KR102237714B1 - 상후앙포러스 상후앙 균주 및 그 생성물, 추출물 및 적용 - Google Patents

상후앙포러스 상후앙 균주 및 그 생성물, 추출물 및 적용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 상후앙포러스의 액체 발효물 또는 상후앙포러스의 추출물의 제조방법, 상기 액체 발효물 또는 추출물로부터 확인되는 화합물 및 그들의 신규한 활성에 관한 것이다.

Description

상후앙포러스 상후앙 균주 및 그 생성물, 추출물 및 적용{SANGHUANGPORUS SANGHUANG STRAINS AND THEIR PRODUCTS, EXTRACTS AND APPLICATIONS}
본 발명은 에스트로겐-의존성 상태의 치료 또는 예방에 있어서 미생물 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 상후앙포러스 상후앙(Sanghuangporus sanghuang) 균주, 상후앙포러스 상후앙 균주의 추출물의 제조, 이 추출물로부터 확인되는 화합물 및 이 화합물의 신규한 활성을 제공한다.
에스트로겐 수용체(estrogen receptor, "ER")는 내재성 에스트로겐과의 상호 작용을 통하여 다양한 생물학적 효과의 유도를 매개하는 리간드-활성화 전사 조절 단백질이다. ER은 두 가지 동형 단백질, ERα(알파) 및 ERβ(베타)를 갖는 것으로 밝혀졌다. 상기 두 가지 동형 단백질은 상이한 조직에 분포되는 것으로 밝혀졌다. ERα는 가슴, 난소 및 자궁에 주로 분포하고, ERβ는 뼈, 폐, 내피 세포, 전립선 및 다른 조직에 주로 분포한다. 두 가지 동형 단백질 모두 에스트로겐에 대하여 높은 친화성을 가지나, 상이한 근원으로부터의 특정 유사체에 대한 친화성에 있어서는 상당한 차이가 있다. 따라서, 소위 선택적 에스트로겐 수용체 조절자(Selective Estrogen Receptor Modulator, "SERMs")가 존재할 수 있다. SERMs는 에스트로겐과 구조적 및 기능적으로 유사하지만, 상이한 에스트로겐에 대한 반응이 다르므로, 상이한 기관에서 상이한 ERs을 조절할 수 있다. 이상적 SERMs는 유선, 자궁 등에서 길항작용을 제공하고, 심혈관계, 뼈 및 중추신경계에서 양성 조절 효과(positive regulation effect)를 제공하기 위하여, 에스트로겐-유사 효과를 가져야만 한다. 이러한 차이에 의해, SERMs가 상이한 조직에서 차별화된 생리학적 영향을 일으킬 수 있게 된다(Paterni, I., Granchi, C., Katzenellenbogen, J.A., Minutolo, F., (2014) Estrogen receptors alpha(ERα) and beta(ERβ): subtype-selective ligands and clinical potential. Steroids. pii S0039-128X (14), 00151-00152.).
버섯(거대진균류)은 수세기 동안 천연의 생체활성 이차 대사산물의 전통적인 공급원으로 축적되고 가치를 인정받았다 가노더마 루시둠(Ganoderma lucidum), 펠리너스 린테우스(Pellinus linteus) 및 트라메테스 베르시콜로르(Trametes versicolor)와 같은 약용 버섯은 전통적인 아시아 치료법에서 이미 사용된 역사가 있으며, 많은 신규한 생물학적 활성 화합물이 보고되었다. 일부 약용 종들은 잘 조사되었으나, 많은 종들이 화학적으로 탐구되지 않고 잘 조사되지 않은 채로 남아있다.
상후앙포러스 상후앙은 중국 본토, 일본, 한국, 미얀마 및 대만에 분포되어 있고, 뽕나무(Morus)에서만 자라며, 야생에서 매우 드물다. 상후앙포러스 상후앙 및 이 속의 다른 종들은 여전히 화학적으로 탐구되지 않은 상태이다.
본 발명의 일 측면은 상후앙포러스(Sanghuangporus)의 액체 발효물(liquid fermentate) 또는 상후앙포러스 추출물의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 측면은
Figure 112019031302744-pat00001
(화합물 1) 및
Figure 112019031302744-pat00002
(화합물 2)
의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 측면은 본 발명의 방법으로부터 얻어질 수 있는 상후앙포러스의 액체 발효물 또는 상후앙포러스 추출물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 측면은 본 발명의 상후앙포러스의 액체 발효물 또는 상후앙포러스 추출물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 측면은 본 발명의 추출물 또는 약학적 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 에스트로겐-의존성 상태, 질병, 이상 또는 증후군의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상의 에스트로겐-의존성 상태, 질병, 이상 또는 증후군을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 측면은 치료학적 유효량의 본 발명의 액체 발효물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 에스트로겐-의존성 상태, 질병, 이상 또는 증후군의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상의 에스트로겐-의존성 상태, 질병, 이상 또는 증후군을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 측면은 화합물 1 또는 화합물 2로부터 선택되는 치료학적 유효량의 화합물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 에스트로겐-의존성 상태, 질병, 이상 또는 증후군의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상의 에스트로겐-의존성 상태, 질병, 이상 또는 증후군을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 측면은 ER 활성을 갖는 화합물의 스크리닝 방법으로서, 상기 방법은
(a) 에스트로겐 반응 요소(estrogen response elements, "ERE") 및 리포터 유전자를 발현하는 형질감염 세포를 제공하는 단계;
(b) 상기 화합물, 양성 대조군 또는 음성 대조군의 존재 하에 상기 형질감염 세포를 배양하는 단계; 및
(c) 상기 리포터 유전자의 활성을 측정하는 단계를 포함하며,
상기 음성 대조군에 비하여 상기 리포터 유전자의 상승된 활성은 상기 화합물이 ER 활성을 갖는다는 것을 나타내며, 상기 양성 대조군은 상기 정의된 화합물 1 또는 화합물 2이다.
본 발명의 다른 측면은 부다페스트 조약에 따라 2018년 8월 29일에 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)에 수탁번호 DSM 32914으로 기탁되고, 2018년 11월 6일에 Food Industry Research and Development Institute (FIRDI)의 Biosource Collection and Research Center (BCRC)에 수탁번호 BCRC930200로 기탁된, S. sanghuang 38847을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 에스트로겐-의존성 상태, 질병, 이상 또는 증후군의 예방 또는 치료용 의약 제조에 있어서, 본 발명의 상후앙포러스(Sanghuangporus)의 액체 발효물 또는 추출물 또는 약학적 조성물의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 에스트로겐-의존성 상태, 질병, 이상 또는 증후군의 예방 또는 치료용 의약 제조에 있어서, 상기 정의된 화합물 1 또는 화합물 2의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명은 하기 항목에서 더 상세하게 설명된다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 본 발명의 상세한 설명 및 청구범위에서 쉽게 찾아질 수 있다.
도 1은 본 발명의 화합물 1 및 화합물 2의 ER 활성을 나타낸다.
정의
본 명세서에 다르게 정의되지 않으면, 본 발명에 관하여 사용된 과학적 및 기술적 용어는 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 용어의 의미 및 범위는 명확해야 하나, 잠정적인 모호성이 있는 경우, 본 명세서에 제공된 정의는 임의의 사전 또는 외적인 정의보다 우선한다.
