JP5687868B2 - 糖尿病治療におけるラノスタンおよびポリア抽出物の使用 - Google Patents
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Description
で示されるラノスタン化合物またはその薬理上許容される塩を哺乳動物における糖尿病を治療するのに有効な量を含む、哺乳動物における糖尿病を治療するための薬剤組成物を提供する。本発明によると、ラノスタン化合物(I)もしくはその薬理上許容される塩または上記ラノスタン化合物(I)もしくはその薬理上許容される塩を含むポリア抽出物を使用することによって、哺乳動物における糖尿病を治療できる。
の範囲を限定するために使用してはならない。
雲南で成長させたポリア26kgを、加熱しながら75%水性アルコール(エタノール)溶液260リットルで抽出した。抽出は3回繰り返し、得られた3つの抽出溶液を合わせて、真空濃縮して、抽出物225.2gを得た。続いて、その抽出物について定量分析を行い、その1グラムあたりにラノスタン76.27mgが含まれていた。ここで、K1(パキム酸(pachymic acid))は33.4mg、K1−1(デヒドロパキム酸(dehydropachymic acid))は9.59mg、K2−1(ツムロス酸(tumulosic acid))は19.01mg、K2−2(デヒドロツムロス酸(dehydrotumulosic acid))は6.75mg、K3(ポリポレン酸C(polyporenic acid C))は5.06mg、およびK4(3−エピデヒドロツムロス酸(3−epidehydrotumulosic acid))は2.46mgを占めた。
実施例1で得られたアルコール抽出物125gを、さらに1.3リットルのジクロロメタンで6回抽出し、得られた6つの抽出溶液を合わせて濃縮して、抽出物22.26gを得た。このジクロロメタン抽出物を、加熱した95%アルコール溶液に溶解し、放置して冷却し、次いでろ過し、不溶物を廃棄した。ろ液中のアルコール濃度が45%になるまで少量の水をろ液に加えて、沈殿させ、遠心分離により沈殿物17.4gを得た。続いて、この沈殿物を定量分析したところ、沈殿物1グラムあたり、ラノスタン264.78mgが含まれることが分かった。ここで、K1−1は159.7mg、K1−2は56.96mg、K2−1は24.43mg、K2−2は8.8mg、K3は9.84mg、およびK4は5.05mgを占めた。シリカゲルの薄層クロマトグラフィー(TLC)法により、前記沈殿物はセコラノスタンを全く含まないことを確認した。
ポリア100kgを水800kg中で3時間煮沸し、その後放置して50℃になるまで冷却し、5N NaOH溶液を用いて、pH値を11になるように調整し、次いでその溶液を3時間攪拌した。遠心分離機を使用して、固形物から液体を分離し、分離した固形物にさらに水800kgを加えた。pH値をNaOHで11に調整し、攪拌し、遠心分離により固形物を除くことを含む、上記の手順を繰り返した。得られた2つの液体を合わせて、50℃で真空濃縮して100kgの溶液とし、次いで、3N HClを用いてpH値を6.5になるように調整して、沈殿物を生成した。前記沈殿物を溶液から分離し、続いてH2O 40Lで洗浄し、沈殿物を回収するために遠心分離した。沈殿物は水8Lを用いて噴霧乾燥し、380gの粉末を得た。その後、前記粉末を4Lのアルコールを用いて3回抽出し、抽出溶液を合わせて濃縮し、アルコール抽出物238.9gを得た。この238.9gのアルコール抽出物は、TLC分析によりセコラノスタン化合物を全く含まないことが証明された。次いで、この238.9gのアルコール抽出物を、HPLCにより分離し、抽出物1グラムにつき、K2を214mg、K3を23mg、K4を24mgおよびK1を4.52mg得た。言い換えれば、抽出物1グラムは約265mgのラノスタン化合物を含む。
