TWI654980B

TWI654980B - 自牛樟芝提取之活性物質樟芝酸k及其用於抗糖尿病、抗高血脂、及降低肝臟脂質的用途

Info

Publication number: TWI654980B
Application number: TW106115708A
Authority: TW
Inventors: 施純青; 郭悅雄; 林正修; 楊昌勳
Original assignee: 施純青
Priority date: 2016-06-24
Filing date: 2017-05-12
Publication date: 2019-04-01
Also published as: US10124012B2; US20170368077A1; TW201800097A

Abstract

本發明提供了治療或糖尿病，高血糖症，高脂血症，降低肝臟脂質的製備方法和應用。自牛樟芝提取的活性物質之樟芝酸K(Antcin K)可達到治療或預防糖尿病、高三酸甘油酯血症、高膽固醇血症、且同時藉由調節葡萄糖轉運蛋白4（GLUT4）、AMP活化蛋白激酶（AMPK）的磷酸化、過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）以及脂肪酸合酶（FAS），來降低肝臟脂質的生成。

Description

自牛樟芝提取之活性物質樟芝酸K及其用於抗糖尿病、抗高血脂、及降低肝臟脂質的用途

本發明係關於一種牛樟芝提取物，特別是指從牛樟芝子實體提取之純化物樟芝酸K（antcin K，簡稱AnK）用於製備降低血糖、血脂及/或肝臟脂肪之醫藥化合物之用途。

糖尿病幾乎無法單獨隔離發生，大部分係以各式代謝異常的症狀併發產生，其中包括胰島素抵抗，高胰島素血症，高甘油三酯血症等。第二型糖尿病之患病人口於2025年將達到約3億多人，其中，約90%以上的第二型糖尿病病理機轉已被揭示，第二型糖尿病所揭露之致病機轉在於胰島素阻抗，所謂胰島素阻抗係指脂肪組織、骨骼肌或肝組織中的β細胞功能受損或胰島素失去敏感度無法受到激發。

牛樟芝(多孔菌科，無褶菌目)在台灣係可作為各種疾病的治療及食療偏方，其極為罕見以及珍貴，因為牛樟芝僅生長在常綠的牛樟樹材內心材部分。該牛樟芝的子實體，即發酵液的濾液，即牛樟芝的子實體得示現許多生理功能。樟芝子實體包括萜類化合物，如樟芝酸（A，B和C）、zhankuic acids (A, B, C, D, 和 E)、15α乙酰基去氫硫色多孔菌酸(15𝛼-acetyl-dehydrosulphurenic acid)、去氫齒孔菌酸(dehydroeburicoic acid)和去氫硫色多孔菌酸(dehydrosulphurenic acid)、樟芝酸E和F、methyl antcinate G、methyl antcinate H以及齒孔酸。經固體培養的子實體和深層培養濾液已被證明具有保肝作用和抗氧化活性。

經先前的研究已證實，於體內代謝方面，牛樟芝中的13種萜類化合物之測定係透過液相層析串聯式質譜儀(LC/MS/MS) 測定經口服試驗之小鼠的血漿，發現經血漿測定後的ergostanoids的血漿濃度比lanostanoids高得多，且當ergostanoids可於生物體內進行還原和羥化反應時，其平均滯留時間範圍係3~6小時；而當lanostanoids於代謝反應中失去活性時，其平均滯留時間將減緩至9~16小時。樟芝酸K(3α,4β,7β-trihydroxy-4α-methylergosta- 8,24(28)-dien-11-on-25S-26-oic acid; AnK)(如圖1所示)，自經椴木栽培的牛樟芝子實體所提取的三萜類活性化合物，可誘導人體肝細胞Hep3B細胞凋亡性的細胞死亡。

從野生牛樟芝子實體中經由乙醇浸提法所分離出的樟芝酸K，顯示1-25Mm的濃度依賴性以及抗炎作用（藉由調節白血球細胞活性同時抑制其活性氧化物作用），可經由人體的嗜中性白血球(neutrophil)的兩種驅化物質fMLP以及TPA的誘導。

我們近期研究發現，自牛樟芝中提取的ergostatrien-3𝛽-ol以及dehydroeburicoic acid 顯示出優異抗高血糖和抗高血脂的活性。儘管如此，樟芝酸K，係牛樟芝子實體的主要活性成分，對於體外試驗以及經飲食誘導的糖尿病老鼠的糖尿病和與脂異常的影響還是未知數。葡萄糖轉運蛋白4（GLUT4）已被視為血液中葡萄糖濃度穩定狀態的指標，升高的血糖濃度再經過巨大的熱量攝取之後，可迅速恢復正常的血糖濃度；胰島素刺激或收縮通過從細胞內位點到膜上引發GLUT4轉位導致葡萄糖攝取。在第2型糖尿病患者中其骨骼肌胰島素誘導GLUT4轉運的數量顯著地降低。

因此，GLUT4數量之提高或其誘發的轉位之機轉係加速藥物開發的標的。周邊組織的葡萄糖攝取量到骨骼肌膜可以通過兩種途徑來促進包括胰島素依賴之機轉導致的Akt/ PKB的激活和肌肉收縮調節刺激或缺氧調節的AMPK的活化。藉由AMPK發揮醣脂代謝主導作用機轉促使第2型糖尿病的葡萄糖和脂質代謝的失調，因此AMPK之激活係被看好的療法。

二甲雙胍(Metf)於一般醫療診所中係用於治療第二型糖尿病之常見藥物，該藥物可激活肝細胞以及骨骼肌組織中的AMPK。

過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）於脂質代謝的調節中發揮關鍵作用，並藉由調節眾多的與脂肪生成以及脂肪酸氧化之相關基因表現，據以降低三酸甘油脂(TG)濃度。非諾貝特(Feno)是PPARα活性劑之一且已被應用於治療高三酸甘油酯血症，經高脂飲食(HFD-)飼養之C57BL/6J小鼠，可誘導出第二型糖尿病早期症狀以及顯著地增加脂肪重量以及產生胰島素阻抗以及增加血糖、血液總膽固醇(TC)和三酸甘油脂(TG)的濃度。

