KR101730504B1 - 당뇨병 치료에서 라노스테인 및 복령 추출물의 용도 - Google Patents

Abstract

당뇨병을 치료하기 위한 조성물이 본 발명에 제공된다. 이 조성물은 유효 성분으로서 라노스테인 화합물을 함유한다. 라노스테인 화합물의 적절한 원료는 대사산물들로부터의 복령 추출물, 균핵 또는 복령(Poria cocos (Schw) Wolf)의 발효 생성물이다. 복령 추출물은 추출물의 중량으로 라노스테인 화합물들의 1-60%를 함유하고 세코라노스테인이 없다.

Description

당뇨병 치료에서 라노스테인 및 복령 추출물의 용도{USE OF LANOSTANE AND PORIA EXTRACT IN TREATING DIABETES}

본 발명은 당뇨병 치료에서 복령 추출물의 용도 및 더욱 구체적으로, 혈액에서 불충분한 인슐린으로부터 유도된 당뇨병 치료에서 복령 추출 화합물의 용도에 관한 것이다.

당뇨병은 부유한 국가들의 성인 인구(특히 노인)에서 일반적으로 보이는 만성 질환이다. 당뇨병 환자들은 주로 두 타입으로 나뉠 수 있으며, 이의 첫 번째는 제 1 형 당뇨병 또는 인슐린 의존성 당뇨병으로 불리며; 이 질환은 인체에서 자가면역 반응들에 의해 췌장 β-세포들의 파괴로부터 초래되고, 환자 신체에서 인슐린을 생산할 수 없게 한다. 따라서, 이런 환자들은 이들의 혈관에 인슐린을 갖지 않으며 결과적으로 인슐린 주입을 필요로 한다. 두 번째 형태의 당뇨병은 제 2 형 당뇨병 또는 비-인슐린 의존성 당뇨병으로 불리고 질환의 원인은, 비록 유전적 요인들이 중요한 역할을 하는 것으로 생각되나, 아직 불분명하고, 라이프스타일(예를 들어, 비만)의 영향들은 이 질환의 발생에 매우 중요하다.

대략 500 A.D 년에, "Emergency Formulas Worth a Thousand in Gold"라는 이름의 중국 의학 서적은 당나라 때 완성되었고 당뇨병들을 치료하는데 사용된 의약들의 여러 혼합물을 기록하였고 혼합물들의 일부는 복령을 포함하는 것으로 알려져 있다. 2002년에, 엠, 사토라는 일본 연구자는 복령의 껍질로부터 얻은 디하이드로트라미트놀산이 제 2 형 당뇨병의 치료에 사용될 수 있다는 것을 나타내는 논문을 Biological & Pharmaceutical Bulletin에 발표하였다(Biol. Pharm. Bull. 2002, 25(1), 81-86). 이의 주요 메커니즘은 인슐린에 대한 환자 신체의 민감성을 증가시키는 것(인슐린에 대한 환자 저항성을 감소시키는 것)이어서 당뇨병의 치료 목적을 얻을 수 있다. 그러나, 인비트로 지방세포를 사용하는 과거 실험들은 디하이드로트라메티놀산의 유효 농도는 10^-5M라는 것을 나타내었고, 생쥐를 사용하는 인비보 실험들은 디하이드로트라메티놀산의 유효 농도는 110mg/kg이라는 것을 나타내었고, 결과적으로 연구자들이 신체에서 사용하기 위한 유효 농도는 적어도 700mg 이상이어야 한다는 결론에 도달한다. 그러나 700mg의 유효 농도는 현재 사용된 임상적 복용량의 10배 이상과 동일하여 이의 임상적 약물의 개발에 실제 도전을 일으킨다.

본 발명의 목적은 활성 성분으로서 다음 화학식(I)을 가진 라노스테인 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 치료에 효과적인 양을 포함하는 당뇨병의 치료를 위한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 활성 성분으로서 다음 화학식(I)을 가진 라노스테인 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 치료에 효과적인 양을 포함하는 당뇨병의 치료를 위한 약학적 조성물에 관한 것이며, 상기 당뇨병은 포유류의 혈액에서 인슐린 부족으로 유발된다.

(I)

화학식에서, R₁은 H 또는 -CH₃이고; R₂는 -OCOCH₃, =O, 또는 -OH이고; R₃는 -H 또는 -OH이고; R₄는 -C(=CH₂)-C(CH₃)₂R_a이고, 여기서 R_a는 -H 또는 -OH, 또는 -CH=C(CH₃)R_b, 여기서 R_b는 -CH₃ 또는 -CH₂OH이고; R₅는 -H 또는 -OH이고, R₆는 -CH₃ 또는 -CH₂OH이다.

바람직하게는, 상기 라노스테인 화합물(I)은 다음 화학식을 가진다:

또는

.

바람직하게는, 상기 라노스테인 화합물(I)은 다음 화학식을 가진다:

바람직하게는, 상기 약학적 조성물은 주사용이다.

바람직하게는, 상기 약학적 조성물은 경구 섭취용이다.

바람직하게는, 상기 당뇨병은 제 1 형 당뇨병이다.

바람직하게는, 상기 당뇨병은 제 2 형 당뇨병이다.

바람직하게는, 상기 포유류는 인간이다.

바람직하게는, 상기 약학적 조성물은 활성 성분으로서 화학식(I)을 가진 분리된 라노스테인 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함한다.

바람직하게는, 상기 약학적 조성물은 활성 성분으로서 복령 추출물의 치료에 효과적인 양을 포함하는 포유류에서 당뇨병을 치료하기 위한 것이며, 상기 복령 추출물은, 복령 추출물의 중량을 기초로, 화학식 (I)을 가진 라노스테인 화합물 1-60%를 포함하고 상기 복령 추출물은 실질적으로 세코라노스테인이 없으며, 당뇨병은 포유류의 혈액에서 불충분한 인슐린으로부터 유도된다.

바람직하게는, 상기 복령 추출물은, 복령 추출물의 중량을 기초로, 라노스테인 화합물(I) 5-35%를 포함한다.

