CN111172202A - 桑黄属桑黄株及其产物、萃取物及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明系关于桑黄属桑黄株及其产物、萃取物及应用。本发明系关于桑黄属的液体发酵物或桑黄属的萃取物的制备、从该液体发酵物或该萃取物鉴定的化合物及其新颖活性。

Description

桑黄属桑黄株及其产物、萃取物及应用
技术领域
本发明系关于治疗或预防雌激素依赖性病状的微生物的领域。特定言的，本发明提供桑黄属桑黄株、桑黄属桑黄株萃取物的制备、从该萃取物鉴定的化合物及该等化合物的新颖活性。
背景技术
雌激素受体(estrogen receptor，「ER」)为经由其与内源性雌激素的相互作用来介导多种生物效应的诱导的配体活化转录调节蛋白。已发现ER具有两种同功异型物：ERα(α)及ERβ(β)。已发现该两种同功异型物分布在不同组织中。ERα主要分布在乳房、卵巢及子宫中；而 ERβ分布在骨骼、肺、内皮细胞、前列腺及其他组织中。两种同功异型物对雌激素均具有高亲和力，但是对来自其他来源的某些类似物的亲和力显着不同。选择性雌激素受体调节剂 (Selective Estrogen Receptor Modulator，SERM)在结构上及在功能上类似于雌激素，但是其对不同雌激素受体的反应系不同的，因此能够调节不同器官中的不同ER。理想的SERM应该具有类似雌激素的作用，以便其能够在乳腺、子宫等中产生拮抗作用，且在心血管系统、骨骼及中枢神经系统中产生促进作用。此等差异使得SERM能够在不同组织中造成不同的生理影响(Paterni,I.,Granchi,C.,Katzenellenbogen,J.A.,Minutolo,F.,(2014)Estrogen receptors alpha (ERα)and beta(ERβ):subtype-selective ligands andclinical potential.Steroids.pii S0039-128X (14),00151-00152.)。
菇类(大型真菌)已累积多个世纪且一直被作为天然生物活性次级代谢物的传统来源而受到重视。药用菇类，诸如灵芝(Ganoderma lucidum)、裂蹄木层孔菌(Phellinuslinteus)及变色栓菌(Trametes versicolor)，在传统的亚洲治疗中具有确定的使用历史，且已报导过许多新颖的生物活性化合物。虽然已对一些药用物种进行很好的研究，但仍有许多物种未深入研究。
桑黄属桑黄(Sanghuangporus sanghuang)分布在中国大陆、日本、韩国、缅甸及台湾地区，仅生长在桑树上，且在野外非常罕见。桑黄属桑黄及此属中的其他物种仍未进行化学探究。
发明内容
本发明的目的的一为提供用于预防或治疗选自由肾上腺癌、骨癌及脑癌组成的群组的癌症的方法及/或药剂。
本发明的一方面为提供一种用于抑制肿瘤细胞生长的方法，其包含使该肿瘤细胞与包含治疗有效量的至少一种叶黄素的组合物接触。
本发明的一个态样为提供一种用于制备桑黄属液体发酵物或桑黄属萃取物的方法。
本发明的另一态样为提供一种用于制备
Figure RE-GDA0002176160460000021
(化合物1)及
Figure RE-GDA0002176160460000022
(化合物2)的方法。
本发明的另一态样为提供一种可自本发明方法获得的桑黄属液体发酵物或桑黄属萃取物。
本发明的另一态样为提供一种医药组合物，其包含本发明的桑黄属液体发酵物或桑黄属萃取物及医药学上可接受的载剂。
本发明的另一态样为提供一种用于预防或治疗有需要的受试者的雌激素依赖性病状、疾病、病症或症候群的方法，该方法包含向受试者投与本发明的萃取物或医药组合物。
本发明的另一态样为提供一种用于预防或治疗有需要的受试者的雌激素依赖性病状、疾病、病症或症候群的方法，该方法包含向受试者投与治疗有效量的本发明的液体发酵物。
本发明的另一态样为提供一种用于预防或治疗有需要的受试者的雌激素依赖性病状、疾病、病症或症候群的方法，该方法包含向受试者投与治疗有效量的选自化合物1或化合物2的化合物。
本发明的另一态样为提供一种用于筛选具有ER活性的化合物的方法，该方法包含以下步骤：
(a)提供表现雌激素反应组件(ERE)及报导基因的转染细胞；
(b)在该化合物、阳性对照或阴性对照存在下培养该等转染细胞；及
(c)量测该转染细胞中报导基因的活性；
其中与该阴性对照相比该报导基因的升高的活性指示该化合物具有ER活性，且其中该阳性对照为如上文所定义的化合物1或化合物2。
本发明的另一态样为提供一种桑黄属桑黄38847，其在2018年8月29日根据布达佩斯条约 (Budapest Treaty)寄存于德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen，DSMZ)并指定为寄存号码DSM 32914，并在2018年11月6日以寄存号码 BCRC 930200寄存于食品工业发展研究所(Food Industry Researchand Development Institute， FIRDI)的生物资源保存及研究中心(BiosourceCollection and Research Center，BCRC)。
本发明的又一态样为提供本发明的桑黄属液体发酵物或萃取物或医药组合物在制造用于预防或治疗雌激素依赖性病状、疾病、病症或症候群的药剂方面的用途。
本发明的又一态样为提供如上文所定义的化合物1或化合物2在制造用于预防或治疗雌激素依赖性病状、疾病、病症或症候群的药剂方面的用途。
在以下部分中详细描述本发明。本发明的其他特征、目的及优势可以在本发明的实施方式及申请专利范围中容易地找到。
附图说明
图1显示本发明的化合物1及化合物2的ER活性。
