TWI564015B - 可用於降低血糖、血脂及降肝臟脂肪之牛樟芝純化物Ergostatrien-3β-ol之用途 - Google Patents

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Description

可用於降低血糖、血脂及降肝臟脂肪之牛樟芝純化物 Ergostatrien-3 β-ol之用途
本發明係關於一種牛樟芝純化物，特別是指牛樟芝純化物於製備降低血糖、血脂及/或肝臟脂肪之醫藥組合物之用途。
流行病學分析業已預測第二型糖尿病患者在2025年時將達到約3億人口。第二型糖尿病在所有的糖尿病患中佔了90%，其特徵是高血糖症，具體表現包括胰島素分泌異常或是在包含脂肪組織、骨骼肌和肝臟組織等周緣組織的胰島素作用不敏感性，後者又稱胰島素阻抗(insulin resistance)，其發生與遺傳或環境因素有關，而飲食成分在環境因素中扮演著一關鍵因素。
葡萄糖運轉蛋白4(Glucose transporter 4；以下簡稱為GLUT4)是全身葡萄糖體內平衡穩態的關鍵調節因子，胰島素或運動會動員GLUT4轉位，即GLUT4從細胞內儲存腔遷移至脂肪細胞及骨骼肌細胞膜表面，造成細胞攝取葡萄糖。而損害GLUT4表現、GLUT4轉移及/或胰島素訊息傳導，將影響胰島素刺激葡萄糖攝取，從而導致胰島素阻抗及高血糖血症。因此，增強GLUT4表現的治療策略將能促進抗糖尿病藥物的發現。
腺苷單磷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，以下簡稱為AMPK)是葡萄糖和脂質代謝的關鍵調節因子；因為在第二型糖尿病患者中，葡萄糖及脂質代謝是失調的，而AMPK調節劑已被提出對於葡萄糖及脂質代謝失調可達到有效治療。
牛樟芝(Clitocybe nuda or Lepista nuda，Antrodia camphorata)，俗名牛樟菇、紅樟芝，為多孔菌科(Polyporaceae)食用真菌，是台灣特有珍貴的藥用真菌，寄生於牛樟樹中空的內壁上，其子實體常應用於各種疾病的治療，例如抗腫瘤、保肝、增強免疫力等疾病。野生牛樟芝於民間被宣稱具有多樣活性及功效，包括解酒、解毒(food and drug intoxication)、治療腹瀉(diarrhea)、腹痛(abdominal pain)、治療高血壓(hypertension)、止癢(skin itching)、以及抗癌(cancer)。目前民間使用上的困難是野生牛樟芝取得不易，數量極為稀少且價格昂貴。目前牛樟芝可以人工培植，有液體發酵、固體培養法、和椴木栽培法。子實體和培養的菌絲體兩者都含有脂肪酸、木質素、phenyl衍生物、倍半萜、固醇、三萜化合物。牛樟芝子實體具有免疫調節、抗氧化、和保肝的活性。液體發酵培養液具有抗腫瘤活性。培養的菌絲體具有抗發炎作用、血管鬆弛、和抗腫瘤活性。液體發酵培養液對四氯化碳誘導的大鼠具有保肝的活性。除此之外，牛樟芝的子實體對部分癌症也有抑制效果，因此，也同時有藥用，或開發成為防癌、抗癌健康食品的價值。
然而，目前對於從牛樟芝的深層發酵液中獲得的純化物Ergostatrien-3 β-ol(EK100，以下簡稱為EK100)，在經由高脂飲食又導致的糖尿病小鼠是否能具有抗糖尿病及抗高血脂的血糖、血脂控制以及改善脂肪肝的功效則未知。
本發明之第一目的在於開發牛樟芝純化物EK100的新用途，尤其是用於製備降低血糖，或應用於預防或治療糖尿病之醫藥化合物。
本發明之第二目的在於開發牛樟芝純化物EK100的新用途，尤其是用於製備降低血液脂質、或總膽固醇(total cholesterol，以下簡稱為TC)或三酸甘油酯(triglyceride，以下簡稱為TG)之醫藥化合物。
本發明之第三目的在於開發牛樟芝純化物EK100的新用途，尤其是用於製備增加血液的高密度脂蛋白之醫藥化合物。
