KR20080003931A

KR20080003931A - 인슐린 저항성 증후군의 치료

Info

Publication number: KR20080003931A
Application number: KR1020077027674A
Authority: KR
Inventors: 허태린; 송희복; 박동찬; 황승락
Original assignee: 주식회사 티지 바이오텍
Priority date: 2005-04-27
Filing date: 2006-04-27
Publication date: 2008-01-08
Also published as: US20060246163A1; WO2006114775A2; JP2009501696A; WO2006114775A3

Abstract

본 발명은 돌외의 추출물을 유효성분으로 함유하는 체지방감소 뿐만 아니라, 고혈당증, 비만, 인슐린 저항성 증후군의 치료에 사용되는 조성물을 개시한다.

돌외 추출물, 가이페노사이드, 인슐린 저항성 증후군, 비만, 당뇨병

Description

인슐린 저항성 증후군의 치료{Treatment of Insulin resistance syndrome}

본 발명은 돌외(Gynostemma pentaphyllum) 추출물 또는 가이페노사이드(gypenoside)를 유효성분으로 함유하는 치료학적 조성물에 관한 것이다. 추가적으로, 본 발명은 인슐린 저항성 증후군, 비만 또는 고지혈증의 치료용 조성물의 사용에 관한 것이다.

인슐린 저항성 증후군은 복잡하며 다원적인(polygenic) 질병이다. 가장 중요한 두 가지 인자, 즉, 비만과 염증반응들은 상기 증후군 및 관련 병적 질환들의 발생과 관련되어 있다. 특히 복부 비만은 인슐린 저항성의 발생에 긴밀한 관계가 있다고 알려져 있다. 인슐린 저항성 증후군의 많은 환자들에게 있어서, 명백한 임상증상을 나타나는 여부 및 이를 치료하지 않음으로서 발생되는 심각한 후유증을 고려한다면, 인슐린 저항성 증후군을 치료하기 위한 효과적이고 안전한 경구 투여 치료법에 대한 의학적 수요가 존재한다.

비만환자의 근육조직에서 인슐린 저항성에 대한 기전을 밝히기 위한 수많은 기초 및 임상 연구를 통하여 세포내의 지방산 축적이 상기 질환 발병의 중요한 역 할을 한다고 발표되었다(McGarry, 2002). 혈중 지방산(FA)이 지방산 운송 단백질(fatty acid transport protein, FATP)을 경유하여 세포내로 들어가게 되면, 이 FA는 코엔자임 에이(coenzyme A)와 에스테르화하여 아실-코에이(acyl-CoA)로 변환된다. 그 결과로, 아실-코에이 (일부는 글리세롤 골격에 결합되어 다이아실글리세롤을 형성)는 JNK(c-Jun N-terminal kinase) 및/또는 PKCs(potein kinase Cs)를 활성화하게 된다. 이러한 키나제 효소(kinases)들은 직간접적으로 인슐린 수용체 기질 (IRS1/2; insulin receptor substrate 1 &2)의 세린(serine) 잔기를 인산화한다(Dresener, 1999). IKK(I-kappa B kinase)-β가 제거된 생쥐에 IKK-β의 저해제인 살리실레이트를 이용한 실험에서, 슐만 등은 인슐린 저항성 증후군 환자들의 근육 조직에서 지질에 의해 유도되는 IRS1의 세린 인산화가 IKK-β의 활성에 의해 매개되는 것을 발견하였다(Kim, 2001). 이 세린 인산화(serine phosphorylated)된 IRS1/2은 PI3K(phosphatidyl-inositol 3 kinase)의 인슐린 수용체로의 결합을 저해한다. 이 인슐린 수용체로부터 유리된 PI3K는 인슐린 신호를 포도당 전달단백질(glucose transporter), 특히 인슐린-민감성 포도당 전달체 4(GLUT4; glucose transporter 4)에 전달하지 못하게 되며, 그 결과로 근육조직에서 인슐린 저항성을 나타나게 된다. 최근에 간과 지방조직과 같은 인슐린 타겟(target) 조직에서 비만-관련 인슐린 저항성은 아주 상이한 기전으로 유발된다고 알려졌다(Ozcan, 2004). 골격근이나 간세포/지방세포에서의 비만-유래 인슐린 저항성은, 종국에, 인슐린 비감응성 GLUT4에 기인되며, 그 결과 순환계로부터 당의 제거가 용이하지 않게 된다.

대부분의 조직에서 ATP를 생성시키는 선호되는 에너지원은 포도당이다. 탄수 화물은 친수성이어서 세포내로 자유로이 유입될 수 없어 포도당 전달 단백질 (GLUT)에 의해서 세포내로 전달되게 된다. 12개 이상의 다양한 GLUT들이 포유동물의 조직에서 발견되었으며, 이들 중 몇몇은 특정 조직에 위치하며, 다양한 조직에 넓게 분포되어 있다. 골격근, 간, 지방조직은 식후 혈당을 제거하는 대표적인 기관이다. 환언하면, 탄수화물이 많은 음식을 섭취하면 이 세 조직은 인슐린에 민감하게 반응하게 된다는 것이다. 당장 불필요한 다량의 탄수화물 음식을 섭취하면 급격히 증가된 이러한 포도당은 추후 사용을 위해 글리코겐이나 지방(트리아실글리세롤)으로 저장된다. 골격근과 간세포는 과잉 포도당을 글리코겐 형태로 저장하는 기관이다. 간 및 지방세포(지방질)는 지방을 합성하고 저장하는 주요 기관이다. 운동, 스트레스 혹은 기아 상태에서는 지방조직의 트리아실글리세롤은 산화과정을 위하여 지질 분해 작용(lipolysis)으로 가수 분해되어 유리 지방산이 된다. 근육 및 간 조직으로 전달된 상기 유리 지방산은 이후에 β-산화과정에서 ATP 합성에 필요한 NADH를 생성한다.

비만은 2형 당뇨병 및 고수준의 혈중 유리 지방산을 빈번하게 수반하고, 이는 인슐린 신호를 감소시키게 되므로, 체지방을 감소시키는 것은 인슐린 내성 및 2형 당뇨병의 개선에 유익하다. 따라서, 신체상의 체지방의 어느 부분을 감소시키고 또는 어떻게 감소시키는가는 중요한 관심이 된다. AMPK(AMP-activated protein kinase)의 활성화는 β-산화작용을 증가시키는 동시에 체지방합성을 감소시킬 수 있어 인슐린 저항성을 개선할 수 있다. AMPK의 활성화는 ACC(acetyl-CoA carboxylase)을 불활성화시켜, 말로닐-코에이(malonyl-CoA)의 생성을 감소시키고, 이로써 지방생성은 감소시키고 β-산화는 증가시킨다 (Oh, 2005). β-산화를 하기 위해서는 지방산이 미토콘드리아로 이동되어야 한다. 운반 시스템인 카니틴 셔틀(carnitine shuttle)은 긴사슬 지방산이 미토콘드리아막을 통과할 수 있게 한다. 간 및 근육세포에서 이 운반 시스템은 말로닐-코에이에 의해서 저해된다. 그러므로 AMPK의 활성화에 의한 말로닐-코에이의 감소는 미토콘드리아로의 지방산의 전달을 증가시키고, 그 결과 β-산화는 증가되어, 체지방이 감소하게 된다.

포도당은 췌장의 베타세포를 자극하여 인슐린을 분비하게 한다. 인슐린은 세포로의 포도당을 흡수할 수 있도록 세포막으로 GLUT4의 이동을 자극시키고, 또한 세포질에서는 글리코겐 합성을 증가시킨다. 분비된 인슐린이 적절하게 혈당을 조절하지 못할 경우에는, 췌장의 β-세포는 혈당을 생리학적 범위내로 조정하기 위하여 좀 더 많은 인슐린을 분비하게 한다. 이러한 β-세포의 과도한 인슐린 분비현상과 포도당을 흡수하는 조직들의 인슐린에 대한 비반응성이 인슐린 저항성의 대표적인 현상이다. 이러한 현상이 지속되면 결국에는 2형 당뇨로 발전된다. 또한 이러한 당뇨병 전개 도중에 고혈압, 동맥경화증 및 기타 질환들이 2형 당뇨와 수반된다.

현재 2형 당뇨병 치료제로 사용되는 비구아나이드(biguanide)의 계열 화합물인 메트포르민(merformin) 또는 TZD(thiazolidinedione)의 계열 화합물인 로지글리타존(rosiglitazone)은 인슐린 저항성을 개선시키는 효과가 있다. 메트포르민은 임 상적으로 수십 년 동안 당뇨병 치료제로서 사용되어 왔으며 그 주된 항당뇨 기작은 간 조직에서의 포도당생성을 억제하는데 있다. 로지글리타존과 같은 TZD계열의 화합물은 PPAR-γ(peroxisome proliferator activated receptor-γ)의 리간드로서 알려져 있으며, TZD가 PPARγ 에 결합하면 세포지방화와 관련된 다수의 유전자를 조절하게 된다. 지방조직으로부터 유도되는 지방산 및 펩타이드 호르몬들은 TZD-유도로 인슐린 민감성의 개선을 매개하는 것으로 알려져 있다. 흥미롭게도, 이들의 유래 및 활성 작용상의 상이함에도 불구하고, 상기 두 화합물들은 미토콘드리아의 호흡성 사슬(respiratory chain)의 호흡성 복합체(respiratory complex) 1의 효소 활성을 저해에 의한 ATP 수준에 의한 AMPK의 활성을 자극한다는 공통점을 갖는다(Brunmair 2004). 그러나 상기 두 저혈당성 화합물에 의해 AMPK 활성의 자극이 인슐린 민감성의 개선에 기여하는지 여부에 대해서는 알려져 있지 않다.

AMPK를 활성화시키는 화합물들을 비만, 인슐린 저항성 증후군 또는 2형 당뇨병의 치료를 위하여 스크리닝 방법(screening method)을 개발하여 탐색하게 되었다. 아시아 지역에서 수백 년 동안 다양한 질환 치료에 안전하게 사용되어 온 천연 식물 재료들이 근육 세포에서 AMPK을 활성시키는지 여부를 검사하였다. 시험된 수천 종의 식물 추출물 중에서, 돌외(Gynostemma pentaphyllum Makino) 추출물이 인슐린 저항성 증후군의 치료에 가능한 후보 물질로 선택되었다.