具体实施方式
定义
除非本文中另外定义，否则结合本发明使用的科学与技术术语应具有一般技术者通常理解的含义。术语的含义及范畴应为清楚的；然而，倘若存在任何潜在的歧义，则本文中提供的定义优先于任何字典或外部定义。
除非上下文另外需要，否则单数术语应包括复数，且复数术语应包括单数。例如，如本文中所使用的术语「一」或「一个」定义为一个或多于一个。
除非明确指示仅指替代物或替代物为相互排斥的，否则术语「或」在申请专利范围中用于意谓「及/或」。
范围在本文中表述为从「约」一个特定值及/或至「约」另一特定值。在表述此类范围时，一个实施例包括从一个特定值及/或至另一特定值的范围。同样地，当藉由使用「约」字将值表示为近似值时，应理解特定值形成另一实施例。将进一步理解，范围中的每一者的端点相对于及独立于另一端点均为有意义的。如本文中所用的术语「约」系指±30％，较佳±20％，更佳±10％，且甚至更佳±5％。
如本文中所使用的术语「桑黄属」系指桑黄属的任何物种。
如本文中所使用的术语「次级代谢物」系指衍生自由真菌产生的初级代谢物的化合物，其并非初级代谢物且不是生长所必需的。
如本文中所使用的术语「萃取物」系指在样品制备过程期间获得且包含活性(先导)化合物的所有可能的萃取物。该萃取物可以采用液体、固体或粉末形式。
如本文中所使用的术语「活性萃取物」系指展现出所要生物活性的所有可能的萃取物。本发明的此类活性萃取物的实例包括(但不限于)粗萃取物、液体发酵物、管柱层析级分、经高效液相层析(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)纯化的级分、经薄层层析 (thin layer chromatography，TLC)纯化的级分等。
如本文中所使用的术语「溶剂」系指能够溶解另一种物质的碳基液体。
如本文中所使用的术语「非极性溶剂」系指极性指数不超过约2.0的任何有机溶剂。此类非极性溶剂的实例包括(但不限于)己烷、石油醚、四氯化碳及其混合物。
如本文中所使用的术语「极性溶剂」系指极性指数大于约2.0且通常容易与水混溶的任何有机溶剂。此类中等极性溶剂的实例包括(但不限于)甲醇、乙醇、乙腈及其混合物。
如本文中所使用的术语「硅胶」系指以合成方式从硅酸钠制得的颗粒状、玻璃状、多孔形式的二氧化硅。硅胶含有奈米多孔二氧化硅微结构，悬浮于液体内部。
如本文中所使用，如本文中所使用的术语「溶离溶液」系指用于从管柱层析、离子交换树脂等溶离萃取物的溶液。
如本文中所使用的术语「预防」系指延迟易感受试者的症状发作，减少病症或病状的发生，或抑制病症或病状的发生，或阻止病症或病状的发展。
如本文中所使用的术语「治疗(treating)」或「治疗(treatment)」系指缓解、减轻、逆转及/或改善易感受试者的病症或病状或其一或多种症状，或停止该疾病或病状的症状。
如本文中所使用的术语「受试者」系指动物，尤其是哺乳动物。在一个较佳实施例中，术语「受试者」表示人类。
如本文中所使用的术语「治疗有效量」系指单独使用或与其他用于预防或治疗牙周炎的治疗/药剂组合使用的活性成分的展现治疗功效的量。
如本文中所使用的术语「医药学上可接受的载剂」系指溶剂、稀释剂、黏合剂、黏着剂、佐剂、赋形剂、受体、稳定剂、类似物、调味剂、甜味剂、乳化剂或防腐剂，其为一般熟习此项技术者所熟知，用于制造医药或膳食组合物。医药学上可接受的载剂的实例包括 (但不限于)水、盐水、缓冲剂及惰性无毒固体。
如本文中所使用的术语「投与(administering)」或「投与(administration)」系指可用于实现本发明的组合物或药剂至所要生物学作用位点的递送的方法。
如本文中所使用的术语「病状」、「疾病」、「病症」或「症候群」可互换使用。
桑黄属的来源
桑黄属物种的实例包括(但不限于)小囊桑黄(Sanghuangporusmicrocystideus)、环区桑黄 (Sanghuangporus zonatus)、暴马桑黄(Sanghuangporusbaumii)、桑黄属桑黄(Sanghuangporus sanghuang)、小孔忍冬桑黄(Sanghuangporuslonicericola)、杨树桑黄(Sanghuangporus vaninii)、韦尔桑黄(Sanghuangporusweirianus)、高山桑黄(Sanghuangporus alpinus)及锦带花桑黄(Sanghuangporusweigelae)。
在本发明的一个较佳实施例中，桑黄属为桑黄属桑黄。
制备过程及可从该等制备过程获得的萃取物
本发明提供一种培养担子菌桑黄属桑黄以产生各种次级代谢物的方法。
本发明提供一种用于制备桑黄属桑黄的液体发酵物的方法，该方法包含在培养液中在适合桑黄属的条件下培养桑黄属。
本发明提供一种用于制备桑黄属萃取物的方法，该方法包含以下步骤：
(a)藉由在培养液中培养桑黄属而获得桑黄属液体发酵物；及
(b)藉由将该桑黄属液体发酵物与醇混合而获得该桑黄属萃取物。
本发明提供一种用于制备
Figure RE-GDA0002176160460000051
(化合物1)及
Figure RE-GDA0002176160460000052
(化合物2)的方法，该方法包含以下步骤：
(a)藉由在培养液中在适合桑黄属的条件下培养桑黄属而获得桑黄属液体发酵物；
(b)藉由将该桑黄属液体发酵物与醇混合而获得醇溶性萃取物；
(c)对该醇溶性萃取物进行硅胶管柱层析；
(d)藉由用溶离溶液溶离该管柱而获得不同溶离液；及
(e)藉由薄层层析(二氯甲烷:丙酮：40:1)收集第一溶离级分及第二溶离级分，其中该第一溶离级分包含该化合物1且该第二溶离级分包含该化合物2。
在本发明的步骤(b)中，醇为甲醇、乙醇或正丁醇。
在本发明的步骤(d)中，管柱系用二氯甲烷/乙酸乙酯(1:1)溶离。
