TWI592164B - 枇杷葉細胞的萃取純化物委陵菜酸用於降血糖及/或減少肝臟脂肪之用途 - Google Patents
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Description
本案係關於一種枇杷葉萃取純化物之新用途，特別是指萃取自枇杷葉細胞懸浮培養液的委陵菜酸(Tormentic Acid；PTA)之降血糖和減少脂肪肝之用途。
第二型糖尿病佔所有糖尿病患者比例的90%。胰島素阻抗(insulin resistance)發生於絕大多數第二型糖尿病，其係由於對周緣組織中的胰島素的鈍性所導致。根據預測，第二型糖尿病，在世界人口中的發病率將在2025年達到6.1%，因此，尋求用於治療第二型糖尿病之一種安全且低毒性的替代藥物變得重要。第二型糖尿病主要降低葡萄糖攝取，第二型糖尿病伴會隨著數種引起一系列代謝性疾病的併發症，包括肥胖和血脂異常。眾所周知，血糖和脂肪會構成波動的動態平衡，因此，尋求解決第二型糖尿病的葡萄糖攝取量和肝醣異生作用亦顯重要。
胰島素係在飯後分泌，接著是葡萄糖轉運蛋白4，胰島素被轉運到質膜，從而導致葡萄糖攝取進入細胞，並有助於降低血糖。胰島素阻抗和高血
糖是由葡萄糖運送蛋白質(GLUT4)的轉運(translocation)和攝取(uptake)問題所致。因此，增加GLUT4之蛋白質含量及/或轉運，係糖尿病管理中的重要課題。
腺苷單磷酸活化蛋白激酶(AMPK)調節各種代謝途徑，且其被認為是管理包括第二型糖尿病和脂質異常等代謝疾病的重要目標。第二型糖尿病被被認為是不正常的葡萄糖和脂質代謝，因此，腺苷單磷酸活化蛋白激酶(AMPK)調節劑(modulators)已被建議是有效的治療。
枇杷之學名為Eriobotrya japonica，其係薔薇科之蘋果亞科的一個屬，為常綠小喬木。目前研究已證實，枇杷葉經乾燥後可被用於治療糖尿病，枇杷葉含有許多五環三萜類化合物(pentacyclic triterpenes)而具有包括保肝(hepatoprotection)及抗糖尿病等不同的藥效(pharmaceutical effects)。據研究指出，枇杷癒合組織培養會產生大量的三萜類化合物(triterpenes)，且本案發明人先前參與的研究已顯示，枇杷葉萃取物(Shih et al.,2010)及其細胞懸浮培養物(含5種成分)(Shih et al.,2013)能夠改善胰島素敏感性和高血脂症，所述枇杷葉的細胞懸浮培養物中含有二羥基香豆素(oleanolic acid)、熊果酸(ursolic acid)、山楂酸(maslinic acid)、科羅索酸(corosolic acid，又稱2-alpha-羟基熊果酸)及委陵菜酸(PTA，tormentic acid)5種主要生物活性成分，其中，委陵菜酸(PTA)具有如圖1所示之化學結構式。本案發明人認為，該5種成分之間會產生協合效應，且其中之一的協合效應，是其中的兩種化學物質組合後給予的效果大於各成分單獨給予之效果的總和，因而對糖尿病和脂質產生影響。然而，純粹僅以委陵菜酸(PTA)用於抗糖尿病和抗肝臟脂異常的效果則是完全未知的。
本發明之第一目的在於開發枇杷葉細胞懸液的委陵菜酸(PTA)之新用途，尤其是降低血糖，或應用於預防或治療糖尿病之醫藥化合物。
本發明之第二目的在於開發枇杷葉細胞懸液的委陵菜酸(PTA)之新用途，尤其是用於降低肝臟的脂質或三酸甘油酯之醫藥化合物。
本發明之第三目的在於開發枇杷葉細胞懸液的委陵菜酸(PTA)之新用途，尤其是應用於降低肝細胞空泡樣變(hepatic ballooning degeneration)現象之醫藥化合物。
本發明之第四目的在於開發枇杷葉細胞懸液的委陵菜酸(PTA)之新用途，尤其是用於製備增加骨骼肌的腺苷單磷酸活化蛋白激酶(AMPK)磷酸化、蛋白質激酶B磷酸化(p-Akt)以及葡萄糖轉運蛋白4(GLUT4 proteins)之醫藥化合物。
