TWI714918B - 桑黃屬桑黃株及其產物、萃取物及應用 - Google Patents

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陳慶源
袁國芳
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Abstract

本發明係關於桑黃屬之液體發酵物或桑黃屬之萃取物的製備、從該液體發酵物或該萃取物鑑定的化合物及其新穎活性。

Description

桑黃屬桑黃株及其產物、萃取物及應用
本發明係關於治療或預防雌激素依賴性病狀之微生物之領域。特定言之，本發明提供桑黃屬桑黃株、桑黃屬桑黃株萃取物之製備、從該萃取物鑑定之化合物及該等化合物之新穎活性。
雌激素受體(estrogen receptor，「ER」)為經由其與內源性雌激素之相互作用來介導多種生物效應之誘導的配體活化轉錄調節蛋白。已發現ER具有兩種同功異型物：ERα (α)及ERβ (β)。已發現該兩種同功異型物分佈在不同組織中。ERα主要分佈在乳房、卵巢及子宮中；而ERβ分佈在骨骼、肺、內皮細胞、前列腺及其他組織中。兩種同功異型物對雌激素均具有高親和力，但是對來自其他來源之某些類似物的親和力顯著不同。選擇性雌激素受體調節劑(Selective Estrogen Receptor Modulator，SERM)在結構上及在功能上類似於雌激素，但是其對不同雌激素受體之反應係不同的，因此能夠調節不同器官中之不同ER。理想的SERM應該具有類似雌激素的作用，以便其能夠在乳腺、子宮等中產生拮抗作用，且在心血管系統、骨骼及中樞神經系統中產生促進作用。此等差異使得SERM能夠在不同組織中造成不同的生理影響(Paterni, I., Granchi, C., Katzenellenbogen, J.A., Minutolo, F., (2014) Estrogen receptors alpha (ERα) and beta (ERβ): subtype-selective ligands and clinical potential.Steroids . pii S0039-128X (14), 00151-00152.)。
菇類(大型真菌)已累積多個世紀且一直被作為天然生物活性次級代謝物的傳統來源而受到重視。藥用菇類，諸如靈芝(Ganoderma lucidum )、裂蹄木層孔菌(Phellinus linteus )及變色栓菌(Trametes versicolor )，在傳統的亞洲治療中具有確定的使用歷史，且已報導過許多新穎的生物活性化合物。雖然已對一些藥用物種進行很好的研究，但仍有許多物種未深入研究。
桑黃屬桑黃(Sanghuangporus sanghuang )分佈在中國大陸、日本、韓國、緬甸及臺灣，僅生長在桑樹上，且在野外非常罕見。桑黃屬桑黃及此屬中之其他物種仍未進行化學探究。
本發明之一個態樣為提供一種用於製備桑黃屬液體發酵物或桑黃屬萃取物的方法。
本發明之另一態樣為提供一種用於製備
Figure 02_image001
(化合物1)及
Figure 02_image003
(化合物2)的方法。
本發明之另一態樣為提供一種可自本發明方法獲得之桑黃屬液體發酵物或桑黃屬萃取物。
本發明之另一態樣為提供一種醫藥組合物，其包含本發明之桑黃屬液體發酵物或桑黃屬萃取物及醫藥學上可接受之載劑。
本發明之另一態樣為提供一種用於預防或治療有需要之受試者之雌激素依賴性病狀、疾病、病症或症候群的方法，該方法包含向受試者投與本發明之萃取物或醫藥組合物。
本發明之另一態樣為提供一種用於預防或治療有需要之受試者之雌激素依賴性病狀、疾病、病症或症候群的方法，該方法包含向受試者投與治療有效量之本發明之液體發酵物。
本發明之另一態樣為提供一種用於預防或治療有需要之受試者之雌激素依賴性病狀、疾病、病症或症候群的方法，該方法包含向受試者投與治療有效量之選自化合物1或化合物2的化合物。