在本发明的步骤(d)中，管柱系用2×、3×、4×或5×管柱体积的二氯甲烷/乙酸乙酯(1:1)溶离。
在本发明的步骤(d)中，管柱依序用二氯甲烷/乙酸乙酯(1:1)、二氯甲烷/乙酸乙酯/甲醇 (1:1:0.5)及二氯甲烷/乙酸乙酯/甲醇(1:1:1)溶离。
在本发明的步骤(d)中，管柱依序用2×、3×、4×或5×管柱体积二氯甲烷/乙酸乙酯(1:1)、 2×、3×、4×或5×管柱体积二氯甲烷/乙酸乙酯/甲醇(1:1:0.5)及2×、3×、4×或5×管柱体积二氯甲烷/乙酸乙酯/甲醇(1:1:1)溶离。
在一个实施例中，在步骤(d)之后，其进一步包含浓缩该溶离级分及/或干燥该级分以获得膏体或固体发酵物的步骤。
在本发明的步骤(e)中，溶离缓冲液为二氯甲烷:丙酮(10:1)、二氯甲烷:丙酮(20:1)、二氯甲烷:丙酮(30:1)、二氯甲烷:丙酮(40:1)、二氯甲烷:丙酮(50:1)或二氯甲烷:丙酮(60:1)。
在一些实施例中，溶剂为非极性溶剂或极性溶剂。根据本发明，所用硅胶可为硅胶60 GF254、硅胶60(小于0.063mm)、硅胶60(0.2-0.5mm)、硅胶60(0.063-0.200mm)、硅胶60特纯、硅胶60(0.040-0.063mm)、硅胶60(35-70mm)或硅胶60F254(0.063-0.200mm)。
根据本发明，管柱层析中所用的溶离溶液可以包括(但不限于)二氯甲烷/乙酸乙酯、二氯甲烷/乙酸乙酯/甲醇、正己烷/乙酸乙酯、二氯甲烷:丙酮、甲醇、乙醇及乙醇/乙酸乙酯。
在本发明的一个实施例中，二氯甲烷/乙酸乙酯溶剂中二氯甲烷与乙酸乙酯之间的体积比、正己烷/乙酸乙酯溶剂中正己烷与乙酸乙酯之间的体积比及乙醇/乙酸乙酯溶剂中乙醇与乙酸乙酯之间的体积比可为95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、 55:45、50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90及95:5。在本发明的一个较佳实施例中，所用二氯甲烷/乙酸乙酯溶剂的比率为50:50。
在本发明的一个实施例中，二氯甲烷/乙酸乙酯/甲醇的体积比可为1:1:0.3、1:1:0.4、 1:1:0.5、1:1:0.6、1:1:0.7、1:1:0.8、1:1:0.9、1:1:1、1:0.3:1、1:0.4:1、1:0.5:1、1:0.6:1、 1:0.7:1、1:0.8:1、1:0.9:1、0.3:1:1、0.4:1:1、0.5:1:1、0.6:1:1、0.7:1:1、0.8:1:1或0.9:1:1。
本发明亦提供一种获自上文所描述的制程的桑黄属液体发酵物或桑黄属萃取物。
在本发明的一个实施例中，桑黄属液体发酵物或桑黄属萃取物包含
Figure RE-GDA0002176160460000061
及/或
Figure RE-GDA0002176160460000062
本发明亦提供包含化合物1
Figure RE-GDA0002176160460000071
及化合物2
Figure RE-GDA0002176160460000072
的组合物。
桑黄属的培养条件
根据一个实施例，桑黄属桑黄系在麦芽萃取物琼脂(malt extract agar，MEA)培养基上培养6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19 天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天或30天。
桑黄属桑黄菌落(6至21天)系在含有液体培养基的培养三角瓶中在22℃、23℃、24℃、 25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃下培养7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、 14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天或21天。
该液体培养基包含玉米淀粉、玉米浆(corn steep liquor)、酵母萃取物、pH约5.8-6.3的海盐蒸馏水。
ER平台
本发明提供一种用于筛选具有雌激素受体(ER)活性的化合物的方法，该方法包含以下步骤：
(a)提供表现雌激素反应组件(ERE)及报导基因的转染细胞；
(b)在该化合物、阳性对照或阴性对照存在下培养该等转染细胞；及
(c)量测该转染细胞中报导基因的活性；
其中与该阴性对照相比该报导基因的升高的活性指示该化合物具有ER活性，且其中该阳性对照为
Figure RE-GDA0002176160460000073
(化合物1)及/或
Figure RE-GDA0002176160460000074
(化合物2)。
在本发明的一个实施例中，ERE为5'-GGTCAnnnTGACC-3'(其中n为A、T、C或G)(SEQID NO:7)。
在本发明的一个实施例中，报导基因可为碱性磷酸酶(SEAP)、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)或红色荧光蛋白(redfluorescent protein，RFP)。
组合物
根据一个实施例，本发明提供一种组合物，其包含治疗有效量的可自本发明的制造方法获得的桑黄属萃取物及医药学上可接受的载剂。