本發明之第五目的在於開發枇杷葉細胞懸液的委陵菜酸(PTA)之新用途，尤其是用於製備改善肝藏內的磷酸化腺苷單磷酸活化蛋白激酶及/或改善骨骼肌蛋白質激酶B磷酸化，並提升胰島素敏感性之醫藥化合物。
緣是，為達上述目的，本發明提供一種枇杷葉細胞的萃取物，該枇杷葉細胞的懸浮培養物的委陵菜酸(PTA)，其係採用已殺菌種子進行癒傷組織誘導後，再於生物反應器中培養以獲得一細胞懸浮液；該細胞懸浮液經乾燥並用乙醇萃取後，濃縮得一白色粉末；將該白色粉末在反向矽膠柱中進行色譜分離，再經製備高效液相層析儀(high-performance liquid chromatography；PHPLC)純化後所製得。
藉此，透過該由枇杷葉細胞懸浮液萃取純化而得的委陵菜酸(PTA)，增加骨骼肌的腺苷單磷酸活化蛋白激酶(AMPK)的激活作用，並增加骨骼肌葡萄糖轉運蛋白4時，進而產生降低血糖的功效，進而達到減輕糖尿病症狀之功效。此外，委陵菜酸在肝臟透過降低固醇調節組件結合蛋白1c(sterol regulatory element binding protein 1c；SREBP-1c)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，FAS)及載脂蛋白C-Ⅲ(apolipoprotein C-III；apo C-Ⅲ)mRNA的基因表現量之調節，而產生降低肝臟脂質生成(de novo lipogenesis)的效果，並增加過氧化物酶體增殖物活化受體(peroxisome proliferator-activated receptor；PPAR)的α表現量，增加肝臟脂肪酸氧化(fatty acid oxidation)作用，即增加肝臟脂質代謝；又血液中的脂質是波動的，累積在脂肪組織的脂質絕大多半是從血液中三甘油酯而來，並且肝臟是一脂質和脂蛋白代謝的器官，因此產生降低血液與肝臟中三酸甘油酯的功效；終而達到將該枇杷葉萃取物(委陵菜酸)應用於降低血糖、減少肝臟的脂質或三酸甘油酯，以及治療糖尿病之用途，達到提供一種用於治療糖尿病的高安全性、低毒性之替代物。
圖1係委陵菜酸(PTA)之化學結構式。
圖2A顯示正常小鼠在口服葡萄糖耐受性測試中口服委陵菜酸的影響。
圖2B顯示小鼠在第12週口服委陵菜酸對血糖指數的影響。
圖2C顯示小鼠在第12週口服委陵菜酸對循環三酸甘油酯的影響。
圖3A顯示小鼠口服委陵菜酸後對於附睾白色脂肪組織的影響。
圖3B顯示小鼠口服委陵菜酸後對於肝組織形態的影響。
圖4A顯示接受口服灌胃委陵菜酸四週之小鼠肝臟組織中的PEPCK、G6 Pase、11 β-HSD1、DGAT2、PPAR α、SREBP1c、FAS、及apo C-III mRNA表現進行半定量RT-PCR分析之數據圖式。
圖4B顯示將圖4A中的PEPCK、G6 Pase、11 β-HSD1、DGAT2測得之信號經圖像分析而定量，且透過GAPDH使每個值標準化。
圖4C顯示將圖4A中的PPAR α、SREBP1c、FAS、及apo C-III mRNA測得之信號經圖像分析而定量，且透過GAPDH使每個值標準化。
圖5A顯示接受口服灌胃委陵菜酸四週之小鼠，其骨胳肌中的GLUT4的蛋白質組成、肝臟組織及骨骼肌中的總AMPK中的磷酸化AMPK(Thr172)比例。
圖5B顯示將圖5A存在骨骼肌之Akt(磷酸化Akt標準化為總Akt(pAkt/Akt))的磷酸化狀態的定量結果。
本發明特徵與優點的一些典型實施例將在以下說明中詳細敘述。應理解的是本發明能夠在不同的態樣上具有各種的變化，然其皆不脫離本發明的範圍，且其中的說明及圖式在本質上係當作說明之用，而非用於限制本發明。
本發明提供了枇杷葉細胞懸液的委陵菜酸用於製備降低血糖、肝臟脂質及三酸甘油酯之醫藥化合物的新用途，以及治療糖尿病。以下將進一步說明枇杷葉萃取物之萃取純化方法及其功效試驗。
本發明的枇杷葉細胞的萃取純化物係自枇杷葉細胞懸浮液中萃取純化而得之單一成分：委陵菜酸。其具體萃取純化方法，係將已殺菌種子進行