ポリア粉末を中国で成長したマツホド(Poria cocos(Schw) Wolf)30kgから製造した。このポリア粉末は、95%アルコール120Lを用いて24時間かけて抽出された。この混合物をろ過し、ろ液を得た。残渣は3回抽出して、ろ過した。ろ液を合わせて濃縮し、265.2gの量の乾燥抽出物を得た。乾燥抽出物は、二相抽出剤(n−ヘキサン:95%メタノール=1:1(体積比))を用いた分配抽出を行い、そこからメタノール相を除き、その後、濃縮して246.9gの量の乾燥した固形物を得た。乾燥固形物は、乾燥固形物の10〜40倍の重量のシリカゲルを充填したシリカゲルカラムを用いて分離した。70〜230メッシュの直径を有する前記シリカゲルは、Merck社製シリカゲル60を用いて準備した。前記カラムは次の溶離液を順に用いて溶出した:ジクロロメタン:メタノール=96:4(体積比)の混合溶媒;ジクロロメタン:メタノール=90:10(体積比)の混合溶媒;および純粋メタノール。溶離液は、薄層クロマトグラフィー(TLC)によって試験した。ここで、検出には紫外線ランプおよびヨウ素蒸気を用い、ジクロロメタン:メタン=96:4(体積比)の混合溶媒を展開液として使用した。TLCにおいて類似の組成を有する溶出液は混合した。
実施例4で調製されたPCM部分を有するカプセルを下記表2に示される組成に基づいて調製した。
トリテルペン化合物のI型糖尿病を予防および治療するための使用を調査する実験
下記の細胞実験のために使用された前記ポリア抽出物は実施例2で製造された沈殿または図1に示された精製された化合物であった。前記抽出物はアルコール:DMSO(9:1(体積比))の溶媒に溶解され、得られた溶液は培養皿に加えられ、最終体積の1000分のIまで各ウェルに加えられた。
3T3−L1ははじめ紡鐘型細胞に見られるげっ歯類の前含脂肪細胞の一種である。細胞は誘導剤とともに加えられ2−3日間培養された際、細胞は変形し、より丸い形態になる。数日後、前記細胞は異化し、より特別な細胞になる。異化の進行していない細胞における主なグルコース輸送体はGLUT1であり、異化した細胞においては主に活性なグルコース輸送体はGLUT4である。さらに、細胞膜上においてGULT4が多ければ多いほど、血液グルコースがより早く、より大量に細胞膜へ転移し、細胞に吸収され、血液グルコースはより急速に少なくなる。前記3T3−L1含脂肪細胞はインスリンにより活性化されるグルコース吸収の包括的なシステムを有し、脂質の生産および調整の完全な過程を観察すると同様、グルコース代謝およびインスリン信号化過程の調査に十分である。したがって、全体が異性化した3T3−L1含脂肪細胞は広く利用される代表的な細胞株であり、ヒト組織からの真性の含脂肪細胞の連続的な培養をするのが困難であるため、研究者は一般的にこの特別な細胞株を関連実験および評価をするために使用する。
3T3−L1前含脂肪細胞は37℃でCO25%および空気95%中、ペニシリン100IU/mL、ストレプトマイシン(streptomycin)100g/mL、1%の非必須アミノ酸(nonessential amino acid)および10%の子牛血清(calf serum)を補われているDulbecco最小必須培地(DMEM)中で培養された。一度細胞は完全に成長し、異化は異化誘導剤(3−イソブチルー1−メチルキサンタン(3−isobutyl−1−methylxanthane)(IBMX)0.5mM、デキサメタゾン(dexamethasone)1M、インスリン10g/mLおよびウシ胎仔血清(fetal bovine serum)10%を含むDMEM)を用いて細胞を2日間処理させた。前記細胞は10g/mLインスリンおよび10%FBSで補われているDMEMを用いてさらに2日間再培養され、その後インスリンを含まない10%のFBS/DMEMに2日おきに変更して4−6日間培養された。この時点で、約90%の細胞が含脂肪細胞表現型を発現し、実験の準備が整っていた。実験を開始する前に、前記3T3−L1細胞ははじめPBS溶液で洗浄し、血清およびインスリンの両方からの阻害を除くため、血清およびインスリンを含まない0.2%BSA/DMEM培地中一晩培養された。
