555-557), 그리고, 엔도스타틴 및 인터루킨-12는 혈관신생에 대한 내생성 억제제 (Boehm, T. et al., 1997. Endostatin: an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. Cell 88:277-285)로서 다양한 고형 종양에 대한 임상실험 단계에 있다.

상기 화합물 및 펩티드 중에서 임상적인 접근이 수행된 물질들은 주로 합성된 화합물인데, 미국특허 제 5,908,930 호는 티로신 인산화 효소를 억제하는 화합물 및 이를 포함하는 약제학적 조성물을 개시하고 있다. 미국특허 제 5,846,562 호는 항혈관신생성 질병의 치료에 효과적인 퓨마길롤 유도체 (fumagillol derivative)를 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물을 개시하고 있으며, 미국특허 제 5,994,388 호는 사이토칼라신 (cytochalasin) 및 이소인돌리논 (isoindolinone)의 유도체들을 유효성분으로 포함하는 항혈관신생 제제를 개시하고 있고, 미국특허 제 6,228,879 호는 혈관신생 및 혈관신생 질환의 발병을 억제할 수 있는 신규한 화합물인 EM-138을 개시하고 있다. 대한민국 특허공개 제 2001-98524호는 해면동물로부터 추출한 원도닌 A가 혈관신생을 억제함을 시사하고 있다. 합성된 화합물뿐만 아니라, 몇몇 펩티드들도 임상적인 접근이 수행되고 있는데, 대한민국 특허공개 제 2000-5903호는 살모사의 독으로부터 추출한 신규한 펩티드인 살모신이 혈관신생을 저해할 수 있으므로 항암제로서 사용할 수 있음을 개시하고 있고, 대한민국 특허공개 제 2001-53018 호는 혈관신생을 억제하는 단백질에 관하여 개시하고 있다.

수개의 화합물 및 펩티드가 상술한 것처럼 항혈관신생제로 개발되고 있지만, 공지된 억제제와 관련없는 구조를 갖는 신규한 항혈관신생성 화합물은 신규한 항혈관신생 치료제의 개발에 대해서 뿐만 아니라, 항혈관신생 연구의 화학 유전학적 접 근에 유용한 도구로서 가치가 있을 것이다.

이에 기초하여, 본 발명자는 미생물의 대사물로부터 항혈관신생 활성을 갖는 저분자량의 화합물을 검색하였고, 그 결과, 본 발명자는 엠벨리시아 클라미도스포라 배양 추출물에서 얻은 신규한 화합물이 강력한 항혈관신생성 화합물임을 확인하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌 및 특허 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌 및 특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

따라서, 본 발명의 목적은 신규한 헵타트리에노산 치환된 이중환 케톤 유도체 (heptatrienoic acid substituted bicyclic ketone derivative)를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 신규한 화합물을 유효 성분으로 포함하는 비조절된 혈관신생-관련 질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 첨부된 청구범위 및 도면과 함께 이하의 상세한 설명에 의해 명확하게 된다.

본 발명의 일 구현예에 의하며, 본 발명은 하기 화학식 I로 표시되는 신규한 헵타트리에노산 치환된 이중환 케톤 유도체를 제공한다:

화학식 I

본 발명의 화합물은 균류인 엠벨리시아 클라미도스포라 (Embellisia chlamydospora)로부터 분리되거나 화학적으로 합성된다. 엠벨리시아 클라미도스포라로부터 본 발명의 화합물을 분리 및 정제하는 방법은 공지된 다양한 정제 방법을 통하여 할 수 있다. 본 발명의 유도체를 분리 및 정제하는 것은 실시예 3에 예시되어 있다.

상기 화학식 I로 나타내는 본 발명의 화합물 구조의 핵 (nucleus)에는 몇 개의 비대칭 탄소 중심이 있고, 따라서, 본 발명의 화합물의 모든 입체 이성질체는 본 발명의 범위에 포함된다는 것은 당업자에게 명확하다. 자연에서 분리되는 본 발명의 화합물은 대체적으로 하나의 특정 입체 이성질체로서 광학적으로 활성을 나타내는 것이지만, 화학적으로 본 발명의 화합물을 합성하는 경우에는 라세미체가 통상적으로 생성된다. 따라서, 라세미체도 본 발명의 범위에 포함될 것이다.