口服组合物一般包括惰性稀释剂或可食用载剂。口服组合物可为液体，或可以封装于明胶胶囊中或压缩成锭剂。可包括医药学上相容的黏合剂及/或佐剂材料作为口服组合物的一部分。锭剂、丸剂、胶囊、糖衣锭及其类似物可含有以下成分或具有类似性质的化合物中的任一者：黏合剂，诸如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，诸如淀粉或乳糖；崩解剂，诸如褐藻酸、淀粉羟基乙酸钠(Primogel)或玉米淀粉；润滑剂，诸如硬脂酸镁或斯特罗特斯 (Sterotes)；滑动剂，诸如胶状二氧化硅；甜味剂，诸如蔗糖或糖精；及/或调味剂，诸如胡椒薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂。经黏膜投药可经由使用鼻喷雾剂或栓剂而实现。对于经皮投药，通常将活性化合物调配成如此项技术中熟知的软膏、油膏、凝胶或乳膏。
该组合物可以习知制剂形式向患者经口或非经肠投与，习知制剂形式诸如胶囊、微囊、锭剂、颗粒剂、散剂、糖衣锭、丸剂、栓剂、注射剂、悬浮液及糖浆。适合调配物可藉由常用方法使用诸如以下的习知有机或无机载剂来制备：赋形剂(例如蔗糖、淀粉、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、葡萄糖、纤维素、滑石、磷酸钙或碳酸钙)、黏合剂(例如纤维素、甲基纤维素、羟甲基纤维素、聚丙基吡咯啶酮、聚乙烯吡咯啶酮、明胶、阿拉伯胶(gum arabic)、聚乙二醇、蔗糖或淀粉)、崩解剂(例如淀粉、羧甲基纤维素、羟丙基淀粉、经低取代的羟丙基纤维素、碳酸氢钠、磷酸钙或柠檬酸钙)、润滑剂(例如硬脂酸镁、轻质无水硅酸、滑石或月桂基硫酸钠)、调味剂(例如柠檬酸、薄荷脑、甘胺酸或橙粉)、防腐剂(例如苯甲酸钠、亚硫酸氢钠、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)、稳定剂(例如柠檬酸、柠檬酸钠或乙酸)、悬浮剂(例如甲基纤维素、聚乙烯吡咯啶酮或硬脂酸铝)、分散剂(例如羟丙基甲基纤维素)、稀释剂(例如水)及基础蜡(例如可可脂、白凡士林或聚乙二醇)。在一些实施例中，本发明的组合物可以采用半固体或固体形式，诸如牙膏、凝胶洁牙剂、牙粉、假牙清洁片、口香糖或固体锭剂或类似物。
效用
本发明的萃取物、粗萃取物、液体发酵物及组合物可用于预防、治疗有需要的受试者的雌激素依赖性病状、疾病、病症或症候群，或降低其风险。因此，本发明提供一种用于预防或治疗有需要的受试者的雌激素依赖性病状、疾病、病症或症候群的方法，该方法包含向受试者投与本发明的萃取物、粗萃取物、液体发酵物及组合物。
在一个较佳实施例中，该雌激素依赖性病状、疾病、病症或症候群包括(但不限于)乳腺痛(乳房疼痛/压痛)、乳房纤维瘤、乳房发育(乳房增大)、巨乳症(乳房肥大)、心血管疾病、中风、男性女乳症、乳癌、骨质疏松症、女孩早熟症、黑斑、月经过多、子宫内膜异位、子宫内膜增生、子宫腺肌症、子宫纤维瘤、子宫癌(例如，子宫内膜癌)、卵巢癌及男性高雌性素症，诸如某些病状，如硬化及克氏症候群(Klinefelter's syndrome)。
在一个较佳实施例中，心血管疾病包括(但不限于)高血压(hypertension)(高血压(high blood pressure))、冠心病(心脏病发作)、脑血管疾病(中风)、周边血管疾病、心脏衰竭、风湿性心脏病、先天性心脏病、心肌病、高血压性心脏病、风湿性心脏病、心肌病、心律不整、心脏瓣膜病、心脏炎、主动脉瘤、血栓栓塞病及静脉血栓形成。
在一个较佳实施例中，该组合物视情况包含适用于预防或治疗雌激素依赖性病状、疾病、病症或症候群的习知药物或试剂。此等习知药物或试剂的正常剂量为此项技术中所熟知。此等习知药物或试剂包括(但不限于)SERM(诸如克罗米芬(clomifene)、奥美昔芬(ormeloxifene)、雷诺昔酚(raloxifene)、他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、拉索昔芬(lasofoxifene)及奥培米芬(ospemifene))；雌激素受体拮抗剂，诸如氟维司群(fulvestrant)；芳香酶抑制剂，诸如阿那曲唑(anastrozole)及依西美坦(exemestane)；促性腺激素释放激素 (gonadotropin-releasing hormone，GnRH)类似物，诸如亮丙瑞林(leuprorelin)及西曲瑞克 (cetrorelix)；及/或其他抗促性腺激素(antigonadotropin)，诸如达那唑(danazol)、孕三烯酮 (gestrinone)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)及乙酸甲羟孕酮(medroxyprogesterone acetate)。
在一个较佳实施例中，该组合物视情况包含适用于预防或治疗骨质疏松症的习知药物或试剂。此等习知药物或试剂的正常剂量为此项技术中所熟知。此等习知药物或试剂包括(但不限于)抗骨质吸收剂(antiresoptive agent)(例如，双磷酸盐)、核因子κB配体受体活化剂 (receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand，RANKL)抑制剂、SERM(诸如克罗米芬、奥美昔芬、雷诺昔酚、他莫昔芬、托瑞米芬、拉索昔芬及奥培米芬)、同化剂(例如，特立帕肽(teriparatide))及雷奈酸锶(strontium ranelate)。