因此，以此機轉模型來研究開發上述兩種胰島素訊息傳導路徑，並做為開發新的治療的干預工具。其中，α亞基上的Thr¹⁷² 位置的磷酸化係影響AMPK活性的關鍵。本研究首次偵測樟芝酸(AnK)在體外測試，與進行進一步的調查樟芝酸(AnK)潛在影響對於代謝作用可否顯示有益的效果，其中包括降糖假說，並同時與臨床藥物如Metf和Feno作為對照藥物，比較其對於GLUT4蛋白的表現量以及藉由活化AMPK的調節降血脂效果；此外，對標靶基因的表達進行測定，該標靶基因包括PPARα和從由樟芝酸K(AnK)治療HFD飼餵的小鼠的周邊組織的脂肪酸合酶（FAS）。

本發明之第一目的在於開發牛樟芝提取物之活性物質樟芝酸K的新用途，其係用於製備治療第二型糖尿病之醫藥化合物，該提取物係自牛樟芝子實體提取之活性物質，該活性物質為純化物樟芝酸K。

本發明之第二目的在於開發牛樟芝提取物之活性物質樟芝酸K的新用途，其係用於製備治療高血脂症之醫藥化合物，該提取物係自牛樟芝子實體提取之活性物質，該活性物質為樟芝酸K。

本發明之第三目的在於開發牛樟芝提取物之活性物質樟芝酸K的新用途，其係用於製備降低血糖及影響胰島素濃度之醫藥化合物，該提取物係自牛樟芝子實體提取之活性物質，該活性物質為樟芝酸K。

其中，所述牛樟芝萃取物的新用途是透過樟芝酸K降低肝臟中PEPCK及G6 Pase的mRNA以及增加骨骼肌中GLUT4膜蛋白，達到降低血液中葡萄糖濃度。

本發明之第四目的在於開發牛樟芝提取物之活性物質樟芝酸K的新用途，其係用於製備降低血液中三酸甘油酯及總膽固醇之醫藥化合物，該提取物係自牛樟芝子實體提取之活性物質，該活性物質為樟芝酸K。

其中，所述牛樟芝萃取物的新用途是以樟芝酸K抑制肝臟的FAS和PPARγ伴隨降低SREBP-1c和DGAT2的mRNA指數，達到降低了血液中三酸甘油酯及總膽固醇指數，而增加了PPARα的表現量並伴隨著肝臟中脂肪酸氧化增強CPT-1a的mRNA指數。

其中，所述牛樟芝萃取物的新用途是以樟芝酸K減少SREBP-2的mRNA指數，達到降低血液中總膽固醇指數。（SREBP-2，膽固醇調節組件結合蛋白-2，sterol response element binding protein-2）

本發明之第五目的在於開發牛樟芝提取物之活性物質樟芝酸K的新用途，其係用於製備增加骨骼肌及肝臟組織中phospho-AMPK/total-AMPK蛋白表現量之醫藥化合物，該提取物係自牛樟芝子實體提取之活性物質，該活性物質為樟芝酸K。（p-AMPK，phospho-AMPK，磷酸化腺苷單磷酸活化蛋白激酶；t-AMPK，total-AMPK；AMPK，AMP-activated protein kinase，腺苷單磷酸活化蛋白激酶）

本發明之第六目的在於開發牛樟芝提取物之活性物質樟芝酸K的新用途，其係用於製備治療脂肪肝之醫藥化合物，該提取物係自牛樟芝子實體提取之活性物質，該活性物質為樟芝酸K。

其中，所述牛樟芝萃取物的新用途是透過樟芝酸K減少存在於脂肪組織中PPARγ及FAS脂肪合成基因，達到減少脂肪細胞分化及脂質貯存。

藉此，透過該由牛樟芝提取物中的活性物質樟芝酸K，使經高脂肪飲食 (HFD)誘導引起的糖尿病及其他相關症狀，經施予活性物質樟芝酸K後，達到以下功效：

施予劑量10、20、40 mg/kg/day的樟芝酸K治療的小鼠的血糖數值明顯地下降。

透過樟芝酸K治療，使高脂肪飲食(high-fat diet; HDF)誘導糖尿病小鼠的血液三酸甘油酯（circulating triglyceride，TG）及總膽固醇（total cholesterol，TC）濃度下降，顯示樟芝酸K具有改善糖尿病和血脂異常的功效。

透過樟芝酸K治療，增加HFD誘導糖尿病小鼠的肝臟及骨骼肌中的膜GLUT4的表現量以及phospho-AMPK的表現量，顯示樟芝酸K具有改善高血糖症的功效。

在透過樟芝酸K治療改善高血糖症的過程中， PEPCK及G6 Pase的mRNA表現量會隨之降低，達到抑制肝臟葡萄糖生成以及減弱糖尿病狀態的功效。（PEPCK，Phosphoenolpyruvate carboxykinase，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶；G6-Pase，glucose-6-phosphatase，6-磷酸葡萄糖）

透過降低FAS的蛋白表現量，樟芝酸K治療具有促進血液三酸甘油酯降低的效果。

透過樟芝酸K治療，HFD誘導糖尿病小鼠的SREBP-2的mRNA表現量降低且血液中膽固醇數值減少，顯示樟芝酸K能夠透過增加骨骼肌細胞膜GLUT4蛋白，增加脂肪酸氧化的PPARα以及降低FAS的蛋白以及增加骨骼肌及肝臟組織中phospho-AMPK/total-AMPK蛋白表現量，達到防止或改善高脂肪飲食 (HFD)誘導糖尿病小鼠的糖尿病及血脂異常狀態。