문맥상 다르게 요구되지 않으면, 단수형은 복수형을 포함하며, 복수형은 단수형을 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에 사용된 용어 "하나(a)" 또는 "하나(an)"는 일 이상으로 정의된다.
청구범위에 사용된 용어 "또는"은 대안만을 명백히 나타내거나 또는 대안이 상호 배타적인 경우를 제외하고는, "및/또는"을 의미하는 것으로 사용된다.
본 명세서에서, 범위는 "약" 하나의 특정 값으로부터 및/또는 "약" 다른 특정 값까지를 표현한다. 그러한 범위가 표현되는 경우, 실시형태는 하나의 특정 값으로부터 및/또는 다른 특정 값까지의 범위를 포함한다. 유사하게, 값들이 단어 "약"을 이용함으로써 근사치로 표현되는 경우, 특정 값은 다른 실시형태를 형성한다는 것이 이해될 것이다. 범위 각각의 종료점은 다른 종료점과 관련하여, 및 다른 종료점으로부터 독립적으로 의미가 있다는 것이 이해될 것이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 ± 30%, 바람직하게 ± 20%, 더욱 바람직하게 ± 10%, 더욱더 바람직하게 ± 5%를 나타낸다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "상후앙포러스(Sanghuangporus)"는 상후앙포러스 속의 임의의 종을 나타낸다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "2차 대사 산물(secondary metabolite)"은 진균에 의해 생성되고, 1차 대사 산물이 아니며, 성장에 필요하지 않은, 1차 대사 산물로부터 유래된 화합물을 나타낸다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "추출물(extract)"은 샘플 제조 과정 중에 수득되고, 활성 (리드) 화합물을 포함하는 모든 가능한 추출물을 나타낸다. 추출물은 액체, 고체 또는 분말의 형태일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "활성 추출물"은 원하는 생물활성을 나타내는 모든 가능한 추출물을 나타낸다. 본 발명의 그러한 활성 추출물의 예는, 조 추출물, 액체 발효물, 컬럼 크로마토그래피 분획물, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)-정제 분획물, 박막 크로마토그래피(TLC)-정제 분획물 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "용매"는 다른 물질을 용해시킬 수 있는 탄소계 액체를 나타낸다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "비극성 용매"는 약 2.0 이하의 극성도(polarity index)를 갖는 임의의 유기 용매를 나타낸다. 그러한 비극성 용매의 예는 헥산, 석유 에테르, 사염화탄소, 및 그 혼합물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "극성 용매"는 약 2.0보다 큰 극성도를 가지며, 일반적으로 물과 쉽게 혼화되는 임의의 유기 용매를 나타낸다. 그러한 중간 정도의 극성 용매(moderately polar solvent)는 메탄올, 에탄올, 아세토니트릴, 및 그 혼합물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "실리카 겔"은 소듐 실리케이트로부터 합성적으로 제조된 과립형의 유리질 다공성 형태의 이산화규소를 나타낸다. 실리카 겔은 액체 내부에 떠 있는 나노 기공성 실리카 미세구조를 함유한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "용리액(elution solution)"은 컬럼 크로마토그래피, 이온교환수지 등으로부터 추출물을 용리시키는데 이용되는 용액을 나타낸다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "예방하는"은 감수성 대상의 증상 발병을 지연시키거나, 이상 또는 상태의 발생을 감소시키거나, 이상 또는 상태의 발생을 억제시키거나, 또는 이상 또는 상태의 발달을 저지하는 것을 나타낸다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 이상 또는 상태 또는 일 이상의 그의 증상을 경감, 완화, 반전 및/또는 개선시키거나, 감수성 대상에서 질병 또는 상태의 증상을 멈추게 하는 것을 나타낸다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "대상"은 동물, 특히 포유동물을 나타낸다. 바람직한 일 실시형태에서, 용어 "대상"은 "인간"을 나타낸다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "치료학적 유효량"은 치료 효능을 나타내는, 치주염(periodontitis)을 예방 또는 치료하기 위하여, 단독으로 또는 다른 치료제/의약과 조합되어 사용되는 활성 성분의 양을 나타낸다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 약학 조성물 또는 식이 조성물을 제조하기 위하여, 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는, 용매, 희석액, 결합제, 접착제, 보조제, 부형제, 수용체, 안정화제, 유사체, 풍미제, 감미제, 유화제 또는 보존제를 나타낸다. 약학적으로 허용가능한 담체의 예는 물, 염류용액, 완충액, 및 비활성 비독성 고체를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "투여하는" 또는 "투여"는 본 발명의 조성물 또는 의약을 생물학적 작용의 원하는 부위에 전달할 수 있도록 하기 위하여 이용될 수 있는 방법을 나타낸다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "상태(condition)", "질병(disease)", "이상(disorder)" 또는 "증후군(syndrome)"은 상호교환적으로 사용될 수 있다.
상후앙포러스 의 근원
상후앙포러스 종의 예는, 상후앙포러스 마이크로시스티데우스(Sanghuangporus microcystideus), 상후앙포러스 조나터스(Sanghuangporus zonatus), 상후앙포러스 바우미(Sanghuangporus baumii), 상후앙포러스 상후앙(Sanghuangporus sanghuang), 상후앙포러스 로니세리콜라(Sanghuangporus lonicericola), 상후앙포러스 바니니(Sanghuangporus vaninii), 상후앙포러스 웨이리아너스(weirianus), 상후앙포러스 알피너스(alpinus) 및 상후앙포러스 웨이겔라(Sanghuangporus weigelae)를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 상후앙포러스는 상후앙포러스 상후앙이다.
제조 방법 및 그로부터 얻어질 수 있는 추출물
본 발명은 다양한 2차 대산 산물의 제조를 위하여 담자균(basidiomycete) 상후앙포러스 상후앙을 배양하는 방법을 제공한다.
본 발명은 상후앙포러스에 적합한 조건 하에서, 브로스(broth)에서 상후앙포러스를 배양하는 것을 포함하는 상후앙포러스 상후앙의 액체 발효물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 상후앙포러스 추출물의 제조방법을 제공하며, 상기 방법은:
(a) 브로스에서 상후앙포러스를 배양함으로써 상후앙포러스의 액체 발효물을 수득하는 단계; 및
(b) 상후앙포러스의 액체 발효물을 알코올과 혼합함으로써 상후앙포러스 추출물을 수득하는 단계를 포함한다.
본 발명은
Figure 112019031302744-pat00003
(화합물 1) 및
Figure 112019031302744-pat00004
(화합물 2)
의 제조방법을 제공하며, 상기 방법은:
(a) 상후앙포러스에 적합한 조건 하에서, 브로스에서 상후앙포러스를 배양함으로써 상후앙포러스의 액체 발효물을 수득하는 단계;
(b) 상후앙포러스의 액체 발효물을 알코올과 혼합함으로써 알코올 용해성 추출물을 수득하는 단계;
(c) 알코올 용해성 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 처리하는 단계;
(d) 용리액으로 컬럼을 용리하여 상이한 용출액(eluates)을 수득하는 단계; 및
(e) 박막 크로마토그래피 (CH2Cl2:아세톤: 40:1)에 의해 제1 용출 분획물(eluted fraction) 및 제2 용출 분획물을 수집하는 단계를 포함하며,
제1 용출 분획물은 화합물 1을 포함하고, 제2 용출 분획물은 화합물 2를 포함한다.