在一个较佳实施例中，该组合物视情况包含适用于预防或治疗乳癌的习知药物或试剂。此等习知药物或试剂的正常剂量为此项技术中所熟知。此等习知药物或试剂包括(但不限于) 阿贝马昔布(Abemaciclib)、阿布拉生(Abraxane)(太平洋紫杉醇(Paclitaxel)白蛋白稳定的奈米粒子调配物)、曲妥珠单抗-美坦新偶联物(Ado-Trastuzumab Emtansine)、阿飞尼妥(Afinitor) (依维莫司(Everolimus))、阿那曲唑、阿可达(Aredia)(帕米膦酸二钠(Pamidronate Disodium))、阿丽米克斯(Arimidex)(阿那曲唑)、阿诺新(Aromasin)(依西美坦)、卡培他滨 (Capecitabine)、环磷酰胺(Cyclophosphamide)、多西他赛(Docetaxel)、盐酸小红莓 (Doxorubicin Hydrochloride)、艾伦斯(Ellence)(盐酸表柔比星(Epirubicin Hydrochloride))、盐酸表柔比星、甲磺酸艾日布尔(Eribulin Mesylate)、依维莫司(Everolimus)、依西美坦、5-FU (氟尿嘧啶注射剂)、法乐通(Fareston)(托瑞米芬)、法洛德克斯(Faslodex)(氟维司群)、弗隆 (Femara)(来曲唑(Letrozole))、氟尿嘧啶注射剂、氟维司群、盐酸吉西他滨(Gemcitabine Hydrochloride)、健择(Gemzar)(盐酸吉西他滨)、乙酸戈舍瑞林(Goserelin Acetate)、哈拉温 (Halaven)(甲磺酸艾日布尔)、贺癌平(Herceptin)(曲妥珠单抗(Trastuzumab))、艾博兰斯 (Ibrance)(帕泊昔布(Palbociclib))、伊沙匹隆(Ixabepilone)、艾克斯普拉(Ixempra)(伊沙匹隆)、卡德克拉(Kadcyla)(曲妥珠单抗-美坦新偶联物)、科斯恰里(Kisqali)(瑞博昔布(Ribociclib))、二甲苯磺酸拉帕替尼(Lapatinib Ditosylate)、来曲唑、灵帕杂(Lynparza)(奥拉帕尼(Olaparib))、乙酸甲地孕酮、甲胺喋呤(Methotrexate)、顺丁烯二酸来那替尼(NeratinibMaleate)、乐宁克斯(Nerlynx)(顺丁烯二酸来那替尼)、奥拉帕尼(Olaparib)、太平洋紫杉醇、太平洋紫杉醇白蛋白稳定的奈米粒子调配物、帕泊昔布、帕米膦酸二钠、帕杰它(Perjeta)(帕妥珠单抗(Pertuzumab))、帕妥珠单抗、瑞博昔布、柠檬酸他莫昔芬、紫杉醇(Taxol)(太平洋紫杉醇)、紫杉德(Taxotere)(多西他赛)、噻替派(Thiotepa)、托瑞米芬、曲妥珠单抗、曲西乐 (Trexall)(甲胺喋呤)、泰克泊(Tykerb)(二甲苯磺酸拉帕替尼)、维泽尼(Verzenio)(阿贝马昔布)、硫酸长春碱(Vinblastine Sulfate)、希罗达(Xeloda)(卡培他滨)、诺雷德(Zoladex)(乙酸戈舍瑞林)。
提供以下实例以帮助熟习此项技术者实践本发明。即使如此，该等实例仍不应视为对本发明的不当限制，因为一般熟习此项技术者可以在不脱离本发明的精神或范畴的情况下对本文中所论述的实施例进行修改及变化。
实例1：微生物材料
在此研究中所用的真菌系从桑属物种的叶片分离，且基于rDNA内转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)序列及核糖体大次单位(large subunit，LSU)序列而被鉴定为是桑黄属桑黄(Sanghuangporus sanghuang/S.sanghuang)。
鉴定
分析来自真菌株的rDNA ITS序列及LSU序列。下表1中显示所用引子序列。
表1
引子名称 序列 SEQ ID NO
V9G 5'-TTACGTCCCTGCCCTTTGTA-3' SEQ ID NO:1
LR1 5'-GGTTGGTTTCTTTTCCT-3' SEQ ID NO:2
LR5 5'-TCCTGAGGGAAACTTCG-3' SEQ ID NO:3
LROR 5'-ACCCGCTGAACTTAAGC-3' SEQ ID NO:4
使用V9G/LR1引子组或LR5/LROR引子组按以下条件进行PCR反应：(1)94℃，5分钟，1 个循环；(2)94℃，30秒；50℃，1分钟；及72℃，1分钟，35个循环；及(3)72℃，10分钟， 1个循环。
扩增区段ITS1-5.8S-ITS2(643bp)。在比较之后，发现区段ITS1-5.8S-ITS2与NCBIGenBank数据库中的模式菌株Wu0903-1(寄存号码JN794061)具有99％(639/642)的序列相似性。
扩增区段LSU(877bp)。在比较之后，发现存在两种突变(M＝A或C，Y为T或C)且区段LSU具有84.6％(720/851)的覆盖率且与模式菌株Wu0903-1具有99％(718/720)的序列相似性。
桑黄属桑黄38847具有以下ITS序列及LSU序列：
ITS序列(SEQ ID NO:5)：
Figure RE-GDA0002176160460000111
LSU序列(SEQ ID NO:6)：
Figure RE-GDA0002176160460000112
Figure RE-GDA0002176160460000121
桑黄属桑黄38847在2018年8月29日根据布达佩斯条约寄存于德国微生物菌种保藏中心 (DSMZ)且分配得到寄存号码DSM 32914，并在2018年11月6日以寄存号码BCRC930200寄存于食品工业发展研究所(FIRDI)的生物资源保存及研究中心(BCRC)。
实例2：制备发酵液
将9-cm皮氏培养皿(Petri dish)中的麦芽萃取物琼脂(MEA)培养基上的各桑黄属桑黄38847 株的21日龄菌落切割至含有200ml蒸馏水的瓶中并掺合30秒以制备真菌接种物用于液体发酵。将10ml真菌接种物添加至含有200ml液体培养基(30g玉米淀粉、10g玉米浸渍液、5g 酵母萃取物及在1L蒸馏水中的2g海盐，pH 6)的500-ml三角瓶中。将所接种的培养基在25℃下在旋转震荡器上在100rpm的速度下培育两周。收获14L的发酵液，随后过滤以移除真菌菌丝体，获得发酵产物。
实例3：萃取及分离