본 발명은 복령으로부터 추출된 유효 성분들은 (1) 글루코오스 이동체 4(GLUT4)의 유전자 발현(mRNA 발현)을 증가시키고; (2) GLUT4의 생산을 증가시키고; (3) GLUT4 단백질을 지질(또는 근육) 세포들의 세포막 상에 세포내로 이동시키고; (4) GLUT4를 세포외 글루코오스를 세포들 속에 운반하게 하고 (5) 인슐린이 하는 것과 같이 세포들에서 트라이글리세라이드를 제조하고 저장함으로써 인슐린으로서 기능적으로 작용할 수 있다는 것을 보여준다. 따라서, 복령의 유효 성분들은 인슐린으로서 기능적으로 사용될 수 있고 혈류로부터의 글루코오스를 세포들 속에 운반하여 혈당 수준을 낮춘다. 그 결과, 상기 성분들은 제 1 형 당뇨병 및 불충분한 혈액 인슐린에 의해 유발된 제 2 형 당뇨병의 치료에 사용되는 것이 이상적이다. 더욱 중요한 것은, 인비트로 지질 실험들은 상기 성분들은 일본 연구자 사토에 의해 기술된 10^-5M 유효 농도보다 1000배 미만인 0.01μM의 농도로 글루코오스 흡수를 할 수 있다는 것을 나타내었다.

본 발명의 내용 중에 포함되어 있음

본 발명의 상기한 목적들과 장점들은 첨부된 도면들과 함께 생각할 때 더욱 분명하게 이해될 것이다.
도 1은 복령으로부터 추출되고 정제된 라노스테인-타입 트라이터펜 화합물들의 구조를 도시하는 도면이다.
도 2a는 복령 추출물들의 효과가 3T3-L1 지방세포들에 의해 당 흡수의 증가에 영향을 주었다는 것을 도시하는 그래프이다. 도 2b는 인슐린(0.1μM)이 30분 동안 작동하게 하고 정제된 트라이터펜 화합물들(0.01μM)이 2시간 동안 작동하게 하는 효과들이 당이 첨가된 조건하에서 당 흡수에 영향을 주었다는 것을 도시하는 그래프이다. 도면들은 평균±SD(n=6)로 도시된다. 표시 ^*는 대조군(처리되지 않음)과 비교해서 p<0.05를 나타내고, ^**는 p<0.01을 나타내는데 사용된다.
도 3a는 파침산(PA)은 2시간 동안 0.01μM로 제공될 때 최고 당 흡수를 유발하는데 효과적이라는 것을 나타내는 그래프이다. 도 3b는 PA 복용량의 증가에 따라 당 흡수의 증가를 나타내는 그래프이다. PA는 당이 검사를 위해 첨가되기 전에 2시간 동안 작동하게 되었고 도면들은 평균±SD(n=6)로 도시된다. 대조군(처리되지 않음)과 비교해서, 표시 ^*는 p<0.05를 나타내는데 사용되고 ^**는 p<0.01를 의미한다.
도 4는 PA는 분화되고 성숙한 지방세포들에서 당 흡수만을 증가시킬 수 있다는 것을 도시하는 그래프이다. 미성숙 및 성숙 지방세포들은 PA와 먼저 혼합되었고 2시간 동안 반응하게 하였고 PT를 첨가하였고; 세포들의 상기 두 종류에서 당 흡수는 PA에 의해 당 흡수가 증가하는 것과 같이 현저하게 억제될 것이다. 도면들은 평균±SD(n=6)로 도시된다. 대조군(처리되지 않음)과 비교해서, 표시 ^*는 p<0.05를 나타내는데 사용되고 ^**는 p<0.01를 의미한다.
도 5a는 PA는 GLUT1의 발현을 증가시키는데 효과적이지 않았다는 것을 도시하는 그래프이다. 도 5b는 PA는 GLUT1의 발현을 증가시키는데 효과적이었다는 것을 도시하는 그래프이다. 분화된 성숙한 세포들은 24시간 동안 PA의 다른 농도로 처리하였고 그런 후에 GLUT1과 GLUT4의 발현들을 분석하였다. 도면들은 평균±SD(n=3)로 도시된다. 대조군(처리되지 않음)과 비교해서, 표시 ^*는 p<0.05를 나타내는데 사용되고 ^**는 p<0.01를 의미한다.
도 6은 PA는 GLUT4의 mRNA를 증가시키는데 효과적이었다는 것을 도시하는 그래프이고, 분화된 성숙한 세포들은 24시간 동안 인슐린(0.1μM) 및 PA(0.01μM)로 개별적으로 처리되었고 GLUT1 및 GLUT4의 mRNA 발현을 분석하였다. 도면들은 평균±SD(n=3)로 도시된다. 대조군(처리되지 않음)과 비교해서, 표시 ^*는 p<0.05를 나타내는데 사용되고 ^**는 p<0.01를 의미한다.
도 7a 및 7b는 PA는 GLUT4의 억제된 mRNA 발현으로 지방세포들에서 당 흡수를 증가시키는데 효과적이지 않다는 것을 도시하는 다이어그램이다. 성숙한 지방세포들 및 GLUT4의 억제된 mRNA 발현(shG4-30)을 가진 지방세포들은 PA 및 인슐린의 다른 농도로 처리하였고 그런 후에 GLUT4 발현(도 7a)과 당 흡수에 대한 이의 효과(도 7b)를 분석하였다. 도면들은 평균±SD(n=6)로 도시된다. 대조군(처리되지 않음)과 비교해서, 표시 ^*는 p<0.05를 나타내는데 사용되고 ^**는 p<0.01를 의미한다.
도 8a는 분석을 위해 원심분리에 의해 얻은 세포막의 다른 층들로부터의 GLUT4 단백질들을 도시하는 그래프이며, PA는 세포소기관(intracellular organelles)으로부터 세포막으로 GLUT4의 전좌를 증가하는데 효과적이었다는 것을 나타낸다. 도 8b는 형광 분석에 의해 전체 세포에서 세포막의 층들로부터 GLUT4의 분석을 도시하는 그래프이며, PA는 세포소기관으로부터 세포막으로 GLUT4의 전좌를 증가하는데 효과적이었다는 것을 나타낸다. 도면들은 평균±SD(n=3)로 도시된다. 대조군(처리되지 않음)과 비교해서, 표시 ^*는 p<0.05를 나타내는데 사용되고 ^**는 p<0.01를 의미한다.
도 9는 PA는 트라이글리세라이드의 합성을 증가시키는데 효과적이었고 지방세포들에서 (생성물로 글리세롤을 발생시키는) 지질들의 파괴를 억제하는데 효과적이었다는 것을 도시하는 그래프이다. 성숙한 지방세포들은 인슐린(0.1μM)과 PA의 다른 농도로 24시간 동안 처리하였다. 도면들은 평균±SD(n=6)로 도시된다. 대조군(처리되지 않음)과 비교해서, 표시 ^*는 p<0.05를 나타내는데 사용되고 ^**는 p<0.01를 의미한다.