본 발명의 화합물은 생물학적 특징으로서 항혈관신생 활성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 화합물은 비조절되는 (unregulated) 혈관신생과 관련된 질병 또는 질환의 치료 또는 예방에 탁월하다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 약제학적 유효량의 하기 화학식 I로 표시되는 신규한 헵타트리에노산 치환된 이중환 케톤 유도체 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 비조절된 혈관신생과 관련된 질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공한다:

화학식 I

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 화학식 I의 유도체를 유효성분으로 포함하므로, 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 중복된 내용은 그 기재를 생략한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 현관신생을 효과적으로 억제하여 혈관신생-관련 질환의 치료 또는 예방의 용도를 갖는다. 보다 상세하게는, 본 발명의 약제학적 조성물은 혈관신생 단계에서 내피세포의 증식 및 분화를 억제하며, 이러한 사실은 하기 실시예에 예시되어 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 비조절된 혈관신생 관련 질환으로서 본 발명의 조성물을 이용하여 치료 또는 예방할 수 있는 질환은 류마티스 관절염, 당뇨성 망막염, 암, 혈관종 또는 건선이다. 보다 바람직하게는, 상기 비조절된 혈관신생 관련 질환은 암이다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제, 향료, 향수 및 윤활제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 음식, 투여 시간, 환자의 상태, 약물 조합, 반응 감응성 및 병의 정도와 같은 요인들에 의해 다양하다. 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-100 ㎎/㎏이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태 등으로 제조될 수 있다. 이때 제형은 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 일릭서제, 분말, 과립제, 정제, 캅셀제, 리니먼트제, 로션, 및 연고제 형태일 수도 있다.

이하 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 첨부된 청구의 범위에 의하여 정의되는 본 발명의 범위를 이들 실시예에 의해 제한하는 것은 아니다.

도 1은 엠벨리시아 클라미도스포라 배양 추출물에 의한 BAECs (bovine aortic endothelial cell)의 관 형성 억제를 보여주는 사진:

(A) 대조군 (B) bFGF 단독 및 (C) bFGF와 엠벨리시아 클라미도스포라 배양 추출물 (20 ㎍/ml).

도 2는 본 발명의 신규 화합물을 생성하는 엠벨리시아 클라미도스포라의 세포 형태를 보여주는 사진: 약간 다른 형태의 분생자 (conidia) (화살표는 발아된 세포를 나타낸다), (B) 분생자병 (conidiophores) 상의 자국 (화살표), (C) 인공 배지 (PDA) 상의 하이팔 코일 (Hyphal coil), (D) 초기 균사 성장, (E) 응집된 빽빽한 균사괴 (mycelial mass) 및 (F) 인공 배지, PDA, 상의 엠벨리시아 클라미도스포라의 데마티아과 균사체 (dematiaceous mycelia) 및 짙은 갈색의 유협포자.

도 3은 엠벨리시아 클라미도스포라로부터 항혈관신생 화합물의 정제과정을 보여주는 모식도이다.

도 4는 BAEC, 정상 (CHANG) 및 암 (HT29, HepG2, C8161, HT1080, HeLa) 세포주의 성장에 대한 본 발명의 이중환 케톤 유도체의 영향을 보여주는 그래프이다.

도 5는 BAECs의 관 형성에 대한 본 발명의 이중환 케톤 유도체의 억제 효과를 보여주는 그래프이다.

도 6은 BAECs의 침입에 대한 본 발명의 이중환 케톤 유도체의 억제 활성을 보여주는 현미경 관찰결과를 나타낸다.

도 7은 BAECs의 침입에 대한 본 발명의 이중환 케톤 유도체의 저해 활성을 보여주는 현미경 관찰결과를 나타낸다.

시료

이하 실시예에서 사용한 시료는 상업적으로 구입하였다:

실리카 겔은 머크사 (독일연방공화국)로부터 구입하였고, 모든 용매는 분석용 등급 또는 1 등급이었다. 염기성섬유아세포성장인자 (bFGF)는 업스테이트 바이오텍크놀로지사 (Lake Placid, NY)에서 구입하였다. MEM, DMEM 및 RPMI1640은 라이프 텍크놀로지사 (Grand Island, NY)에서 구입하였다. 마트리겔 및 트랜스웰 플레이트는 콜래보러티브 바이오메디칼 프로덕트사 (Bedford, MA) 및 코닝 코스타사 (Cambridge, MA)에서 각각 구입하였다. 젤라틴 타입 B를 시그마사 (St. Louis, MO)로부터 구입하였다.