用BuOH萃取自实例2获得的桑黄属桑黄株的发酵产物中的每一者(14L)，得到BuOH萃取物(11.6g)及H2O溶性级分(22.7g)。对BuOH萃取物(11.6g)进行硅胶管柱层析，其中(二氯甲烷/乙酸乙酯：1:1)用作主要溶离溶液且甲醇用于逐渐增加溶离剂极性(二氯甲烷/乙酸乙酯：1:1→二氯甲烷/乙酸乙酯/甲醇：1:1:0.5→二氯甲烷/乙酸乙酯/甲醇：1:1:1→甲醇，产生 17个溶离级分(溶离级分编号1至17))。藉由制备型TLC(二氯甲烷/丙酮：40:1)纯化级分1，得到两个溶离级分，其中第一溶离级分包含化合物1(36.4mg)且第二溶离级分包含化合物2 (12.8mg)。化合物1为微黄色油状物。化合物2为无色油状物。
实例4：表征化合物1及化合物2
化合物1
化合物1的结构经过判别为(E)-5-(2,2-二甲基-6-亚甲基环己基)-3-甲基戊-2-烯酸(又名桑黄灵(sanghuanglin))，其具有以下结构：
Figure RE-GDA0002176160460000131
表2中显示化合物1在CDCl3中的1H-及13C-NMR光谱数据。
表2
Figure RE-GDA0002176160460000132
藉由HSQC、HMBC及COSY实验进行碳氢归属(assignment)。
化合物2
化合物2结构经判别为(+)-(2E,4E)-5-((S)-2,2-二甲基-6-亚甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯酸(亦称为MDA)，其具有以下结构：
Figure RE-GDA0002176160460000133
表3中显示化合物2在CDCl3中的1H-及13C-NMR光谱数据。
表3
Figure RE-GDA0002176160460000141
藉由HSQC、HMBC及COSY实验进行碳氢归属。
实例5：ER总活性分析
雌激素受体(ER)模型
ER为配体活化的强化子蛋白，其为类固醇/核受体超家族的成员。ER以高亲和力结合于称为雌激素反应组件(ERE)的特异性DNA序列(5'-GGTCAnnnTGACC-3'，SEQ ID NO:7)且响应于雌二醇(E2)转活化基因表现(Nucleic Acids Res.2001年7月15日；29(14):2905-2919)。分泌性碱性磷酸酶(secreted alkaline phosphatase，SEAP)为被广泛用于研究启动子活性或基因表现的报导子(reporter)。
将1ml 0.05％胰蛋白酶-EDTA溶液添加至T75细胞培养角瓶中的80％汇合度(confluence)(若细胞处于对数期，则在第5天)的MCF-7细胞中，在37℃下持续5分钟。分离细胞后，添加5ml经炭处理的含有FBS的培养基以悬浮细胞。以经活性碳处理过的FBS所配置的培养基2ml制备细胞悬浮液，使细胞悬浮液的最终体积为10ml。用8通道移液器将混合物分配至96孔盘的各孔中(100微升/孔，2×104个细胞/孔)，且将96孔盘置放于37℃及5％CO2下隔夜以获得约70％汇合度。
为了转染表现受ERE调控报导基因的细胞，制备转染混合物。
Figure RE-GDA0002176160460000142
转染试剂为一种广谱试剂，其能够在包括初级细胞在内的诸多哺乳动物细胞类型中提供高效质体DNA 递送。具体而言，将1ml
Figure RE-GDA0002176160460000143
14μl
Figure RE-GDA0002176160460000144
转染试剂及5μg pERE-TA-SEAP 添加至1.5ml艾本德管(Eppendorf)中且使转染混合物静置15-30分钟。
将含有TransIT-DNA的转染混合物分配至96孔盘的各孔中(10微升/孔)，且将96孔盘在 37℃及5％CO2下置放24小时。使用8通道移液器从96孔盘移除上清液。向96孔盘的各孔添加 90μl经活性碳处理的含有FBS的培养基(不含酚红)、视情况选用的0.1nM E2刺激剂(视筛选目的而定)及10μl样品(E2、38847发酵液、化合物1及化合物2)，在37℃、5％CO2培育箱中持续 48小时。
结果
表4
Figure RE-GDA0002176160460000151
a相对雌激素受体(ER)活性由所关注样品的活性与未处理细胞(仅培养基)的活性之间的比率表示
如从表4可以看出，38847发酵液的发酵液具有优异ER活性。
如图1中所示，化合物1及化合物2在不同浓度(2μg/ml、5μg/ml及10μg/ml)下展现显著的 ER活性。令人惊讶地发现，化合物1及化合物2相较于17-β雌二醇(阳性对照)达到更佳的ER活性。
实例6：评估SERM活性
细胞培养
使CV-1细胞(草原猴(Cercopithecus aethiops)肾细胞)以70-80％的汇合生长且在浓度为 5×104个细胞/毫升的细胞悬浮液中收获该等细胞。将细胞悬浮液添加至96孔盘的各孔(100微升/孔)且将96孔盘在37℃、5％CO2培育箱中培育隔夜。
制备用于转染的DNA混合物
在1.5ml艾本德管中混合500μl
Figure RE-GDA0002176160460000152
缓冲液、5μg pERE-TA-SEAP及5μg ERαDNA质体(或ERβDNA质体)，随后添加20μl
Figure RE-GDA0002176160460000153
转染试剂及1.5ml培养基。将DNA混合物添加至96孔盘的各孔(20μl)且将96孔盘在37℃、5％CO2培育箱中培育4小时。
细胞收获
从96孔盘的各孔移除上清液溶液，随后向96孔盘的各孔添加90μl经活性碳处理的不含酚红的FBS培养基。将待测试样品添加至96孔盘的孔，将其在37℃、5％CO2培育箱中培育48至 72小时。收获细胞用于后续报导基因分析及细胞毒性分析。