본 발명의 단계 (b)에서, 알코올은 메탄올, 에탄올 또는 n-부탄올이다.
본 발명의 단계 (d)에서, 컬럼은 CH2Cl2/에틸 아세테이트 (1:1)로 용리된다.
본 발명의 단계 (d)에서, 컬럼은 2×-, 3×-, 4×- 또는 5×-컬럼 부피 CH2Cl2/에틸 아세테이트 (1:1)로 용리된다.
본 발명의 단계 (d)에서, 컬럼은 CH2Cl2/에틸 아세테이트 (1:1), CH2Cl2/에틸 아세테이트/MeOH (1:1:0.5) 및 CH2Cl2/에틸 아세테이트/MeOH (1:1:1)로 순차적으로 용리된다.
본 발명의 단계 (d)에서, 컬럼은 2×-, 3×-, 4×- 또는 5×- 컬럼 부피 CH2Cl2/에틸 아세테이트 (1:1), 2×-, 3×-, 4×- 또는 5×-컬럼 부피 CH2Cl2/에틸 아세테이트/MeOH (1:1:0.5) 및 2×-, 3×-, 4×- 또는 5×-컬럼 부피 CH2Cl2/에틸 아세테이트/MeOH (1:1:1)로 순차적으로 용리된다.
일 실시형태에서, 단계 (d) 후에, 페이스트 또는 고체 발효물을 수득하기 위하여, 용출 분획물을 농축하거나 및/또는 용출 분획물을 건조하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 단계 (e)에서, 용리 버퍼는 CH2Cl2:아세톤 (10:1), CH2Cl2:아세톤 (20:1), CH2Cl2:아세톤 (30:1) , CH2Cl2:아세톤 (40:1) , CH2Cl2:아세톤 (50:1) 또는 CH2Cl2:아세톤 (60:1)이다.
일부 실시형태에서, 용매는 비극성 용매 또는 극성 용매이다. 본 발명에 따르면, 이용된 실라카 겔은 Silica Gel 60 GF254, Silica Gel 60 (0.063 mm 미만), Silica Gel 60 (0.2-0.5 mm), Silica Gel 60 (0.063-0.200 mm), Silica Gel 60 extra pure, Silica Gel 60 (0.040-0.063 mm), Silica Gel 60 (35-70 mm), or Silica Gel 60 F254 (0.063-0.200 mm)일 수 있다.
본 발명에 따르면, 컬럼 크로마토그래피에 사용된 용리액은 CH2Cl2/에틸 아세테이트, CH2Cl2/에틸 아세테이트/MeOH, n-헥산/에틸 아세테이트, CH2Cl2:아세톤, 메탄올, 에탄올 및 에탄올/에틸 아세테이트를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시형태에서, CH2Cl2/에틸 아세테이트 용매 중 CH2Cl2과 에틸 아세테이트 사이의 부피비, n-헥산/에틸 아세테이트 용매 중 n-헥산과 에틸 아세테이트 사이의 부피비, 및 에탄올/에틸 아세테이트 용매 중 에탄올과 에틸 아세테이트 사이의 부피비는 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40, 55:45, 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 및 5:95일 수 있다. 본 발명의 바람직한 일 실시형태에서, 이용된 CH2Cl2/에틸 아세테이트 용매의 비는 50:50이다
본 발명의 일 실시형태에서, CH2Cl2/에틸 아세테이트/MeOH의 부피비는 1:1:0.3, 1:1:0.4, 1:1:0.5, 1:1:0.6, 1:1:0.7, 1:1:0.8, 1:1:0.9, 1:1:1, 1:0.3:1, 1:0.4:1, 1:0.5:1, 1:0.6:1, 1:0.7:1, 1:0.8:1, 1:0.9:1, 0.3:1:1, 0.4:1:1, 0.5:1:1, 0.6:1:1, 0.7:1:1, 0.8:1:1 또는 0.9:1:1이다.
또한, 본 발명은 전술한 방법으로부터 얻어진 상후앙포러스의 액체 발효물 또는 상후앙포러스 추출물을 제공한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 상후앙포러스의 액체 발효물 또는 상후앙포러스 추출물은
Figure 112019031302744-pat00005
및/또는
Figure 112019031302744-pat00006
을 포함한다.
본 발명은 또한
(화합물 1)
Figure 112019031302744-pat00007
및
(화합물 2)
Figure 112019031302744-pat00008
을 포함하는 조성물을 제공한다.
상후앙포러스 의 배양 조건
일 실시형태에 따르면, S. sanghuang은 맥아 추출물 한천(MEA) 배지에서, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일 또는 30일 동안 배양된다.
S. sanghuang 콜로니(6- 내지 21-일)는 액체 배양 배지를 함유하는 플라스크에서, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일 또는 21일 동안, 22℃, 23℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃ 또는 30℃에서 배양된다.
액체 배양 배지는 옥수수 전분, 옥수수 침지액(corn steep liquor), 효모 추출물, pH 약 5.8-6.3의 씨 솔트 증류수(sea salt distilled water)를 포함한다.
ER 플랫폼
본 발명은 에스트로겐 수용체(ER) 활성을 갖는 화합물의 스크리닝 방법을 제공하며, 상기 방법은:
(a) 에스트로겐 반응 요소(ERE) 및 리포터 유전자를 발현하는 형질감염 세포를 제공하는 단계;
(b) 상기 화합물, 양성 대조군 또는 음성 대조군의 존재 하에, 상기 형질감염 세포를 배양하는 단계; 및
(c) 상기 리포터 유전자의 활성을 측정하는 단계를 포함하며,
상기 음성 대조군에 비하여 상기 리포터 유전자의 상승된 활성은, 상기 화합물이 ER 활성을 갖는다는 것을 나타내며, 상기 양성 대조군은
Figure 112019031302744-pat00009
(화합물 1) 및/또는
Figure 112019031302744-pat00010
(화합물 2)
본 발명의 일 실시형태에서, ERE는 5'-GGTCAnnnTGACC-3'(n은 A, T, C 또는 G이다)(서열번호: 7)이다.
본 발명의 일 실시형태에서, 리포터 유전자는 알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase, SEAP), β-갈락토시다아제(β-galactosidase), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(chloramphenicol acetyltransferase), 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP) 또는 적색 형광 단백질(red fluorescent protein, RFP)일 수 있다.