本發明之第四目的在於開發牛樟芝純化物EK100的新用途，尤其是用於製備降低肝臟的脂質或三酸甘油酯之醫藥化合物。
本發明之第五目的在於開發牛樟芝純化物EK100的新用途，尤其是用於製備降低肝細胞空泡樣變現象(ballooning degeneration of hepatocyte)之醫藥化合物。
本發明之第六目的在於開發牛樟芝純化物EK100的新用途，尤其是用於製備增加骨骼肌的磷酸化腺苷單磷酸活化蛋白激酶(phospho-AMPK，以下簡稱為p-AMPK)、磷酸化蛋白質激酶B(phospho-Akt，以下簡稱為p-Akt)以及葡萄糖轉運蛋白4(GLUT4)之醫藥化合物。
本發明之第七目的在於開發牛樟芝純化物EK100的新用途，尤其是用於製備改善肝藏內的磷酸化腺苷單磷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)及/或改善骨骼肌蛋白質激酶B磷酸化(p-Akt)，並提升胰島性敏感性之醫藥化合物。
其中，本發明提供一種牛樟芝純化物，其係自牛樟芝深層發酵液的凍乾粉提取之純化物EK100(Ergostatrien-3 β-ol)；其中，該純化物EK100係 將牛樟芝深層發酵液的凍乾粉以甲醇在室溫下萃取三次；令該甲醇萃取液在真空中蒸發，得到棕色殘留物；將該棕色殘留物懸浮於純水中，利用乙酸乙酯將之分離出一混合物；將該混合物在矽膠上進行層析，利用己烷與乙酸乙酯的混合物洗提以增加極性，再以高效液相色譜法純化後製得一產物，將該產物經含有10%乙酸乙酯的己烷溶液洗提，並用乙醇進行重結晶後所製得。
藉此，透過高脂飲食誘發小鼠誘發的胰島素阻抗以及高血脂症，經施予活性物質EK100後，達到以下功效：(1)使血糖、糖化血色素(glycated hemoglobin，以下簡稱為HbA1c)、總膽固醇(TC)、三酸甘油酯(TG)、胰島素及瘦體素等血液數值明顯下降且最終改善胰島素阻抗；(2)降低肝臟空泡樣變(ballooning degeneration)以及內臟脂肪細胞尺寸(the average areas of adipocytes)；(3)使骨胳肌中的葡萄糖轉運蛋白4(GLUT4)及磷酸化蛋白質激酶B(p-Akt)蛋白表現量顯著地增加；(4)使骨胳肌及肝臟中的磷酸化腺苷单磷酸活化蛋白激酶(phospho-AMPK)蛋白表現量顯著增加；(5)降低肝臟磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Phosphoenolpyruvate carboxykinase，以下簡稱為PEPCK)及6-磷酸葡萄糖(glucose-6-phosphatase，以下簡稱為G6-Pase)的表現並降低葡萄糖生成；(6)純化物EK100通過減少膽固醇調節組件結合蛋白1c(sterol regulatory element binding protein-1c，以下簡稱為SREBP-1c)但增加過氧化物酶體增殖物活化受體α(peroxisome proliferator-activated receptor α，以下簡稱為PPAR α)的表 現量，來抑制肝臟脂肪酸合成及增加脂肪酸的氧化，而達到降低血液中三酸甘油酯的功效；(7)膽固醇調節元件結合蛋白2(sterol regulatory element binding protein-2，以下簡稱為SREBP-2)在膽固醇合成的調節中扮演重要角色，純化物EK100透過使肝臟SREBP-2的表現下降，達到降低血液中總膽固醇；(8)純化物EK100透過增加脂蛋白元A-I(apolipoprotein A-I，以下簡稱為apo A-I)在肝細胞的表現，而提高高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，以下簡稱為HDL-C)的濃度。apoA-I作為HDL-C中的主要載脂蛋白，流行病學的研究證實：提高血漿apoA-I的濃度，可能介導了HDL-C對抗冠狀心臟血管疾病發展的作用；因此，本發明純化物EK100具有效對抗冠狀心臟血管疾病發展之功效；(9)純化物EK100具有調節GLUT4、PEPCK、G6-Pase、SREBP-1c、SREBP-2、apo A-I及p-AMPK的功效，而具有治療第二型糖尿病及與其相關的高血脂症之潛力；(10)純化物EK100係提取自牛樟芝的成分，達到提供一種用於治療糖尿病的高安全性、低毒性之藥品有效成分替代物。