실시예 1: 항혈관신생성 화합물을 생산하는 미생물의 검색

실시예 1-1: 미생물 라이브러리로부터 배양 추출물의 제조

본 검색에서 사용된 미생물들 (균류)을 세계의 다양한 지역의 토양으로 분리하였다. 희석된 용액 100 ㎕를 PDA 또는 L·O 배지에 살포하고 7일 동안 28℃에서 배양하였다. 그 다음, 각각의 콜로니를 MEA (malt extract agar) 배지로 옮기고, 7일 동안 28℃에서 배양하였다. 분리 균주를 25 ㎖의 YpSs (글루코오스 (20 g/L), 효모 추출물 (2 g/L), 펩톤 (5 g/L), MgSO₄ㆍ7H₂O(0.5 g/L), KH₂PO₄(1 g/L, pH 5.6-5.8) 배양 배지를 포함하고 있는 250 ㎖의 주름진 플라스크에서 접종하고 145 rpm의 회전 교반기에서 7일 동안 28℃에서 배양하였다. 그 다음, 배양액 (culture broth)을 동일한 부피의 아세톤으로 추출하였다.

실시예 1-2: 항혈관신생성 화합물을 생산하는 미생물의 검색 (관 형성 분석)

수 개의 미생물 배양 추출물을 시험하여 항혈관신생성 화합물을 생산하는 미생물의 검색하였다. 이를 위하여 관 형성 분석을 실시하였다. 마트리겔 (10 ㎎ /㎖) 150 ㎕를 48 웰 배양 플레이트에 도포하고 2시간 동안 37℃에서 중합시켰다. BAECs (bovine aortic endothelial cells, ATCC, 1x 10⁵ 세포)를 상기 마트리겔 표면 위에 접종하고 bFGF (basic fibroblast growth factor, 30 ng/㎖)로 처리하였다. 그 다음, 미생물 배양 추출물 (20 ㎍/㎖)을 첨가하고 6-18 시간 동안 배양하였다. 세포의 형태적 변화를 현미경 하에서 관찰하고 ImagePro Plus 소프트웨어 (Media Cybernetics, Inc.)를 사용하여 40배 배율로 사진찰영하였다. 관-형성 내피세포의 세포독성을 프리판 블루 (trypan blue) 염색으로 측정하였다. 실험은 독립적으로 2회 반복하였다. 결과적으로, 균류 (fungus)인 엠벨리시아 클라미도스포라 (Embellisia chlamydospora)로부터 얻은 배양 추출물이 bFGF에 의하여 유도되는 내피세포의 관 형성을 강력하게 억제하였다 (도 1).

실시예 1-3: 엠벨리시아 클라미도스포라 변종의 분류학적 연구

상기 변종 (strain)의 생화학적 그리고 생리학적 성질을 "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology"에 따라 실험하였으며, 탄소원의 활용을 포함하는 생리학적 성질을 Shirling 및 Gottlieb의 방법에 따라 실험하였다 (Kwon, H. J. et al., 2001. Anti-angiogenic activity of acalycixenolide E, a novel marine natural product from Acalycigorgia inermis. J. Microbiol. Biotechnol. 11:656-662). 엠벨리시아 클라미도스포라의 세포 형태를 광학현미경 하에서 관찰하였으며, 도 2에 나타내었다.

실시예 2: 유기체 및 배양 조건

실시예 2-1: 엠벨리시아 클라미도스포라 의 배양

엠벨리시아 클라미도스포라의 스톡배양 (stock culture)을 MEA 배지 플레이트 (글루코오스 20 g/L, 맥아 추출물 20 g/L, 펩톤 1 g/L, 한천 18 g/L)에서 28℃에서 유지하였다. 시드 배양 (seed cultivation)을 위하여, 스톡플레이트의 한천 조각을 멸균 조건 하에서 잘라내고 밀기울 (wheat bran) 배지 (밀기울 50 g /50 ㎖)를 포함하는 1 L의 원추형 플라스크에 접종하였다. 3일 동안 28℃에서 배양한 시드를 대단위 배양을 위하여 밀기울 배지 (밀기울 100 g /100 ㎖)를 포함하는 원추형 플라스크당 5-6 스푼씩 첨가하여 하였고, 총 10 플라스크를 7일 동안 28℃에서 배양하였다.