조성물
일 실시형태에 따르면, 본 발명은 치료학적 유효량의, 본 발명의 제조방법으로부터 얻어질 수 있는 상후앙포러스 추출물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
경구 조성물은 일반적으로 비활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 경구 조성물은 액체일 수 있으며, 또는 젤라틴 캡슐로 둘러싸일 수 있으며, 또는 정제로 압축될 수 있다. 약학적으로 상용성인 결합제 및/또는 보조 재료가 경구 조성물의 일부로서 포함될 수 있다. 정제(tablets), 알약(pills), 캡슐(capsules), 트로치(troches) 등은 임의의 하기 성분 또는 유사한 성질의 화합물을 함유할 수 있다: 미세결정질 셀룰로오스, 트라간트검 또는 젤라틴과 같은 결합제; 전분 또는 락토오스와 같은 부형제; 알긴산, 프리모겔(Primogel) 또는 옥수수 전분과 같은 붕괴제; 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로테스(Sterotes)와 같은 윤활제; 콜로이달 이산화규소와 같은 활택제(glidant); 수크로오스 또는 사카린과 같은 감미제; 및/또는 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 향료와 같은 풍미제. 경점막 투여는 나잘 스프레이(nasal sprays) 또는 좌약의 사용을 통하여 이루어질 수 있다. 경피 투여를 위하여, 활성 화합물은 전형적으로 당해 기술분야에 일반적으로 공지된 바와 같이, 연고(ointments), 납고(salves), 겔(gels), 또는 크림으로 제제화된다.
조성물은 캡슐, 마이크로캡슐, 정제, 과립, 분말, 트로치, 알약, 좌약, 주사제, 현탁액 및 시럽과 같은 통상적인 제제 형태로 경구 또는 비경구적으로 환자에게 투여될 수 있다. 적합한 제제는 부형제(예를 들어, 수크로오스, 전분, 만니톨, 소르비톨, 락토오스, 글루코오스, 셀룰로오스, 탈크, 칼슘 포스페이트 또는 칼슘 카보네이트), 결합제(예를 들어, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 하이드록시메틸셀룰로오스, 폴리프로필피롤리돈, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 아라비아검, 폴리에틸렌글리콜, 수크로오스 또는 전분), 붕괴제(예를 들어, 전분, 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필전분, 저 치환 하이드록시프로필셀룰로오스, 소듐 비카보네이트, 칼슘 포스페이트 또는 칼슘 시트레이트), 윤활제(예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 경질 무수 규산(light anhydrous silicic acid), 탈크 또는 소듐 라우릴 설페이트), 풍미제(예를 들어, 시트르산, 멘톨, 글리신 또는 오렌지 파우더), 보존제(예를 들어, 소듐 벤조에이트, 소듐 바이설파이트, 메틸파라벤 또는 프로필파라벤), 안정화제(예를 들어, 시트르산, 소듐 시트레이트 또는 아세트산), 현탁제(예를 들어, 메틸셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리클론 또는 알루미늄 스테아레이트), 분산제(예를 들어, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스), 희석제(예를 들어, 물) 및 베이스 왁스(예를 들어, 코코아 버터, 백색 바셀린(white petrolatum) 또는 폴리에틸렌글리콜)와 같은, 통상적인 유기 또는 무기 담체를 이용하여 통상적으로 채용되는 방법에 의해 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 치약, 겔 치약(gel dentifrice), 가루 치약(dental powder), 의치 세정 정제, 츄잉검 또는 고체 로젠지(solid lozenge) 등과 같은 반고체 또는 고체 형태일 수 있다.
유용성
본 발명의 추출물, 조 추출물, 액체 발효물 및 조성물은 에스트로겐-의존성 상태, 질병, 이상 또는 증후군의 위험을 예방, 치료 또는 감소시킬 필요가 있는 대상에서, 에스트로겐-의존성 상태, 질병, 이상 또는 증후군의 위험을 예방, 치료 또는 감소시키는데 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 추출물, 조 추출물, 액체 발효물 및 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 에스트로겐-의존성 상태, 질병, 이상 또는 증후군의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상에서, 에스트로겐-의존성 상태, 질병, 이상 또는 증후군의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
바람직한 실시형태에서, 에스트로겐-의존성 상태, 질병, 이상 또는 증후군은 유방통(mastodynia)(유방 통증/유방 압통)(breast pain/tenderness), 유섬유종(breast fibroids), 유방 발육(mammoplasia)(유방 확대)(breast enlargement), 큰 유방증(macromastia)(유방 비대)(breast hypertrophy), 심혈관계 질환(cardiovascular disease), 뇌졸중(stroke), 여성형 유방(gynecomastia), 유방암(breast cancer), 골다공증(osteoporosis), 소녀의 성조숙증(precocious puberty in girls), 기미(melasma), 월경 과다증(menorrhagia), 자궁내막증(endometriosis), 자궁내막증식증(endometrial hyperplasia), 자궁선근증(adenomyosis), 자궁섬유종(uterine fibroids), 자궁암(uterine cancers)(예를 들어, 자궁내막암(endometrial cancer)), 난소암(ovarian cancer), 및 간경변(cirrhosis) 및 클라인펠터 증후군(Klinefelter's syndrome)과 같은 특정 상태에서와 같은 남성에서의 에스트로겐 과잉증(hyperestrogenism)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직한 실시형태에서, 심혈관계 질환은 고혈압(hypertension)(높은 혈압), 관상동맥심장질환(coronary heart disease)(심장마비), 뇌혈관질환(cerebrovascular disease)(뇌졸중), 말초혈관질환(peripheral vascular disease), 심부전(heart failure), 류마티스성 심장질환(rheumatic heart disease), 선천성 심장질환(congenital heart disease), 심근증(cardiomyopathies), 고혈압성 심장질환(hypertensive heart disease), 류마티스성 심장질환, 심근증, 부정맥(heart arrhythmia), 심장 판막 질환(valvular heart disease), 심장염(carditis), 대동맥류(aortic aneurysms), 혈전색전성질환(thromboembolic disease), 및 정맥 혈전증(venous thrombosis)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직한 실시형태에서, 조성물은 에스트로겐-의존성 상태, 질병, 이상 또는 증후군의 예방 또는 치료에 유용한 통상적인 약물 또는 제제를 선택적으로 포함한다. 