本發明特徵與優點的一些典型實施例將在以下說明中詳細敘述。應理解的是本發明能夠在不同的態樣上具有各種的變化，然其皆不脫離本發明的範圍，且其中的說明及圖式在本質上係當作說明之用，而非用於限制本發明。

本發明提供了牛樟芝提取物之活性物質樟芝酸K(AnK)用於製備降低血糖、肝臟脂質、及降低血液三酸甘油酯和總膽固醇、以及治療糖尿病之醫藥化合物的新用途。以下將進一步說明牛樟芝萃取物的提取方法及其功效試驗。

第一部分:材料與方法

本發明所使用的GLUT4的抗體購自聖克魯斯生物技術（聖克魯斯，CA，USA）獲得（SC -79838號）;磷酸AMPK（Thr¹⁷² ），PPARα（數ab8934）和PPARγ（數ab45036）購自Abcam公司公司（劍橋，MA，USA）購得; 而FAS（3180號），磷酸化Akt（Ser⁴⁷³ ）（4060號），總-AMPK（Thr¹⁷² ）和β-肌動蛋白（編號4970）係來自Cell Signaling Technology公司（丹弗斯，MA，USA）。抗兔次級抗體是從傑克遜ImmunoRes。實驗室公司（西林，PA，USA）。

再者，本發明所使用的牛樟芝子實體來源，係向台灣新竹市Balay生物技術公司購買，且其（CMPC393）憑證標本係由中國醫學大學所鑑定。 3.0公斤的子實體用甲醇萃取三次，之後用50％乙酸乙酯和50％己烷層析。該程序如前段所描述。純度99％以上的樟芝酸K(AnK)其分析儀器係高效液相層析儀(HPLC，Shimadzu CL 20-A, Kyoto, Japan)，HPLC管柱(TOSOH TSKgel DS-80Ts)，並利用100％的MeOH（甲醇）作為沖洗填充HPLC管柱的有機溶劑。

再者，於本發明體外試驗所使用的C2C12成肌細胞培養基（ATCC, CRL-1772），係置於生長培養基中進行細胞培養而來，而該生長培養基為達爾伯克(氏)改良伊格爾(氏)培養基（DMEM，Dulbecco's modified Eagle medium；來自Gibco BRL公司），其添加了10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS；來自Hyclone公司）、100 U/mL青黴素 / 100μg/mL鏈黴素（Gibco BRL公司）；當細胞融合（confluent）達到80%時，用0.05%的胰蛋白酶分裂（split）為1：4。將成肌細胞稀釋並放置在直徑9cm的培養皿中，並培養至其融合狀態（confluency）達到80%-90%，接著將培養基更換為2%的FBS/DMEM，為時5-7天，每隔24小時更換一次。其中，於本發明中所述的「細胞融合」是指貼附型細胞附著在細胞培養皿上漫延擴散分裂增殖直至鋪滿整個培養皿底部，此時稱作confluency，中文為融合狀態。

再者，於試管中測定GLUT4膜蛋白及phospho-Akt (Ser⁴⁷³ )/total-Akt蛋白的實驗中，先將分化的C2C12細胞置於DMEM/BSA培養基中，37℃下持續2小時進行血清飢餓（serum starved）處理之後，分組對濃度為 1、5、10及25μg/mL的樟芝酸K（AnK，待測活性物質）進行細胞培養，對活性物質樟芝酸K與載體（含食鹽水的二甲基亞碸（DMSO，DMSO最終濃度為0.2%）進行30分鐘的細胞培養，對活性物質樟芝酸與100 nM的胰島素進行25分鐘的細胞培養。

接著進行將C2C12細胞以冰冷的磷酸鹽緩衝生理鹽水（PBS，Phosphate buffered saline）沖洗三次後分成兩組。將其中一組C2C12細胞置於RIPA裂解液（RIPA buffer）中裂解，該RIPA裂解液添加了蛋白酶抑制剂（complete protease inhibitor cocktail，來自Roche公司）和磷酸酶抑制（phosphatase inhibitor），接著在離心速率20000g下離心20分鐘。收集離心後的上清液蛋白並貯存在零下20℃的環境。前述RIPA裂解液的pH值約為8，其配方為50 mM的三羥甲基氨基甲烷（Tris-HCl）、150 mM的氯化鈉（NaCl）、1%的乙基苯基聚乙二醇（NP-40，Nonidet P-40）、0.5%的去氧膽酸鈉（sodium deoxycholate）及0.1%的十二烷基硫酸鈉（SDS）。

將另一組C2C12細胞置於緩衝液中在4℃下進行勻漿。前述緩衝液的pH值約為7.4，其配方為250 mmol/L的蔗糖（sucrose）、50 mmol/L的三羟甲基氨基甲烷（Tris）及0.2 mmol/L的乙二胺四乙酸（edetic acid）。將均質液在離心速率9000g及4℃下離心10分鐘。用0.5mL勻漿緩衝液使沉澱物懸浮，然後離心，重複三次。收集三次離心的上清液並將之混合，在離心速率190000g及4℃下離心60分鐘。用0.2mL勻漿緩衝液再次使沉澱物懸浮，接著貯存在零下20℃。前述步驟是在設有過濾膜的情況下進行。

蛋白質濃度是透過BCA 蛋白質定量試劑盒（BCA assay，Pierce）測得。取等量的蛋白質，在SDS樣品緩衝液中稀釋四次，並進行SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳）以及西方墨點法（Western blotting），利用包括Akt、phospho-Akt Ser⁴⁷³ 以及GLUT4等特異性抗體進行免疫染色。使用Alpha Easy FCsoftware進行密度墨點（density blotting）分析。

第二部分：動物模型實驗

藥品非諾貝特（Fenofibrate，以下簡稱為Feno）是一種PPARα的活化劑，並在高三酸甘油酯血症的治療上行之多年。PPARα是與脂質代謝相關的基因的關鍵調節因子，其通過參與調節脂質生成、脂肪酸氧化、能量消耗等許多靶基因，導致血液三酸甘油酯和脂肪酸的減少。