돌외는 박과 (Cucurbitaceae)에 속하는 다년생 식물로서 이 식물의 추출물이 혈중 콜레스테롤을 낮추고, 혈압을 조절하고, 면역력을 강화시키며, 염증 감소, 혈소판 응집 등을 저해할 수도 있는 화합물 또는 활성 성분을 포함하는 것으로 간주하여 민간 치료약으로서 사용되어 왔다. 그러나, 이 효과들은 과학적으로 규명되거나 증명되지 않았다. 돌외는 또한 Amachzuru, Jiaogulan, Miracle Grass, Southern Ginseng, Vitis pentaphyllum 또는 Xianxao로도 지칭된다. 이 식물의 잎 추출물의 주요 구성성분은 가이페노사이드(gypenosides; GP)이며, 이는 다마란계(dammmarane-type) 사포닌이다. 최근 류(Liu) 등은 돌외로 부터 15 종의 다마란계 사포닌을 분리하였다 (Liu, 2004). 10종은 이미 이전에 분리되어진 것이고, 5종은 에폭시 환이 있는 C-17의 측쇄가 함유되어 있는 신규 트리테르페노이드(triterpenoid)이다. 인(Yin) 등은 또한 이 식물로부터 상기 19종의 글리코사이드 중에서 15 종의 신규 다마란계 배당체(Glycosides)로 밝혀졌다. 이러한 최근의 신규 화합물 발견에 대한 성공적인 연구결과는 현대적인 분석 도구들의 발달로 기인하였다. 그러나 상기 신규 배당체의 각각 또는 조합이 임의의 특정한 약리학적 활성을 나타내는지 여부는 아직 밝혀지지 않았다.

돌외 추출물은 인슐린 저항성 증후군에 좋은 효과를 나타냈다. 이러한 상기 돌외의 추출물 또는 가이페노사이드의 항-인슐린 저항성은 다음과 같은 두 가지 발견에 기초한다. 첫째, 이 추출물은 AMPK 활성을 자극시켜 인슐린-비의존적으로 GLUT4의 세포막으로의 이동을 촉진시키는 자극제(stimulator)이다. 두 번째로 이 추출물은 IKK (I-kB kinase 저해제)-β와 JNK (c-Jun N-terminal kinase)의 활성을 억제하여 IRS1의 세린 잔기의 인산화를 감소시킨다는 것이다.

본 발명은 돌외(Gynostemma pentaphyllum Makino)로부터 유래된 다마란계 사포닌인 가이노페노사이드를 함유하는 생약 추출물의 사용법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 일 양태는, 돌외 추출물의 제조방법을 제공하는 것이다. 이 제조 방법은 상기 식물 구성요소를 추출하고 상기 추출물은 건조함을 포함한다.

본 발명은 인슐린-비의존적으로 GLUT4를 세포막으로 이동을 촉진시키고, IKK-β 및 JNK 활성을 억제시킴으로서 인슐린 저항성을 감소시켜 세포로의 포도당 흡수를 촉진시킴으로서 인슐린 저항성 객체에게 식후 혈당 수치를 감소시키기 위한 돌외 추출물 또는 가이페노사이드(gypenosides)의 사용방법을 제공한다.

본 발명은 또한 AMPK 활성을 촉진시키고, ACC(acetyl CoA carboxylase)의 활성을 불활성화시켜, β-산화를 증가시키고 체지방/지질을 감소하기 위한 돌외 추출물 또는 가이페노사이드(gypenosides)의 용도(use)를 제공한다.

본 발명은 또한 근육조직상의 IKK-β 및 JNK 활성을 저해함으로서 인슐린 신호를 증가시키기 위한 돌외 추출물 또는 가이페노사이드의 용도를 제공한다. 이러한 키나제(kinase) 효소 활성의 억제는 IRS의 세린(serine) 잔기의 인산화를 감소시켜 인슐린-자극에 의해서 세포로 포도당 흡수를 증가시킨다.

또한 본 발명은 인슐린 저항성 증후군 환자에게 돌외 추출물 또는 가이페노사이드(GP)를 투여함을 포함하는 인슐린 저항성 증후군 및 관련 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

따라서, 일 양태로서, 본 발명은 치료학적으로 돌외 추출물을 유효성분으로 함유하는 인슐린 저항성 증후군, 비만, 체지방 감소 및 고중성지방혈증(hypertriglyceridemia)의 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 가이페노사이드의 함량은 0.5-10% 의 중량을 포함하며, 바람직하게는 10 - 2000 μg/ml을 포함한다.

본 발명은 또한 치료학적 유효성분의 상기 조성물을 인슐린 저항성 증후군, 비만 또는 고중성지방혈증으로 고통 받는 환자에게 투여함을 포함하는 인슐린 저항성 증후군, 비만 또는 고중성지방혈증을 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 추출물의 양은 10mg 내지 30mg/일 또는 약 0.5 mg 내지 5 mg/일으로 사용가능하다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 치료학적 유효성분의 상기 조성물로부터 분리되는 가이페노사이드를 인슐린 저항성 증후군, 비만/과체중, 체지방 감소 및 고중성지방혈증으로 고통받는 환자에게 투여함을 포함하는 인슐린 저항성 증후군, 비만/과체중, 체지방 감소 및 고중성지방혈증을 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 조성물의 양은 약 1mg 내지 1000mg/일 또는 10 mg 내지 800 mg/일으로 사용가능하다.

상기 조성물은 온천수, 여과수, 증류수, 탄산수, 쥬스, 요구르트, 우유, 식용유 및 이들의 조합과 같은 액상 담체를 포함할 수 있다.

상기 조성물은 또한 아이스크림, 햄버거, 시리얼, 쿠키, 빵, 케이크, 비스켓, 가공육 또는 이들의 조합과 같은 식품 첨가제의 형태로 포함되어 사용될 수 있다.

추가적으로, 상기 조성물은 방부제, 감미료, 향미제, 착색제, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 나아가, 상기 조성물은 정제 형태로 제형화가 가능하다. 상기 정제는 충전제, 결합제, 코팅제, 희석제 또는 이들의 조합으로부터 제조가능하다. 나아가, 상기 기제는 식물성 셀룰로오스, 천연 실리카, 스테아르산 마그네슘, 왁스, 식물성 글리세리드, 식물성 스테아르산 또는 이의 조합을 추가로 포함할 수 있다.

상기 조성물은 또한 글리타존(glitazones), 파이브레이트(fibrates), 스타틴(statins), 비구아나이드(biguanides), 설포닐우레아(sulfonylurea) 화합물, 아데닌 뉴클레오타이드 (adenine nucleotides) 또는 이들의 유도체 및 약학적으로 허용되는 이들의 염을 포함할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 3T3-L1 세포의 세포 지방화 증진 활성을 갖는 무독성 AMPK 활성제를 탐색하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 이러한 목적은 본 발명의 하기한 설명란, 첨부되는 참고 도면 및 청구항들에 의하여 보다 충분하게 이해될 것이다.

[바람직한 구현예의 상세한 설명란]

본원에서 정의되는 “담체(carrier)”는 적용되는 용량 또는 농도에서 노출되는 세포 또는 포유동물에 무독성인, 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제(excipients) 또는 안정화제(stabilizer)를 포함한다. 통상적인 약학적으로 허용가능한 염은 액상 pH 완충용액이다. 약학적으로 허용가능한 담체의 예로는 이에 제한되지는 않으나, 인산염, 구연산염, 및 기타 유기산과 같은 완충액; 아스코르브 산을 포함하는 항산화제; 저분자량 (약 10개 이하의 잔기를 갖는) 폴리펩티드(polypeptide); 면역글로블린; 폴리비닐피롤리돈(PVP)과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류, 및 포도당, 만노스 또는 덱스트린과 같은 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트화제; 만니톨 또는 솔비톨과 같은 당알콜; 나트륨과 같은 염-형성 반대이온(counterions); 및 /또는 TWEEN, polyethylene glycol (PEG) 및 PLURONICS과 같은 계면활성제를 포함한다.

본원에서 정의되는 “용량(dose)”은 시간 간격 또는 정시에 복용하도록 처방되는 치료제의 특정 량을 의미한다.

본원에서 정의되는 “유효성분(effective amount)”은 건강에 유익하거나 요구되는 임상적 또는 생화학적 결과를 나타내기에 적당한 양을 의미한다. 상기 용량은 한 번 이상 복용할 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 화합물의 유효성분은 질병 상태의 진행을 일시적인 완화, 개선, 안정화, 역으로 진행, 느린 진행 또는 지연하고자 하는 것이다. 본 발명의 바람직한 구현예로서, 본 발명에서 상기 “유효성분”은 AMPK 및 GLUT4 이동을 촉진시킬 수 있는 화합물의 양으로 정의된다. 또 다른 구현예로서, 상기 “유효성분”은 상기 증상을 치료, 비만 또는 인슐린 저항성 증후군을 치료 또는 저해하기에 효과적인 조성물의 양으로 정의된다. 또 다른 양태로서, 상기 “유효성분” 은 인슐린 저항성 증후군의 효과가 감소되어야 하는 인슐린에 비의존적인 기작으로 세포로의 포도당 흡수를 증가시키는 가이페노사이드의 양일 수도 있다.

본원에서 정의되는 “GP”는 돌외로부터 추출한 가이페노사이드를 의미한다.

본원에서 정의되는 “인슐린 저항성 증후군(insulin Resistance Syndrome)”은 인슐린 저항성/상보적 고인슐린분비혈증을 수반하는 다양한 비정상적 상태를 의미하며, 이는 하기를 포함한다: 포도당 내성(포도당 대사 및 포도당 내성상의 능력 장애), 고지혈증(트리글리세리드의 증가, HDL-C(high-density lipoprotein cholesterol) 감소, LDL(low-denstiy lipoprotein) 입자 반경상의 감소, 식후 트리글리세리드-풍부 지질단백질의 축적상의 증가), 내피기능 장애(단핵세포의 부착율 증가, 혈장내 세포 부착 분자들의 농도 증가 및 비대칭성 디메틸아기닌(dimethylarginine)의 농도 증가, 내피-의존성 혈관 확장 감소), 전구응고인자(플라미노겐 활성 저해제-1 및 피브리노겐의 증가), 혈행역학적 변화(교감신경계 활성 및 신장 염분저류), 염증의 표식자(C-reactive protein의 증가, 백혈구 세포의 증가 등); 비정상적인 요산 대사(혈장의 요산의 농도 증가 및 신장의 요산 제거율 증가), 테스토스테론(testosterone) 분비 증가(난소); 및 수면호흡장애 등을 포함한다. 또한, 인슐린 저항성을 수반하는 임상적인 증후군으로 다음을 포함한다: 제2형 당뇨병, 심혈관계 질환, 본태성고혈압, 다중낭성난소증후군, 비알콜성 지방간, 암 또는 수면성무호흡 등이 포함된다.