본 발명에 개시된 포유류들(예를 들어, 인간)에 의한 영양물 섭취를 향상시키는 복령의 추출물은 미정제 추출물을 얻기 위한 종래의 추출 방법에 의해 복령(Poria cocos (Schw) Wolf)을 추출하는 단계, 크로마토그래피에 의해 미정제 추출물을 낮은 극성 부분의 라노스테인(96:4의 다이클로로메테인:메탄올의 용출액으로) 및 높은 극성 부분의 세코라노세테인(90:10 및 0:100의 다이클로로메테인:메탄올의 용출액으로)으로 분리하는 단계를 포함하는, US2004/0229852A1에 개시된 것과 유사한 방법에 의해 제조될 수 있고, 라노스테인 부분은, 다이클로로메테인:메탄올 = 96:4의 혼합 용매에 의해 전개될 때, 적어도 0.1의 크로마토그래피 값, Rf를 가진 박층 크로마토그래피에 의해 탐지되며, Rf는 세코라노스테인 부분의 경우 0.1 미만이다. 여러 라노스테인은 라노스테인 부분을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 용출시킴으로써 라노스테인 부분과 분리되며, 사용된 용출액은 97:3 내지 95:5이다.

다음 실시예들은 본 발명을 더욱 상세하게 기술하기 위해 제공되며 본 발명의 범위를 제한하는데 사용되지 않아야 한다.

본 명세서에서 언급한 백분율과 다른 양은 달리 나타내지 않는 한 중량이다. 백분율은 전체 100%에 대해 사용된 임의의 범위로부터 선택된다.

실시예 1

연난(Yunnan)에서 자란 26kg의 복령을 260리터의 75% 수성 알콜 용액으로 가열하면서 추출하였다. 추출을 3회 반복하였다. 결과로 얻은 세 추출 용액을 혼합하고 진공 농축하여 225.2g의 추출물을 얻었다. 추출물에 대해 정량 분석을 뒤이어 수행하여, 76.27mg의 라노스테인이 추출물의 각 그램당 발견될 수 있다고 나타내었고, 여기서 K1(파침산(pachymic acid))이 33.4mg을 차지하였고; K1-1(디하이드로파침산)이 9.59mg을 차지하였고; K2-1(투물로스산(tumulosic acid))이 19.01mg을 차지하였고; K2-2(디하이드로투물로스산)이 6.75mg을 차지하였고; K3(폴리포렌산 C)이 5.06mg을 차지하였고 K4(3-에피디하이드로투물로스산)가 2.46mg을 차지하였다.

실시예 2

실시예 1의 125g의 알콜 추출물을 1.3리터의 다이클로로메테인으로 6회 추가로 세척하였고; 결과로 얻은 추출 용액을 혼합하고 농축하여 22.26g의 추출물을 얻었다. 다이클로로메테인 추출물을 가열된 95% 알콜에 용해하고 냉각한 후 여과하고 불용성 물질들을 버렸다. 알콜 농도가 45%에 도달할 때까지 소량의 물을 여과물에 첨가하여 침전하였고; 이를 통해 17.4g의 침전물을 원심분리하여 얻었다. 침전물에 대한 뒤이은 정량적 분석들은 침전물의 각 그램이 264.78mg의 라노스테인으로 구성되었다는 것으로 나타내었고, 여기서 K1-1이 159.7mg을 차지하였고; K1-2가 56.96mg을 차지하였고; K2-1이 24.43mg을 차지하였고; K2-2가 8.8mg을 차지하였고; K3가 9.84mg을 차지하였고 K4가 5.05mg을 차지하였다. 실리카겔에 의한 박층 크로마토그래피(TLC)의 방법은 침전물이 어떠한 세코라노스테인을 포함하지 않았다는 것을 확인하는데 사용하였다.

실시예 3

100kg의 복령을 3시간 동안 800kg의 물로 끓인 후 50℃로 냉각시키기 위해 방치하고 이의 pH 값을 5N NaOH 용액을 사용하여 pH 11로 조절하고 결과로 얻은 용액을 3시간 동안 교반하였다. 원심분리기를 사용하여 액체를 고체로부터 분리하고 800kg의 물을 분리된 고체에 첨가하였다. 상기 절차를 반복하였고, pH 값을 NaOH로 pH 11로 조절하는 단계, 교반하는 단계 및 원심분리로 고체를 제거하는 단계를 포함하였다. 두 개의 결과로 얻은 액체를 혼합하고 50℃에서 100kg의 용액으로 진공 농축하였고 pH 값을 3N HCl를 사용하여 pH 6.5로 조절하여 침전물을 생성하였다. 상기 침전물을 용액으로부터 분리하고, 뒤이어 40L H₂O로 세척하고 원심분리하여 침전물을 얻었다; 침전물을 8L의 물로 분사 건조하여 380g의 분말을 얻었다. 그 후, 분말을 4L의 알콜을 사용하여 3회 추출하였고 추출 용액들을 혼합하고 농축하여 238.9g의 알콜 추출물을 얻었다. 238.9g의 알콜 추출물은 TLC 분석에 의해 세코라노스테인 화합물들을 함유하지 않는 것으로 입증되었고 HPLC 분리하여, 추출물의 그램당 2l4mg의 K2, 23mg의 K3, 24mg의 K4 및 4.52mg의 K1을 나타내었다. 다시 말하면, 추출물의 각 그램은 대략 265mg의 라노스테인 화합물을 가진다.