이러한 통상적인 약물 또는 제제의 정상 용량은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 이러한 통상적인 약물 또는 제제는 SERMs(클로미펜(clomifene), 오르멜록시펜(ormeloxifene), 랄록시펜(raloxifene), 타목시펜(tamoxifen), 토레미펜(toremifene), 라소폭시펜(lasofoxifene) 및 오스페미펜(ospemifene)과 같은), 풀베스트란트(fulvestrant)와 같은 에스트로겐 수용체 길항제, 아나스트로졸(anastrozole) 및 엑스메스탄(exemestane)과 같은 아로마타제 억제제(aromatase inhibitors), 류프로렐린(leuprorelin) 및 세트로렐릭스(cetrorelix)와 같은 생식샘자극호르몬 분비 호르몬(gonadotropin-releasing hormone, GnRH), 및/또는 다나졸(danazol), 게스트리논(gestrinone), 메제스트롤 아세테이트(megestrol acetate), 및 메드록시프로게스테론 아세테이트(medroxyprogesterone acetate)와 같은 다른 안티고나도트로핀(antigonadotropins)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직한 실시형태에서, 조성물은 골다공증의 예방 또는 치료에 유용한 통상적인 약물 또는 제제를 선택적으로 포함한다. 이러한 통상적인 약물 또는 제제의 정상 용량은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 이러한 통상적인 약물 또는 제제는 골흡수억제제(antiresorptive agent)(예를 들어, 비스포스포네이트(bisphosphonate), 핵 인자 카파-B 리간드의 수용체 활성자(receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand, RANKL) 억제제, SERMs(클로미펜, 오르멜록시펜, 랄록시펜, 타목시펜, 토레미펜, 라소폭시펜 및 오스페미펜과 같은), 단백동화제(anabolic agent)(예를 들어, 테리파라타이드(teriparatide)) 및 스트론튬 라넬레이트(strontium ranelate)를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직한 실시형태에서, 조성물은 유방암의 예방 또는 치료에 유용한 통상적인 약물 또는 제제를 선택적으로 포함한다. 이러한 통상적인 약물 또는 제제의 정상 용량은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 이러한 통상적인 약물 또는 제제는 아베마시클립(Abemaciclib), 아브락산(Abraxane)(파클리탁셀 알부민-안정화 나노입자 제제(Paclitaxel Albumin-stabilized Nanoparticle Formulation)), 아도-트라스투주랍 엠탄신(Ado-Trastuzumab Emtansine), 아피니터(Afinitor)(에버롤리무스(Everolimus)), 아나스트로졸(Anastrozole), 아레디아(Aredia)(파미드로네이트 디소듐(Pamidronate Disodium)), 아리미덱스(Arimidex)(아나스트로졸), 아로마신(Aromasin)(엑스메스탄), 카페시타빈(Capecitabine), 시클로포스파미드(Cyclophosphamide), 도세탁셀(Docetaxel), 독소루비신 하이드로클로라이드(Doxorubicin Hydrochloride), 엘렌스(Ellence)(에피루비신 하이드로클로라이드(Epirubicin Hydrochloride)), 에피루비신 하이드로클로라이드, 에리불린 메실레이트(Eribulin Mesylate), 에버롤리무스, 엑스메스탄, 5-FU(플루오로우라실 주사(Fluorouracil Injection)), 파레스톤(Fareston)(토레미펜(Toremifene)), 파스로덱스(Faslodex)(풀베스트란트(Fulvestrant)), 페마라(Femara)((레트로졸(Letrozole)), 플루오로우라실 주사, 풀베스트란트, 젬시타빈 하이드로클로라이드(Gemcitabine Hydrochloride), 젬자(Gemzar)(젬시타빈 하이드로클로라이드), 고세렐린 아세테이트(Goserelin Acetate), 할라반(Halaven)(에리불린 메실레이트), 헤르셉틴(Herceptin)(트라스투주맙), 이브란스(Ibrance)(팔보시클립(Palbociclib)), 익사베필론(Ixabepilone), 익셈프라(Ixempra)(익사베필론(Ixabepilone)), 캐싸일라(Kadcyla)(아도-틀라스투주맙 엠탄신), 키스칼리(Kisqali)(리보시클립(Ribociclib)), 라파티닙 디토실레이트(Lapatinib Ditosylate), 레트로졸(Letrozole), 린파르자(Lynparza)(올라파립(Olaparib)), 메제스트롤 아세테이트(Megestrol Acetate), 메토트렉세이트(Methotrexate), 네라티닙 말레에이트(Neratinib Maleate), 너링스(Nerlynx)(네라티닙 말레에이트), 올라파립(Olaparib), 파클리탁셀, 파클리탁셀 알부민-안정화 나노입자 제제, 팔보시클립(Palbociclib), 파미드로네이트 디소듐(Pamidronate Disodium), 페르제타(Perjeta)(페르투주맙(Pertuzumab)), 페르투주맙, 리보시클립(Ribociclib), 타목시펜 시트레이트, 탁솔(Taxol)(파클리탁셀), 탁소텔(Taxotere)(도세탁셀), 티오테파(Thiotepa), 토레미펜, 트라스투주맙, 트렉살(Trexall)(메토트렉세이트(Methotrexate)), 타이커브(Tykerb)(라파티닙 디토실레이트(Lapatinib Ditosylate)), 버제니오(Verzenio)(아베마시클립), 빈블라스틴 설페이트(Vinblastine Sulfate), 젤로다(Xeloda)(카페시타빈), 졸라덱스(Zoladex)(고세렐린 아세테이트(Goserelin Acetate))를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
하기 실시예는 당해 기술분야의 통상의 기술자가 본 발명을 실시하는데 도움을 주기 위하여 제공된다. 그렇다고 하여도, 본 명세서에 논의된 실시예에 대한 변형 및 변화가 본 발명적 발견의 정신 또는 범위로부터 벗어나지 않고 당해 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이루어질 수 있으므로, 하기 실시예는 본 발명을 부당하게 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1: 미생물 재료
본 연구에 사용된 진균은 Morus sp.의 잎으로부터 분리되었으며, rDNA 내부 전사 스페이서(internal transcribed spacer, ITS) 서열 및 리보솜의 큰 소단위체(ribosomal large subunit, LSU) 서열에 기초하여 상후앙포러스 상후앙(S. sanghuang)으로 동정되었다.
동정
진균 균주로부터의 rDNA ITS 서열 및 LSU 서열이 분석되었다. 사용된 프라이머 서열을 하기 표 1에 나타내었다.
프라이머명 서열 서열번호
V9G 5'-TTACGTCCCTGCCCTTTGTA-3' 서열번호: 1
LR1 5'-GGTTGGTTTCTTTTCCT-3' 서열번호: 2
LR5 5'-TCCTGAGGGAAACTTCG-3' 서열번호: 3
LROR 5'-ACCCGCTGAACTTAAGC-3' 서열번호: 4
PCR 반응은 V9G/LR1 프라이머 세트 또는 LR5/LROR 프라이머 세트를 사용하여, 하기 조건으로 수행되었다: (1) 1 사이클에 대하여, 94℃, 5 분; (2) 35 사이클에 대하여, 94℃, 30 초; 50℃, 1 분; 및 72℃, 1 분; 및 (3) 1 사이클에 대하여, 72℃, 10 분.
단편 ITS1-5.8S-ITS2 (643 bp)가 증폭되었다. 비교 시에, 단편 ITS1-5.8S-ITS2가 NCBI GenBank database의 표준 균주 Wu0903-1 (Accession No. JN794061)과 99% (639/642)의 서열 유사성을 갖는 것으로 밝혀졌다.
단편 LSU (877 bp)가 증폭되었다. 비교 시에, 2종의 돌연변이 (M=A 또는 C, Y는 T 또는 C)가 있으며, 단편 LSU는 표준 균주 Wu0903-1과 84.6% (720/851)의 커버리지율(coverage rate) 및 99% (718/720)의 서열 유사성을 갖는 것으로 밝혀졌다.