二甲雙胍（Metformin）是目前相當普遍用於治療第二型糖尿病的抗糖尿病藥品，其能夠激活肝臟及骨骼肌中的AMPK。

因此，非諾貝特及二甲雙胍被選為對照藥物組，用於評估樟芝酸K（AnK）的抗糖尿病療與作用的對照藥物。為了評估體內GLUT4和phospho-AMPK進行血糖調節的表現是否改變，以及α次元Thr¹⁷² 的磷酸化對AMPK活性是必要的，故本發明以高脂肪飲食 (HFD)誘導糖尿病小鼠作為第二型糖尿病的動物模型並對其骨骼肌及肝臟組織進行了檢測，藉以探討樟芝酸K（AnK）對於抗糖尿病及抗高血脂方面的效果，並測定樟芝酸K（AnK）在抗糖尿病、脂肪形成以及肝組織中標靶基因包括PPARα及脂肪酸合成酶FAS等的調控表現。

以下說明本發明於測試牛樟芝提取物之活性物質樟芝酸K（AnK）於預防或治療糖尿病以及降血脂之功效的動物模型實驗設計，以及小鼠之血液數據、血清生化值分析、病理組織分析、肝脂質分析、以及RNA的萃取及mRNA的相對定量標的基因表現量。本動物實驗模型係部分依據實驗動物照護及使用委員會(IACUC) （2015年3月12日）版本的指導原則辦理。

從國家實驗動物繁育研究中心購買四周齡的雄鼠C57BL/6J（總量= 63隻），並將其區分為控制組/低脂飲食組（low-fat-diet; CON，總量:9隻小鼠）和高脂飲食組（HFD，總量:54隻小鼠），其中，低脂飲食組(CON)的飲食組成為20％蛋白質，70％碳水化合物，以及10％的脂肪；而高脂飲食組（high-fat-diet; HFD）的飲食組成為20％蛋白質，35％碳水化合物，以及45％的脂肪。如是兩組相異飲食組成的實驗小鼠，於本發明實驗中將經過12週的療程餵養。

控制組以及高脂飲食組的脂肪攝取分別為10%以及45%；又HFD組小鼠經8周誘導後被分6組(每組9隻小鼠)，並將這6組小鼠於實驗誘導後的四週中，施餵6種不同種類以及劑量的藥物進行治療，包括：(1) AnK1=樟芝酸K 10 mg/kg/day、(2) AnK2=樟芝酸K 20 mg/kg/day、(3) AnK3=樟芝酸K 40 mg/kg/day、(4) Feno=非諾貝特0.25 g/kg/day、(5) Metf =二甲雙胍0.3 g/kg/day、以及(6) 相當劑量的蒸餾水（vehicle），所述蒸餾水、樟芝酸K、二甲雙胍或非諾貝特是在28天（四周）內，每天口服灌胃一次。在實驗期間，所有小鼠禁食過夜後從眶後竇收集血液樣本。經四周治療餵養後，移走食物使小鼠禁食12小時後將小鼠犧牲。從小鼠收集所需的組織樣本並稱重，部分組織樣本取得後立即送入零下80℃的環境進行冷凍，以用於後續標靶基因分析。

空腹血糖及生化指標測定

將前述從禁食小鼠眶後竇收集的血液樣本的一部分立即用於葡萄糖數值的分析，另一部分用於血液中三酸甘油酯（TG）、總膽固醇（TC）及游離脂肪酸（free fatty acids）、血液胰島素、瘦體素、以及脂聯素數值的分析。從禁食小鼠的眶後竇收集血液樣本（0.8毫升），利用葡萄糖分析儀（Model 1500 sidekick glucose analyzer; YSI）分析葡萄糖，血漿甘油三酯（Plasma triglycerides，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、游離脂肪酸（free fatty acids，FFA）係使用市售試劑盒根據製造商指示進行測定（甘油三酯-E測試／Triglycerides-E test、膽固醇-E測試／Cholesterol-E test及游離脂肪酸-Ｃ測試／FFA-C test；和光純藥／Wako Pure Chemical，日本大阪）。

血中胰島素、瘦體素(leptin)及脂聯素(adiponectin)濃度之測定

血中胰島素、瘦體素及脂聯素的數值是以商業可購得的定量試劑盒進行分析。所述的定量試劑盒包括小鼠胰島素ELISA試劑盒（Mercodia, Uppsala, Sweden）、小鼠瘦體素ELISA試劑盒（Morinaga, Yokohama, Japan）、小鼠脂聯素ELISA試劑盒（Crystal Chem International, Downers Grove, IL, USA）。其中，ELISA為酵素免疫分析法，Enzyme-linked immunosorbent assay，簡稱ELISA。

病理組織分析

對收集到的一部分附睾白色脂肪組織和肝臟組織標本進行檢測，並使用顯微鏡（Olympus BX51, BX51, Olympus, Tokyo, Japan）拍攝顯微圖像。

mRNA的相對定量顯示基因表現分析

根據製造商的指示，利用Trizol試劑（Trizol reagent）分離來自肝臟組織的總RNA（分子研究中心公司，辛辛那提，美國俄亥俄州）。透過2%瓊脂糖凝膠電泳對前述提取的總RNA完整性進行量化測定，並通過2％瓊脂糖凝膠電泳以及260和280nm的紫外線吸光度測定RNA濃度（分光光度計U-2800A，日立）。總RNA（1μg）反轉錄為cDNA，以及5mL的莫洛尼鼠白血病病毒如前述方案反轉錄為酶（震中，麥迪遜，WI，USA）。聚合酶鏈反應是在最後的25μL中進行，其含有1U的Blend Taq-Plus（TOYOBO公司，日本）、1μL的RT第一鏈cDNA產物、各10μM的正向引子和反向引子、75mM的Tris-HCl（三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽）其中含有1mg/ L的吐溫20（tween-20，pH值為8.3，又稱：聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯）、2.5 mM的dNTP（deoxy-ribonucleoside triphosphate，脱氧核糖核苷三磷酸）以及2 mM的MgCl₂ （氯化鎂）。所述引子如下表1所示。該產物係在2%瓊脂糖凝膠上進行測定，並用溴化乙錠（ethidium bromide）染色。