癒傷組織誘導後，再於生物反應器中進行培養，以獲得一細胞懸浮液；接著，將該細胞懸浮液(約844.5克)乾燥並用乙醇萃取，然後濃縮以製得一白色粉末部分(約6.1克)，將該白色粉末(約0.5克)在反向矽膠柱(reverse silica gel column)(LiChroprep RP-18，Merck公司產品，40-63微米)中進行色譜分離，然後進一步經製備高效液相層析儀(PHPLC)純化，最終製得本發明用於製備保健產品之委陵菜酸(PTA)。
於本實施例中，萃取溶劑並不限於乙醇，亦可選自甲醇或其他可達到相同或相當萃取效果之溶劑，或者利用其他本領域具有通常知識者所習用之萃取方法，於此不贅述。
前述經細胞懸浮液萃取而得之委陵菜酸(230.5mg)的光譜測定資料如下：1H NMR(吡啶-d5)δ 1.00(H-25),1.07(H-24),1.10(H-26),1.11(H-30),1.26(H-23),1.42(H-29),1.71(H-27),3.04(H-18),3.36(H-3 α),4.09(H-3 β),5.58(H-12).1H NMR(400MHz)。前述光譜係使用如前所述之Bruker AMX-400光譜儀測定。
由於小鼠C57BL/6模組經餵食高脂飲食(high-fat diet；HF)可誘導致胰島素阻抗(insulin resistance)、肥胖(obesity)、高血脂症(hyperlipidemia)、高胰島素血症(hyperinsulinemia)、高瘦素血症(hyperleptinemia)及高游離脂肪酸血症(excess circulating free fatty acid)，因此，本發明使用高脂飲食誘導的糖尿病和高脂血症狀態進行了動物實驗。其中，腺苷單磷酸活化蛋白激酶(AMPK)的激活作用是依據α亞基的Thr172的磷酸化而定，故本發明同時檢驗委陵菜酸(PTA)在涉及抗糖尿病及脂肪生成的標的基因表現量或蛋白質的含量的影響，所述基因表現或基因蛋白包括葡萄糖運送蛋白質4(GLUT4)、磷酸化的蛋白質
激酶B(p-Akt)、磷酸化的腺苷單磷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphenolpyruvate carboxykinase；PEPCK)、6-磷酸葡萄糖(glucose-6-phosphatase；G6-Pase)、膽固醇調節組件結合蛋白1c(SREBPs-1c)、過氧化物酶體增殖物活化受體α(PPAR α)及載脂蛋白C-Ⅲ(apo C-Ⅲ)。
以下說明本發明於測試枇杷葉細胞懸液的委陵菜酸用於預防或治療糖尿病之功效的動物和實驗設計，以及小鼠之血液數據、血清生化值分析、病理組織分析、肝脂質分析與RNA的萃取及mRNA的相對定量標的基因表現量。
動物和實驗設計
第一部分，口服葡萄糖耐受性(OGTT，oral glucose tolerance)試驗採用ICR小鼠(n=5)測試前經12小時隔夜禁食，給予葡萄糖(1g/kg body weight)前30分鐘經口灌服0.2、0.4或0.8g/kg body weight的委陵菜酸或等量的vehicle(水)；其中，對照組(control group)經口灌服葡萄糖，而實驗組(normal group)則沒有給予葡萄糖。自餵食葡萄糖開始(0分鐘)直到餵食葡萄糖後120分鐘之間，每隔30分鐘從禁食小鼠的眶後竇(retro-orbital sinus)抽取血液樣品，藉以監測血糖濃度。
第二部分，在第二型糖尿病動物實驗中，係採用4週齡C57BL/6J鼠(購自國家實驗研究院實驗動物中心)，飼養室溫度控制在22±3℃，濕度60±5%，維持12小時光照(7：00~19：00)，在調適一週後，將小鼠隨機分組分成兩組，包括低脂飲食(low-fat diet)的控制組(n=9)和高脂飲食(high-fat diet)的實驗組(n=36)，整個實驗持續12週。其中低脂飲食成分為20%蛋白質、70%碳水化合物和10%脂防，高脂飲食成分為20%蛋白質、35%碳水化合物和45%脂防。在餵食8週之