본원에서 정의되는 “약학적으로 허용하는 담체 및/또는 희석제(pharmaceutically acceptable carrier and/or diluents)”는 임의의 모든 종류의 용매, 분산제, 코팅제, 항세균제 및 항진균제, 항등제 그리고 흡수지연제 등을 포함한다. 상기 약학활성 성분을 위한 상기 매개체(media) 및 시약들의 사용법은 당 업계에 공지되어 있다. 상기 약리활성 성분과 양립할 수 없는 경우를 제외하고는 상기 치료 조성물의 사용에 있어서, 통상적인 매개체 또는 시약들의 사용이 고려될 수 있다. 또한 보조 활성성분을 상기 조성물에 포함시킬 수 있다.

본원에서 정의되는 바와 같이, “치료(treatment)”는 유리한 또는 요구되는 임상적 결과를 얻기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적으로 위하여, 상기 유리한 또는 요구되는 임상적 결과는 이에 제한되는 않으나, 증상의 경감, 질병 정도의 감소, 질병의 안정화(더 이상 악화하지 않음), 질환 진행의 지연, 상기 질환의 일시적인 완화 또는 개선, 질환의 완화(전체적이거나 부분적으로)를 포함한다. 또한, “치료(treatment)”는 또한 치료 받지 않는 경우에 예상되는 것에 비해 평균 연장된 생존율을 의미할 수 있다. 또한 “치료”는 치료학적 치료 및 예방 또는 예방적 처치를 의미한다. 상기 치료가 요구되는 객체는 이미 상기 질환을 갖는 객체뿐만 아니라 예방되어야 할 객체를 포함한다. 질병의 “일시적 완화(Palliating)”는 질병상태의 정도 및/또는 바람직하지 못한 임상적 증상이 감소 및/또는 비처치시에 비하여 상기 진행과정의 진행기간이 늦어지거나 길어지는 상태인 것을 의미한다.

하나의 구현예로서, 상기 제조된 돌외 추출물 분말 또는 가이페노사이드는 이전에 알려진 바가 없는 치료 및 건강 증진 등의 장점을 제공한다. 보다 구체적으로, 상기 약학적으로 효과량 또는 처방량의 추출물 또는 가이페노사이드는 내당성 장애, 포도당 대사 능력 장애, 인슐린 저항성 장애 및 렙틴 저항성 장애를 개선할 수 있다.

또 다른 구현예로서, 가이페노사이드는 AMPK를 활성화시키는 데 사용되는 것이다. 또 다른 구현예로서, 상기 목표 단백질은 ACC이다. 또 다른 구현예로서, 상기 목표 단백질은 세포내 단백질인 CPT(carnitine palmitoyl transferase)이다. 추가적인 구현예로서, 상기 목표 단백질은 세포내 단백질 세포막성 단백질 IRS1이다. 추가적인 구현예로서, 상기 목표 단백질은 세포성 단백질 GLUT4이다.

추출 조성물 및 제형

본 발명의 치료 조성물중 가이페노사이드의 함량은 약 0.5 내지 10% 중량 또는 0.6 내지 9%, 0.7 내지 8%, 0.8 내지 7%, 0.9 내지 6%, 1 내지 5%, 2 내지 4%이고, 더욱 바람직하게는 2.1 내지 3.5%, 2.2 내지 3.4%, 2.3 내지 3.3%, 2.4 내지 3.2%, 2.5 내지 3%, 2.6 내지 2.9%, 또는 2.7 내지 2.8%내의 범위일 수 있다.

본 발명의 치료용 조성물에서의 가이페노사이드의 농도는 10 내지 2,000 μg/ml, 20 내지 1,000 μg/ml, 30 내지 500 μg/ml이고, 바람직하게는 100 내지 300 μg/ml내의 범위일 수 있다.

본 발명의 호환적인 구현예로서, 활성 조성물은 크로뮴, 망간, 아연, 니아신, 비티민 B6 또는 비타민 B12의 혼합물로부터 제조가능하다. 바람직하게는 상기 크로뮴은 약 20 내지 500 μg의 양으로 존재하며, 망간은 약 1 내지 10 mg의 양으로 존재하며, 아연은 약 2 내지 10 mg의 양으로 존재하며, 니아신은 약 50 내지 500 mg의 양으로 존재하며, 비타민 B6는 약 1 내지 50 mg의 양으로 존재하며, 및 비타민 B12는 약 5 내지 100 μg의 양으로 존재하는 것이다.

상기 질병의 특이적 임상적 상태에 따라서 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 바람직하게는, 고정된 투약량으로 제조하기 적절한 단위량으로 정제, 좌약, 환약, 캡슐, 분말, 용액, 현탁, 크림, 젤, 패치, 질좌약, 에어솔, 세안약, 에멀젼 또는 기타 형태의 고체상, 반고체상 또는 액상 투여 형태로, 정맥, 근육, 피하, 경피, 질, 눈, 코를 통한 투여와 같은 경구 또는 비경구 투여법과 같은 임의 전신적 투여용법으로 제조가능하다. 상기 약학조성물은 통상적인 담체 또는 운반체 및 기타 약제, 약학적 물질, 운반체, 보조제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에서, 바람직하게는 본 발명의 생약 조성물을 위한 담체로는 열매 및 과일의 주재료, 야채 수프 및 고기 수프의 주재료, 두유, 또는 영양 보조제들을 포함할 수 있다.

만일 야채 수프 또는 고기수프의 주원료가 상기 생약 조성물의 기제(base)로 사용되고자 하는 경우에는, 상기 조성물의 항-당뇨 효과가 유지되는 범위 내에서 임의의 야채 수프 또는 고기 수프가 사용될 수 있음도 명백하다.

상기 기제가 열매 또는 과일의 추출물로 제조되기를 원한다면, 돌외 조성물의 항-당뇨 효과를 방해하지 않는 범위 내에서 어떠한 열매 또는 과일의 기제로 사용할 수 있음을 인지해야 한다.

본 발명의 조성물은 두유에 함유할 수 있으며, 이와 같은 음료는 독성을 예방하기 위해서 냉장해야 함을 인식되어야 한다. 더 나아가, 상기 발명의 조성물은 돌외 조성물의 항-인슐린 효과가 유지되는 범위 내에서 어떠한 영양보조제와 함께 존재, 첨가, 혼합 또는 조합될 수 있다.

상기의 약학조성물은 습윤제, 유화제, pH 완충용액, 아세테이트나트륨(sodium acetate), 솔비탄 모노라우레이트 (sorbitan monolaurate), 트리에탄올라민 올레이트 (triethanolamine oleate) 등의 무독성 보조 물질 소량을 포함할 수도 있다.

상기 제형상의 생약의 양은 당업계에 종사하는 당업자에 널리 알려진 바와 같이, 예를 들어, 전체 제형 중량의 약 0.01 내지 99.9 중량비% (wt%)의 약제 및 0.01 내지 99.9 중량% (wt%) 부형제를 첨가할 수 있다.

상기의 조건을 위한 바람직한 투여법은 상기 질병의 정도에 따라 조절가능한 편리한 일일 복용의 경구 투여를 사용할 수 있다. 상기의 경구 투여를 위하여, 약학적으로 허용가능한 무독성 조성물은 현재 사용되는 부형제, 예를 들어 약학적 수준의 만니톨, 락토즈, 전분, 스테아르산 마그네슘, 사카린나트륨, 탈크, 셀루로즈, 포도당, 젤라틴, 수크로즈, 마그네슘 칼보네이트 등 부형제내에 상기 생약 조성물을 가하여 생성된다. 상기의 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 분말 형태, 서방형 제제 등으로 투여된다. 상기 조성물은 본 발명에 따른 유효성분을 0.01 중량% 내지 99.99 중량%을 포함할 수 있다.

본 발명의 한 구현예에서, 상기 조성물은 활성 성분외에 수크로즈가 코팅된 환약 또는 정제 제형이며, 락토즈, 수크로즈, 인산디칼슘 등의 희석제; 전분 또는 이들의 유도체와 같은 붕해제 (disintegrant); 스테아르산 마그네슘 등과 같은 윤활제; 및 전분, 폴리비닐피롤리돈, 아카시아 검, 젤란틴, 셀루로즈 및 이들의 유도체 등과 같은 결합제를 포함할 수 있다.

“약학적 조성물(pharmaceutical composition)” 또는 “생약 의약 조성물 (herbal medicinal composition)”은 상기의 조성물이 각각의 인슐린 저항성 증후군, 비만 및 고지혈증의 치료 및 예방을 위한 목적으로 투여되도록 제형화되는 것으로 의미된다. 상기 작용 기전은 AMPK의 활성 및 IKK 및 JNK의 활성의 감소에 의해 일어나는 것으로 간주된다. 그러나, 상기 가이페노사이드 성분은 독성이 없는 것으로 이해되어야 할 것이다.

치료용 조성물 ( Therapeutic Composition )

치료용 조성물의 제형은 당업계에 널리 알려져 있으며, 하기의 참고 문헌 레밍턴의 약리과학서 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 미국)에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 체중 1 kg 당 약 0.05 μg 내지 20 mg이 투여될 수 있다. 투여용량은 최적의 치료 반응을 제공하기 위해 조절가능하다. 예를 들어, 투여량은 하루에 여러번 나눠 투여하거나 또는 치료학적 조건에 따라 점차적으로 감소시킬 수도 있다. 상기 활성 성분은 경구 투여, 복강주사 (수용성일 경우), 근육주사, 피하주사, 경피 또는 비강 등과 같은 편리한 경로로 투여될 수 있다.

주사 용도에 적합한 약학적 제형은 멸균 수용액 (수용성) 또는 분산제 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉시 제조용 제제의 멸균 분말들을 포함할 수 있다. 모든 경우에 있어서, 상기 제형은 주사적 (syringability)으로 용이할 정도의 멸균 및 액상이어야만 한다. 제조 및 저장 조건하에서 안정되어야 하며, 박테리아 및 곰팡이와 같은 미생물의 오염에 대해 보호되어야 한다. 상기 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜 용액 등), 이들의 혼합물 및 식물성 유지 등을 포함하는 용매 또는 분산 배지일 수가 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제의 사용하며, 분산의 경우에는 요구되는 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용으로 유지 가능하다. 미생물에 의한 오염을 방지작용은 예를 들어, 클로로부탄올, 페놀, 소르빅산 또는 티메로살 등과 같은 다양한 항균 및 항곰팡이 시약을 사용할 수 있다. 많은 경우에서, 예를 들어 수크로즈 또는 염화나트륨 등과 같은 등장성 물질을 포함할 수 있다. 주사가능한 조성물의 장기적 흡수는 흡수를 지연시키는 시약 조성물 성분, 예를 들어 모노스테아르산 알루미늄 및 젤라틴의 사용을 통해 달성될 수 있다.