圖1係牛樟芝純化物EK100的化學結構式。
圖2A顯示本發明動物實驗中各組小鼠體重的曲線圖。
圖2B至圖2H顯示本發明動物實驗中各組小鼠在食物攝取量(圖2B)、內臟脂肪重量(圖2C)、血糖值(圖2D)、血液總膽固醇濃度(圖2E)、血液三酸甘油酯濃度(圖2F)、血液瘦素濃度(圖2G)、血液胰島素濃度(圖2H)的長條圖。
圖3A顯示本發明動物實驗中各組小鼠的附睾白色脂肪組織的病理切片圖。
圖3B顯示本發明動物實驗中各組小鼠的肝組織的病理切片圖。
圖4A顯示本發明動物實驗中各組小鼠肝臟組織中的PEPCK、G6-Pase、adiponectin、SREBP-1c、DGAT2(acyl-coenzyme A：diacylglycerol acyltransferase 2)、apo C-III、SREBP-2、apo A-I、PPARalpha、GAPDH表現進行半定量RT-PCR分析之數據圖式。
圖4B至圖4D顯示將圖4A中的PEPCK、G6-Pase、adiponectin、SREBP-1c、DGAT2、apo C-III、SREBP-2、apo A-I、PPAR α、GAPDH測得之信號經圖像分析而定量，且透過GAPDH使每個值標準化。
圖5A顯示本發明動物實驗中各組小鼠，以西方點墨分析法(Western blot)測定各骨胳肌中的GLUT4、phospho-AMPK(Thr172)/total-AMPK(Thr172)、phospho-Akt(Ser473)/total-Akt(Ser473)的蛋白質含量，以及肝臟中的phospho-AMPK(Thr172)/total-AMPK(Thr172)的蛋白質含量。
圖5B顯示將圖5A測得之蛋白質含量的定量長條圖。
圖6顯示本發明純化物EK100的提取方法流程圖。
本發明特徵與優點的一些典型實施例將在以下說明中詳細敘述。應理解的是本發明能夠在不同的態樣上具有各種的變化，然其皆不脫離本發明的範圍，且其中的說明及圖式在本質上係當作說明之用，而非用於限制本發明。
本發明提供了牛樟芝純化物EK100用於製備降低血糖、肝臟脂質、三酸甘油酯以及治療第二型糖尿病之醫藥化合物的新用途。以下將進一步說明牛樟芝純化物的提取方法及其功效試驗。
本發明的牛樟芝純化物是指從牛樟芝深層發酵液的凍乾粉提取之單一成分：純化物EK100(Ergostatrien-3 β-ol)。請配合參閱圖6所示，本發明純化物EK100的具體提取方法，係將1.6kg的牛樟芝深層發酵液的凍乾粉，以16公升的甲醇在室溫下萃取三次，每次萃取一天。該甲醇萃取液在真空中蒸發，得到棕色殘留物，將該棕色殘留物懸浮於1公升的純水中，然後用1公升的乙酸乙酯分三次將之分離出一混合物。將乙酸乙酯分層(95克)，在矽膠上進行層析，並用己烷與乙酸乙酯的混合物洗提，藉以增加極性並以高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，簡稱HPLC)進一步純化。將初提取出的純化物EK100(5.4克)產物，以含有10%乙酸乙酯的己烷溶液洗提，並用乙醇進行重結晶。
如圖1所示，顯示本發明牛樟芝純化物EK100(ergostatrien-3 β-ol)的化學結構式。