後，將高脂飲食誘發之糖尿病鼠隨機再次分成4組，每組9隻小鼠，分別為以胃管每天經口灌服1次0.06(PTA1)或0.12(PTA1)g/kg體重的委陵菜酸、或對照降血糖藥(rosiglitazone，縮寫：Rosi。餵食量Rosi；1%甲基纖維素、10mg/kg body weight)(葛蘭素史克公司，GlaxoSmithKline)，連續灌藥4週，同時仍維持高脂飲食。而其中的高脂飲食的對照組和低脂飲食的對照組，則是餵予等體積的生理食鹽水。最後，移開食物將小鼠從晚上十點至早上十點禁食，隔天將小鼠犧牲，收集血液和組織以用於分析。取下肝臟、骨骼肌並稱重，接著立即凍結，並保持在-80℃下以用於標靶基因的分析。將肝素(30單位/毫升)(Sigma)加入到血液樣本。收集血液樣本動作於30分鐘內完成。血漿樣本在4℃、1600g下離心15分鐘，藉此獲得用於測定血漿胰島素和瘦素之濃度。
血液數值分析
從禁食小鼠的眶後竇收集血液樣本(0.8毫升)，利用葡萄糖分析儀(Model 1500 sidekick glucose analyzer；YSI)分析血液葡萄糖之數值。血漿甘油三酯(Plasma triglycerides，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、游離脂肪酸(free fatty acids，FFA)係使用市售試劑盒根據製造商指示進行測定(甘油三酯-E測試/Triglycerides-E test、膽固醇-E測試/Cholesterol-E test及游離脂肪酸-C測試/FFA-C test；和光純藥/Wako Pure Chemical，日本大阪)。血液中胰島素和瘦體素的濃度是透過酶聯免疫吸附試驗(又稱酵素免疫分析法，Enzyme-linked immunosorbent assay，簡稱ELISA)並使用市售試劑盒根據製造商指示進行測定(小鼠胰島素ELISA試劑盒，Sibayagi，日本群馬縣；小鼠瘦體素ELISA試劑盒，森永，日本橫濱)。
病理組織分析
取肝組織用福爾馬林(200g/kg/)中性緩衝溶液固定並包埋在石蠟中。將組織剖面(8微米)以蘇木精和曙紅(hematoxylin and eosin)染紅，以用於顯微鏡檢查，在顯微鏡(萊卡，DM2500)下並使用萊卡數位相機(DFC-425-C)拍攝織組切片圖像。
肝脂質之分析
肝脂質之分析係採用現有技術進行提取(Shih et al.,2010)。於本實施例中，肝脂質的提取，乃取0.375克肝臟樣本，使之與1mL蒸餾水經勻漿(homogenized)5分鐘後；最後，將乾燥的沉澱物重新懸浮在0.5毫升乙醇中，並採用與測試血清脂質的甘油三酯相同的試劑盒，對提取的肝臟之脂質進行分析。
RNA的萃取及mRNA的相對定量顯示基因表現
根據製造商的指示，利用Trizol試劑(Trizol reagent)分離來自肝臟組織的總RNA(分子研究中心公司，辛辛那提，美國俄亥俄州)。透過2%瓊脂糖凝膠電泳對前述提取的總RNA完整性進行檢測，並通過2%瓊脂糖凝膠電泳以及260和280nm的紫外線吸光度(ultraviolet light absorbency)測定RNA濃度(分光光度計U-2800A，日立)。總RNA(1μg)反轉錄(reverse transcribed)為cDNA，以及5mL的莫洛尼鼠白血病(Moloney murine leukemia)病毒如前述方案反轉錄為酶(震中，麥迪遜，WI，USA)。聚合酶鏈反應(PCR)是在最後的25μL中進行，其含有1U的Blend Taq-Plus(TOYOBO公司，日本)、1μL