멸균 주사 용액은 적절한 용매 내에서 적정량의 유효성분을 상기에 나열되어 있는 다양한 기타 성분들과 함께 혼합하고, 여과 살균법을 통하여 제조된다. 일반적으로 분산제(dispersion)는 다양한 멸균된 활성성분을 기본 분산 배지 및 상기에 기재되어 있는 요구되는 기타 성분을 포함하는 멸균된 운반체 (vehicle)와 혼합하여 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균분말의 경우에서, 바람직한 제조방법은 진공건조 및 동결건조 방법이며, 이들은 전술한 이들의 멸균 여과 용액으로부터 활성 성분 분말 및 추가적으로 요구되는 성분들을 수득할 수 있다.

상기 활성 성분은 예를 들어 불활성 희석제 또는 식용 가능한 담체와 함께, 경구 투여될 수 있으며, 또는 견고하거나 부드러운 젤라틴 캡슐로 포장되거나, 정제로 제형화되거나, 또는 식이용 음식물에 직접 혼합될 수도 있다. 경구 투여법으로 상기 활성 성분은 부형제와 혼합될 수 있으며, 식용가능한 정제, 구강정 타블렛, 트로키(Troches)제, 캡슐제, 영약, 현탁액, 시럽, 봉합제 등의 형태로도 제조될 수 있다. 이와 같은 조성물 및 제제는 유효 성분을 최소한 1 중량% 이상을 함유하여야 한다. 조성물 및 제제의 비율은 물론 다양할 수 있으며 통상적으로 약 5% 내지 80 중량%을 함유하는 것이다. 이와 같은 치료학적으로 유용한 치료용 조성물에서 활성 성분의 함량은 적절한 투여량을 통해 획득할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 조성물 또는 제제의 경구 복용 단위는 유효 성분의 함량이 0.1 μg 내지 2000 mg을 함유한다.

또한, 정제, 환약, 캡슐제 등은 하기를 포함할 수 있다: 트라가칸트검, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴과 같은 결합제; 이인산 칼슘과 같은 부형제; 옥수수 전분, 감자 전분 및 알긴산과 같은 붕해제; 스테아르산 마그네슘과 같은 윤활제; 수크로즈, 락토즈와 같은 감미제; 페퍼민트(peppermint), 윈터그린(wintergreen) 또는 체리 등으로부터 추출된 방향제등을 첨가할 수 있다. 투여 단위 형태가 캡슐형인 경우에는 상기 제시된 제제에 추가적으로 액상 운반체를 포함할 수 있다. 다양한 기타 재료는 코팅제로 존재하거나 투여 단위의 물리적 형태가 변형된 형태일 수 있다. 예를 들어, 정제, 환제 또는 캡슐제는 착색제(shellac), 설탕 또는 이들 모두로 코팅될 수 있다. 시럽 또는 영약(elixir)은 유효성분, 감미제로서 수크로즈, 보존제로서 메틸 및 프로필파라벤즈, 착색제 및 방향제로서는 체리 및 오렌지 향을 포함할 수 있다. 물론, 모든 투여형태를 제조하는데 사용되는 모든 재료들은 약학적으로 순수해야 하며, 적용량에서 실질적으로 무독성이어야 한다. 추가적으로, 상기 활성 성분은 서방형 제제 및 제형 내에 혼합 할 수 있다.

투여상의 편이성 및 복용 단위의 균일성를 위한 투여 단위 형태상으로 비경구적 조성물로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 게시된 바와 같이, 투여 단위 형태는 치료할 포유류를 위한 단일 복용 단위에 적합한 물리적으로 구별되는 단위를 의미한다; 약학 담체에 요구되는 치료학적 효과를 생산하기 위해 계산되는 활성 물질의 규정된 양을 포함하는 각 단위를 의미한다. 본 발명의 투여 단위 형태의 사용법은 (a) 활성 성분의 특이적 특성 및 달성하고자 하는 특정한 치료적 효과, 및 (b) 당업계에 자명한 육체적 건강이 손상된 병적 상태인 생체의 질병 치료를 위한 활성 성분을 혼합하는 제한 인자에 따라 직접적으로 서술 및 의존된다.

상기 주요 활성 성분은 투여 단위 형태 내의 적절한 약학적으로 허용가능한 운반체와 함께 유효량으로 편리하고 유효한 투여의 형태로 혼합된다. 단위 투여 형태는 예를 들어, 활성성분을 0.5 μg 내지 2000 mg의 범위 내로 포함할 수 있다. 비율로 표현시, 상기 활성성분은 일반적으로 약 0.5 μg/ml의 담체의 양으로 제조된다. 보조 활성 성분을 포함하는 조성물의 경우에서는, 상기 복용량은 상기 활성성분의 통상적 복용량 및 투여방법을 참고하여 결정된다.

본 발명은 본원에 개시된 특정 구현예의 범위 내에만 한정되는 것은 아니다. 본원에 개시된 바에 추가적으로 발명의 다양한 변형은 하기의 내용 및 도면을 통해 당업자에게 자명할 것이다. 이와 같은 변형은 청구항의 범위 내에 포함된다. 하기의 실시예들은 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐, 발명의 범위를 한정되는 것은 아니다.

도 1은 호르몬의 존재 하에서 가이페노사이드 처리시 3T3-L1 세포에서의 세포 지방화를 증진시키는 효과를 나타낸 도이다.

1) 비처리 2) 5μg/ml 3) 20μg/ml 4) 50μg/ml

도 2는 3T3-L1 세포에서, 로지글리타존과 GP의 지방조직생성의 증진 효과를 나타낸 도이다.

도 3은 래트(rat) 혈관 평활근 세포에서의 돌외 추출물에 의한 세포질 및 세포막 분획상에서의 PPARγ 및 GLUT4의 상위조절(upregulation)을 나타내는 도이다.

1) 대조군 2)로지글리타존 5 μM 3) 돌외 추출물 0.5 mg/mL

도 4A-4I은 가이페노사이드가 L6 세포질내의 GLUT4가 세포막으로 이동이 증가하였음을 보여준다. L6 세포들은 9일간 저 포도당 배지상에서 미오튜브(myotube) 세포로 성숙을 유도한다. 가이페노사이드 (60 μg/mL) 또는 인슐린(100 nM)을 PI3K 또는 p38 MAPK에 대한 저해제와 함께 또는 없이 처리하였다. 이 저해제들을 가이페노사이드 또는 인슐린 처리 1시간 전에 처리하였다. 냉 PBS로 세척 후에, 상기 세포들을 GLUT4 특이 항체를 처리한 후에 FITC-결합 2차 항체를 처리하여 FACS로 분석하였다. (A) 주어진 조건에서 FACS에 나타난 전체 세포 분포도(도 A의 원은 게이트화 영역 표시);(B) 비처리된 대조군 세포의 FACS 양상 C) 가이페노사이드가 처리된 세포에 비특이적 항체로 배영된 FACS 양상 (D) 가이페노사이드가 처리된 세포에 GLUT4 특이 항체로 반응시킨 FACS 양상 (E) 워트마닌(wortmanin)존재하에 가이페노사이드를 처리한 세포의 FACS 양상 (F) SB20358 존재하에서 가이페노사이드를 처리한 세포에 GLUT4 특이 항체로 코팅된 FACS 양상 (G) 인슐린이 처리된 세포의 FACS 양상 (H) 인슐린과 워트마닌이 처리된 세포의 FACS 양상 (I) SB20358 존재하에 인슐린으로 처리된 세포의 FACS 양상.

도 5는 가이페노사이드를 세포에 처리한 시간에 따른 AMPK의 활성도 변화를 나타낸 도이다. L6 미오튜브(myotube) 세포에 가이페노사이드 (60 μg/mL)을 처리하고 표시된 시간만큼 배양하였다. 이 세포를 용해 버퍼로 용해시킨 후에 세포질 단백질을 SDS-PAGE에서 분리 후, 단백질 밴드는 니트로셀룰로오스로 이동되었고 인산화-AMPK는 특이 항체로 분석하였다. (1)대조군 (2) 가이페노사이드 30분 처리,(3) 가이페노사이드 1시간 처리 (4) 가이페노사이드 2시간 처리군

도 6은 래트 평활근 세포에 고농도 포도당과 함께 가이페노사이드를 처리한 후에 AMPK의 인산화 정도를 측정하였다. (1) 대조군 (2) 고농도(27.5 mM)의 포도당 처리 (3) 고농도의 포도당과 함께 가이페노사이드 (10 μg/mL) 처리 (4) 고농도의 포도당과 함께 가이페노사이드 (30 μg/mL) 처리

도 7은 L6 미오튜브 세포에 고농도의 포도당과 함께 가이페노사이드를 처리하였을 때 AMPK 및 p38 MAPK의 활성 변화를 측정하였다. 이 인산화효소들의 활성은 특이 항체를 이용하여 측정하였다. (1) 대조군 (2) 가이페노사이드 (30 μg/mL) (2) 가이페노사이드 (60 μg/mL) (4) AICAR (1 mM) 처리군

도 8은 L6 세포에 가이페노사이드를 처리한 후 ACC와 AKT에 대한 인산화 정도를 실험하였다. (1) 대조군 (2) 가이페노사이드 30 μg/mL (3) 가이페노사이드 60 μg/mL (4) 가이페노사이드 100 μg/mL (5) AICAR 1 mM; (6) 인슐린 100 nM.

도 9는 L6 세포에 가이페노사이드를 처리한 후 IRS1의 세린 잔기에 대한 인산화 정도를 실험하였다. 시험관내 시험법(in vitro)으로서 L6 세포는 인위적인 인슐린 저항성를 유도하기 위하여 지방산이 결합된 BSA로 전처리하였다. (1) BSA 처리한 세포 (2) 지방산 결합된 BSA 처리 (3) 지방산 결합된 BSA 처리 후 가이페노사이드 60 μg/mL 처리.