西方墨點法測定

用於測定膜GLUT4和phospho-AMPK（Thr172）蛋白的蛋白質提取和免疫墨點法（immunoblot）方法，是在前述動物模型的小鼠骨骼肌和肝組織上進行。PPARα、PPARγ及FAS蛋白質的測定是在前述動物模型的小鼠肝組織和白色脂肪組織（white adipose tissue，WAT）上進行。小鼠骨骼肌受到GLUT4表現量分析，且總細胞膜部份（total membrane fraction）和緩衝液一起被收集並以前述方法進行測定。GLUT4、phospho-AMPK以及total-AMPK的蛋白質含量以前述西方墨點法測定。

在本發明細胞培養實驗中，包括C2C12成肌細胞在CON組、DMSO組、Insulin組、AnK組(1μg/mL)、AnK組(5μg/mL) 、AnK組(10μg/mL)以及AnK組(25μg/mL)中的GLUT4、phospho-Akt（Ser⁴⁷³ ）、total-Akt（Ser⁴⁷³ ）及GAPDH的蛋白質含量（圖2A、圖2B）。

以下配合表2說明前述測試中，本發明動物模型實驗中，經HFD誘導所生成之患糖尿病小鼠之結果。動物模型實驗中，經HFD誘導所生成之患糖尿病小鼠在體重(表2)、附睾白色脂肪組織/肝臟組織的病理切片（圖4A、圖4B）、小鼠肝臟組織中G6-Pase、DGAT2、PPARalpha、SREBP1c、aP2、apoCIII、SREBP-2、及GAPDH表現的半定量RT-PCR分析（圖5A、圖5B、圖5C）。

小鼠骨骼肌的GLUT4、 phospho-AMPK（Thr¹⁷² ）、total-AMPK（Thr¹⁷² ）、phospho-Akt（Ser⁴⁷³ ）、total-Akt（Ser⁴⁷³ ）、GAPDH之蛋白質含量測定；肝臟 phospho-AMPK（Thr¹⁷² ）、total-AMPK（Thr¹⁷² ）、β肌動蛋白、phospho-Akt（Ser⁴⁷³ ）、total-Akt（Ser⁴⁷³ ）、GAPDH的蛋白質含量測定（圖6A、圖6B）

小鼠肝臟的PPARα、FAS、β肌動蛋白的蛋白質含量測定（圖7A、圖7B、圖7C）、小鼠脂肪細胞的PPARγ、FAS、β肌動蛋白的蛋白質含量測定（圖7A、圖7B、圖7C）。

如圖2A、圖2B及表2，顯示在本發明細胞培養實驗中，以不同培養基對C2C12骨骼成肌细胞進行細胞培養後的蛋白質含量分析結果。其中，CON（control）表示以DMEM培養的空白對照組（以下簡稱CON組），DMSO表示以DMSO進行培養的對照組（以下簡稱DMSO組），Insulin表示以胰島素進行培養的實驗組（以下簡稱Insulin組），1、5、10、25（μg/mL）分別表示在不同濃度的純化物樟芝酸K（AnK）進行培養的實驗組（以下依序簡稱AnK組(1)、AnK組(5)、AnK組(10) 、AnK組(25)）。其中，星號係相較於CON組之統計分析結果表示，其中，*表示P ＜ 0.05、**表示P ＜ 0.01、***表示P ＜ 0.001。

請配合參閱圖2A、圖2B，顯示試管實驗的膜蛋白GLUT4、phospho-Akt (Ser⁴⁷³ )/total-Akt、以及phospho-AMPK (Thr¹⁷² )/total- AMPK蛋白的表現量。在細胞培養實驗結束時，C2C12肌纖維細胞在Insulin組、AnK組(5)、AnK組(10) 、AnK組(25)的GLUT4膜蛋白表現高於CON組，其統計分析結果依序為：Insulin組：P ＜ 0.001； AnK組(5)：P ＜ 0.001；AnK組(10)：P ＜ 0.001；AnK組(25)：P ＜ 0.001。另外，C2C12肌纖維細胞在Insulin組、以及AnK組(10)、AnK組(25)的phospho-Akt (Ser⁴⁷³ )/total- Akt蛋白表現量高於CON組，其統計分析結果依序為：Insulin組：P ＜ 0.001； AnK組(10)：P ＜ 0.001；AnK組(25)P ＜ 0.001。再者，C2C12肌纖維細胞在Insulin組及AnK組(5)、AnK組(10)、AnK組(25)的phospho-AMPK (Thr¹⁷² )/total- AMPK蛋白表現量高於CON組，其統計分析結果依序為：Insulin組：P ＜ 0.001；AnK組(5)：P ＜ 0.001; AnK組(10)：P ＜ 0.001；AnK組(25)P ＜ 0.001。

請搭配圖3A至圖3F及表2，顯示在本發明動物模型實驗中，餵食不同劑量的活性物質樟芝酸（AnK）、二甲雙胍（Metformin）或非諾貝特（Fenofibrate）對於HFD誘導第二型糖尿病小鼠之組織及血液數值分析結果。其中，CON（control）表示空白對照組（以下簡稱CON組），HFD表示HFD誘導對照組（以下簡稱HF組），HF+AnK1、HF+AnK2、HF+AnK3分別表示服用不同劑量的活性物質樟芝酸K（AnK）的實驗組（以下依序簡稱HF+AnK1組、HF+AnK2組、HF+AnK3組），而HF +Metf表示經HFD誘導並口服藥品二甲雙胍（Metformin，Metf）的實驗組（以下簡稱HF+Metf組），HF+Feno表示經HFD誘導並口服藥品非諾貝特（Fenofibrate，Feno）的實驗組（以下簡稱HF+Feno組）。井號係相較於CON組之統計分析結果表示，其中，#表示P ＜ 0.05、##表示P ＜ 0.01、###表示P ＜ 0.001；而星號係相較於HF+水（vehicle）組之統計分析結果表示，其中，*表示P ＜ 0.05、**表示P ＜ 0.01、***表示P ＜ 0.001。