실시예 2-2: 세포주 및 배양 조건

HT-29 결장암 세포 및 BAECs를 10%의 FBS (fetal bovine serum)를 포함하는 RPMI 및 MEM에서 각각 배양하였다. CHANG-간 정상, HepG2 인간 간암, HT1080 섬유육종, C8161 흑색종 및 HeLa 자궁경부암 세포들을 10% FBS, 5.5 ㎖ 페니실린/스트렙토마이신 및 NaHCO₃을 포함하는 DMEM에서 5% CO2 및 95% 공기 하에서 37℃에서 배양하였다.

실시예 3: 엠벨리시아 클라미도스포라 로부터 항혈관신생 화합물의 분리 및 정제

엠벨리시아 클라미도스포라로부터 활성 화합물의 정제 과정이 도 3에 나타나 있다. 밀기울 배지 내의 성장한 균사체 (mycelium) (1 ㎏)을 5 부피의 아세톤으로 24시간 동안 추출하고 여과지 (Whatman, 3 mm)로 여과하였다. 여과액을 진공 농축하고 동일한 부피의 에틸아세테이트로 추출하였다. 에틸아세테이트를 진공 농축하고 그 다음 실리카 겔 (Merck silica gel 60) 칼럼 크로마토그래피 (6 x 17 ㎝)에 처리하였으며, CHCl₃으로 준비되었다. CHCl₃:MeOH (9:1)로 용출되는 활성 분획들을 수집하여, 증발시키고 제조용 박막 크로마토그래피 (silica gel 60 F254)에 처리하였으며, 용매시스템으로 CHCl₃: MeOH (8:2)을 사용하였다. 활성 화합물을 C18 역상 칼럼 (Shiseido Co., Japan, semi-preparative UG 120Å, 10 mm x 250 mm)을 사용하여 HPLC로 정제하였으며, 0.1% TFA에서 70% 아세토니트릴로 용출하였다. 활성 화합물은 황색 오일로 수득되었으며, 화합물의 순도는 HPLC로 확인하였다. 활성 화합물의 분자식은 고해상 질량 데이터 (MW 396.52)에 기초하여 C₂₅H₃₂O₄이었다.

실시예 4: 항혈관신생성 화합물의 화학 구조의 결정

NMR 스펙트럼을 CD₃OD 용매에서 ¹H에 대해서는 500 MHz, ¹³C에 대해서는 125MHz로 Varian Unity 500 분광기를 사용하여 기록하였다. 모든 화학적 이동 (chemical shift)은 MeOH (3.30/49.50 ppm)을 기초로하여 δ(ppm)으로 기록되었으며, 내부 표준으로 TMS를 사용하였다. Mass 스펙트럼은 Jeol JMS-HX 110 고해상도 질량 분광기로 수집하였다. 사용된 모든 용매는 스펙트럼 급이거나 사용전 유리에서 재증류된 것을 사용하였다.

정제된 항혈관신생성 화합물의 NMR 데이터는 표 1에 나타나있다:

정제된 항혈관신생성 화합물의 생리화학적 특성은 표 2에 나타나있다:

따라서, 정제된 항혈관신생성 화합물은 화학식 I의 신규한 헵타트리에노산 치환된 이중환 케톤 유도체로 동정되었으며, "엠벨리스타틴 (embellistatin)"으로 명명하였다.

실시예 5: 엠벨리스타틴의 항혈관신생 활성

실시예 5-1: 다양한 세포주의 성장에 대한 엠벨리스타틴의 효과

본 발명자들은 우 대동맥 내피세포 (BAECs)를 포함하는 다양한 세포주의 성장에 대한 엠벨리스타틴의 효과를 MTT (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸리움 브로미드) 비색 분석법으로 조사하였다. 세포를 웰당 5x10³의 밀도로 96-웰 배양 플레이트에 접종하고 안정화를 위하여 24시간 동안 배양하였다. 다양한 농도의 엠벨리스타틴을 각각의 웰에 첨가하고 3일 동안 배양한 후, MTT 분석을 실시하였다. 50 ㎕의 MTT (2 ㎎/㎖ 스톡용액; 시그마사, St. Louis, MO)를 첨가하고 상기 플레이트를 추가적으로 4시간 동안 배양하였다. 배지를 제거한 후, 100 ㎕의 DMSO를 첨가하였다. 상기 플레이트를 540 nm에서 보편적인 미크로플레이트 리더 (Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski, VT)로 판독하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 엠벨리스타틴은 각각의 세포주의 증식을 다른 성장 억제 스펙트럼으로 저해하였다. 주목할 만 하게도, 엠벨리스타틴은 정상 (CHANG) 세포주 라인의 성장보다 BAECs 및 암 (HT29, HepG2, C8161, HT1080, HeLa) 세포주 라인의 성장을 강력하게 억제한다. 이러한 데이터는 엠벨리스타틴이 내피세포 성장을 억제함으로써 항혈관신생 활성을 나타낼 수 있다는 것은 시사한다. 내피세포의 생존성은 5 ㎍/㎖까지의 엠벨리스타틴 처리에 대하여 영향을 받지 않았으며, 이는 도 4에서 보여지는 엠벨리스타틴의 생장 억제 활성은 상기 화합물의 단순한 세포독성에 의한 것이 아님을 의미한다.