羅格列酮(rosiglitazone，以下簡稱為Rosi)為Thiazolidinediones(TZDs)類抗糖尿病藥物之一，其係過氧化體增殖活化受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ agonists，以下簡稱為PPAR γ)的親和劑。這類型的PPAR γ親合劑可降低血糖值；羅格列酮不會刺激胰島素分泌，而是透過直接 靶向胰島素阻抗和增加外週葡萄糖攝取，達到改善第二型糖尿病患的血糖控制，羅格列酮的作用方式主要促成胰島素增敏效果和增加GLUT4蛋白質含量。
藥品非諾貝特(Fenofibrate，以下簡稱為Feno)是一種PPAR α的活化劑，並在高三酸甘油酯血症的治療上行之多年。PPAR α是與脂質代謝相關的基因的關鍵調節因子，其通過參與調節脂質生成、脂肪酸氧化、能量消耗等許多靶基因，導血液三酸甘油酯和脂肪酸的減少。
對C57BL/6J小鼠進行高脂飲食對於建立早期第二型糖尿病是強大且有效的模型。C57BL/6J小鼠在高脂飲食的誘導下，不僅明顯增加脂肪組織的體積，也產生明顯的胰島素阻阻抗、高血脂症、高胰島素血症、高三酸甘油酯以及高膽固醇血症。二甲雙胍(Metformin)是目前相當普遍用於治療第二型糖尿病的抗糖尿病藥品，其能夠激活肝臟及骨骼肌中的AMPK；雖然二甲雙胍會導致包括乳酸性酸中毒的副作用，但仍被認為對第一型和第二型糖尿病的治療潛力。羅格列酮則是透過不同於二甲雙胍的訊息路徑達到激活AMPK的目的；並且羅格列酮也對脂肪激素的血漿濃度有影響，還會減少肝臟累積及改善胰島素阻抗有關，因此，羅格列酮被選為正對照組，用於評估EK100的抗糖尿療效與作用的對照藥物。α次元Thr172的磷酸化對AMPK之激活作用是必要的，所以本發明選擇高脂飲食小鼠模型來探討EK100對於抗糖尿病及抗高血脂方面進行了研究，包括AMPK激活、GLUT4含量。作為EK100可能的分子機轉，也分析對周邊組織的標靶基因表現量的影響，並且以與羅格列酮及非諾貝特為對照藥物。
以下說明本發明於測試牛樟芝純化物EK100用於預防或治療糖尿病之功效的動物和實驗設計，以及小鼠之血液數據、血清生化值分析、病理組織分析、肝脂質分析與RNA的萃取及mRNA的相對定量標的基因表現量。
動物和實驗設計
在第二型糖尿病動物實驗中，係採用4週齡C57BL/6J鼠(購自國家實驗研究院實驗動物中心)，飼養室溫度控制在22±3℃，濕度60±5%，維持12小時光照(7：00~19：00)，在調適一週後，小鼠開始一項為期12周的實驗。首先，將小鼠隨機分組分成兩組，其一為控制組(control group，簡稱CON)，具有9隻小鼠接受低脂飲食餵養(Diet 12450B,Research Diets,Inc.,New Brunswick,NJ,USA)，其二為高脂飲食組(high-fat diet group，簡稱HF)，具有54隻小鼠接受脂肪含量達45%的高脂飲食餵養(Diet 12451,Research Diets,Inc.,New Brunswick,NJ,USA)。
經過8周的飲食誘導，將高脂飲食組小鼠進一步以每組9隻小鼠隨機地分為6組，在最後4週裡，保持高脂飲食並每天以經口灌胃方式，分組給予EK100(10、20、40mg/kg/day body wt)、非諾貝特(Feno；購自西格瑪化工有限公司，聖路易斯，管理劑量於250mg/kg/day body wt)、羅格列酮(rosiglitazone，簡稱Rosi；1%甲基纖維素，10mg/kg body weight，取自葛蘭素史克(GlaxoSmithKline)公司，編號：BRL49653C之產品)或水(vehicle)。其中，控制組及高脂飲食控制組只餵食水。前述低脂飲食的總熱量中包括10% kcal的脂肪含量，其他熱量組成包括20%蛋白質、70%碳水化合物，而高脂飲食則在總熱量中包括45% kcal的脂肪含量，其他熱量組成包括20%蛋白質、35%碳水化合物。