분말은 4L의 50% 수성 알콜 용액을 사용하여 추출하였고 50% 수성 알콜 용액을 제거하여 불용성 분말을 얻었다; 추출을 3회 반복하여 50% 수성 알콜 용액에 불용성인 물질 245.7g을 얻었다. 불용성 물질은 TLC 분석에 의해 세코라노스테인 화합물을 갖지 않는 것으로 확인되었고 HPLC에 의해 분리되고 정제되어 추출물의 각 그램당 214mg의 K3, 23mg의 K3, 24mg의 K4 및 4.52mg의 K1를 얻었고, 이는 추출물의 각 그램당 대략 261mg의 라노스테인 화합물과 동일하다.

실시예 4

복령 분말은 30kg의 중국산 복령(Poria cocos (Schw) Wolf)으로 제조하였다. 복령 분말을 24시간 동안 120L 95% 알콜로 추출하였다. 혼합물을 여과하여 여과물을 얻었다. 잔류물을 추가 3주기 동안 추출하고 여과하였다. 여과물들을 혼합하고 농축하여 265.2g의 건조 분말을 얻었다. 건조 추출물을 2상 추출제(n-헥세인: 95% 메탄올 = 1:1)로 분배 추출하였고 메탄올 층을 제거하고, 농축하여 246.9g의 건조 고체를 얻었다. 건조 고체의 분리는 건조 고체의 중량의 10-40배 실리카겔을 채운 실리카겔 컬럼에 의해 수행하였다. 70-230 메쉬의 지름을 가진 실리카겔은 머크사에 의해 제조되었고 실리카겔 60의 기초를 가진다. 컬럼은 다음 용출액: 다이클로로메테인:메탄올 = 96:4의 혼합 용액; 다이클로로메테인:메탄올 = 90:10의 혼합 용액 및 순수 메탄올로 용출되었다. 용출액들은 박층 크로마토그래피(TLC)로 검사하였고, 자외선 램프와 요오드 증기가 탐지를 위해 사용되었고 다이클로로메테인:메탄올 = 96:4의 혼합 용액은 전개액으로 사용되었다. TLC에서 유사한 구성물질을 가진 용출액들을 혼합하였다.

용출은 다이클로로메테인:메탄올 = 96:4의 혼합 용액으로 수행하여 78g의 양으로 PCM 부분을 얻었다. PCM은 박층 크로마토그래피에서 6개 추적점(trace points)을 나타내었다. 다이클로로메테인:메탄올 = 90:10 및 순수 에탄올의 용출액으로 수행된 용출로부터 얻은 용출액들을 혼합하여 168g의 PCW 부분을 얻었다.

PCM 부분은 다이클로로메테인:메탄올 = 96.5:3.5의 용출액과 동일한 실리카겔 컬럼에 의해 추가로 분리되어 K1(K1-1 및 K1-2), K2(K2-1 및 K2-2), K3, K4, K4a, K4b, K5, K6a 및 K6b의 정제된 라노스테인 성분들을 얻었다. 분리 단계와 확인 분석 데이터의 추가 상세내용은 US2004/0229852 A1에서 발견할 수 있다.

상기 K1 내지 K6b 화합물은 다음 구조를 가진다:

K1-1:R2 = OCOCH3(파침산) K1-2:R2 = OCOCH3(소량)

K2-1:R2 = OH(투물로스산) (디하이드로파침산)

K2-2:R2 = OH(소량)

(디하이드로투물로스산)

K3:R6 = CH3, R5 = H K4:R2 = α-OH, R5 = H

(폴리포렌산) (3-에피디하이드로투물로스산)

K4a:R6 = CH2OH, R5 = H K4b:R2 = β-OCOCH3, R5 = OH

K6a: R6 = CH3, R5 = OH

K6b K5

PCM 부분으로부터 분리된 라노스테인 화합물 K1 내지 K6b의 양은 아래 표에 나열된다. PCM 부분은 대략 15중량%의 라노스테인 화합물 K1 내지 K6b를 함유한다.

K10	K2	K3	K4	K4a	K4b	K5	K6a	K6b
3.0g	6.2g	1.93g	0.55g	66mg	86.8mg	47.6mg	21.4mg	90.7mg

실시예 5

실시예 4에서 제조된 PCM 부분을 가진 캡슐들은 다음 조성물을 기초로 제조하였다:

성분들	캡슐 당	30,000 캡슐 당
실시예 4에서 제조된 PCM(대략 15중량%의 K1-K6 화합물 함유)	11.2mg	336.0g
소듐 실리코알루미네이트	5.0mg	150.0g
감자 전분	378.8mg	11,364.0g
마그네슘 스테아레이트	5.0mg	150.0g
전체	400mg	12,000.0g

PCM 부분 및 소듐 실리코알루미네이트는 #80 메쉬를 사용하여 걸러내었고 감자 전분은 #60 메쉬를 사용하여 걸러내었고 마그네슘 스테아레이트는 #40 메쉬를 사용하여 걸러내었다. 뒤이어, 상기 성분들을 혼합기에 골고루 혼합하고 결과로 얻은 혼합물을 No. 1 빈 캡슐에 채웠다. 각 캡슐은 대략 1.68mg(0.42중량%)의 유효 성분 K1-K6를 함유한다.

실시예 6

제 1 형 당뇨병을 예방하고 치료하기 위한 트라이터펜 화합물들의 사용을 검사하는 실험들

다음 세포 실험들을 위해 사용된 복령 추출물들은 실시예 2에서 제조한 침전물이거나 도 1에 도시된 정제된 화합물이었다. 추출물들은 알콜:DMSO(9:1)로 제조된 용매에 용해하였고; 결과로 얻은 용액을 배양 접시들에 첨가하였고, 여기서 최종 부피의 단지 1/1000을 각 웰에 첨가하였다.