도 10은 튜니카마이신(tunicamycin)이 처리된 L6 미오튜브 세포에 가이페노사이드의 처리가 IRS1, IKK-β, 및 SAPK/JNK에 대한 인산화 정도에 대한 영향을 평가하였다. 튜니카마이신은 N-linked glycosylation을 저해하는 항생물질로서 인슐린 저항성을 유발할 수 있다고 알려진 물질이다. SDS-PAGE 실행 후, 니트로스셀루로스 막에 전달된 단백질에 대하여 anti-phospho-IKKβ(S^177/181), anti-phospho IRS1 (S³⁰⁷), 및 anti-phospho SAPK/JNK (T¹⁸³) 특이 항체로 그 영향을 실험하였다.

(1) 대조군 (2) 튜니카마이신을 처리한 L6 세포 (3) 튜니카마이신과 함께 가이페노사이드 30 μg/mL (4) 튜니카마이신과 함께 가이페노사이드 60 μg/mL (5) 튜니카마이신과 함께 AICAR 1 mM를 처리한 세포 (6) 인슐린 100 nM 처리한 세포 (7) 튜니카마이신과 인슐린 100 nM가 함께 처리된 세포

도 11은 고농도의 포도당과 함께 가이페노사이드를 평활근 세포에 처리한 후 IKK와 NF-kB의 활성에 대한 영향을 평가하였다. 상위 페널(upper panel): 인산화 I-kB (lanes 1-4), p65 (lanes 5-7) 하위 페널(lower panel): beta tubulin (lanes 1-4), nuclear actin (lanes 5-7) (1) 대조군 (2) 고농도 포도당 (27.5 mM) (3) 고농도 포도당 (27.5 mM)과 가이페노사이드 10 μg/mL (4) 고농도 포도당 (27.5 mM)과 가이페노사이드 30 μg/mL (5) 대조군 (6) 고농도 포도당 (27.5 mM)과 가이페노사이드 10 μg/mL (7) 고농도 포도당 (27.5 mM)과 가이페노사이드 30 μg/mL.

도 12는 L6 세포에 가이페노사이드를 2시간 동안 처리한 후에 JNK의 활성에 대한 영향 평가를 하였다. 세포질 분획에 대하여 인산화 JNK 특이 항체를 사용하여 실험이 진행되었다. (1) 대조군 (2) 가이페노사이드 30 μg/mL (3) 가이페노사이드 60 μg/mL (4) AICAR 1 mM (5) 인슐린 100 nM

도 13은 L6 세포에 가이페노사이드를 처리한 후, 2-데옥시글루코스(2-deoxyglucose)의 세포로의 흡수를 측정하였다. (1) 대조군 (2) 가이페노사이드 60 μg/mL (3) AICAR 1 mM (4) 인슐린 100 nM

도 14는 HepG2 세포에서 가이페노사이드를 처리한 후 β-산화에 대한 영향을 평가하였다. (1) 대조군 (2) 가이페노사이드 30 μg/mL

도 15는 가이페노사이드를 섭취한 db / db mice의 내당성 개선 효과에 대한 실험이다.

도 16은 가이페노사이드를 섭취한 db / db mice의 당화 혈색소 개선 효과에 대한 실험이다. HbA1c: Glycated hemoglobin (당화혈색소)(^abValue 는 p<0.05에서 유의성이 있음.)

도 17은 8주간 경구투여로 가이페노사이드를 섭취한 db / db mice의 혈장내 고인슐린증에 대한 개선 효과에 대한 실험이다. (^abcValue 는 p<0.05에서 유의성이 있음)

도 18은 가이페노사이드를 섭취한 db / db mice의 C-peptide 개선 효과에 대한 실험이다. (^abValue 는 p<0.05에서 유의성이 있음)

도 19는 가이페노사이드를 섭취한 db / db mice의 혈중 렙틴 감소 효과에 대한 실험이다.(^abcValue 는 p<0.05에서 유의성이 있음)

도 20은 가이페노사이드를 섭취한 db / db mice의 간조직에서의 포스포에놀피루베이트카복시키나제(PEPCK)에 대한 영향에 관한 실험이다.(^abValue 는 p<0.05에서 유의성이 있음).

도 21은 가이페노사이드를 섭취한 db / db mice의 근육조직에서 AMPK의 활성과 IRS1의 세린잔기 인산화에 대한 영향에 관한 실험이다: (1) 대조군 (2) 가이페노사이드 0.01% 섭취한 db / db mice (3) 가이페노사이드 0.02% 섭취한 db / db mice (4) 글루코반스(Glucovance) 0.02% 섭취한 db / db mice.

실시예 1. 가이페노사이드 제조방법

이 구현예에서는 본 발명은 돌외 추출물의 제조방법을 상술한다.

상기 제조방법에 있어서, 특정 유형의 항고혈당 활성을 갖는 돌외 추출물을 선택하였다. 추출물은 본 발명의 생약 추출물에 기초한 조성물상에 활성 성분을 포 함하는 약학적인 활성 화합물을 고농도로 갖는 추출물을 수득하였다.

본 발명의 하나의 구현예로서, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다:

(a) 마쇄된 돌외 잎을 수성 알코올(70% 에탄올와 같은)에서 추출하는 단계;

(b) (a)단계를 반복하고, 두 번째 수용성 알코올 추출물 용출액을 회수하고,및 (a), (b) 단계에서 획득한 두 알코올 추출물을 합치는 단계;

(c) 알코올을 증발시킨 후에 상기 용액을 증류수와 추가적으로 혼합하고 여과하는 단계;

(d) 상기 용액을 1-부탄올(1-BuOH), 물층과 혼합한 후에 1-부탄올을 증발시키는 단계;.

(e) 건조하여 상기 회수된 용출액의 액상 부분을 감소시켜 유기성 물질들을 회수하고, 돌외 추출물 분말형태을 제조하는 단계;및

(6) 필요에 따라서 추가적인 분리 및 정제하는 단계.

실시예 2. 3T3-L1 세포에서 세포지방화를 증가시키는 화합물의 동정(in vitro)

세포지방화 증진활성을 얻기 위한 활성 화합물을 세포 수준의 어세이법으로 동정하였다. 요약하면, 3T3-L1 세포을 96 웰 플레이트에서 배양하였다. 선별하기 전에, 세포들을 지방세로로 성숙할 수 있는 최적의 조건으로 조절하였다. 10% FCS가 포함된 DMEM에서 유지된 3T3-L1인 지방 전구세포는 특정한 호르몬 칵테일(5 μg/mL 인슐린, 1 μM 덱사메사손 및 500 μg/mL IBMX) 존재 하에서 지방세포로 성숙하게 하였다. 3일째에서, DMEM 내에서 호르몬으로서 오직 인슐린만을 포함하는 배지로 이틀마다 교체하였다. 통상적으로, 세포지방생성 유도의 수준은 Oil-Red O로 염색함으로써 평가하였다. 시험 시료의 농도는 10 μg/mL이였다. 로지글리타존을 3T3-L1 세포에서 세포지방생성을 증가시키는 양성 대조군으로 사용하였다.

3T3-L1 세포의 세포지방화는 가이페노사이드의 첨가량과 비례하여 증가하였다 (도 1 참조). 세포 배양에서 세포의 내부에 트리글리세라이드의 축적을 위한 에너지원으로서 포도당이 유일하기 때문에, 가이페노사이드가 세포에서의 트리글리세라이드 합성에 요구되는 탄소원을 충족시키기 위한 세포내로의 포도당 흡수를 촉진시키는 능력을 가지고 있음을 의미한다. 상기 세포는 로지글리타존 존재 하에서 가이페노사이드에 의해 세포지방생성이 더 많이 증가하였다(도 2). 이 결과는 가이페노사이드는 세포지방생성기전상에서 로지글리타존과 상이함을 의미한다. 3T3-L1 세포에서의 세포지방생성은 능동적인 세포 분화과정으로서, 이는 상기 지방세포생성을 증가하는 물질들이 세포 생리학적으로 독성이 없음을 의미한다. 세포지방화를 자극하는 많은 물질들은 GLUT4의 이동(translocation)을 증가시켰다.

식후 혈중 포도당은 근육 또는 다른 인슐린에 민감한 조직으로 흡수된다. 인슐린에 민감한 세포인 래트 평활근 세포는 상기 후보 화합물이 세포막쪽으로 GLUT4의 이동을 증가시킬 수 있는지의 여부를 두 가지 방법으로 측정하였다. 첫째, 마이크로좀이 제거된 막성분은 편차원심분리로 분획되었다(Pinent, 2004). 막 단백질을 SDS-PAGE한 후 나이트로셀룰로즈막에 옮겼다. 이 나이트로셀룰로즈막은(blotted membrane)을 GLUT4 특이항체와 반응시켰고 그 특이적인 밴드는 기질과 HRP-결합 2 차 항체에 의해서 방사된 형광에 노출된 필름으로 확인되었다. 이 실험에서, 돌외 추출물 처리군은 대조군 세포와 비교하여 막성 GLUT4가 증가되었고 (도 3, 중간 페널), 이 결과는 가이페노사이드 처리가 GLUT4의 이동을 증가시켰음을 의미한다. 앞서 기술한 바와 같이, 돌외 추출물은 또한 세포지방화 생성을 증가시키기 위한 중요한 요소인 PPARγ 수준을 증가시켰다 (도 3, 상위 페널)

다른 한 방법으로, L6 미오튜브 세포는 GLUT4 특이항체와 반응시킨 후, FITC-결합 IgG 2차 항체와 반응시켰다. 그 형광의 세기를 FACS로 분석하였다. 인슐린은 GLUT4의 이동에 대한 양성 표시자(marker)로 사용되었다. 가이페노사이드 처리는 GLUT4의 이동을 증가시켰다 (도 4 C & D). 가이페노사이드 처리에 의해 증가된 GLUT4의 이동은 PI3K의 저해제인 워트마닌(wortmanin)이나 p38 MAPK의 저해제인 SB20358에 의해서 감소하지 않았다 (도 4E & F). PI3K와 p38 MAPK는 인슐린의 신호전달에 중요한 매개분자이기 때문에, 가이페노사이드에 의한 GLUT4 이동 기작은 아마도 인슐린의 신호전달과는 상이할 것이다 (도 4 G, H 및 I).

실시예 3. 가이페노사이드의 고농도 또는 유리 지방산에 의해 유도된 인슐린 저항성의 완화(in vitro)

AMPK는 인산화를 통해 ACC 및 HMG-CoA 환원효소(reductase)를 직접적으로 조절하며(Henin, 1995), 이는 각각 미토콘드리아에서의 β-산화를 증가시키고 간조직에서의 콜레스테롤의 합성을 저해한다. AMP의 유사체인 AICAR (5'-phosphoribosyl-5-aminoimidazole-4-carboxamide)는 AMPK를 활성화시키는 것으로 알려져 있다.