报导基因分析
从96孔盘收集25μl细胞培养上清液，且随后将其添加至新的发光微量培养盘，将其在 65℃水浴下培育30分钟以移除活性内源性碱性磷酸酶，且在冰上置放5分钟并离心(1,000 rpm)一分钟。在室温下添加25μl Phospha-LightTM分析缓冲液，持续5分钟，且在室温下添加 25μl含有CSPD(3-(4-甲氧基螺{1,2-二氧杂环丁烷-3,2'-(5'-氯)三环[3.3.1.13,7]癸}-4-基)苯基磷酸二钠)的Phospha-LightTM反应缓冲液，持续20分钟。将发光微量培养盘置放于VictorTMLight 1420发光计数器中且量测SEAP酶活性。
结果
Figure RE-GDA0002176160460000161
a：相对雌激素受体(ER)活性由所关注样品的活性与未处理细胞(仅培养基)的活性之间的比率表示
b：化合物1＝桑黄灵；
c：化合物2＝(+)-(2E,4E)-5-((S)-2,2-二甲基-6-亚甲基环己基)-3-甲基戊-2,4-二烯酸(亦称为 MDA)
17-β雌二醇(E2)作为阳性对照显示出1.3的ER-β/ER-α比。出人意料的是，化合物1及化合物2分别显示3.1及2.2的ER-β/ER-α比。结果证明，化合物1及化合物2的ER-β活性优于ER-α活性，从而具有SERM活性。
预期熟习此项技术者能想到如上述说明性实例中所阐述的本发明的许多修改及变化。因此，本发明应仅受随附申请专利范围限制。
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<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 1
ttacgtccct gccctttgta 20
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 2
ggttggtttc ttttcct 17
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 3
tcctgaggga aacttcg 17
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 4
acccgctgaa cttaagc 17
<210> 5
<211> 643
<212> DNA
<213> 桑黄属ITS序列
<400> 5
gtgctggtgc gaaatcgcgc atgtgcacgg tcttcgcgct caaatccaac tcaaacccct 60
gtgcacctta tatatcgcga gtcgaagtta gtagcctgag gtcttgtaag taattagtag 120
aagggcgaaa gcgcgactct tgctcgttag gtagcctttc gaaaatgaaa gcgagtgcgt 180
cgggtgaaga cttcggcttg tcgttacaaa acaccttata ttgtctttgt gaatgtaatg 240
ctccttgtgg gcgaaaataa atacaacttt caacaacgga tctcttggct ctcgcatcga 300
tgaagaacgc agcgaaatgc gataagtaat gtgaattgca gaattcagtg aatcatcgaa 360
tctttgaacg caccttgcgc cccttggtat tccgaggggc atgcctgttt gagtgtcatg 420
tttatctcaa accgctcgtc tttcttaatt gaagggcttg aggtttggac ttggaggttt 480
actgctggcg cctttcgagg ggtcggctcc tcttaaatac attagctggg ctttggctcg 540
cgtttacggt gtaatagttg attccattca ccaacgagcg cttgcctgac gagcttgctt 600
ctagccgtcc gcgtcgtcgg acaaggagtc acctccttct tga 643
<210> 6
<211> 877
<212> DNA
<213> 桑黄属LSU序列
<400> 6
ctgcgagtga agcgggaaga gctcaaattt aaaatctggc ggccttctgg acgtccgagt 60
tgtagtctgg agaagtgtta tccgcgtcgg accgtgtaca agtctcctgg aacggagcgt 120
catagagggt gagaatcccg tccatgacac ggacgcccga tgctatgtga ggcactctcg 180
aagagtcgag ttgtttggga atgcagctca aaatgggtgg taaattccat ctaaagctaa 240
atattggcga gagaccgata gcgaacaagt accgtgaggg aaagatgaaa agcactttgg 300
aaagagagtt aaacagtacg tgaaattgtt gaaagggaaa cgcttgaagt cagtcgcgtc 360
ccgtggaact cagcctggtt tcgacctggt gtactttcca tgtggacggg tcaacatcaa 420
tttcggccgg tggacaaggg cgaggggaat gtagcgttgc ttcggcgacg tgttatagcc 480