1. 지방세포들의 세포 배양

3T3-L1은 처음에 방추세포화(spindle-celled)된 것으로 보이는 설치류 지방전구세포들의 형태이다. 세포들이 유도 물질과 첨가되어 2-3일 동안 배양될 때, 세포들은 변형되고 형태적으로 더욱 원형으로 보일 수 있다; 세포들이 분화될 시간이 많으면 많을수록, 세포들이 더욱 분화된다. 분화를 겪지 않은 세포들에서, 주요 글루코오스 운반체는 GLUT1인 반면, 분화된 세포들에서, 주요 활성 글루코오스 운반체는 GLUT4이다. 또한, 세포막 상에 더 많은 GLUT4가 존재하면 할수록, 세포막을 가로질러 이동하는 세포들이 더 많아지고 세포들에 의해 흡수되는 혈당의 부피가 더 커져서 혈당은 더욱 빠르게 낮아질 수 있다. 3T3-L1은 지방세포들은 인슐린에 의해 활성화된 글루코오스 흡수의 종합적인 시스템을 보유하며 따라서 글루코오스 신진대사와 인슐린 시그널링 경로의 연구뿐만 아니라 지질의 발생과 제어의 완전한 과정을 관찰하는데 적합하다. 따라서, 완전히 분화된 3T3-L1 지방세포들은 널리 사용되는 대표적 세포주가 되었고 인간 조직들로부터의 실제 지방세포들은 연속적인 세대에서 배양하기 어렵기 때문에, 연구자들은 관련 실험들과 평가를 수행하기 위해 이런 특정 세포주를 일반적으로 사용한다.

(a) 지방세포들의 세포 배양

3T3-L1 전구지방세포들을 37℃에서 5% CO₂와 95% 공기에서 100 IU/mL 페니실린, 100 g/mL 스트렙토마이신, 1% 비필수 아미노산 및 10% 소 혈청으로 보충된 듈베코 최소 필수 배지(DMEM)에서 배양하였다. 일단 세포들이 완전히 성장하면, 분화는 세포들을 2일 동안 분화 유도물질(0.5mM 3-아이소뷰틸-1-메틸잔탄(IBMX), 1M 덱사메타손, 10g/mL 인슐린 및 10% 태아 소 혈청을 함유하는 DMEM)로 처리하여 유도하였다. 세포들을 10g/mL 인슐린과 10% FBS로 보충한 DMEM으로 추가 2일 동안 다시 채운 후 4-6일 동안 2일 마다 인슐린 없이 10% FBS/DMEM으로 바꿨다. 이 단계에서, 거의 90%의 세포들이 지방세포 표현형을 발현하였고 실험이 준비되었다. 실험을 개시하기 전에, 3T3-L1 세포들을 먼저 PBS 용액으로 세척한 후 혈청-제거 및 인슐린-제거 0.2% BSA/DMEM 배지에서 밤새 배양하여 혈청과 인슐린으로부터 방해물들을 제거하였다.

(b) GLUT4 실험들의 mRNA 발현을 억제하기 위해 사용된 지방세포들의 세포 배양

GLUT4 발현의 일관된 억제를 가진 유전자 발현을 만들기 위해서, GLUT4-억제 RNA를 운반하는 바이러스성 운반체(TRCN0000043630 shRNA, Genomics Research Center, Academia Sinica, R.O.C.)를 사용하여 3T3-L1 전구지방세포(shG4-30)를 감염시켰고 세포주를 추가로 분화하게 하였고, 이로부터 분화된 지방세포들을 실험을 위해 사용하였다.

(c) GLUT4 단백질들의 전좌를 검사하기 위해 사용된 지방세포들의 세포 배양:

인플루엔자 바이러스 단백질 HA 마킹을 가진 GLUT4 운반체(HA-GLUT4-GFP, Timothy E. McGraw, Weill Cornell Medical College에 의해 기부)를 사용하여 리포펙타민 2000(Invitrogen, CA, USA)에 의해 3T3-L1 전구지방세포를 트랜스펙트하였고 인플루엔자 바이러스 단백질 HA 마킹을 가진 GLUT4 단백질들을 일관적으로 발현하는 지방세포들의 균주들을 G418을 사용하여 선별하였고, 그 결과 세포들은 지방세포들로 분화되게 하였고 GLUT4 단백질들의 전좌를 평가하는데 사용되었다.

2. 2-데옥시-글루코오스 흡수의 평가

3T3-L1 지방세포들에 의한 글루코오스 흡수를 증가시키는데 것에 대한 트라이터펜 화합물들의 효과들을 검사하는 실험들의 경우, 3T3-L1 전구지방세포들은 6-웰 배양 접시들에서 배양하였고 분화-유도 물질에 의해 분화되기 전에 그 안에서 완전히 성장되게 하였다. 일단 3T3-L1 세포들이 성숙하게 되고 7-12일 후 지방세포들로 분화된 후, 세포들을 글루코오스 흡수를 검사하기 위해 사용하였다. 상기 지방세포들을 먼저 혈청-제거 배지(0.2% BSA/DMEM)에 밤새 놓았고, 트라이터펜 화합물들의 다른 농도를 함유하는 혈청-제거 세포 배지에서 2-6시간 동안 배양하고 37℃에서 3시간 동안 KRP 버퍼(20 mM HEPES, 137 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM MgSO₄, 1.2mM KH₂PO₄, 2.5 mM CaCl₂, 및 2 mM 피루브산염, pH 7.4 및 0.2% BSA)에서 배양을 진행하기 전에 PBS 용액으로 한 번 세척하였다. 마지막으로, 0.2μCi/mL의 2-데옥시-D-[¹⁴C]-글루코오스(2-DG, Amersham Biosciences, Little Chalfont, Bucks, U.K)와 0.1mM 2-DG로부터 유도된 0.2ml의 비-방사성 글루코오스 버퍼를 글루코오스 흡수에 대한 실험을 시작하기 위해 KRP 버퍼에 대한 대체물로 사용하였다. 5분 동안 실험을 수행한 후, 세포들을 제거하고 PBS 용액으로 세척하여 글루코오스의 흡수를 종료하였다. 뒤이어, 세포들을 0.2ml의 0.2% SDS에 용해하고 용해된 세포들을 가진 10μL의 용액을 여과 염기들을 가진 유니필터 플레이트(Perkim-Elmer, Wellesley, MA, USA)에 옮기고 37℃에서 진공 오븐에서 건조하였고, 여기서 각 웰에 30μL의 카운팅 용액(counting solution)을 첨가한 후 마이크로-디스크 액체 섬광 계수기(TopCount, Packard NXT, Packard BioScience Company, Meriden, CT, USA)를 사용하여 분석하였다. 세포들에 축적된 글루코오스 농도를 계산하였고, 단백질 농도로 나누어, 매분 마다 세포 단백질들의 매 마이크로그램에서 글루코오스 흡수의 나노몰(nmol/min/mg)로 나타낸 글루코오스 흡수 비율을 얻었다. 단백질 농도는 표준 비신초닌산(BSA) 단백질 분석 키트(Pierce, Rockford, IL, USA)를 사용하여 측정하였다. 비-특이적 글루코오스의 흡수는 0.2μCi의 L-[14C]-글루코오스를 첨가하여 측정하였고 분석기에 의해 얻은 값으로부터 빼기 위해 사용하여 특이적 글루코오스의 흡수에 대한 값을 얻었다. 따라서, 3T3-L1 지방세포들에 의한 글루코오스 흡수에 대한 트라이터펜 화합물들의 다른 농도들의 효과들을 측정할 수 있다.