GLUT4を阻害するRNAを運送するウィルス性担体(TRCN0000043630 shRNA, Genomics Research Center, Academia Sinica, R.O.C.)は、GLUT4発現を着実に阻害する遺伝子を発現させるため、3T3−L1前含脂肪細胞(shG4−30)を感染するために使用され、細胞株は異化された含脂肪細胞を実験で使用するた、異化された。
インフルエンザウィルスタンパク質HAマークされたGLUT4担体(HA−GLUT4−GFP, Timothy E. McGraw, Weill Cornell Medical Collegeより提供)がリポフェクタミン(Lipofectamine 2000 (Invitrogen,CA,USA))により3T3−L1前含脂肪細胞に核酸を導入するために使用され、HAマーキングしているインフルエンザウィルスタンパク質により着実に発現されたGLUT4タンパク質がG418を用いて映し出された。前記細胞は含脂肪細胞に異化されGLUT4タンパク質の転移を評価するのに使用された。
3T3−L1含脂肪細胞によるグルコース摂取の促進におけるトリテルペン化合物の効果を試験する実験のために、3T3−L1前含脂肪細胞は6つのウェルを有する培養皿で培養され、異化誘導試薬を用いて異化される前に十分に成長させた。3T3−L1細胞は成熟し7−12日後に含脂肪細胞に異化されると、その細胞はグルコース摂取試験に使用された。前記含脂肪細胞ははじめ血清を含まない培地(0.2% BSA/DMEM)中に一晩置かれ、次いで2−6時間トリテルペン化合物を異なる濃度で含む血清を含まない細胞培地中で培養し、KRP緩衝液(20mMのHEPES,137mMのNaCl,4.7mMのKCl,1.2mMのMgSO4,1.2mMのKH2PO4,2.5mMのCaCl2,および2mMのピルビン酸塩,pH7.4および0.2%のBSA)中、37℃で3時間培養する前にPBS溶液で1回洗浄した。最後に0.2 μCi/mLの2−デオキシ−D−[14C]−グルコース(2−DG,Amersham Biosciences,Little Chalfont,Bucks,英国)と0.1mMの2−DG由来の0.2mlの非放射性グルコース緩衝溶液がグルコース摂取の実験を開始するためにKRP緩衝溶液の代替として使用された。5分間実験を行った後、グルコースの摂取を停止するために細胞は除去されPBS溶液で洗浄された。続いて、前記細胞は0.2mlの0.2%SDS中に溶解され、細胞を溶解した10μLの溶液はろ過基盤の付属したUniFilter plates(Perkim−Elmer,Wellesley,MA,USA)に移され、37℃で真空炉中乾燥され、それぞれのウェルに30mLの計数溶液を加え、それからマイクロディスク液体シンチレーション分析装置(TopCount,Packard NXT,Packard BioScience Company,Meriden,CT,米国)により分析された。細胞中に蓄積されたグルコースの濃度は計算され、タンパク質濃度で除算することで、毎分の細胞タンパク質のマイクログラム毎のナノモル量(nmol/min/mg)として示されるグルコース摂取速度を得た。前記タンパク質濃度は標準ビシンコニン酸(BCA)タンパク質分析装置(Pierce,Rockford,IL,米国)を用いて決定された。非特異性のグルコースの摂取は0.2μCiのL−[14C]−グルコースを加えて決定され、特異的なグルコースの摂取量を得るために分析して得られた値から減算するために使用された。したがって、3T3−L1含脂肪細胞によるグルコース摂取における異なる濃度のトリテルペン化合物の影響を決定することができる。