ccccgtcgca tacactggct gggattgagg accgcagcac gcccttgtgg ccggggggtt 540
cgccccacgt aacgtgctta ggatgttggc ataatggctt taagcgaccc gtcttgaaac 600
acggaccaag gagtctaaca tgcttgcgag tgttcgggtg gaaaaccctt gcgcgtaatg 660
aaagtgaaag ttgggaacct ccgcgagggg gtgcaccgac gcccggccct gacgttctct 720
gacggtgccg cggtagagca cgtatgttgg gacccgaaag atggtgaact atgcctgaat 780
agggcgaagc cagaggaaac tctggtggag gctcgtagcg attctgacgt gcaaatcgat 840
cgtcaaattt gggtataggg gcgaaagact aatcgaa 877
<210> 7
<211> 13
<212> DNA
<213> 雌激素反应组件(EREs)
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(8)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 7
ggtcannntg acc 13

Claims (19)

1.一种用于制备桑黄属(Sanghuangporus)液体发酵物的方法，其包含在培养液中培养桑黄属。
2.一种用于制备桑黄属萃取物的方法，其包含以下步骤：
(a)藉由在培养液中培养桑黄属而获得桑黄属液体发酵物；及
(b)藉由将该桑黄属液体发酵物与醇混合而获得该桑黄属萃取物。
3.一种用于制备
Figure FDA0002111568710000011
及
Figure FDA0002111568710000012
的方法，其包含以下步骤：
(a)藉由在培养液中培养桑黄属而获得桑黄属液体发酵物；
(b)藉由将该桑黄属液体发酵物与醇混合而获得醇溶性萃取物；
(c)对该醇溶性萃取物进行硅胶管柱层析；
(d)藉由用溶离溶液溶离该管柱而获得不同溶离液；及
(e)藉由薄层层析(二氯甲烷∶丙酮：40∶1)收集第一溶离级分及第二溶离级分，其中该第一溶离级分包含该化合物1且该第二溶离级分包含该化合物2。
4.如权利要求1至3中任一项的方法，其中桑黄属系选自由桑黄属桑黄(S.sanghuang)38847(DSMZ寄存号码DSM 32914及食品工业发展研究所寄存号码BCRC 930200)组成的群。
5.如权利要求2或3的方法，其中在步骤(b)中，该等醇系选自由甲醇、乙醇及丁醇组成的群。
6.如权利要求3的方法，其中在步骤(d)中，该管柱系用二氯甲烷/乙酸乙酯(1∶1)溶离。
7.如权利要求3的方法，其中在步骤(d)中，该管柱依序用二氯甲烷/乙酸乙酯(1∶1)、二氯甲烷/乙酸乙酯/甲醇(1∶1∶0.5)及二氯甲烷/乙酸乙酯/甲醇(1∶1∶1)溶离。
8.如权利要求3的方法，在步骤(e)之后，其进一步包含浓缩该溶离级分及/或干燥该级分以获得膏体或固体发酵物的步骤。
9.一种桑黄属液体发酵物，其获自如权利要求1的方法。
10.一种桑黄属萃取物，其获自如权利要求2的方法。
11.如权利要求9的桑黄属液体发酵物，其包含
Figure FDA0002111568710000021
及/或
Figure FDA0002111568710000023
12.如权利要求10的桑黄属萃取物，其包含
Figure FDA0002111568710000024
及/或
Figure FDA0002111568710000025
13.一种医药组合物，其包含如权利要求9的桑黄属液体发酵物或如权利要求10的桑黄属萃取物及医药学上可接受的载剂。
14.一种如权利要求9的桑黄属液体发酵物或如权利要求10的桑黄属萃取物的用途，其系用于制造用于预防或治疗雌激素依赖性病状、疾病、病症或症候群的药剂。
15.一种化合物在制造用于预防或治疗雌激素依赖性病状、疾病、病症或症候群的药剂方面的用途，其中该化合物系选自
Figure FDA0002111568710000026
及/或
Figure FDA0002111568710000027
16.如权利要求14或15的用途，其中该雌激素依赖性病状、疾病、病症或症候群系选自由以下组成的群：乳腺痛(乳房疼痛/压痛)、乳房纤维瘤、乳房发育(乳房增大)、巨乳症(乳房肥大)、心血管疾病、中风、男性女乳症、乳癌、骨质疏松症、女孩早熟症、黑斑、月经过多、子宫内膜异位、子宫内膜增生、子宫腺肌症、子宫纤维瘤、子宫癌、卵巢癌及高雌性素症。
17.如权利要求14的用途，其中该液体发酵物具有雌激素受体(estrogen receptor，ER)活性及选择性雌激素受体调节剂(selective estrogen receptor modulator，SERM)活性。
18.如权利要求15的用途，其中该化合物1及该化合物2具有ER活性及SERM活性。
19.一种用于筛选具有雌激素受体(ER)活性的化合物的方法，其包含以下步骤：
(a)提供表现雌激素反应组件(estrogen response element，ERE)及报导基因的经转染细胞；
(b)在该化合物、阳性对照或阴性对照存在下培养该等经转染细胞；及
(c)量测该报导基因的活性；
其中与该阴性对照相比该报导基因的升高的活性指示该化合物具有ER活性，且其中该阳性对照为
Figure FDA0002111568710000031
及/或
Figure FDA0002111568710000032
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