3. GLUT1 & 4 단백질의 평가

3T3-L1 지방세포들에서 GLUT 단백질 발현을 증가시키는 것에 대한 트라이터펜 화합물들의 효과들을 검사하는 실험의 경우, 상기 분화되고 성숙한 3T3-L1 지방세포들을 혈청-제거 세포 배지에서 밤새 배양한 후 24시간 동안 트라이터펜 화합물들의 다른 농도를 함유하는 혈청-제거 세포 배지에서 추가로 배양하였다. 이후 PBS 용액으로 세포들을 세척하고 4℃에서 30분 동안 세포들을 0.2mL 세포용해 버퍼(1 % NP-40, 150 mM NaCl, 0.1 % SDS, 50 mM Tris-HCl pH 7.6, 10 mM EDTA, 0.5 % 데옥시콜레이트, 1 mM PMSF, 1 mM Na3VO4, 10 mM NaF, 10 mM β-글리세포포스페이트, 10 g/mL 프로테아제 억제제 및 포스포타제 억제제 칵테일)에서 용해하였다. 각 샘플로부터 동일한 양의 단백질을 소듐 도데실 설페이트(SDS)-10% 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(PAGE)으로 분리하였고 폴리바이닐리덴 다이플루오라이드(PVDF) 막(Millipore, Bedford, MA, USA) 상에 트랜스블롯하였다. 뒤이어, 트라이터펜 화합물들의 다른 농도하에서 3T3-L1 지방세포들에서 GLUT 단백질 발현에 대해 어떠한 효과가 있었는지에 대해 측정하기 위해, GLUT1 (Abcam, Cambridge, MA), GLUT4 (R&D systems, Minneapolis, MN), 및 β-액틴, (Chemicon, Temecula, CA, USA)에 대해 표적화된 단클론 항체들을 사용하여 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다. 노출되고 X-레이 막 속으로 가공되기 전에 단백질들의 각 샘플을 화학발광키트(ECL, Amersham, U.K.)로 처리하였고 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 정량적으로 분석하였다.

4. GLUT1 & 4의 유전자 발현의 평가

트라이터펜 화합물들의 다른 농도하에서 3T3-L1 지방세포들에서 GLUT 단백질들의 mRNA 발현을 평가하기 위해 실시간 Q-PCR을 수행하였다. 먼저, 세포들로부터 전체 RNA를 얻기 위해 세포 배지를 제거하고 트라이졸 버퍼(Invitrogen, Irvine, CA, USA)를 사용하기 전에, 완전히 분화된 3T3-L1 지방세포들을 다른 농도의 트라이터펜 화합물들과 혼합하였고 24시간 동안 방치하였다. 그 후, 1㎍의 RNA 샘플을 이로부터 채취하였고 고용량 cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems, Darmstadt, Germany)를 사용하여 샘플에 있는 mRNA를 cDNA 속에 역전사하는데 사용하였다. 프라이머들을 GLUT1, GLUT4, 및 β-액틴에 대해 특이적으로 설계하였고 상대 유전자 발현 값들을 스텝원 v2.0 소프트웨어(Applied Biosystems)를 사용하는 ΔΔCT 방법으로 계산하기 전에, SYBR 그린 Q-PCR 분석기(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 탐지를 위한 유전자(Glut1 & 4) 및 기준 유전자(β-액틴)를 증가시켰다.

5. GLUT4 단백질들의 전좌의 평가

(1) GLUT4 단백질들의 전좌의 분석

지방세포들 또는 근육 세포들에 의한 글루코오스 흡수를 증가시키는 인슐린의 메카니즘에서, 세포소기관들로부터 원형질막(PM)으로의 GLUT4의 전좌는 실제로 중요한 역할을 하며, 따라서 3T3-L1 지방세포들에서 원형질막으로 GLUT4의 전좌를 증가시키는 것에 대한 트라이터펜 화합물들의 효과들을 여기서 검사하였다. 분화되고 성숙한 3T3-L1 지방세포들을 혈청-제거 세포 배지에서 밤새 배양한 후 2시간 동안 트라이터펜 화합물들의 다른 농도를 함유하는 혈청-제거 세포 배지에서 추가로 배양하였다. 그 후 저농도 마이크로솜(LDM)으로부터 세포 원형질막 일부를 분리하기 위해 다른 회전 속도(16,000g - 200,000g)에서 고속 원심분리하였다[Liu, L. Z. et.al.; Mol Biol. Cell 17, (5), 2322-2330, 2006]. 3T3-L1 지방세포들에서 세포 LDM으로부터 PM으로 GLUT4의 전좌에 대한 트라이터펜 화합물들의 다른 농도로부터 어떠한 효과들이 있는지를 관찰하기 위해, GLUT4에 대한 단클론 항체를 사용하여 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다.