실시예 5-2: 내피세포의 관 형성에 대한 엠벨리스타틴의 효과

관 내피세포는 빠른 인 비트로 분화가 일어나서 모세관과 같은 구조를 형성하며, 이는 세포-매트릭스 상호작용, 세포간 연락 및 세포 이동성을 요구하는 내피 분화 과정에 대한 시료의 영향을 평가할 수 있는 간단한 분석법 (실시예 1-2에 기재)을 제공한다. 마트리겔 층상에 배양된 BAECs는 혈관신생 인자의 부재 시에는 보통은 불완전하고 협소한 관-유사 구조를 형성한다. 하지만, bFGF와 같은 혈관신생 인자의 처리에 의하여 모세관 네트워크 형성이 보다 자극을 받으며, 그 결과, 연장되고 튼튼한 관-유사 구조가 생기며, 이는 대조군에 비하여 매우 많은 수의 세포에 의하여 조직되어있다 (도 5A 및 B). 이 과정에 대한 엠벨리스타틴이 효과를 실험하기 위하여, bFGF에 의하여 자극된 BAECs를 엠벨리스타틴으로 처리하였다. 도 5C는 엠벨리스타틴이 효과적으로 bFGF에 의하여 유도된 관 형성을 억제하는 것을 보여준다. 이들 세포는 트리판 블루로 염색되지 않으며, 이는 엠벨리스타틴에 의한 관 형성의 억제는 세포에 대한 단순한 세포독성에 기인하지 않음을 의미한다.

실시예 5-3: BAECs 침입에 대한 엠벨리스타틴의 효과

혈관신생의 또 다른 중요한 특징으로서, 새로운 혈관을 형성하기 위해서는 이동 내피세포들이 그들의 기저막을 깨고 통과하여야 하며, bFGF는 이러한 내피세포 침입을 자극한다. 따라서, 본 발명자는 인 비트로에서 내피세포 침입에 대한 엠벨리스타틴의 효과를 트랜스웰 챔버 시스템을 사용하여 조사하였다. 상기 시스템은 폴리카르보네이트 필터 삽입물을 갖추었으며, 상기 필터 삽입물은 비-침입성 세포의 이동을 저지하는 마트리겔로 도포하였다. 필터의 하부를 10 ㎕의 젤라틴 (1 ㎍/㎕)으로 도포하고 상부를 10 ㎕의 마트리겔로 도포하였다. bFGF (30 ng/㎖), BSA 및 엠벨리스타틴을 600 ㎕의 MEM에 놓인 하부 웰에 첨가하였다. BAECs (1x10⁵ 세포)를 필터의 상부에 놓은 후, 챔버를 18 시간 동안 37℃에서 배양하였다. 세포를 70%의 메탄올로 고정하고 헤마톡실린/에오신으로 염색하였다. 세포 침입은 단일 필터에서 전체 세포수를 계수하여 결정하였으며, 광학 현미경을 사용하였고, ImagePro Plus 소프트웨어로 40배 배율로 사진촬영하였다. 실험은 독립적으로 2회 반복되었다. 도 6 및 7은 엠벨리스타틴 (5 ㎍/㎖)이 BAECS의 bFGF-자극된 침입을 상당하게 억제하는 것을 보여준다. 이 데이터는 엠벨리스타틴이 인 비트로에서 내피세포의 혈관신생을 억제하는 것을 나타내는 것이다.

Claims (5)

1. 하기 화학식 I로 표시되는 헵타트리에노산 치환된 이중환 케톤 유도체를 유효성분으로 포함하며, 류마티스 관절염, 당뇨성 망막염, 암, 혈관종 또는 건선으로부터 선택되는 혈관신생-관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:

   화학식 I

   
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3. 삭제
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5. 제 1 항에 있어서, 상기 혈관신생-관련 질환은 암인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물

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