體重、體重增加量、食物攝取量及組織重量

如是表2之數據結果係來自開始的時候，所有小鼠的平均體重為20.05±0.13克，到實驗結束時，HF組之實驗小鼠體重以及體重增加量比起控制組(CON)確實明顯的提升；再來比對經藥物治療的組群，其中，HF+AnK2，HF+AnK3以及HF+Feno組的小鼠明顯下降最終體重(final body weight)( 相對於HF組)，同時，HF+AnK1組，HF+AnK2組，HF+AnK3組，HF+Feno組以及HF+Metf組的小鼠亦明顯降低體重增加量(weight gain)( 相對於HF組)。食物攝取量的部分，HF組之實驗小鼠小於控制組(CON)，但與其餘HF+AnK1組，HF+AnK2組，HF+AnK3組，HF+Feno組以及HF+Metf組相對於HF組並太大無差異；而經施餵高脂肪飲食後(請參照表二HF組數據)，顯示出會造成附睾白色脂肪組織(Epididymal white adipose tissue；EWAT)、腸系膜白色脂肪組織(Mesenteric white adipose tissue；MWAT)，腹膜後脂肪組織(Retroperitoneal white adipose tissue ；RWAT)和內臟脂肪(visceral fat)重量的增加，而當經給予樟芝酸K(包括HF+AnK1組，HF+AnK2組，HF+AnK3組)及HF+Feno組、和HF+Metf組後會顯著降低附睾白色脂肪組織(EWAT)、腹膜後脂肪組織(RWAT)、腸系膜白色脂肪組織(MWAT)、以及內臟脂肪的重量，HF+Feno組的數據資料顯示出棕色脂肪組織（BAT）的重量的減少，但增加了肝臟重量。

血糖數值，生化指標，脂肪激素之濃度(包括瘦體素和脂聯素)以及肝臟中總脂質(total lipid)及三酸甘油酯(triacylglycerol)總量。

HF+AnK1組，HF+AnK2組，HF+AnK3組，HF+Feno組以及HF+Metf組等經施予藥劑的六組，相較於HF組血糖濃度顯著降低（如圖3A所示），同時，該六組施予藥劑組亦顯著地降低血液三酸甘油脂(TG)、總膽固醇(TC)和游離脂肪酸(FFA)的濃度（如圖3B與3C所示）；

經高脂肪飲食誘導後，造成血漿胰島素和瘦素濃度顯著增加(HF組相較於CON組)，但是降低了血液脂聯素的濃度。經給予純化物樟芝酸K或對照藥物後，HF+AnK1組，HF+AnK2組，HF+AnK3組，HF+Feno組以及HF+Metf組顯著地降低血漿瘦素、胰島素、以及FFA濃度，並且顯著增加脂聯素之濃度（圖3D，圖3E，圖3F和圖3G所示）。經高脂肪飲食誘導後，引起肝臟總脂質和甘油三酯的含量的增加。經給予純化物樟芝酸K或對照藥物後，HF+AnK1組，HF+AnK2組，HF+AnK3組，HF+Feno組以及HF+Metf組顯著降低肝臟總脂質含量(total lipid)和三酸甘油酯(triacylglycerol)的含量。

組織病理檢測

經過12週之高脂肪飲食誘導，於HF組別之小鼠導致其脂肪細胞hypertrophy (本實驗中之HF組小鼠之脂肪細胞面積: 10142.9±428.1um² ；CON組小鼠則為: 6044.4±359.1 um² )，得到(請配合參照圖4A)

高脂肪飲食誘導導致肝細胞顯著地氣球狀變性(ballooning degeneration)，本研究發現顯示該肝細胞的氣球狀變性係發生在HF組的小鼠身上，其導致了肝細胞破裂死亡且將於細胞中間堆積肝糖(糖原質)，且於圖4中可看出細胞核因脂肪細胞的肥大而被擠壓到角落，上述情形被稱為氣球狀(ballooning)；

基於先前研究，將組織學中肝細胞的氣球狀變性(ballooning)之量化程度可分成:

如今以此量化標準來評估本實驗各組之肝細胞的氣球狀變性程度，得到下表: (請配合參照圖4B)

肝臟標靶基因表現

如圖5A、圖5B、圖5C所示，HF組的G6-Pase、DGAT2、SREBP-1c、aP2、apoCIII、SREBP-2相較於CON組具有較高的mRNA表現量。經給予牛樟芝純化物樟芝酸K及對照藥物後，HF+AnK1組，HF+AnK2組，HF+AnK3組，HF+Feno組以及HF+Metf組顯示出其G6-Pase、DGAT2、SREBP-1c、aP2、apoCIII、SREBP-2的mRNA表現量相較於HF組是降低的，但是PPARalpha的mRNA表現量是增加的。