(2) GLUT4 단백질들의 전좌의 분석

HA-GLUT4-GFP를 안정적으로 발현하는 3T3-L1 전구지방세포들을 96웰 배양 접시 상에서 성장시키고 완전히 성장한 후 유도 물질로 분화하게 하였다(Govers, R. et.al.; Mol Cell Biol. 24 (14), 6456-6466, 2004). 완전히 분화된 3T3-L1 지방세포들을 받고 2시간 동안 트라이터펜 화합물들의 다른 농도로 방치하였고 세포 배지를 제거하고 세포들을 얼음 냉각된 PBS 용액으로 세척하였다. 뒤이어, 세포들을 15분 동안 실온에서 4% 파라포름알데하이드에 고정하였고 세포들을 얼음 냉각된 PBS 용액으로 2-3회 세척한 후 2시간 동안 제 1 안티-헤마글루티닌(HA) 항체(12CA5)로 배양하였다. 그 후, 세포들을 다시 얼음 냉각된 PBS 용액으로 2-3회 세척하고 1시간 동안 로다민-접합 제 2 항체(Leinco, Ballwin, MO)로 배양하였다. 형광 미세적정 판 리더기(POLARstar Galaxy; BMG Labtechnologies, Offenburg, Germany)를 사용하여 로다민과 GFP로부터 형광의 활성 파장(예를 들어, 480/Ex. 425 nm 및 576 nm/Ex. 550 nm)을 측정하기 전에 세포들을 다시 얼음 냉각된 PBS 용액으로 세척하였다. 로다민 형광 대 GFP 형광의 비율을 계산하였고 원형질막으로 전좌된 HA-GLUT4-GFP의 상대량을 측정하는데 사용하였다. HA-태그 GLUT4는 원형질막으로 전좌된 후 로다민에 의해서만 표지화될 수 있기 때문에, 비율은 원형질막에 대한 GLUT4 전좌의 평가에서 유용하였다.

6. 트라이글리세라이드의 축적과 글리세롤의 방출에 의한 효과

3T3-L1 지방세포들에서 트라이글리세라이드의 축적과 글리세롤의 방출에 대한 트라이더펜 화합물들의 효과들을 검사하는 실험의 경우, 분화되고 성숙한 3T3-L1 지방세포들을 혈청-제거 세포 배지에서 밤새 배양한 후 24시간 동안 트라이터펜 화합물들의 다른 농도를 함유하는 혈청-제거 세포 배지에서 추가로 배양하였다. 배지를 수집하고 트라이터펜 화합물들의 다른 농도가 3T3-L1 지방세포들에서 지질 파괴에 의한 글리세롤의 방출에 어떠한 영향을 갖는지를 측정하기 위해, 글리세롤 분석 키트(Randox Laboratories, Antrim, UK)를 사용하여 글리세롤의 방출에 대해 검사하였다. 지방세포들에서 트라이글리세라이드의 수준은 오일 레드 O 염색(Oil-Red O staining)에 의해 측정하였다(Ramirez-Zacarias, J. L. et.al.; Histochemistry 97, (6), 493-497,1992). 세포들에서 지질들의 축적에 의해 형성된 오일 방울들을 염색하고, 60% 아이소프로판올로 2회 세척하고 490nm의 흡수도에서 정량화하기 전에 100% 아이소프로판올에서 추출하였다. 기록들을 지방세포들에서 트라이글리세라이드들의 축적에 대한 트라이터펜 화합물들의 다른 농도들의 효과를 평가하기 위해서, 트라이터펜 화합물들을 제공받기 전에 지방세포들로부터 기록들과 비교하였다.

실험 결과들은 인슐린과 같이, 트라이터펜 화합물들은 다음 네 가지 특성들을 가져서 제 1 형 당뇨병을 치료하는데 효과적이라는 것을 나타내었다:

(1) 지방세포 모델에서, 복령으로부터의 성분들 또는 추출물들은 세포외 글루코오스의 세포들 속으로의 흡수를 증가시키는데 효과적이었다:

도 2a에 도시된 대로 성숙한 지방세포들에 대한 복령 추출물(실시예 2)의 효과들의 평가로부터, 복령 추출물들은 글루코오스 흡수를 증가시키는데 분명히 효과적이었고 글루코오스 흡수를 증가시키는 효과는 세포들에 제공된 복용량의 증가와 명백하게 관련이 있었다. 한편, 인슐린 100nM의 첨가는 글루코오스 흡수를 증가시키는데 효과적이었다. 실시예 2로부터의 순수한 화합물들을 추가 실험들에 사용하였다. 도 2b는 순수한 화합물들을 지방세포들에 제공하고 2시간 후, PA, TA 및 PPA를 포함한 화합물들 중 세 개는 0.01μM이 제공될 때 165.89%, 142.5%, 및 147.9%로 글루코오스 흡수를 현저하게 증가시켰다는 것을 도시하였다. PA에 의해 유도된 증가가 가장 현저하였고 따라서 다음 평가들은 PA를 기초로 수행하였다.

도 3a에 따르면, 글루코오스 흡수를 증가시키는 것에 대한 PA의 효과들은 시간이 경과하면서 증가하였고 투여 2시간 후 가장 현저하였다(165.89%로 증가). 또한, PA 농도의 증가는 글루코오스 흡수를 증가시켰다. 도 3b에서 PA가 1μM 제공될 때, 글루코오스 흡수는 209.84%로 증가하였다는 것을 볼 수 있다.

도 4에 따르면, PA는 전구지방세포들이 아닌 분화된 지방세포들에서 글루코오스 흡수를 증가시키는데만 효과적이었다. 플로레틴(PT)이 전구지방세포들 및 지방세포들에 모두 투여될 때, 두 형태의 세포들에서 글루코오스 흡수는 현저하게 억제되었다. 과거 연구 문헌에 따르면, 전구지방세포들은 단지 GLUT1을 갖는 반면, 지방세포들은 GLUT4를 가진다. 따라서, PA는 GLUT4를 증가시킴으로써 글루코오스 흡수를 증가시키는 것으로 생각된다.

(2) 성숙한 지방세포들에서 GLUT4의 단백질 및 mRNA 발현을 증가시키는 것에 대한 PA, 트라이터펜 화합물의 효과

도 5는 PA의 다른 복용량이 24시간 동안 성숙한 지방세포에 투여되고, GLUT1 및 4의 단백질 발현에 대한 PA의 효과들을 평가하기 위해 GLUT1 및 4를 표적화하는 웨스턴 블럿 분석을 수행할 때, 결과들은 PA가 GLUT1(도 5b)이 아닌 GLUT4(도 5a)의 단백질 발현을 증가시키는데 효과적이었다는 것을 나타내었다.