在實驗最後，移開食物將小鼠從晚上十點至早上十點禁食，隔天將小鼠犧牲，收集血液和組織以用於分析。取下肝臟、骨骼肌並稱重，接著立即凍結，並保持在-80℃下以用於標靶基因的分析。將肝素(30單位/毫升)(Sigma) 加入到血液樣本。收集血液樣本動作於30分鐘內完成。血漿樣本在4℃、1600g下離心15分鐘，藉此獲得用於測定血漿胰島素和瘦素之濃度。
血液數值分析
從禁食小鼠的眶後竇收集血液樣本(0.8毫升)，並利用葡萄糖分析儀(Model 1500 sidekick glucose analyzer；YSI)分析葡萄糖水平。透過商業可取得的HbA1c試劑盒(BioSystems S.A.,Barcelona,Spain)測得HbA1c百分比。對血液三酸甘油酯(Plasma triglycerides，TG)、總膽固醇(TC)、游離脂肪酸(free fatty acids，簡稱FFA)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)以及低密度脂蛋白膽固醇(lowdensity lipoprotein cholesterol，以下簡稱為LDL-C)等，係利用商業可取得的測定試劑盒並依其指示進行測試(甘油三酯-E測試/Triglycerides-E test、膽固醇-E測試/Cholesterol-E test及游離脂肪酸-C測試/FFA-C test；和光純藥/Wako Pure Chemical，日本大阪；高密度脂蛋白膽固醇測試/HDL-C-test及低密度脂蛋白膽固醇/LDL-C-test，羅氏診斷有限公司/Roche Diagnostics GmbH，印第安納波利斯，美國)。血液中胰島素水平和瘦體素水平則是透過酶聯免疫吸附試驗(又稱酵素免疫分析法，Enzyme-linked immunosorbent assay，簡稱ELISA)並使用市售試劑盒根據製造商指示進行測定(小鼠胰島素ELISA試劑盒，Sibayagi，日本群馬縣；小鼠瘦體素ELISA試劑盒，森永，日本橫濱)。
病理組織分析
將收集到的一部分附睾白色脂肪組織和肝組織，用福爾馬林(200g/kg)中性緩衝溶液固定並和包埋在石蠟中，將組織剖面(8μm)以蘇木精和曙 紅染紅，以用於顯微鏡檢查。使用顯微鏡(萊卡，DM2500)進行顯微鏡檢查，並使用萊卡數位相機(DFC-425-C)拍攝組織切片圖像。
肝脂質之分析
取得動物實驗各組小鼠的肝臟。用1mL的蒸餾水均化0.375克的肝臟5分鐘，以提取肝脂質，再使用甘油三酯試劑盒進行血清脂質分析。
RNA的萃取及mRNA的相對定量顯示基因表現
根據製造商的指示，利用Trizol試劑(Trizol reagent)分離來自肝臟組織的總RNA(分子研究中心公司，辛辛那提，美國俄亥俄州)。透過2%瓊脂糖凝膠電泳對前述提取的總RNA完整性進行檢測，並通過2%瓊脂糖凝膠電泳以及260和280nm的紫外線吸光度測定RNA濃度(分光光度計U-2800A，日立)。總RNA(1μg)反轉錄為cDNA，以及5mL的莫洛尼鼠白血病病毒如前述方案反轉錄為酶(震中，麥迪遜，WI，USA)。聚合酶鏈反應是在最後的25μL中進行，其含有1U的Blend Taq-Plus(TOYOBO公司，日本)、1μL的RT第一鏈cDNA產物、各10μM的正向引子和反向引子、75mM的Tris-HCl(三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽)其中含有1mg/L的吐溫20(tween-20，pH值為8.3，又稱：聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯)、2.5mM的dNTP(deoxy-ribonucleoside triphosphate，脫氧核糖核苷三磷酸)以及2mM的MgCl2(氯化鎂)。所述引子如下表1所示。該產物係在2%瓊脂糖凝膠上進行測定，並用溴化乙錠(ethidium bromide)染色。