상기 실시예 1에서, 가이페노사이드는 세포막으로의 GLUT4의 이동을 증진시켰다. 인슐린의 작용이외에 근육 수축은 AMPK 활성화를 통한 GLUT4의 이동을 촉진시키는 것으로 알려져 있다. 가이페노사이드 처리가 AMPK의 활성을 활성화시키는지 여부를 확인하기 위해서 L6 미오튜브 세포에 가이페노사이드를 처리하였다. AMPK의 활성은 특이적인 항체를 이용하여 AMPK의 172번의 트레오닌 잔기에서의 인산화의 증가로 평가하였다. AMPK의 인산화는 L6 미오튜브 세포에서 가이페노사이드를 처리한 후 2시간 이내에 나타났고(도 5) 그러한 인산화 수준은 가이페노사이드의 처리 시간이 연장되어도 증가되지 않았다. L6 미오튜브 세포는 인슐린 저항성을 유도하고 AMPK 활성을 억제하기 위해 고농도 포도당(27.5mM)으로 전처리하였다 (Itani, 2003). 가이페노사이드의 처리에 따라 트레오닌 잔기에서의 AMPK 인산화가 현저히 증가하였다. 고농도의 가이페노사이드 처리는 AMPK의 더 많은 인산화를 유도하였다. 이 결과는 가이페노사이드가 처리된 인슐린 민감성 세포에서 AMPK의 활성이 증가되었음을 의미한다 (도 5 및 도 6).

L6 세포를 낮은 혈청 조건에서 성숙한 근육 세포로 분화시켰다. AICAR를 양성 대조군으로 사용하였다. 일단 약물 처리가 종료되면, 세포들을 회수하여 분해시켰고, 개개 처리군으로부터의 동량의 단백질의 AMPK 및 p38 MAPK 활성 수준을 분석하였다(도 7 참조). AMPK 단백질에 대한 면역블로팅하였다. 30 μg/mL의 가이페노사이드 처리군에서는 비처리군과 비교하여 AMPK의 172번째 트레오닌 잔기에서의 인산화의 증가가 나타나지 않았다. 그러나, 60 μg/mL의 가이페노사이드 처리군에서는 AMPK의 인산화 수준이 유의적으로 증가하였다. 1mM의 AICAR에 의한 AMPK의 인산 화 수준은 60 μg/mL의 가이페노사이드 처리군의 인산화 정도와 비슷하였다. 가이페노사이드는 공통의 골격구조를 공유하는 유사 화합물들의 혼합물이다. 가이페노사이드는 가이페노사이드의 평균 분자량이 약 1000 달톤이라고 간주하고 AMPK를 활성화시키는데 있어서 AICAR 보다 더 높은 효능을 나타내는 것처럼 보인다.

AICAR는 골격 근육 조직에서 p38 MAPK를 활성화 시키는 것으로 알려졌다 (Lemieux, 2003). p38 활성화는 AICAR에 의한 증가된 포도당 흡수와 관련 있음이 증명되었다. 가이페노사이드가 L6세포에서 p38 MAPK를 활성화시킬 수 있는지 여부를 조사하였다. AICAR의 처리는 정말로 p38의 활성화를 발휘하는 반면에, 가이페노사이드는 p38의 활성을 거의 증가시키지 않았다 (도 7). 상기 실시예에서 (도 4) p38 MAPK 활성의 저해제인 SB20358는 가이페노사이드에 의한 GLUT4의 세포막으로의 이동 증가를 억제하지 못함이 증명되었다. AMPK (GP>AICAR) 및 p38 MAPK (GP<AICAR)에서 가이페노사이드와 AICAR 간에 나타나는 다른 반응들을 고려하면, 근육세포의 GLUT4의 이동을 활성화시키는 가이페노사이드의 분자적 기전은 AICAR의 분자적 기전과 동일하지 않을 수도 있다.

실시예 4. 가이페노사이드의 ACC에 대한 효과

ACC는 다양한 조직, 특히 간과 근육 조직에서 지질 대사를 조절하는 중요한 효소이다. 이 효소는 아세틸-코-에이를 카르복실화시켜 미토콘드리아 외부막에 있는 CPT-1의 활성을 저해하는 말로닐-코에이(malonyl-CoA)를 생성하게 한다. CPT-1의 활성 은 미토콘드리아 안에서 지방산 산화의 율속단계 (rate-limiting step)라고 알려졌다 (Lehninger, 2000). ACC는 AMPK 키나제(kinase)의 기질 단백질 중의 하나이다 (Fryer, 2002). 근육이 수축하면, 근육세포는 지방산의 연소를 통해 더 많은 ATP를 제공하기 위해서 AMPK의 활성을 촉진시킨다(Vavvas, 1997). 그러므로 AMPK에 활성에 의한 ACC의 불활성화는 지방산을 감소시킬 수 있는 중요한 연구 목표점이 된다.

L6 미요튜브 세포에 가이페노사이드와 AICAR를 처리하였다. 가이페노사이드 처리는 ACC의 79번 째 세린 잔기를 인산화 하였다(도 8). ACC 인산화는 60 μg/mL의 가이페노사이드에서 최고치에 이루었다. AICAR 처리는 또한 ACC의 인산화를 증가시켰지만, 30 μg/mL의 가이페노사이드 처리에서 관찰되는 그 인산화 정도보다는 약간 더 적게 나타났다. 인슐린은 인산화에 영향을 미치지 않는다. 이러한 결과는 근육 세포에서의 가이페노사이드의 처리는 분자수준에서의 근육 수축현상과 흡사하다는 것을 의미한다. AKT (PKB) 인산화는 인슐린의 신호가 PI3K로 전달된다. 근육세포에서의 가이페노사이드의 처리가 AKT 활성에 영향을 미치는지 여부를 조사하였다(도 8). 가이페노사이드 또는 AICAR 모두 AKT의 활성에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다 (도 8). 양성 대조군인 인슐린은 AKT의 활성을 상당히 증가시켰다. 이 실험은 가이페노사이드에 의해 자극된 GLUT4의 이동(도 3 및 도 4에 상술된 것처럼)이 인슐린 신호 전달방법과 관련되지 않는 것으로 나타났고 오히려 근육 수축과정과 흡사하다.

실시예 5. 가이페노사이드는 IKK 의 활성을 억제함으로써 근육세포에서의 인슐린 저 항성을 감소시킨다.

인슐린 저항성은 2형 당뇨병 및 고혈압을 포함하는 대부분의 대사 증후군 중에서 가장 중요한 대사 이상이다. 그 증거로는 인슐린 저항성의 위험을 약화시키는 것은 심장혈관질환이 감소된다는 것이다 (Reaven, 2005). 그러므로, 골격 근육, 간 및 지방세포와 같은 인슐린 민감성 조직에서 인슐린 저항성의 완화는 건강을 개선시킬 수 있다. 인슐린 민감성 조직 중에서의 인슐린 저항성을 유발하는 분자생물학적 기전은 다양한 것으로 알려져 있다. 그러나 최종 타겟은 대부분 IRS1의 세린 잔기의 인산화와 연관이 있다. 근육세포에서 인슐린 저항성에 관한 두 가지 중요한 매개 분자로서 인산화 효소들인 IKKβ 및 JNK이 있다.(Gual, 2005)

근육세포의 인슐린 저항성에서 대체로 IRS1의 307번 째 세린 잔기의 인산화가 발견된다. BSA만을 처리한 것과 비교하여, 지방산이 결합된 BSA를 처리한 세포의 IRS1에서의 307번째 세린 잔기의 인산화 정도가 약간 증가하였다. 세포 상에서 60 μg/mL의 가이페노사이드 처리시 IRS1의 307번째 세린 잔기의 인산화 정도를 현저하게 감소시켰다 (도 9). IRS1의 307번째 세린 잔기 인산화의 감소는 인슐린 신호분자인 PI3K가 IRS1쪽으로 접근하기 용이하게 하여 세포가 인슐린에 민감하게 한다. 비록 가이페노사이드가 직접적으로 근육세포에의 인슐린 민감성을 증가시키지는 않지만, 본 발명의 증거는 가이페노사이드가 근육세포에서의 인슐린 저항성을 감소시킬 수 있음을 의미한다.

가이페노사이드에 의한 인슐린 저항성 개선에 대한 분자적 기전을 조사하였다. IRS1의 세린 인산화를 위한 두 인산화 효소 (IKK 복합체 및 JNK)가 잘 알려져 있다 (Gao, 2002). 최근 간 및 지방 조직에서 비만-유래 인슐린 저항성의 유발을 JNK가 매개한다고 보고되었다(Ozcan, 2004). IKKβ는 IRS 뿐만 아니라 I-kB 도 인산화하는 것으로 보고되었다 (Itani, 2002). IRS의 세린 인산화는 인슐린 저항성과 직접적으로 연관되어 있고, I-kB의 인산화는 조직의 염증반응에 중요한 요소인 NF-kB를 유리시킨다. 몇몇 연구자들은 제2형 당뇨병을 만성 염증성 질환으로 간주하였다 (Dandona, 2004; Sinha, 2004). 가이페노사이드가 NF-kB의 활성을 억제함으로써 단핵구에서 LPS에 의해서 유도된 염증을 감소시키는 것으로 알려졌기 때문에(Aktan, 2003), 가이페노사이드에 의한 감소된 IRS1의 세린 인산화가 IKK의 활성과 연관이 있는지 여부를 조사하였다.

N이 연결된(N-linked) 글리코실화(glycosylation)를 억제하는 것으로 알려진 항생물질인 튜니카마이신을 처리하게 되면 세포가 인슐린 저항성을 나타낸다(Ozcan, 2004). L6 세포에 튜니카마이신을 처리한 후 IKKβ의 인산화에 대한 가이페노사이드의 효과를 측정하였다. 세포질의 분획을 하고, SDS-PAGE 실시 후 나이트로셀룰로즈막에 면역블라팅(immunoblotting)하였다. 상기 막을 인산화 IKKβ (S¹⁷⁷ ^/181) 항체, 인산화 IRS1 (S³⁰⁷) 항체 및 인산화 SAPK/JNK (T¹⁸³) 항체와 반응시켰다. 가이페노사이드의 처리에 의하여, IRS1의 307번 째 세린 잔기의 인산화가 현저하게 감소하였다 (도 10, 상위 페널의 레인 3 및 4). AICAR와 인슐린은 IKKβ의 인산화를 약하게 감소시켰다. 인슐린에 저항성이 있는 환자의 근육조직에서 IRS1의 세린 잔기(307) 인산화는 IKKβ와 JNK의 활성에 매개된다고 보고되었다. 그러므로 가이페노사이드에 의한 감소된 IRS1의 세린 잔기 인산화가 IKKβ 및 JNK 활성과 관련되어 있는지 여부를 조사하기 위해 실험을 수행하였다. 상기 세포에서의 두 인산화 효소의 활성은 가이페노사이드의 처리에 의해 뚜렷하게 감소하였다.