3T3−L1含脂肪細胞中GLUTタンパク質発現の促進におけるトリテルペン化合物の効果を調査する実験に、前述した異化され成熟した3T3−L1含脂肪細胞は血清を含まない培地中一晩培養され、それから異なる濃度のトリテルペン化合物を含む血清を含まない細胞培地中で24時間さらに培養された。その後、PBS溶液でその細胞を洗浄し、0.2mLの溶解緩衝液(1%のNP−40,150mMのNaCl,0.1%のSDS,50mMのTris−HCl pH 7.6,10mMのEDTA,0.5%のデオキシコール酸塩(deoxycholate),1mMのPMSF,1mMのNa3VO4,10mMのNaF,10mMのβ−グリセロリン酸エステル(β−glycerophosphate),10g/mLプロテアーゼ阻害剤(protease inhibitor)およびフォスフォターゼ阻害剤カクテル(phosphotase inhibitor cocktails))中、30分間4℃で前記細胞を溶解した。それぞれのサンプルからドデシル硫酸ナトリウム(SDS)−10%のポリアクリルアミドゲル電気泳動により等量のタンパク質を分けとり、二弗化ポリビニリデン(PVDF)膜(Millipore,Bedford,MA,米国)上にブロットされた(transblotted)。続いて、ウェスタンブロット分析(Western blot analysis)をGLUT1(Abcam,Cambridge,MA)、GLUT4(R&D systems,Minneapolis,MN)および(β−Actin,Chemicon,Temecula,CA,USA)に対してモノクローナル抗体を用いて行い、トリテルペン化合物の異なる濃度の下では3T3−L1含脂肪細胞中GLUTタンパク質発現に影響があるか否かを決定した。それぞれのタンパク質のサンプルはX線に露光される前に化学発光セット(ECL,Amersham,英国)を用いて処理され、コンピュータソフトを用いて定量的に分析された。
リアルタイムのQ−PCRは異なるトリテルペン化合物濃度において3T3−L1含脂肪細胞中のGLUTタンパク質のmRNA発現を評価するために使用された。はじめ十分に異化された3T3−L1含脂肪細胞は異なる濃度のトリテルペン化合物と混合され、細胞培地を除去しトリゾール緩衝液(Trizol buffer(Invitrogen, Irvine,CA,米国))を使用してRNA全体を細胞から得るために、使用する前に24時間放置された。後に1μgのRNAサンプルがそこから取上げられ、高解像cDNA転写キット(High−Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems,Darmstadt,独国))が使用されサンプル中のmRNAをcDNAに逆転写させた。プライマーは特にGLUT1、GLUT4およびβアクチン用にデザインされ、相対的な遺伝子発現値がStepOne v2.0ソフトウェア(Applied Biosystems)を用いたΔΔCT方法により計算される前に、検出遺伝子(Glut1&Glut4)および参照遺伝子(β−actin)の検出のためそれらの遺伝子を増幅するためにYBRグリーンQ−PCR分析器(Applied Biosystems,Foster City,CA,米国)が使用された。
(1)GLUT4タンパク質の転移の分析
含脂肪細胞または筋細胞によるグルコース摂取を促進させるインスリンの機構において、細胞内小器官から原形質膜(PM)へのGLUT4の転移は実際に極めて重要であり、3T3−L1含脂肪細胞中におけるGLUT4の原形質膜への転移の促進においてトリテルペン化合物の効果がここで調査された。異化され成熟した3T3−L1含脂肪細胞は血清を含まない細胞培地中で一晩培養され、それからトリテルペン化合物を異なる濃度で含む血清を含まない細胞培地中さらに2時間培養された。次いで、細胞原形質膜部位を低密度ミクロソーム(LDM)から分離するために、これを高速遠心分離した[Liu,L.Z.et.al.;Mol Biol. Cell 17,(5),2322−2330,2006]。ウェスタンブロット分析(Western blot analysis)は3T3−L1含脂肪細胞中、細胞内LDMからPMにGLUT4が転移する際にトリテルペン化合物の異なる濃度が与える影響があるか否かを観察するためにGLUT4のためのモノクローナル抗体を用いて行われた。