以下說明前述測試中，本發明動物實驗中，高脂肪飲食誘導致糖尿病的C57BL6J小鼠之結果，包括各組小鼠在體重(圖2A)、食物攝取量(圖2B)、內臟脂肪重量(圖2C)、血糖值(圖2D)、血液總膽固醇濃度(圖2E)、血液三酸甘油酯濃度(圖2F)、血液瘦素濃度(圖2G)、血液胰島素濃度(圖2H)、 附睾白色脂肪組織/肝臟組織的病理切片(圖3A、圖3B)、小鼠肝臟組織中的PEPCK、G6-Pase、adiponectin、SREBP-1c、DGAT2、apo C-III、SREBP-2、apo A-I、PPAR α、GAPDH表現進行半定量RT-PCR分析(圖4A、圖4B)以及不同組織如肝臟及骨骼肌之標靶基因表現量或蛋白質的含量，包括對p-AMPK(Thr172)/total-AMPK、GLUT4、p-Akt(Ser473)/total-Akt之影響(圖5A、圖5B)。
如圖2A及表2所示，實驗開始各組小鼠具有相近的體重，約18.9±0.2g。在實驗的12週中，高脂飲食組(HF)小鼠的體重及體重增加量相較於控制組(CON)顯著地增加。
如圖2B至圖2H及表2，顯示餵食不同劑量的純化物EK100、Feno或Rosi對於高脂飲食誘導第二型糖尿病鼠之肝脂質及血液數值分析結果，其中Control表示低脂飲食對照組，HF表示高脂飲食對照組(賦形劑(vehicle-treated)對照組)，HF+K1、HF+K2、HF+K3分別表示服用不同劑量的純化物EK100的實驗組，而HF+Feno表示服用高脂飲食和藥品非諾貝特(Fenofibrate，Feno)的實驗組，HF+Rosi表示服用高脂飲食和藥品羅格列酮(rosiglitazone，Rosi)的實驗組。井號係相較於CON組之統計分析，其中，#表示P<0.05、##表示P<0.01、###表示P<0.001，而星號係相較於HF組之統計分析，其中，*表示P<0.05、**表示P<0.01、***表示P<0.001。
如圖2A及表2所示，實驗開始各組小鼠具有相近的體重，約18.9±0.2g。在實驗的第12週中，高脂飲食組(HFD)小鼠的體重及體重增加量增加量相較於控制組(CON)顯著地增加。圖2B顯示，HF+K3組及HF+Feno組顯著降低體重增加量增加量。圖2C及表2顯示，高脂飲食小鼠顯著增加脂肪組織(包括附舉、內臟脂肪、腸系膜及腹膜後白色脂肪組織)的重量。表2並顯示，HF+K1組、HF+K2組、HF+K3組、HF+Feno組及HF+Rosi組顯著降低小鼠的腹膜後白色脂肪組織和內臟脂肪的重量；HF+K1組、HF+K2組、HF+K3組、HF+Rosi組顯著降低附 睾脂肪的重量；HF+K3組及HF+Rosi組顯著降低腸系膜的重量；HF+K2組、HF+K3組及HF+Feno組顯著降低棕色脂肪組織(BAT)的重量；HF+K2組、HF+K3組顯著增加骨骼肌的重量；HF+Feno組顯著增加肝臟的重量。
經過12週高脂飲食餵養，高脂飲食組小鼠相較於控制組小鼠顯現了高血糖的表現(P<0.001)。其中，如圖2D，HF+K1組、HF+K2組、HF+K3組、HF+Feno組及HF+Rosi組的血糖水平明顯地下降(依前述組排序為P<0.001、P<0.001、P<0.001、P<0.001、P<0.001)。表2顯示，血紅蛋白的百分比經無酶催化(HbA1c百分比)為整體測量長期的血糖調節的評估方法。HF組的HbA1c的血液數值明顯地高於CON組；HF+K1組、HF+K2組、HF+K3組、HF+Feno組及HF+Rosi組顯示血液中HbA1c數值顯著下降。