S. sanghuang 38847은 하기 ITS 서열 및 LSU 서열을 갖는다:
ITS 서열 (서열번호: 5):
gtgctggtgcgaaatcgcgcatgtgcacggtcttcgcgctcaaatccaactcaaacccctgtgcaccttatatatcgcgagtcgaagttagtagcctgaggtcttgtaagtaattagtagaagggcgaaagcgcgactcttgctcgttaggtagcctttcgaaaatgaaagcgagtgcgtcgggtgaagacttcggcttgtcgttacaaaacaccttatattgtctttgtgaatgtaatgctccttgtgggcgaaaataaatacaactttcaacaacggatctcttggctctcgcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcaccttgcgccccttggtattccgaggggcatgcctgtttgagtgtcatgtttatctcaaaccgctcgtctttcttaattgaagggcttgaggtttggacttggaggtttactgctggcgcctttcgaggggtcggctcctcttaaatacattagctgggctttggctcgcgtttacggtgtaatagttgattccattcaccaacgagcgcttgcctgacgagcttgcttctagccgtccgcgtcgtcggacaaggagtcacctccttcttga
LSU 서열 (서열번호: 6):
ctgcgagtgaagcgggaagagctcaaatttaaaatctggcggccttctggacgtccgagttgtagtctggagaagtgttatccgcgtcggaccgtgtacaagtctcctggaacggagcgtcatagagggtgagaatcccgtccatgacacggacgcccgatgctatgtgaggcactctcgaagagtcgagttgtttgggaatgcagctcaaaatgggtggtaaattccatctaaagctaaatattggcgagagaccgatagcgaacaagtaccgtgagggaaagatgaaaagcactttggaaagagagttaaacagtacgtgaaattgttgaaagggaaacgcttgaagtcagtcgcgtcccgtggaactcagcctggtttcgacctggtgtactttccatgtggacgggtcaacatcaatttcggccggtggacaagggcgaggggaatgtagcgttgcttcggcgacgtgttatagccccccgtcgcatacactggctgggattgaggaccgcagcacgcccttgtggccggggggttcgccccacgtaacgtgcttaggatgttggcataatggctttaagcgacccgtcttgaaacacggaccaaggagtctaacatgcttgcgagtgttcgggtggaaaacccttgcgcgtaatgaaagtgaaagttgggaacctccgcgagggggtgcaccgacgcccggccctgacgttctctgacggtgccgcggtagagcacgtatgttgggacccgaaagatggtgaactatgcctgaatagggcgaagccagaggaaactctggtggaggctcgtagcgattctgacgtgcaaatcgatcgtcaaatttgggtataggggcgaaagactaatcgaa
S. sanghuang 38847은 부다페스트 조약에 따라 2018년 8월 29일에 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)에 기탁되어, Accession No. DSM 32914를 부여받았고, 2018년 11월 6일에 Food Industry Research and Development Institute (FIRDI)의 Biosource Collection and Research Center (BCRC)에 Accession No. BCRC930200로 기탁되었다.
실시예 2: 발효 브로스(Fermented Broth)의 제조
9-cm 페트리 디쉬에서 맥아 추출물 한천 (MEA) 배지 상의 각각의 S. sanghuang 38847 균주의 21일된(21-Day-old) 콜로니를 200 ml 증류수가 담긴 병에 잘라 넣고, 30 초 동안 혼합하여, 액체 발효를 위한 진균 접종물을 제조하였다. 10 ml 진균 접종물을, 200 ml 액체 배양 배지(1L 증류수 중의, 30 g 옥수수 전분, 10 g 옥수수 침지액, 5 g 효모 추출물, 및 2 g 씨 솔트, pH 6)를 함유한 500-ml 플라스크에 첨가하였다. 접종된 배지를 100 rpm의 속도로 로터리 쉐이커 상에서 2주 동안 25℃에서 배양하였다. 총 14 L의 진균 발효 브로스를 수확하고 여과하여, 진균 균사체를 제거함으로써, 발효 생성물을 수득하였다.
실시예 3: 추출 및 분리
실시예 2에서 수득된 S. sanghuang 균주의 발효 생성물(14 L) 각각을 BuOH로 추출하여, BuOH 추출물(11.6 g) 및 H2O-가용성 분획물(22.7 g)을 수득하였다. BuOH 추출물(11.6 g)을, (CH2Cl2/에틸 아세테이트: 1:1)가 일차 용리액으로 사용되고 MeOH가 용리액 극성을 점진적으로 증가시키기 위하여 사용되는(CH2Cl2/에틸 아세테이트: 1:1→CH2Cl2/에틸 아세테이트/MeOH: 1:1:0.5→CH2Cl2/에틸 아세테이트/MeOH: 1:1:1→MeOH) 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 처리하여, 17종의 분획물(분획물 Nos. 1 내지 17)을 생성하였다. 분획물 1을 예비 TLC(CH2Cl2/아세톤: 40:1)에 의해 정제하여, 2종의 용출 분획물을 제공하였으며, 여기서 제1 용출 분획물은 화합물 1(36.4 mg)을 포함하고, 제2 용출 분획물은 화합물 2(12.8 mg)를 포함한다. 화합물 1은 노르스름한 오일이다. 화합물 2는 무색 오일이다.
실시예 4: 화합물 1 및 2의 특성화
화합물 1
화합물 1의 구조는 하기 구조를 갖는 (E)-5-(2,2-디메틸-6-메틸렌사이클로헥실)-3-메틸펜트-2-엔산((E)-5-(2,2-dimethyl-6-methylenecyclohexyl)-3-methylpent-2-enoic acid)(또한, 상후앙린(sanghuanglin)으로도 호칭됨)로 결정되었다.
Figure 112019031302744-pat00011
CDCl3에서의 화합물 1에 대한 1H- 및 13C-NMR 분광분석 데이터는 표 2에 나타낸다.
C δ(H)(J, mult, Hz) δ(C)
1 - 170.0 (s)
2 5.69 (br. q, J = 1.2) 114.8 (d)
3 - 164.0 (s)
4 1.95 (m) 39.8 (t)
2.15 (m)
5 1.56 (m) 24.3 (t)
1.64 (m)
Me-3 2.17 (d, J = 1.2) 19.3 (q)
1' 1.70 (dd, J = 12.0, 3.3) 53.7 (d)
2' - 34.9 (s)
3' 1.26 (dt, J = 12.6, 4.6, Heq-β) 36.1 (t)
1.26 (dt, J = 12.6, 4.6, Heq-α)
4' 1.56 (m) 23.6 (t)
5' 2.06 (m) 32.3 (t)
6' - 148.8 (s)
7' 0.85 (s) 26.3 (q)
8' 1.21 (s) 28.3 (q)
9' 4.55 (br. d, J = 1.2) 109.4 (t)
4.79 (br. sex, J = 1.2)
배정은 HSQC, HMBC, 및 COSY 실험에 의해 수행되었다.
화합물 2
화합물 2는 하기 구조를 갖는 (+)-(2E,4E)-5-((S)-2,2-디메틸-6-메틸렌사이클로헥실)-3-메틸펜타-2,4-디엔산((+)-(2E,4E)-5-((S)-2,2-dimethyl-6-methylenecyclohexyl)-3-methylpenta-2,4-dienoic acid)(또한, MDA로도 호칭됨)으로 결정되었다.
Figure 112019031302744-pat00012
CDCl3에서의 화합물 2에 대한 1H- 및 13C-NMR 분광분석 데이터는 표 3에 나타낸다.
C δ(H)(J, mult, Hz) δ(C)
1 - 171.4
2 5.75 (q, J = 0.9) 117.1
3 - 155.0
4 6.14 (d, J = 15.6) 135.3
5 6.32 (dd, J = 15.6, 9.6) 137.3
Me-3 2.32 (d, J = 0.9) 14.3
1' 2.55 (d, J = 9.6) 58.1
2' - 35.7
3' 1.36 (m) 39.0
1.52 (m)
4' 1.61 (m) 23.3
5' 2.06 (m) 34.4
2.28 (m)
6' - 149.4
7' 0.84 (s) 23.6
8' 0.90 (s) 29.4
9' 4.54 (br, s) 109.0
4.77 (br, sex, J = 1.2)
배정은 HSQC, HMBC, 및 COSY 실험에 의해 수행되었다.