不同組織中的標靶基因表現量

如圖6A、圖6B所示，在實驗終止後，HF組的骨骼肌中GLUT4膜蛋白表現量（membrane expressions levels of GLUT4）相較低於CON組（統計分析結果為P ＜ 0.05）。經給予牛樟芝純化物樟芝酸K及對照藥物後，HF+AnK1組，HF+AnK2組，HF+AnK3組，HF+Feno組以及HF+Metf組(相較於HF組)顯著增加骨骼肌中GLUT4膜蛋白表現量（統計分析結果依序為：P ＜ 0.05、P ＜ 0.05、P ＜ 0.001、P ＜ 0.001及P ＜ 0.001）。HF組的骨骼肌及肝臟中phospho-AMPK/total -AMPK蛋白表現量相較低於CON組（統計分析結果依序為： P ＜ 0.05）。經給予牛樟芝純化物樟芝酸K及對照藥物後，HF+AnK1組，HF+AnK2組，HF+AnK3組，HF+Feno組以及HF+Metf組(相較於HF組)顯著增加骨骼肌中phospho-AMPK/total-AMPK蛋白表現量（統計分析結果依序為：P ＜ 0.05、P ＜ 0.001、P ＜ 0.001、P ＜ 0.001及P ＜ 0.001）。經給予牛樟芝純化物樟芝酸K及對照藥物後，HF+AnK1組，HF+AnK2組，HF+AnK3組，HF+Feno組以及HF+Metf組(相較於HF組)顯著增加肝臟中p-AMPK/t-AMPK肌肉蛋白表現量（統計分析結果依序為：P ＜ 0.001、P ＜ 0.001、P ＜ 0.001、P ＜ 0.001及P ＜ 0.001）。隨著治療，HF+AnK1組，HF+AnK2組，HF+AnK3組，HF+Feno組以及HF+Metf組的骨骼肌以及肝臟中(相較於HF組)顯著增加phospho-Akt/total-Akt蛋白表現量（統計分析結果依序為：P ＜ 0.001、P ＜ 0.001、P ＜ 0.001、P ＜ 0.001及P ＜ 0.001）。

如圖7A、圖7B、圖7C所示，HF組的肝臟中PPARα蛋白表現量相較低於CON組（統計分析結果為：P ＜ 0.001）；經過治療後，HF+AnK1組，HF+AnK2組，HF+AnK3組，HF+Feno組以及HF+Metf組的肝臟中PPARα蛋白表現量顯著增加了（統計分析結果依序為：P ＜ 0.05、P ＜ 0.001、P ＜ 0.001、P ＜ 0.001及P ＜ 0.001）。HF組的肝臟中FAS及PPARγ蛋白表現量相較高於CON組（統計分析結果依序為：P ＜ 0.01及P ＜ 0.001）；經過治療後，HF+AnK1組，HF+AnK2組，HF+AnK3組，HF+Feno組以及HF+Metf組的肝臟中FAS及PPARγ蛋白表現量顯著降低了。HF組的脂肪組織中FAS及PPARγ蛋白表現量相較高於CON組（統計分析結果依序為：P ＜ 0.001及P ＜ 0.001）；同理，經過治療後，HF+AnK1組，HF+AnK2組，HF+AnK3組，HF+Feno組以及HF+Metf組的脂肪組織中FAS及PPARγ蛋白表現量顯著被降低了。

綜上所述，本發明開發了牛樟芝提取物之活性物質樟芝酸K作為對於糖尿病及血脂異常的治療效果。高脂肪飲食誘導致糖尿病小鼠在口服純化物樟芝酸K後，不僅顯著地降低血糖及降低胰島素濃度，也降低了血液中三酸甘油酯及總膽固醇。樟芝酸K顯著地增加了骨骼肌膜中的GLUT4膜蛋白表現量以提升葡萄糖攝取。此外，透過給予樟芝酸K至高脂肪飲食導致的糖尿病小鼠，會增加骨骼肌及肝臟組織中phospho-AMPK/total-AMPK蛋白表現量。給予樟芝酸K會降低與肝臟葡萄糖生成抑制作用相關的PEPCK及G6 Pase的mRNA表現。給予樟芝酸K到糖尿病小鼠，透過增強骨骼肌中GLUT4膜蛋白以及降低肝臟中葡萄糖生成之結合，導致降低血液中葡萄糖濃度。樟芝酸K（AnK）透過抑制肝臟的脂質生成的FAS以及增加肝臟中脂肪酸氧化PPARα蛋白的表現量及增強CPT1a的mRNA表現量；並伴隨著降低SREBP1c和DGAT2的mRNA表現量，達到降低了血漿中三酸甘油酯、脂肪肝及總膽固醇指數。樟芝酸K減少了包括存在於脂肪組織中PPARγ及FAS脂肪合成基因的蛋白表現量，其可能有利於減少脂肪細胞分化及脂質貯存。進一步地，樟芝酸K減少了SREBP2的mRNA表現量，這導致了血液中總膽固醇降低。本研究顯示樟芝酸K（AnK）對於第二型糖尿病有關的高脂血症有優異的治療潛力。