래트 혈관 평활근세포(smooth muscle cell)에 염증을 유도하는 것으로 알려진 고농도의 포도당 배지에 배양된 혈관 평활근세포에 가이페노사이드를 처리하였다 (Hattori, 2000). IKKβ의 활성을 측정하기 위하여, IKKβ의 기질단백질인 I-kB의 인산화 수준을 조사하였다. 통상적으로 잘 알려진 방법으로 핵(nucleus)을 분획 한 후, 마이크로좀을 제거하고 원심분리에 의해서 세포질을 분획하였다. 개개 시료로부터 얻은 동량의 단백질을 SDS-PAGE 하였다. 니트로셀루로즈 멤브레인에 블라팅 후 인산화 I-kB (32번 세린 잔기) 항체로 반응시켰고, 핵 분획은 NF-kB의 서브유닛(subunit)인 p65에 대한 면역블라팅을 수행하였다.

고농도의 포도당 처리는 정상 농도의 포도당을 처리한 것과 비교하여 IKK의 인산화를 약간 증가시켰고 이는 고수준의 포도당이 IKK 활성을 촉진시킴을 의미한다.

가이페노사이드를 10 μg/mL 수준으로 처리한 세포에서는 I-kB의 인산화에 영향을 미치지 않았으나, 가이페노사이드를 30 μg/mL 수준으로 처리한 세포에서는 I-kB의 인산화가 현저하게 감소하였으며, 이 실험 결과는 IKK의 활성이 감소되었음을 의미한다 (도 11, 좌측 페널). 또한 가이페노사이드를 30 μg/mL 처리한 세포의 핵 분획에서 NF-kB의 함량이 현저하게 감소되었다. (도 11, 우측 페널) 이 실험 결과에서 인슐린 저항성이 유발된 세포를 가이페노사이드로 처리하면 IKK의 활성을 억제 함으로서 인슐린 저항성을 완화할 수 있음을 밝혀준다.

L6 근육세포를 가이페노사이드를 처리한 후 JNK의 활성에 대한 영향에 대하여 실험하였다. 용량-의존적으로, 가이페노사이드는 JNK의 활성을 감소시켰다. (도12) AICAR 또는 인슐린을 처리한 세포에서는 JNK의 활성에 변화가 없었다. 이 실험들의 결과를 종합해 보면, 가이페노사이드의 처리는 인슐린 저항성의 중요한 생화학적 현상인 IRS의 세린 잔기를 인산화하는 IKKβ and JNK의 활성을 억제하였음을 알 수 있다.

실시예 6. 가이페노사이드(GP)는 AMPK 자극하여 포도당 흡수를 증가시킨다.

실시예 1 내지 5에서 나타낸 바와 같이, 가이페노사이드는 인슐린의 유무에 상관없이 포도당의 세포내 유입을 증가하였다. 세포내 포도당 유입을 in vitro상에서 측정하기 위해서 2-데옥시글루코오스(2-deoxyglucose) 유입 실험을 수행하였다. 2-데옥시글루코오스는 세포내에서 물질대사를 하지 않기 때문에, 세포내 포도당 유입 실험을 측정하기 위해서 방사선이 표지된 2-데옥시글루코오스를 사용하였다.

가이페노사이드가 L6 미오튜브세포에서 포도당의 유입을 증가했는지를 조사하였다. 물질을 첨가하기 전에, 고농도의 포도당은 근육세포에서의 포도당 유입을 차단하는 것으로 알려져 있기 때문에 세포를 고농도의 포도당의 존재하에 배양 하였다(Itani, 2003). 가이페노사이드 (60 μg/ml), AICAR (1 mM) 및 인슐린(100 nM) 을 세포에 각각 2시간, 1시간, 20분 동안 배양하였다. HBS(Hepes-buffered saline)으로 세척을 한 후에, 세포를 10분 동안 HBS에 용해된 2-데옥시글루코오스(10 μM)와 배양하였다. 신틸레이션 계수기(scintillation counter)로 방사선 활성을 측정하기 전에 앞서 충분한 세척을 하였다. 방사선 계수 의해 세포 유입량이 측정되었다.

이타니 (Itani et al.)에 의해 보고된 바와 같이, 고농도의 포도당은 L6세포의 디옥시글루코스 유입에 영향을 미치지 않았다 (도 13). 가이페노사이드, AICAR 및 인슐린 처리는 각각 평균적으로 24, 42 및 40% 정도 2-데옥시글루코스의 세포유입을 증가시켰다. 이 실험은 가이페노사이드가 근육세포내로의 포도당 유입을 아마도 AMPK 및/ 또는 p38 MAPK 활성에 의해서 증가할 수 있음을 나타낸다. 이는 근육 세포 내에서 가이페노사이드가 인슐린만큼 포도당 유입을 증가시키나, 다른 기전을 통하여 작용함을 증명해준다.

이와 관련하여, 가이페노사이드는 근육세포 내에서의 포도당 흡수에 대한 잠재력이 AICAR보다 큼을 알 수 있다.

상기의 실시예들에서, 가이페노사이드는 AMPK를 활성시키며 ACC의 활성을 억제함으로서 가이페노사이드에 의해 β-산화를 증가시키는 환경을 조성함을 암시하고 있다. 간암 세포주 HepG2에 가이페노사이드를 처리하여 β-산화 속도가 증가하 는지 여부를 선행한 기술에 따라 수행하였다 (Singh, 1994). 가이페노사이드를 처리한 세포는 처리를 하지 않은 대조군에 비교하여 70%의 β-산화의 현저한 증가를 나타냈다 (도 14). 실험결과, 가이페노사이드가 적정조건하에서 체지방량을 줄일 수 있음을 확인하였다.

실시예 7

기능성 렙틴(leptin) 수용체가 결여된 db / db 생쥐를 비만, 고혈당 및 인슐린 저항성 모델로서 사용하였다. 생쥐는 일반 사료 식이를 섭취하였다. 가이페노사이드 및 양성 대조군으로서 사용된 글루코반스(Glucovance; 임상 승인 의약품)를 명시된 비율로 일반 사료 식이와 미리 섞어 제공하였다. 식이는 임의로(ad libitum) 제공되었다. 각 실험군은 생쥐 10 마리로 구성되었으며 적응기간 동안 채혈하여 혈당을 측정하였다. 경구 투여를 8주간 지속하였다. 희생시키는 시점에서, 글루코반스를 투여한 동물군은 처리를 하지 않은 그룹에 비하여 평균 22%의 체중 감소를 보였으며, 가이페노사이드를 투여한 동물군은 12% 체중 감소를 나타내었다 (표 1). 그룹간의 식이 섭취량에는 차이가 없었다. 가이페노사이드를 투여한 동물군은 감소된 체중 증가를 보였다.

[표 1]

동물군	체중	체중 (g)
대조군	38.05 ± 1.61 ^a	4.29 ±0.10 ^NS
글루코반스 (0.02%)	29.75 ±1.09 ^c	4.32 ±0.11 ^NS
가이페노사이드 - 0.01%	33.80 ±0.80 ^b	4.59 ±0.13 ^NS
가이페노사이드 - 0.02%	33.56 ±1.14 ^b	4.27 ±0.10 ^NS
^abc그룹간 동일하지 않은 문자의 그룹은 유의성을 나타낸다 (p<0.05). ^NS그룹간의 유의성이 없음을 나타낸다 (p<0.05).

가이페노사이드를 투여한 동물군에서 현저한 체중 감소를 나타냈으므로 이러한 체중 감소가 지방 조직 함량의 변화와 연관지을 수 있을지의 여부를 조사하기 위해 지방 조직 함량을 측정하였다. 표 2에서 보는 바와 같이 상기의 동물들의 체중 감소는 일부 부고환(epididymal) 및 신장 주위의 지방조직(perirenal fat tissues) 함량의 감소에 기인한 것을 보여주고 있다. 가이페노사이드를 투여한 생쥐들은 각각 처리를 하지 않은 동물군과 비교하여 14 내지 15% 및 35 내지 38%의 부고환 및 신장 주위의 지방조직 함량의 감소를 보여준다. 상기의 지방조직의 무게 감소는 AMPK의 활성, 결과적으로 베타 산화의 증가와 연관이 있을 것이다.

[표 2]

동물군	부고환 지방조직 (g/40g B.W)	신장주위 지방조직 (g/40g B.W)
대조군	2.00 ±0.09 a	1.05 ±0.07 a
글루코반스 (0.02%)	1.75 ±0.08 b	0.72 ±0.02 b
가이페노사이드 - 0.01%	1.72 ±0.06^b	0.68 ±0.03^b
가이페노사이드 - 0.02%	1.70 ±0.02^b	0.65 ±.03 ^b
^ab그룹간 동일하지 않은 문자의 그룹은 유의성을 나타낸다 (p<0.05).

혈당 수치를 측정하기 위해 2주 마다 채혈을 실시하였다. 희생 하루 전날, 당 처리율(glucose disposal rate)이 결정되는 내당성 시험(glucose tolerance test)을 위하여 동물들은 16시간 금식시켰다. 요약하면, 포도당(0.5 g/kg 체중)을 각 개체마다 복강내 투여하였으며, 투여 후 규정된 시간에 혈당 수치를 측정하였다.

가이페노사이드를 투여한 동물군의 개선된 내당성을 나타내었다.(도 15). 포도당 주입 1시간 후에, 가이페노사이드 0.01% 및 0.02%를 섭취한 생쥐는 대조군과 비교하여 당처리율이 각각 9.7% 및 11.8% 개선되었다. 이러한 개선효과는 더 나아가 포도당 주입 2시간 후에는 더 향상되어, 가이페노사이드 0.01% 및 0.02%를 섭취한 생쥐는 각각 19% 및 22% 개선을 나타내었다. 반면에, 글루코반스를 투여한 동물군의 경우 포도당 주입 1시간 후에 당처리율이 개선되지 않았으나, 주입 2시간 후에는 대조군과 비교하여 10%의 현저한 개선을 나타내었다. 이 실험결과를 통해 글루코반스에 비해 가이페노사이드를 투여한 db / db 생쥐의 당처리율이 더 높음을 확인하였다.