실시예 5: ER 전체 활성 분석
에스트로겐 수용체 (ER) 모델
ER은 스테로이드/핵 수용체 상과(steroid/nuclear receptor superfamily)의 일원인, 리간드-활성화 인핸서 단백질(enhancer protein)이다. ER은 에스트로겐 반응 요소(EREs)로 호칭되는 특정 DNA 서열(5'-GGTCAnnnTGACC-3', 서열번호: 7)에 높은 친화도로 결합하고, 에스트라디올(E2)에 반응하여 유전자 발현을 트랜스활성화(transactivate)시킨다(Nucleic Acids Res. 2001 Jul 15; 29(14): 2905-2919). 분비된 알칼리 포스파타제(SEAP)는 프로모터 활성 또는 유전자 발현을 연구하는데 광범위하게 이용되는 리포터이다.
1 ml 0.05% 트립신-EDTA 용액을 5 분 동안 37℃에서 T75 플라스크 중의 MCF-7 세포의 80% 컨플루언스(confluence)(세포가 로그상인 경우, 5일째)에 첨가하였다. 세포가 분리된 후, 5 ml 숯 처리된(charcoal-treated) FBS-함유 배지를 첨가하여 세포를 현탁시켰다. 숯 처리된 FBS-함유 FBS 배지를 2 ml 세포 현탁액에 첨가하여 혼합물 최종 부피를 10 ml로 하였다. 혼합물을 8 채널 피펫에 의해 96-웰 플레이트의 각각의 웰(100 ㎕/웰, 2x104 세포/웰)에 분배하고, 96-웰 플레이트를 하룻밤동안 37℃ 및 5% CO2에 두어, 약 70% 컨플루언스를 수득하였다.
세포를 형질감염시켜 ERE를 발현시키기 위하여, 형질감염 혼합물(transfection mixture)을 제조하였다. TransIT®-LT1 Transfection Reagent는일차 세포(primary cell)를 포함하는 많은 포유류 세포 형태에서 높은 효율성의 플라스미드 DNA 전달을 제공하는 광범휘한 스펙트럼 시약이다. 구체적으로, 1 ml Opti-MEM®, 14 ㎕ TransIT®-LT1 Transfection Reagent 및 5 ㎍ pERE-TA-SEAP가 1.5 ml 에펜도르프(Eppendorf)에 첨가되었고, 형질감염 혼합물을 15-30 분 동안 정치시켰다.
TransIT-DNA를 함유하는 형질감염 혼합물을 96-웰 플레이트의 각각의 웰(10 ㎕/웰)에 분배하였고, 96-웰 플레이트를 24시간 동안 37℃ 및 5% CO2에 두었다. 8 채널 피펫을 이용하여 상청액을 96-웰 플레이트로부터 제거하였다. 90 ㎕ 숯 처리된 FBS-함유 배지(페놀 레드-무함유), 선택적으로 0.1 nM E2 자극제(stimulator) (스크리닝의 목적에 따라), 및 10 ㎕ 샘플(E2, 38847 발효 브로스, 화합물 1 및 화합물 2)를 48시간 동안 37℃ 및 5% CO2 배양기에서 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다.
결과
샘플 상대적 ER 활성a
배지 단독 1.00 ± 0.07
0.1 nM 17-β에스트라디올 (E2) 10.99 ±0.52
38847 발효 브로스 (1/10 v/v) 10.19 ±0.47
a 상대적 에스트로겐 수용체(ER) 활성은 대상 샘플의 활성과 비처리된 세포(배지 단독)의 활성 사이의 비율로 표현된다.
표 4로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 38847 발효 브로스의 발효 브로스가 우수한 ER 활성을 갖는다.
도 1에 나타내어진 바와 같이, 화합물 1 및 2는 상이한 농도(2 ㎍/ml, 5 ㎍/ml 및 10 ㎍/ml)에서 중요한 ER 활성을 나타내었다. 놀랍게도, 화합물 1 및 2 가 17-β 에스트라디올(양성 대조군)보다 우수한 ER 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
실시예 6: SERMs 활성의 평가
세포 배양
CV-1 세포(아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(Cercopithecus aethiops kidney cell))를 70-80%의 컨플루언스로 성장시켜, 5×104 세포/ml의 농도의 세포 현탁액으로 수확하였다. 세포 현탁액을 96-웰 플레이트의 각각의 웰(100 ㎕/웰)에 첨가하고, 96-웰 플레이트를 하룻밤동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
형질감염을 위한 DNA 혼합물의 제조
500 ㎕ jetPRIME® 버퍼, 5 ㎍ pERE-TA-SEAP 및 5 ㎍ ERα DNA 플라스미드 (or ERβ DNA 플라스미드)를 1.5 ml 에펜도르프에 첨가한 후, 20 ㎕ jetPRIME® Transfection Reagent 및 1.5 ml 배지를 첨가하였다. DNA 혼합물을 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고(20 ㎕), 96-웰 플레이트를 4시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
세포 수확
상청액을 96-웰 플레이트의 각각의 웰로부터 제거한 후, 페놀 레드 없는 90 ㎕ 숯 처리된 FBS 배지를 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 시험되는 샘플을 96-웰 플레이트의 웰에 첨가하여, 48 내지 72시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 후속적인 리포터 유전자 분석 및 세포 독성 분석을 위하여 세포를 수확하였다.
리포터 유전자 분석
25 ㎕ 세포 배양 상청액을 96-웰 플레이트로부터 수집한 후, 새로운 발광 마이크로플레이트(luminescence microplate)에 첨가하고, 30분 동안 65℃ 수욕에서 배양하여 활성 내재성 알칼리 포스파타제를 제거하였으며, 5분 동안 얼음 위에 둔 후, 1분 동안 원심분리하였다(1,000 rpm). 25 ㎕ Phospha-Light™ 분석 버퍼를 5분 동안 실온에서 첨가하였고, 25㎕ CSPD (디소듐 3-(4-페녹시스피로 {1,2-디옥세탄-3,2'-(5'-클로로)트리시클로 [3.3.1.13,7]데칸}-4-일)페닐 포스페이트)-함유 Phospha-Light™ 반응 버퍼를 20분 동안 실온에서 첨가하였다. 발광 마이크로플레이트를 Victor™ Light 1420 Luminescence Counter에 배치하고, SEAP 효소 활성을 측정하였다.
결과
농도 ER 서브타입 활성a
ER-α ER-β ER-β/ER-α
배지 단독 1.00±0.22 1.00±0.12 1.0
17-β 에스트라디올(E2) 200nM 2.82±0.79 3.70±0.45 1.3
화합물 1b 25㎍/mL 1.21±0.53 3.80±0.11 3.1
화합물 2c 25㎍/mL 1.16±0.16 2.53±0.77 2.2
a: 상대적인 에스트로겐 수용체(ER) 활성은 대상 샘플의 활성과 비처리된 세포(배지 단독)의 활성 사이의 비율로 표현된다.
b: 화합물 1 = 상후앙린(sanghuanglin).
c: 화합물 2 = (+)-(2E,4E)-5-((S)-2,2-디메틸-6-메틸렌사이클로헥실)-3-메틸펜타-2,4-디엔산(MDA로도 호칭됨)
양성 대조군으로서 17-β 에스트라디올(E2)은 1.3의 ER-β/ER-α 비율을 나타내었다. 놀랍게도, 화합물 1 및 2는 각각 3.1 및 2.2의 비율을 나타내었다. 이 결과는, 화합물 1 및 2가 ER-α 활성보다 우수한 ER-β 활성을 가지며, 따라서 SERMs 활성을 갖는다는 것을 실증하는 것이다.