성숙한 3T3-L1 지방세포들에서 GLUT 단백질들의 mRNA 발현에 대한 PA의 다른 농도들의 효과를 연구하기 위해 Q-PCR과 특이적 프로브를 사용한 결과는 도 6에 도시되었고 PA의 1μM은 GLUT4의 유전자 발현을 228%로 증가시킬 수 있다는 것을 나타내었고, PA는 GLUT4의 유전자 및 단백질 발현을 조절할 수 있다는 것을 의미하였다. 또한, mRNA-간섭 방법은 GLUT4(도 7a)의 일정하게 낮은 발현을 가진 3T3-L1 지방세포들을 만들기 위해 사용되었고 지방세포들은 글루코오스 흡수를 추가로 증가시키는데 사용되었고, PA의 다른 복용량은 지방세포들에서 글루코오스 흡수를 크게 증가시키지 않았다는 것을 증명하는 결과는 도 7b에 도시되었고, 따라서 PA는 GLUT4 발현에 직접 영향을 줌으로써 글루코오스 흡수를 증가시킨다는 것을 제공한다.

(3) 성숙한 지방세포들에서 세포소기관들로부터 원형질막으로의 GLUT4의 전좌를 증가시키는 것에 대한 PA의 효과들

글루코오스 흡수를 증가시키는 인슐린에 대한 메카니즘들 중 하나는 글루코오스 흡수를 수행하기 위해 세포소기관들로부터 원형질막으로 다수의 GLUT4의 전좌를 증가시키는 것이다. 따라서, 글루코오스 흡수를 활성화하는 인슐린의 종합 시스템을 가진 성숙한 3T3-L1 지방세포들을 사용하여 GLUT4 단백질들의 전좌를 평가하였다. 도 8a는 고속 원심분리를 사용하여 분리한 원형질막에 대한 웨스턴 블럿 분석의 결과들을 예시하며, PA의 0.01μM은 원형질막에서 GLUT4의 양이 141%로 현저하게 증가하였고 양은 PA 복용량이 1μM로 증가할 때 추가로 증가하였다는 것을 나타낸다. HA-GLUT4-GFP 단백질들을 안정하게 발현하는 3T3-L1 지방세포들의 사용과 형광 측정 방법은 원형질막으로 GLUT4의 전좌를 증가시킴으로써 PA가 글루코오스 흡수를 증가시킨다는 것을 추가로 입증하였다. 도 8b에서 PA의 복용량이 1.0μM로 첨가될 때, 원형질막에 대한 GLUT4의 전좌는 2.71배 증가하였다는 것을 볼 수 있다. 상기 결과들은 PA가 원형질막에 대한 GLUT4의 전좌를 증가시키는데 효과적이라는 것을 입증하였다.

(4) 지방세포들에서 트라이글리세라이드의 축적을 증가시키고 배지 속으로 글리세롤의 방출을 감소시키는 것에 대한 PA의 효과들

지방세포들에서 글루코오스 흡수에 대한 PA의 효과들을 관찰하는 것 이외에, 지방세포들에서 트라이글리세라이드의 합성(저장) 및 지질 파괴(글리세롤의 방출)도 평가하였다. 도 9는 PA의 다른 복용량 투여 24시간 후로부터의 결과들을 도시하였고 트라이글리세라이드의 축적은 오일-레드 O 염색에 의해 측정하였다. PA의 투여하에서, 트라이글리세라이드들의 축적은 137%를 초과하였고 글리세롤의 방출은 원래 수준의 대략 70%로 낮아졌다는 것을 나타내었다. 결과들은 PA는 지질들의 합성을 향상시키고 지질들의 파괴를 예방하는데 효과적이었다는 것을 나타내었다.

본 발명은 이의 바람직한 실시예들로 기술되었고 기술된 실시예들에 대한 여러 변화와 변형은 청구된 청구항들에서만 제한되는 본 발명의 범위와 취지를 벗어나지 않고 일어날 수 있다.

Claims (16)

1. 활성 성분으로서 다음 화학식(I)을 가진 라노스테인 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 치료에 효과적인 양을 포함하는 당뇨병의 치료를 위한 약학적 조성물로서, 상기 당뇨병은 제 1 형이고, 포유류의 혈액에서 불충분한 인슐린으로부터 유발되는 것인 약학적 조성물:
   

   

   
   (I)
   (여기서, R₁은 H 또는 -CH₃이고; R₂는 -OCOCH₃, =O, 또는 -OH이고; R₃는 -H 또는 -OH이고; R₄는 -C(=CH₂)-C(CH₃)₂R_a이고, 여기서 R_a는 -H 또는 -OH, 또는 -CH=C(CH₃)R_b, 여기서 R_b는 -CH₃ 또는 -CH₂OH이고; R₅는 -H 또는 -OH이고, R₆는 -CH₃ 또는 -CH₂OH이다).
2. 제 1 항에 있어서,
   라노스테인 화합물(I)은 다음 화학식을 갖는 약학적 조성물:
   

   

   
   

   

   
   

   

   또는
   

   

   .
3. 제 2 항에 있어서,
   라노스테인 화합물(I)은 다음 화학식을 갖는 약학적 조성물:
   

   
4. 제 1 항에 있어서,
   약학적 조성물은 주사용인 약학적 조성물.
5. 제 1 항에 있어서,
   약학적 조성물은 경구 섭취용인 약학적 조성물.
6. 제 1 항에 있어서,
   포유류는 인간인 약학적 조성물.
7. 제 1 항에 있어서,
   약학적 조성물은 활성 성분으로서 화학식(I)을 가진 분리된 라노스테인 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물.
8. 활성 성분으로서 복령 추출물의 치료에 효과적인 양을 포함하는 포유류에서 당뇨병을 치료하기 위한 약학적 조성물로서, 상기 복령 추출물은, 복령 추출물의 중량을 기초로, 제 1 항에 정의된 화학식 (I)을 가진 라노스테인 화합물 1-60%를 포함하고 상기 복령 추출물은 세코라노스테인이 없으며, 상기 당뇨병은 제 1 형이고, 포유류의 혈액에서 불충분한 인슐린으로부터 유도되는 약학적 조성물.
9. 제 8 항에 있어서,
   상기 복령 추출물은, 복령 추출물의 중량을 기초로, 라노스테인 화합물(I) 5-35%를 포함하는 약학적 조성물.
10. 제 8 항에 있어서,
    라노스테인 화합물(I)은 다음 화학식을 가진 약학적 조성물:
    

    

    
    

    

    
    

    

    또는
    

    

    .
11. 제 8 항에 있어서,
    약학적 조성물은 경구 섭취용인 약학적 조성물.
12. 제 8 항에 있어서,
    포유류는 인간인 약학적 조성물.
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