的RT第一鏈cDNA產物、各10μM的正向引子和反向引子、75mM的Tris-HCl(三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽)其中含有1mg/L的吐溫20(tween-20，pH值為8.3，又稱：聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯)、2.5mM的dNTP(deoxy-ribonucleoside triphosphate，脫氧核糖核苷三磷酸)以及2mM的MgCl2(氯化鎂)。所述引子如下表1所示。該產物係在2%瓊脂糖凝膠上進行測定，並用溴化乙錠(ethidium bromide)染色。
以下說明前述測試中，第一部分實驗，ICR小鼠於口服葡萄糖耐受性試驗(OGTT assay)結果。第二部分實驗，高脂肪飲食誘導致糖尿病的C57BL6J小鼠之結果，包括血液數值、血清生化值、瘦體素、胰島素濃度、及不同組織如肝臟及骨骼肌之標靶基因表現量或蛋白質的含量，包括對磷酸化AMPK(Thr172)/總AMPK、GLUT4、磷酸化Akt(Ser473)/總Akt之影響。
第一部分，ICR小鼠口服葡萄糖耐受試驗
從第2A圖顯示投予0.2、0.4和0.8g/kg/body weight的純化物委陵菜酸，於口服葡萄糖後的30至120分鐘之間，顯著降低血糖濃度。
第二部分 高脂肪飲食誘導致糖尿病小鼠的血液參數、血清生化值瘦體素、胰島素濃度及肝臟脂質。
從第2B、2C圖及表2顯示餵食不同劑量的純化物委陵菜酸(PTA)或Rosi對於高脂飲食誘導第二型糖尿病鼠之血糖和血液生化值分析結果，其中Control表示低脂飲食對照組，HF表示高脂飲食對照組(賦形劑(vehicle-treated)對照組)，HF+PTA1、HF+PTA2分別表示服用不同劑量的純化物委陵菜酸(PTA)的實驗組，而HF+Rosi則表示服用高脂飲食和rosiglitazone的實驗組。井號係相較於Control組之統計分析，其中，#表示P<0.05、##表示P<0.01、###表示P<0.001，而星號係相較於HF組之統計分析，其中，*表示P<0.05、**表示P<0.01、***表示P<0.001。
從第2B、2C圖及第2表之分析結果可知，在連續餵食12週高脂飼料之後，發現餵食高脂飼料12週之小鼠空腹血糖平均值為140.8mg/dL，顯著高於低脂飲食的正常值83.6mg/dL(P<0.001)，而在連續4週餵食不同劑量的純化物委陵菜酸(PTA)或Rosi或高脂飲食的實驗組中，PTA1組和PTA2組即可顯著使空腹血糖值降至96.3和94.8mg/dL(P<0.001；P<0.001；P<0.001)，
降血糖藥rosiglitazone則降至89.7mg/dL，顯示純化物委陵菜酸(PTA)具有極佳的降血糖效果。經過12週的高脂飲食，高脂飲食對照組的血液中三酸甘油酯(Triglyceride)、膽固醇(Total cholesterol,TC)、游離脂肪酸(Free fatty acid,FFA)、瘦體素、和胰島素濃度均比低脂飲食對照組顯著增高高出74.7%、114.9%、68.7%、105.1%、和419.5%(P<0.001；P<0.001；P<0.05；P<0.001；P<0.001)。每天給予委陵菜酸PTA1組、PTA2組及Rosi組可顯著降低血液中的膽固醇、游離脂肪酸、瘦體素、和胰島素。每天給予委陵菜酸(PTA2)組及Rosi組可有效降低膽固醇(TC)。而在肝臟脂肪中，高脂肪飲食顯著增加低脂飲食的肝臟的總脂質(total lipids)及三酸甘油酯(triacylglycerol)的含量(P<0.001；P<0.001)，高脂飲食對照組的總脂質高達98.7mg/g，而肝臟中的三酸甘油酯含量在高脂飲食對照組中高達68.5μmol/g，而每天投予PTA1、PTA2和降血糖藥Rosi組顯著降低肝臟中的總脂質及三酸甘油酯的含量。而餵食劑量0.12g/kg的委陵菜酸(PTA2)即可以有效降低肝臟三酸甘油酯含量至35.2μmol/g(P<0.001)。