圖2E、圖2F及表2顯示，高脂飲食造成血液中總膽固醇、三酸甘油酯、血漿游離脂肪酸增加。其中，HF+K1組、HF+K2組、HF+K3組及HF+Rosi組顯著降低小鼠的膽固醇數值(依前述組排序為P<0.05、P<0.01、P<0.001、P<0.05)；HF+K1組、HF+K2組、HF+K3組、HF+Feno組、HF+Rosi組顯著降低小鼠的三酸甘油酯及血漿游離脂肪酸濃度；HF+K1組、HF+K2組、HF+K3組及HF+Feno組小鼠的HDL-C數值增加；HF+K3組及HF+Rosi組小鼠顯示LDL-C數值下降；由高脂飲食導致增加的肝脂質總量與三酸甘油酯濃度，在HF+K1組、HF+K2組、HF+K3組、HF+Feno組及HF+Rosi組中皆明顯下降而獲得顯著地改善。
圖2G及圖2H顯示，HF組的血液瘦素濃度及胰島素濃度遠高於CON組，其中，HF+K1組、HF+K2組、HF+K3組、HF+Feno組及HF+Rosi組小鼠的血瘦素及胰島素水平明顯地下降低。
圖3A顯示，高脂飲食餵食會造成小鼠的脂肪細胞肥大，如圖，HF組及CON組的脂肪細胞平均面積分別為9604.2±281.3及3797.5±412.9μm2，其中，HF+K1組為4204.0±131.5μm2、HF+K2組為3535.7±340.2μm2、HF+K3組為3458.9±30.7μm2、HF+Feno組為4175.4±322.9μm2，顯示該些組的脂肪細胞肥大現象較不明顯；而HF+Rosi組的脂肪細胞平均面積則為5598.6±162.7μm2。圖3B顯示，高脂飲食餵食會造成小鼠的肝細胞空泡樣變，但在HF+K1組、HF+K2組、HF+K3組、HF+Feno組及HF+Rosi組中，空泡樣變現象減少而獲得改善。
圖4A及圖4B顯示，高脂飲食誘導致PEPCK、G6-Pase、SREBP-1c、DGAT2、apo C-III及SREBP-2的mRNA表現量顯著高於CON組。其中，HF+K1組、HF+K2組、HF+K3組、HF+Feno組及HF+Rosi組顯著降低小鼠的PEPCK、G6-Pase、SREBP-1c、DGAT2、apo C-III及SREBP-2表現量；HF+K3組及HF+Rosi組顯著增加小鼠的脂聯素的表現量；HF+K1組、HF+K2組、HF+K3組顯著增加小鼠的apo A-I的基因表現量；HF+K1組、HF+K2組、HF+K3組及HF+Feno組顯著增加小鼠的PPAR α表現量。
圖5A及圖5B顯示，HF組小鼠的GLUT4、p-Akt/總Akt水平低於CON組小鼠；其中，HF+K1組、HF+K2組、HF+K3組、HF+Feno組及HF+Rosi組顯著增加小鼠骨骼肌中GLUT4的蛋白質含量(依前述組排序分別為P<0.01、P<0.01、P<0.001、P<0.05、P<0.001)。HF組小鼠的p-Akt/總Akt蛋白表現量低於CON組；但在HF+K1組、HF+K2組、HF+K3組、HF+Feno組及HF+Rosi組顯著增加小鼠的肝臟組織及骨骼肌p-AMPK(依前述組排序，肝臟組織分別為P<0.001、P<0.001、P<0.001、P<0.01、P<0.001，骨骼肌分別為P<0.001、P<0.001、P<0.001、P<0.001、P<0.001)。
綜上所述，本發明開發了牛樟芝純化物EK100作為對於糖尿病及血脂異常的治療效果。高脂餵養小鼠在口服純化物EK100後，血糖、糖化血色素(HbA1c)、總膽固醇(TC)、三酸甘油酯(TG)、胰島素及瘦體素的血液濃度都有明顯下降且最終改善胰島素阻抗。EK100具有降低小鼠的肝臟空泡樣變以及內臟脂肪細胞尺寸之功效。小鼠經施予EK100後，骨胳肌中的GLUT4及p-Akt顯著地增加。EK100具有使小鼠骨胳肌及肝臟中的p-AMPK顯著增加。EK100能夠降低肝臟的PEPCK及G6-Pase表現量並降低肝臟葡萄糖的生成。EK100通過減弱SREBP-1c但增加PPAR α的表現，達到抑制肝臟脂肪酸合成及增加脂肪酸氧化，進而降低肝臟血液中三酸甘油酯的功效。EK100具有使肝臟的SREBP-2的表現量下降，達到降低血液中膽固醇水平的功效。EK100透過增加apo A-I在肝細胞的表現量而能夠提高HDL-C的濃度。EK100具有調節GLUT4、PEPCK、G6-Pase、SREBP-1c、SREBP-2、apo A-I及p-AMPK的功效，而具有治療第二型糖尿病及與其相關的高血脂症之潛力。