安定にHA−GLUT4−GFPを発現する3T3−L1前含脂肪細胞は96−ウェル培地皿で培養させられ、それから十分に培養された後に誘導試薬により異化された(Govers,R.et.al.;Mol Cell Biol.24(14),6456−6466,2004)。十分に異化された3T3−L1含脂肪細胞は異なる濃度のトリテルペン化合物を添加し、2時間放置され、細胞培地を除き氷冷したPBS溶液でその細胞を洗浄した。続いて、細胞は15分間室温で4%のパラホルムアルデヒド中に固定され、細胞を氷冷したPBS溶液で2,3回洗浄した後に初期の赤血球凝集索(primary anti−hemagglutinin)(HA)抗体(12CA5)を用いて2時間培養され、この後に細胞は再度氷冷したPBS溶液で2,3回洗浄され、ローダミン共役第2抗体(rhodamine−conjugated secondary antibodies)と共に1時間培養された(Leinco,Ballwin,MO)。細胞は、蛍光マイクロタイタープレートリーダー(POLARstar Galaxy;BMG Labtechnologies,Offenburg,独国)を使用してローダミンおよびGFPから励起された蛍光波長(Em.480/Ex.425nm および Em.576nm/Ex.550nm)を測定する前に再度氷冷したPBS溶液で洗浄された。GFP蛍光に対するローダミン蛍光の割合は計算され、原形質膜へ転移されたHA−GLUT4−GFPの相対量を評価するために使用された。HAタグ化されたGLUT4は原形質膜に転移した後にローダミンでラベルされうるので、その割合は原形質膜へのGLUT4転移の評価に有益であった。
トリグリセリドの堆積と3T3−L1含脂肪細胞内のグリセロールの遊離においてトリテルペン化合物の効果を調査する実験のために、異化して成熟した3T3−L1含脂肪細胞が血清を含まない細胞培地中一晩培養され、トリテルペン化合物を異なる濃度で含む血清を含まない細胞培地中でさらに24時間培養された。その培地は集められグリセロールアッセイキット(Randox Laboratories,Antrim,英国)を用いて異なる濃度のトリテルペン化合物が3T3−L1含脂肪細胞中脂質分解からグリセロールの遊離において効果があるかどうかを決定するためグリセロールの遊離について調査された。含脂肪細胞においてトリグリセリドのレベルはオイルレッドO染色により決定された(Ramirez−Zacarias,J.L.et.al.;Histochemistry 97,(6),493−497,1992)。細胞内で脂質の堆積により形成された油滴が染色され、60%イソプロパノールで2回洗浄され、そして100%イソプロパノールで抽出され490nmの吸収で定量された。その測定値は、含脂肪細胞において異なる濃度のテルペン化合物がトリグリセリドの蓄積に与える効果を評価するために、トリテルペン化合物が与えられなかった含脂肪細胞からの測定値と比較された。
成熟した含脂肪細胞においてポリア抽出物の効果の評価(実施例2)から、図2Aに示されるように;ポリア抽出物はグルコース摂取の増加に明らかに効果的であり、グルコース摂取の増加の効果は細胞に与えられる投与量の増加に正の相関がある。一方、インスリン100nMの添加もまたグルコース摂取量の増加に効果的であった。実施例2の純粋な化合物はさらに実験に使用された。図2Bは0.01μMの純粋な化合物を含脂肪細胞に投与後2時間後に、PA、TAおよびPPAの3つの化合物はグルコース摂取量を165.89%、142.5%、および147.9%に有意に増加した。PAにより誘導される増加が最も顕著であり、以下における評価はPAを基準にして行った。
図5はPAの異なる投与量を24時間成熟した含脂肪細胞に投与し、続いてGLUT1および4のタンパク質発現におけるPAの効果を評価するためにGLUT1および4のウェスタンブロット分析(Western blot analysis)行った。その結果は、PAはGLUT4のタンパク質発現の促進に効果的である(図5A)がGLUT1のタンパク質発現を促進には効果的でない(図5B)ことを示した。