病理診斷
第3圖顯示餵食不同劑量的純化物委陵菜酸(PTA)和rosiglitazone對於高脂飲食誘導第二型糖尿病鼠之肝臟組織的切片結果。根據先前研究指出，病理組織學肝臟細胞空泡發現包括：0級，無；1級，少數細胞；2級，許多細胞。由圖中可見，高脂飲食會造成肝臟空泡樣變(hepatic ballooning degeneration)現象，肝臟空泡現象肉眼可見(平均評分=1.7±0.2)。而餵食不同劑量的純化物委陵菜酸(PTA)和rosiglitazone(PTA1：1.0±0.2、PTA2：0.7±0.2)以及Rosi
(0.9±0.2)可改善脂肪肝所造成之脂肪變性(steatosis)及可以降低肝臟空泡樣變現象(如第3圖所示)。
肝臟標靶基因表現量
從第4A、4B、4C圖之分析結果可知，在連續餵食12週高脂飼料之後，發現餵食高脂飼料12週之小鼠肝臟的PEPCK、G6 Pase、11 β-羟基类固醇脫氢酶(11 β-hydroxysteroid dehydrogenase 1，11 β-HDS1)、二酰基甘油酰基轉移酶(diacyl glycerol acyltransferase 2，DGAT2)、PPAR α、SREBP1c、FAS以及apo C-III的mRNA基因表現量相對於對照組顯著增加，每天給予純化物委陵菜酸PTA1組、PTA2組及Rosi組可顯著降低PEPCK、G6 Pase、DGAT2、11 β-HDS1、SREBP1c、FAS以及apo C-III的mRNA基因表現量。PTA1組及PTA2組則顯著增加PPAR α的mRNA基因表現量。
不同組織之磷酸化AMPK(Thr172)、GLUT4、磷酸化Akt(Ser473)/總Akt蛋白質含量
第5A、5B圖顯示餵食不同劑量的純化物委陵菜酸(PTA)和rosiglitazone對於高脂飲食誘導第二型糖尿病鼠之肝臟和骨骼肌磷酸化AMPK蛋白質的含量、和骨骼肌GLUT4蛋白質含量之比較，以進一步探討餵食不同劑量的委陵菜酸(PTA)降低血糖和三酸甘油酯之機轉。由第5A、5B圖結果可見，發現餵食高脂飼料後小鼠肝臟和骨骼肌的磷酸化AMPK蛋白質的含量相對於低脂肪飲食顯著降低。經餵食不同劑量的純化物委陵菜酸(PTA1和PTA2)和rosiglitazone可以活化肝臟、骨骼肌中的AMPK，亦即增加磷酸化AMPK蛋白質
的含量。同時，發現餵食高脂飼料後小鼠骨骼肌的磷酸化Akt蛋白質含量相對於低脂肪飲食顯著降低，餵食不同劑量的純化物委陵菜酸(PTA1和PTA2)和rosiglitazone亦可以增加骨骼肌Akt蛋白質的含量。同時，由圖結果可見，發現餵食高脂飼料後小鼠骨骼肌的GLUT4蛋白質含量相對於低脂肪飲食顯著降低，餵食不同劑量的純化物委陵菜酸(PTA1和PTA2)和rosiglitazone亦可以增加骨骼肌GLUT4蛋白質的含量，有助於骨骼肌增加葡萄糖攝取而降低血液中的血糖值。
綜上所述，本案開發了純化物委陵菜酸(PTA)作為降低血糖和降低脂肪肝之用途，其中降低脂肪肝包含肝臟總脂質或三酸甘油脂過高，或為兩者皆高的綜合症。此外，純化物委陵菜酸(PTA)亦在葡萄糖耐受試驗中可降低血糖，維持血糖穩定，治療糖尿病包括第一型和第二型糖尿病。在第二型糖尿病的實驗中，本發明利用高脂飲食增加小鼠之血糖、三酸甘油酯、胰島素及瘦體素的數值，透過純化物委陵菜酸(PTA)達到治療該些現象的效果，在第二型糖尿病提高骨骼肌肉對於葡萄糖的吸收，維持血糖穩定，以及影響胰島素分泌，並減少胰島素阻抗。在降低脂肪肝方面，投予純化物委陵菜酸(PTA)可降低肝臟脂肪和三酸甘油脂含量，及改善肝臟空泡樣變現象。投予純化物委陵菜酸(PTA)會增加骨骼肌葡萄糖轉運蛋白4(GLUT4)之蛋白含量，增加葡萄糖的攝取；另一方面降低肝臟磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)以及6-磷酸葡萄糖(G6-Pase)的基因表現量，抑制肝臟糖質新生，進而達到降血糖作用。該純化物委陵菜酸(PTA)增加骨骼肌的蛋白質激酶B磷酸化(p-Akt)並提升胰島素敏感性。純化物委陵菜酸(PTA)顯著增加骨骼肌內的磷酸化腺苷單磷酸活化