Claims (12)

  1. 一種牛樟芝純化物之用途，其中該純化物係自牛樟芝深層發酵液的凍乾粉提取之純化物ergostatrien-3 β-ol；該純化物之用途係用於製備治療第二型糖尿病之醫藥化合物。
  2. 一種牛樟芝萃取純化物之用途，其中該純化物係自牛樟芝深層發酵液的凍乾粉提取之活性物質純化物ergostatrien-3 β-ol；該純化物之用途係用於製備降低血糖、降低糖化血紅素之醫藥化合物。
  3. 一種牛樟芝萃取純化物之用途，其中該純化物係自牛樟芝深層發酵液的凍乾粉提取之活性物質純化物ergostatrien-3 β-ol；該純化物之用途係用於製備降低血脂中包括總膽固醇(TC)或三酸甘油酯(TG)之醫藥化合物。
  4. 一種牛樟芝萃取純化物之用途，其中該純化物係自牛樟芝深層發酵液的凍乾粉提取之活性物質純化物ergostatrien-3 β-ol；該純化物之用途係用於製備增加血液中的高密度脂蛋白(HDL-C)之醫藥化合物。
  5. 一種牛樟芝萃取純化物之用途，其中該純化物係自牛樟芝深層發酵液的凍乾粉提取之活性物質純化物ergostatrien-3 β-ol；該純化物之用途係用於製備活化骨骼肌與肝臟之腺苷單磷酸活化蛋白激酶(AMPK)、以及葡萄糖轉運蛋白4(GLUT4)之醫藥化合物。
  6. 一種牛樟芝萃取純化物之用途，其中該純化物係自牛樟芝深層發酵液的凍乾粉提取之活性物質純化物ergostatrien-3 β-ol；該純化物之用途係用於製備增加骨骼肌蛋白質激酶B(Akt)之磷酸化，並提升胰島性敏感性之醫藥化合物。
  7. 一種牛樟芝萃取純化物之用途，其中該純化物係自牛樟芝深層發酵液的凍乾粉提取之活性物質純化物ergostatrien-3 β-ol；該純化物之用途係用於製備增加肝臟內的腺苷單磷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)之醫藥化合物。
  8. 一種牛樟芝萃取純化物之用途，其中該純化物係自牛樟芝深層發酵液的凍乾粉提取之活性物質純化物ergostatrien-3 β-ol；該純化物之用途係用於製備降低肝臟的總脂質及三酸甘油酯的含量之醫藥化合物。
  9. 一種牛樟芝萃取純化物之用途，其中該純化物係自牛樟芝深層發酵液的凍乾粉提取之活性物質純化物ergostatrien-3 β-ol；該純化物之用途係用於製備降低肝臟空泡樣變現象之醫藥化合物。
  10. 一種牛樟芝萃取純化物之用途，其中該純化物係自牛樟芝深層發酵液的凍乾粉提取之活性物質純化物ergostatrien-3 β-ol；該純化物之用途係用於製備治療由高脂肪飲食所引起的脂肪肝之醫藥化合物，其治療由高脂肪飲食所引起的脂肪肝包含降低肝臟內的膽固醇調節組件結合蛋白1c(SREBP-1c)和增加脂肪酸氧化酶(PPAR α)基因顯現量。
  11. 一種牛樟芝萃取純化物之用途，其中該純化物係自牛樟芝深層發酵液的凍乾粉提取之活性物質純化物ergostatrien-3 β-ol；該純化物之用途係用於製備治療因高脂肪飲食所引起的高瘦體素血症之醫藥化合物，其治療因高脂肪飲食所引起的高瘦體素血症包含降低血中瘦體素(leptin)濃度。
  12. 一種牛樟芝萃取純化物之用途，其中該純化物係自牛樟芝深層發酵液的凍乾粉提取之活性物質純化物ergostatrien-3 β-ol；該純化物之用途係用於製備降低因高脂肪飲食所引起的高內臟脂肪重量(visceral fat mass)，以及降低內臟脂肪細胞大小(hypertrophy of adipocyte)之醫藥化合物。
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