상기 예시적인 실시예에서 이루어진 바와 같이 본 발명의 다수의 변형 및 수정이 이루어질 것으로 당해 통상의 기술자에게 예측된다. 결론적으로, 첨부된 청구범위에 나타나는 제한 사항만이 본 발명에 가해져야 한다.
참고문헌
[1] Steroids. 2014, pii S0039-128X 14, 00151.
[2] Tiosano et al. Reproductive Biology and Endocrinology 2014, 12: 97
[3] Toxicol In Vitro. 2014 August ; 28(5), pages 916-925
[4] Fitoterapia 95 (2014), pages 93-101
[5] Food Sci. Biotechnol. Vol. 17, No. 6, pages 1214-1220
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Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) DSM32914 20180829 Biosource Collection and Research Center (BCRC) of the Food Industry Research and Development Institute (FIRDI) BCRC930200 20181106
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Claims (19)

  1. 브로스(broth)에서 상후앙포러스(Sanghuangporus)를 배양하는 것을 포함하며, 상후앙포러스는 S. sanghuang 38847 (DSMZ Accession No. DSM 32914)인, 상후앙포러스의 액체 발효물의 제조방법.
  2. (a) 브로스에서 상후앙포러스(Sanghuangporus)를 배양함으로써 상후앙포러스의 액체 발효물을 수득하는 단계; 및
    (b) 상기 상후앙포러스의 액체 발효물을 알코올과 혼합함으로써 상후앙포러스 추출물을 수득하는 단계를 포함하며,
    상후앙포러스는 S. sanghuang 38847 (DSMZ Accession No. DSM 32914)인
    상후앙포러스 추출물의 제조방법.
  3. Figure 112020044321460-pat00013
    (화합물 1) 및
    Figure 112020044321460-pat00014
    (화합물 2)의 제조방법으로서,
    상기 방법은
    (a) 브로스에서 상후앙포러스(Sanghuangporus)를 배양함으로써 상후앙포러스의 액체 발효물을 수득하는 단계;
    (b) 상기 상후앙포러스의 액체 발효물을 알코올과 혼합함으로써 알코올 용해성 추출물을 수득하는 단계;
    (c) 상기 알코올 용해성 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 처리하는 단계;
    (d) 용리액으로 컬럼을 용리하여 상이한 용출액을 수득하는 단계; 및
    (e) 박막 크로마토그래피 (CH2Cl2:아세톤: 40:1)에 의해 제1 용출 분획물 및 제2 용출 분획물을 수집하는 단계를 포함하며,
    상기 제1 용출 분획물은 화합물 1을 포함하고, 상기 제2 용출 분획물은 화합물 2를 포함하며,
    상후앙포러스는 S. sanghuang 38847 (DSMZ Accession No. DSM 32914)인
    방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    단계 (b)에서, 알코올은 메탄올, 에탄올 및 부탄올로 이루어진 군으로부터 선택되는
    방법.
  5. 제3항에 있어서,
    단계 (d)에서, 컬럼은 CH2Cl2/에틸 아세테이트 (1:1)로 용리되는
    방법.
  6. 제3항에 있어서,
    단계 (d)에서, 컬럼은 CH2Cl2/에틸 아세테이트 (1:1), CH2Cl2/에틸 아세테이트/MeOH (1:1:0.5) 및 CH2Cl2/에틸 아세테이트/MeOH (1:1:1)로 순차적으로 용리되는
    방법.
  7. 제3항에 있어서,
    단계 (e) 후에, 페이스트 또는 고체 발효물을 수득하기 위하여, 용출 분획물을 농축하거나, 및/또는 용출 분획물을 건조하는 단계를 더 포함하는
    방법.
  8. 제1항의 방법으로부터 수득된 상후앙포러스 액체 발효물.
  9. 제2항의 방법으로부터 수득된 상후앙포러스 추출물.
  10. 제8항에 있어서,
    Figure 112020044321460-pat00015
    (화합물 1) 및/또는
    Figure 112020044321460-pat00016
    (화합물 2)를 포함하는
    상후앙포러스 액체 발효물.
  11. 제9항에 있어서,
    Figure 112020044321460-pat00017
    (화합물 1) 및/또는
    Figure 112020044321460-pat00018
    (화합물 2)를 포함하는
    상후앙포러스 추출물.
  12. 제8항의 상후앙포러스 액체 발효물 또는 제9항의 상후앙포러스 추출물, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 에스트로겐-의존성 상태, 질병, 이상 또는 증후군의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서
    상기 에스트로겐-의존성 상태, 질병, 이상 또는 증후군은 심혈관계 질환, 여성형 유방, 유방암, 골다공증, 및 자궁내막증으로 이루어진 군으로부터 선택되는
    약학적 조성물.
  13. 에스트로겐-의존성 상태, 질병, 이상 또는 증후군의 예방 또는 치료용인, 제8항의 상후앙포러스 액체 발효물로서,
    상기 에스트로겐-의존성 상태, 질병, 이상 또는 증후군은 심혈관계 질환, 여성형 유방, 유방암, 골다공증, 및 자궁내막증으로 이루어진 군으로부터 선택되는
    상후앙포러스 액체 발효물.
  14. 에스트로겐-의존성 상태, 질병, 이상 또는 증후군의 예방 또는 치료용인, 제9항의 상후앙포러스 추출물로서,
    상기 에스트로겐-의존성 상태, 질병, 이상 또는 증후군은 심혈관계 질환, 여성형 유방, 유방암, 골다공증, 및 자궁내막증으로 이루어진 군으로부터 선택되는
    상후앙포러스 추출물.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 상후앙포러스 액체 발효물은 에스트로겐 수용체(ER) 활성 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절자(SERMs) 활성을 갖는
    상후앙포러스 액체 발효물.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 상후앙포러스 추출물은 에스트로겐 수용체(ER) 활성 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절자(SERMs) 활성을 갖는
    상후앙포러스 추출물.
  17. 에스트로겐-의존성 상태, 질병, 이상 또는 증후군의 예방 또는 치료용 화합물로서, 상기 화합물은
    Figure 112020124689208-pat00024
    (화합물 1) 및/또는
    Figure 112020124689208-pat00025
    (화합물 2)로부터 선택되며,
    상기 에스트로겐-의존성 상태, 질병, 이상 또는 증후군은 심혈관계 질환, 여성형 유방, 유방암, 골다공증, 및 자궁내막증으로 이루어진 군으로부터 선택되는
    화합물.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 화합물 1 및 화합물 2는 에스트로겐 수용체(ER) 활성 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절자(SERMs) 활성을 갖는
    화합물.
  19. 수탁번호 DSM 32914로 DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)에 기탁된 상후앙포러스 상후앙 38847(Sanghuangporus sanghuang 38847).
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