실시예 8. 인슐린 저항성 증후군의 표지자들에 대한 가이페노사이드의 효능의 다양한 상술

가이페노사이드의 투여로 인한 이점은 희생시킨 시점에서 개선된 인슐린, C-peptide, 당화혈색소(HbA1C) 및 렙틴 수치로 하기에 상술된다.

실시예 8.1

당화 헤모글로빈(glycated hemoglobin)은 헤모글로빈과 포도당 간의 상호작용의 결과로서 생성된 특이한 물질이다. 헤모글로빈 A1C 시험은 시료를 획득하는 순간만의 혈당 수치만을 측정하는 공복혈당시험법(fasting blood sugar test)과는 상이하다.

한편, AIC 검사는 비교적 장기간에 걸친 평균 혈당 수치(blood sugar level)를 반영한다. 어떤 점에서, HbA1C 측정은 혈당 수치 측정에 의해서 결정되는 당뇨병의 상태에 대한 오인의 위험을 감소시킨다. 당화헤모글로빈 비율은 대조군과 비교하여 각각 0.01% 및 0.02% 가이페노사이드를 먹인 마우스에서 평균 17% 및 16%로 감소하였다(도 16). 비교 약물인 글루코반스(glucovance)는 의외로 HbA1c 수치를 전혀 감소시키지 못했다.

실시예 8.2

실험동물인 db / db 마우스는 선천적으로 렙틴 신호(leptin signaling)를 제대로 작동시키지 못한다. 따라서 상기 동물은 그들의 음식섭취 행동을 조절하지 못한다. 그러므로 상기 동물은 지나치게 비만이게 되며 고지혈증(hyperlipidemia), 고인슐린혈증(hyperinsulinemia) 및 고렙틴혈증(hyperleptinemia)을 나타낸다. 인슐린 저항은 혈중 인슐린 수치가 만성적으로 더 높은 상황으로 되는 손상된 신진대사 반응이다. 이 병은 비만(obesity), 고혈압(hypertension), 이상 중성지방(abnormal triglyceride), 포도당 비민감성(glucose intolerance) 및 제 2형 당뇨병(type 2 diabetes)을 수반한다. 본원 발명의 이 구현예에서, 가이페노사이드는 db / db 마우스와 관련 있는 고인슐린혈증을 완화시켰다(도 17). 실험동물에, 가이페노사이드 처리는 0.01% 및 0.02% 가이페노사이드를 먹인 군 모두에서 혈액 인슐린 수치를 거의 80%로 감소시켰다. 상기의 관찰을 종합하여 보면, 가이페노사이드의 투여는 인슐린 저항을 개선시킨다.

실시예 8.3

인슐린이 췌장의 베타 세포에 의해서 합성될 때, 그것은 하나의 큰 분자(하나의 프로펩티드)로 생산된다. 이후 이 분자는 인슐린 및 C-펩타이드의 2개로 쪼개진다. C-펩타이드의 기능은 알려지지 않았다. C-펩타이드 수치는 제 2형 당뇨병을 갖는 환자 또는 어떠한 인슐린이 여전히 생산되고 있는지 여부를 조사해야 할 질병과 관련 있는 환자에서 측정될 수 있다. 그것은 또한 사람의 몸이 너무 많은 인슐린을 생산하고 있는지 여부를 알아보기 위한 고혈당 평가(낮은 혈당)로 측정될 수 있다. 모든 동물의 군이 C-펩타이드를 생산하였다. 가이페노사이드를 먹인 군의 감소된 C-펩타이드 수치는 가이페노사이드가 인슐린을 낮추는 효과(인슐린 억제 효과)를 뒷받침 해준다(도 18).

실시예 8.4

렙틴(leptin)은 지방세포에 의해서 분비되는 식욕 억제 호르몬이다. 그러나, 대부분의 지나치게 비만인 사람들은 렙틴의 결핍이라 하기보다는 오히려 렙틴에 저항이 있다. 상기 저항성은 렙틴 신호전달 통로(leptin-signaling pathway)의 몇몇 단계에서의 기능의 상실과 관련이 있다. 혈액뇌관문(blood brain barrier)을 가로지르는 렙틴의 수송은 고중성지방에 의해서 손상되며, 이곳은 렙틴 수용체 및 그 수용체의 하류 목표물(downstream targets)의 기능이 감소되어 있다(Banks, 2004). 지방의 저장을 조절하도록 도와주는 렙틴에 대한 비반응성은 마우스에서 비만의 원인이 된다. 렙틴 저항성은 심장 질환 또는 당뇨병과 같은 더 심각한 건강 상태를 유발할 수 있다. 렙틴은 고인슐린혈증을 나타내는 ob / ob 마우스에서 비교적 높게 발현되어 있다(Mizuno, 2004). 이것을 고려하여, db / db 마우스에 가이페노사이드를 처리하였고, 가이페노사이드 처리가 혈중 인슐린 및 렙틴 수치 모두를 감소시키는지 여부를 알아보기 위해서 렙틴 수치를 측정하였다. 가이페노사이드 처리군의 렙틴 수치는 무처리 동물군과 비교하여 유의적으로 감소하였고(도 19), 그것의 작용기전은 감소된 인슐린의 수치와 관련이 있다.

실시예 9. PEPCK 어세이( assay )

간장의 포스포에놀피루브산카르복시인산화효소 (phosphoenolpyruvate carboxykinase, PEPCK)는 포도당신생의 율속단계이다. PEPCK가 간에 과발현될 때, 간 조직은 인슐린에 덜 민감해지며 이것은 높은 인슐린 수치에도 불구하고 더 많은 포도당이 생산됨을 나타낸다(Sun, 2002). 로크해드(Lochhead) 등은 AICAR가 인슐린 과 같이 PEPCK 및 포도당(glucose)-6-인산화효소(phosphotase)를 하향 조절함을 증명하였다(Lochhead, 2002). 간조직의 PEPCK 활성은 AICAR로 관찰하였을 때처럼 가이페노사이드가 상기의 효소활성에 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위해서 측정하였다. 포화된 포스포에놀피루브산의 존재 하에서 균질화된 간 조직에서의 옥살로아세트산(oxaloacetate) 생산을 측정하였을 때, 간에 처리시에 25% 이하의 적은 활성을 나타낸 가이페노사이드를 대조군 동물과 비교하여 평가하였으며(도 20), 이것은 가이페노사이드가 AMPK 활성을 활성화시킴으로써 포도당신생을 조절할 수 있음을 증명한다.

실시예 10. 가이페노사이드가 투여된 동물은 증가된 AMPK 활성 및 IRS1 에서의 감소된 세린 인산화를 나타냈다.

최종적으로, 실험동물의 골격근에서의 AMPK 활성을 실험하였다. 동시에 실험동물의 골격근 조직이 가이페노사이드 처리에 의한 세포 실험에서 나타난 것처럼 감소된 IRS 세린 인산화를 보이는지 여부를 또한 조사하였다. 가이페노사이드가 처리된 동물의 골격근 조직은 증가된 AMPK 활성과 낮은 인산화(phospho)-IRS의 수치를 보였으며, 이것은 가이페노사이드 투여가 실험동물의 인슐린 저항 상태를 개선시켰음을 나타낸다(도 21).

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본원에서 인용되는 상기한 모든 참고자료들은 그 전체로서 단지 참고로 인용된다.

상기한 바와 같이, 돌외(Gynostemma pentaphyllum) 추출물 또는 이로부터 분리되는 가이페노사이드(gypenoside)는 AMPK 활성을 촉진시키고, ACC(acetyl CoA carboxylase)의 활성을 불활성화시켜, β-산화를 증가시킴으로서 체지방/지질을 감소시키므로 인슐린 저항성 증후군, 비만 또는 고지혈증의 치료 및 예방용 조성물로 유용하다.

Claims

치료학적으로 돌외 추출물을 유효성분으로 함유하는 인슐린 저항성 증후군, 비만, 체지방 감소 및 고중성지방혈증의 치료용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 가이페노사이드의 함량은 0.5-10% 의 중량을 포함하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 가이페노사이드의 함량은 약 10 - 2000 μg/ml을 포함하는 조성물.
치료학적 유효성분의 제 1항의 조성물을 인슐린 저항성 증후군, 비만/과체중 또는 고중성지방혈증으로 고통받는 환자에게 투여함을 포함하는 인슐린 저항성 증후군, 비만/과체중 또는 고중성지방혈증을 치료하는 방법.
제 4항에 있어서, 상기 추출물의 양은 10mg 내지 30mg/일인 방법.
제 5항에 있어서, 상기 추출물의 양은 약 0.5 mg 내지 5 mg/일인 방법.
치료학적 유효성분의 제 1항의 조성물로부터 분리되는 가이페노사이드를 인슐린 저항성 증후군, 비만/과체중, 체지방 감소 및 고중성지방혈증으로 고통받는 환자에게 투여함을 포함하는 인슐린 저항성 증후군, 비만/과체중, 체지방 감소 및 고중성지방혈증을 치료하는 방법.
제 7항에 있어서, 상기 가이페노사이드의 양은 1mg 내지 1000mg/일인 방법.
제 8항에 있어서, 상기 가이페노사이드의 양은 10mg 내지 800mg/일인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은, 온천수, 여과수, 증류수, 탄산수, 쥬스, 요구르트, 우유, 식용유 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 액상 담체를 포함하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은, 아이스크림, 햄버거, 시리얼, 쿠키, 빵, 케이크, 비스켓, 가공육 또는 이들의 조합과 같은 식품 첨가제의 형태로 포함되는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은, 방부제, 감미료, 향미제, 착색제, 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은, 정제 형태로 제형화되는 조성물.
제 13 항에 있어서, 상기 정제는 충전제, 결합제, 코팅제, 희석제 또는 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 기재로부터 제조되는 조성물.
제 14 항에 있어서, 상기 정제의 기제는 식물성 셀룰로오스, 천연 실리카, 스테아르산 마그네슘, 왁스, 식물성 글리세리드, 식물성 스테아르산 또는 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 또한 글리타존(glitazones), 파이브레이트(fibrates), 스타틴(statins), 비구아나이드(biguanides), 설포닐우레아(sulfonylurea) 화합물, 아데닌 뉴클레오타이드 (adenine nucleotides) 또는 이들의 유도체 및 약학적으로 허용되는 이들의 염으로 구성되는 군으로부터 선택되는 조성물.
3T3-L1 세포의 세포 지방화 증진 활성을 갖는 무독성 AMPK 활성제를 선택하는 방법.