圖1係牛樟芝提取物之活性物質樟芝酸K (AnK)的化學結構式。圖2A顯示本發明細胞培養實驗中，以西方點墨分析法（Western blot）測定C2C12成肌細胞在CON組、DMSO組、Insulin組、AnK組(1μg/mL)、AnK組(5μg/mL)以及AnK組(10μg/mL)中的GLUT4、phospho-Akt（Ser⁴⁷³ ）、total-Akt（Ser⁴⁷³ ）及GAPDH的蛋白質含量。（GAPDH，Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，甘油醛3-磷酸脫氫酶）圖2B顯示將圖2A測得之蛋白質含量的定量長條圖。圖3A、圖3B、圖3C、圖3D、圖3E、圖3F、圖3G分別係樟芝酸K (AnK)對於經過12週觀察之(1)控制組(CON)、(2)經高脂飲食(HF)餵養組、(3)HF+10(mg/kg/day)AnK1 組、(4) HF+20(mg/kg/day)AnK2組、(5) HF+40(mg/kg/day)AnK3組、(6) HF+250(mg/kg/day)Feno組、(7) HF+300(mg/kg/day)Metf組的各實驗小鼠組別，其(A) 血糖數值、(B)血液三酸甘油脂(TG)濃度、(C) 血液總膽固醇 (TC)濃度、(D)血液胰島素濃度、(E)血液瘦體素濃度、(F) 血液脂聯素濃度、(G) 血液游離脂肪酸 free fatty acid (FFA)濃度的影響。圖4A、圖4B顯示本發明動物模型實驗中，CON組、HF組、HF+ AnK1組、HF + AnK2組、HF + AnK3組、HF +Metf組以及HF +Feno組的小鼠附睾白色脂肪組織（圖4A）及肝臟組織（圖4B）的病理切片圖。圖5A顯示本發明動物模型實驗中，對CON組、HF組、HF+ AnK1組、HF + AnK2組、HF + AnK3組、HF +Metf組以及HF +Feno組之小鼠肝臟組織中的G6-Pase、PPARa、SREBP-1c、DGAT2、aP2、apoCIII、SREBP2、GAPDH的表現進行半定量RT-PCR分析之數據圖式。圖5B至圖5C顯示將圖5A中的G6-Pase、PPARa、SREBP-1c、DGAT2、aP2、apoCIII、SREBP2、GAPDH測得之信號經圖像分析而定量，且透過GAPDH使每個值標準化。圖6A顯示本發明動物模型實驗中，以西方點墨分析法（Western blot）對CON組、HF組、HF+ AnK1組、HF + AnK2組、HF + AnK3組、HF +Metf組以及HF +Feno組之小鼠骨胳肌中的GLUT4、phospho-AMPK（Thr¹⁷² ）、total-AMPK（Thr¹⁷² ）、GAPDH的蛋白質含量進行測定，以及對前述各組之小鼠肝臟中的phospho-AMPK（Thr¹⁷² ）、total-AMPK（Thr¹⁷² ）、與phospho-AMPK（Ser⁴⁷³ ）、total-AMPK（Ser⁴⁷³ ）、GAPDH、β肌動蛋白的蛋白質含量進行測定。圖6B顯示將圖6A測得之蛋白質含量的定量長條圖。圖7A顯示本發明動物模型實驗中，以西方點墨分析法（Western blot）對CON組、HF組、HF+ AnK1組、HF + AnK2組、HF + AnK3組、HF +Metf組以及HF +Feno組之小鼠肝臟中的PPARα、FAS、PPARγ、β肌動蛋白的蛋白質含量進行測定，以及對前述各組之小鼠脂肪組織中的PPARγ、FAS、β肌動蛋白的蛋白質含量進行測定。圖7B顯示將圖7A測得之小鼠肝臟中的PPARα、FAS、PPARγ、β肌動蛋白的蛋白質含量的定量長條圖。圖7C顯示將圖7A測得之小鼠脂肪組織中的PPARγ、FAS、β肌動蛋白的蛋白質含量的定量長條圖。

Claims

一種牛樟芝提取物之用途，其係用於製備治療第二型糖尿病之醫藥化合物，該提取物係自牛樟芝子實體提取之活性物質，該活性物質為純化物樟芝酸K(3α,4β,7β-trihydroxy-4α-methylergosta-8,24(28)-dien-11-on-25S-26-oic acid；AnK)。
一種牛樟芝提取物之用途，其係用於製備降低血糖及影響胰島素敏感性之醫藥化合物，該提取物係自牛樟芝子實體提取之活性物質，該活性物質為純化物樟芝K(3α,4β,7β-trihydroxy-4α-methylergosta-8,24(28)-dien-11-on-25S-26-oic acid；AnK)。
如申請專利範圍第2項所述之用途，其係透過樟芝酸K增加骨骼肌中GLUT4膜蛋白以及蛋白質激酶B(Akt)之磷酸化、增加骨骼肌及肝臟的磷酸化AMPK(phospho-AMPK)蛋白的表現量，及降低肝臟中PEPCK及G6 Pase的mRNA表現量，達到降低血液中葡萄糖濃度。
一種牛樟芝提取物之用途，其係用於製備治療高血脂症之醫藥化合物，該提取物係自牛樟芝子實體提取之活性物質，該活性物質為純化物樟芝酸K(3α,4β,7β-trihydroxy-4α-methylergosta-8,24(28)-dien-11-on-25S-26-oic acid；AnK)。
一種牛樟芝提取物之用途，其係用於製備降低血液中三酸甘油酯及總膽固醇之醫藥化合物，該提取物係自牛樟芝子實體提取之活性物質，該活性物質為純化物樟芝酸K(3α,4β,7β-trihydroxy-4α-methylergosta-8,24(28)-dien-11-on-25S-26-oic acid；AnK)。
如申請專利範圍第5項所述之用途，其係以樟芝酸K降低肝臟的FAS和PPARγ的蛋白表現量伴隨減少SREBP1c和DGAT2的mRNA表現，達到降低了血液中三酸甘油酯濃度，而增加了PPARα的蛋白表現量並伴隨著增加肝臟中CPT1a的mRNA表現以增加脂肪酸氧化；以及其係以樟芝酸K減少SREBP2的mRNA表現量，達到降低血液中總膽固醇數值。
如申請專利範圍第6項所述之用途，樟芝酸K在脂肪細胞其係透過降低脂質生成的基因如PPARγ和FAS的蛋白表現量，減少脂肪細胞分化、降低脂肪累積以及減輕脂肪肝；樟芝酸K在肝臟其係透過增加脂肪酸氧化的PPARα以及降低FAS基因的蛋白表現量，進而減少肝臟脂質和降低血液中三酸甘油酯的含量。
一種牛樟芝提取物之用途，其係用於製備治療由高脂肪飲食所引起的脂肪肝及空泡樣變(balloning degeneration)，以及降低肝臟中的總脂質及三酸甘油酯的含量之醫藥化合物，該提取物係自牛樟芝子實體提取之活性物質，該活性物質為純化物樟芝酸K(3α,4β,7β-trihydroxy-4α-methylergosta-8,24(28)-dien-11-on-25S-26-oic acid；AnK)。
一種牛樟芝提取物之用途，其係用於製備降低血液瘦體素之醫藥化合物，該提取物係自牛樟芝子實體提取之活性物質，該活性物質為純化物樟芝酸K(3α,4β,7β-trihydroxy-4α-methylergosta-8,24(28)-dien-11-on-25S-26-oic acid；AnK)。