蛋白激酶(p-AMPK)的蛋白含量，因此，純化物委陵菜酸(PTA)之骨骼肌腺苷單磷酸活化蛋白激酶(AMPK)的激活作用是有可能是透過增加骨骼肌GLUT4而產生降低血糖的功效，進而達到減輕糖尿病症狀之功效。此外，該純化物委陵菜酸(PTA)透過降低肝臟固醇調節組件結合蛋白1c(SREBPs-1c)及脂肪酸合成酶(FAS)、載脂蛋白C-Ⅲ(apo C-III)、以及二酰基甘油酰基轉移酶(DGAT2)(此酶係三酸甘油酯合成步驟最後一關鍵酶)mRNA基因表現量之調節；另一方面，純化物委陵菜酸(PTA)增加過氧化物酶體增殖物活化受體α(PPAR α)的表現，增加肝臟脂肪酸氧化作用，而增加脂質代謝；顯示該製劑具有減少肝臟脂質生成作用及具增加肝臟脂質代謝效果，因此產生降低肝臟中三酸甘油酯的功效。通過以上測試證實本發明的純化物委陵菜酸對於由高脂飲食導致糖尿病和肝臟脂質異常之小鼠是有效的。透過委陵菜酸(PTA)可活化AMPK，及改善脂肪肝。因此，透過本發明純化物委陵菜酸(PTA)可用於製備降低肝臟總脂質和三酸甘油酯之保健產品，或是製備同時降低肝臟脂質與血糖之醫藥化合物，並可提供予例如生物技術公司、藥廠、健康食品相關業者大量生產製造，故本案極具產業價值，爰依法提出申請。
本案得由熟習此技術之人士任施匠思而為諸般修飾，然皆不脫如附申請專利範圍所欲保護者。
Claims (8)
- 一種自枇杷葉細胞懸浮液萃取之純化物委陵菜酸之用途，其係用於製備降低血糖、影響血液胰島素濃度及/或治療糖尿病之醫藥化合物。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中，該醫藥化合物用於治療第一型糖尿病及第二型糖尿病。
- 如申請專利範圍第2項所述之用途，其係透過純化物委陵菜酸降低肝臟中11 β-羥基類固醇脫氫酶(11 β-HDSI)的mRNA基因表現量治療第二型糖尿病。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其係透過純化物委陵菜酸活化肝臟及骨骼肌之腺苷單磷酸活化蛋白激酶(AMPK)、增加骨骼肌之葡萄糖運送蛋白質(GLUT4)的蛋白含量以及增加葡萄糖攝取而降低血糖。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其係透過純化物委陵菜酸降低肝臟中磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)、6-磷酸葡萄糖(G6-Pase)的mRNA基因表現量及抑制肝臟糖質新生而降低血糖。
- 一種自枇杷葉細胞懸浮液萃取之純化物委陵菜酸之用途，其係用於製備增加骨骼肌之蛋白質激酶B(Akt)的磷酸化蛋白及提升胰島素敏感性之醫藥化合物。
- 一種自枇杷葉細胞懸浮液萃取之純化物委陵菜酸之用途，其係用於製備改善由高脂飲食誘導的脂肪肝(Fatty liver)或改善脂肪變性(Steatosis)及降低肝臟空泡樣變(hepatic ballooning degeneration)現象之醫藥化合物；又該用途係透過純化物委陵菜酸降低肝臟之二酰基甘油酰基轉移酶(DGAT2)的mRNA基因表現量而降低肝臟中三酸甘油酯，並透過委陵菜酸降低肝 臟之固醇調節組件結合蛋白1c(SREBP-1c)、脂肪酸合成酶(FAS)及載脂蛋白c-III(apo C-III)的mRNA基因表現量，而降低肝臟之總脂質含量及改善脂肪肝。
- 一種自枇杷葉細胞懸浮液萃取之純化物委陵菜酸之用途，其係製備降低血液中瘦體素以及影響胰島素之醫藥化合物。
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