グルコース摂取を促進するインスリンのメカニズムの一つはグルコース摂取を実行するために細胞内小器官から原形質膜への大量のGLUT4の転移を促進することである。したがって、インスリンにより活性化されるグルコース摂取のインスリン活性の包括的なシステムを有する成熟した3T3−L1含脂肪細胞がGLUT4タンパク質の転移を評価するために用いられた。図8Aは高速遠心分離器を使用して分離された原形質膜におけるウェスタンブロット分析の結果を図示しており、0.01μMのPAが原形質膜内のGLUT4の量を141%に有意に増加し、PA投与量が1μMに高められたときGLUT4の量は328%にまで増加することを明らかにした。HA−GLUT4−GFPタンパク質を安定的に発現する3T3−L1含脂肪細胞の使用および蛍光測定法はGLUT4の原形質膜への転移を増加することによりPAがグルコース摂取を促進することをさらに確認した。図8Bでは、PAの投与が1.0μMに増加されたとき、GLUT4の原形質膜への転移が2.71倍に高められたことが分かる。前述の結果はPAがGLUT4タンパク質の原形質膜への転移に効果的であることを裏付けた。
含脂肪細胞におけるグルコース摂取へのPAの効果の観察に加えて、含脂肪細胞中でのトリグリセリドの合成(蓄積)および脂質分解(グリセロールの遊離)もまた評価された。図9は異なる投与量でPAを投与した後24時間後の結果を示し、トリグリセリドの蓄積はオイルレッドO染色により測定された。PAの投与により、トリグリセリドの蓄積は元のレベルの137%に増加し、グリセロールの遊離はおよそ元のレベルの70%に低下した。この結果は、PAが脂質の合成の促進および脂質の分解の防止に効果的であることを示した。
Claims (12)
- 有効成分として、下記式(I):
で示されるラノスタン化合物またはその薬理上許容される塩を哺乳動物におけるI型糖尿病を治療するのに有効な量を含み、前記I型糖尿病は、前記哺乳動物の血液中の不十分なインスリンにより誘発されるものである、哺乳動物におけるI型糖尿病を治療するための薬剤組成物。 - 前記式(I)のラノスタン化合物が、下記化学式:
- 前記式(I)のラノスタン化合物が、下記化学式:
- 前記薬剤組成物が注射のためのものである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の薬剤組成物。
- 前記薬剤組成物が経口摂取のためのものである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の薬組成物。
- 前記哺乳動物がヒトである、請求項1〜5のいずれか1項に記載の薬剤組成物。
- 前記薬剤組成物が有効成分として前記式(I)を有する単離されたラノスタン化合物またはその薬理上許容される塩および薬理上許容される賦形剤または希釈剤を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の薬剤組成物。
- ポリア抽出物を有効成分として有効な量含み、前記ポリア抽出物の重量に対して、1〜60重量%の請求項1に定義される前記化学式(I)を有するラノスタン化合物を含み、前記ポリア抽出物がセコラノスタン(secolanostane)を含まない、哺乳動物の血液中の不十分なインスリンにより誘発される哺乳動物におけるI型糖尿病の治療のための薬剤組成物。
- 前記ポリア抽出物が、前記ポリア抽出物の重量に対して、5〜35重量%の請求項1に定義される前記化学式(I)で示されるラノスタン化合物を含む、請求項8に記載の薬剤組成物。
- 前記ラノスタン化合物(I)が、下記化学式:
- 前記薬剤組成物が経口摂取のためのものである、請求項8〜10のいずれか1項に記載の薬剤組成物。
- 前記哺乳動物がヒトである、請求項8〜11のいずれか1項に記載の薬剤組成物。
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