本發明之另一態樣為提供一種用於篩選具有ER活性之化合物的方法，該方法包含以下步驟： (a)         提供表現雌激素反應元件(ERE)及報導基因之轉染細胞； (b)        在該化合物、陽性對照或陰性對照存在下培養該等轉染細胞；及 (c)         量測該轉染細胞中報導基因之活性； 其中與該陰性對照相比該報導基因之升高的活性指示該化合物具有ER活性，且其中該陽性對照為如上文所定義之化合物1或化合物2。
本發明之另一態樣為提供一種桑黃屬桑黃38847，其在2018年8月29日根據布達佩斯條約(Budapest Treaty)寄存於德國微生物菌種保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，DSMZ)並指定為寄存號碼DSM 32914，並在2018年11月6日以寄存號碼BCRC 930200寄存於食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute，FIRDI)之生物資源保存及研究中心(Biosource Collection and Research Center，BCRC)。
本發明之又一態樣為提供本發明之桑黃屬液體發酵物或萃取物或醫藥組合物在製造用於預防或治療雌激素依賴性病狀、疾病、病症或症候群之藥劑方面的用途。
本發明之又一態樣為提供如上文所定義之化合物1或化合物2在製造用於預防或治療雌激素依賴性病狀、疾病、病症或症候群之藥劑方面的用途。
在以下部分中詳細描述本發明。本發明之其他特徵、目的及優勢可以在本發明之實施方式及申請專利範圍中容易地找到。
定義
除非本文中另外定義，否則結合本發明使用之科學與技術術語應具有一般技術者通常理解之含義。術語之含義及範疇應為清楚的；然而，倘若存在任何潛在的歧義，則本文中提供之定義優先於任何字典或外部定義。
除非上下文另外需要，否則單數術語應包括複數，且複數術語應包括單數。例如，如本文中所使用之術語「一(a)」或「一個(an)」定義為一個或多於一個。
除非明確指示僅指替代物或替代物為相互排斥的，否則術語「或」在申請專利範圍中用於意謂「及/或」。
範圍在本文中表述為從「約」一個特定值及/或至「約」另一特定值。在表述此類範圍時，一個實施例包括從一個特定值及/或至另一特定值之範圍。同樣地，當藉由使用「約」字將值表示為近似值時，應理解特定值形成另一實施例。將進一步理解，範圍中之每一者之端點相對於及獨立於另一端點均為有意義的。如本文中所用之術語「約」係指± 30%，較佳± 20%，更佳± 10%，且甚至更佳± 5%。
如本文中所使用之術語「桑黃屬」係指桑黃屬之任何物種。
如本文中所使用之術語「次級代謝物」係指衍生自由真菌產生之初級代謝物的化合物，其並非初級代謝物且不是生長所必需的。
如本文中所使用之術語「萃取物」係指在樣品製備過程期間獲得且包含活性(先導)化合物的所有可能的萃取物。該萃取物可以採用液體、固體或粉末形式。
如本文中所使用之術語「活性萃取物」係指展現出所要生物活性的所有可能的萃取物。本發明之此類活性萃取物之實例包括(但不限於)粗萃取物、液體發酵物、管柱層析級分、經高效液相層析(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)純化之級分、經薄層層析(thin layer chromatography，TLC)純化之級分等。
如本文中所使用之術語「溶劑」係指能夠溶解另一種物質之碳基液體。
如本文中所使用之術語「非極性溶劑」係指極性指數不超過約2.0的任何有機溶劑。此類非極性溶劑之實例包括(但不限於)己烷、石油醚、四氯化碳及其混合物。
如本文中所使用之術語「極性溶劑」係指極性指數大於約2.0且通常容易與水混溶的任何有機溶劑。此類中等極性溶劑之實例包括(但不限於)甲醇、乙醇、乙腈及其混合物。
如本文中所使用之術語「矽膠」係指以合成方式從矽酸鈉製得的顆粒狀、玻璃狀、多孔形式的二氧化矽。矽膠含有奈米多孔二氧化矽微結構，懸浮於液體內部。
如本文中所使用，如本文中所使用之術語「溶離溶液」係指用於從管柱層析、離子交換樹脂等溶離萃取物的溶液。
如本文中所使用之術語「預防」係指延遲易感受試者之症狀發作，減少病症或病狀的發生，或抑制病症或病狀的發生，或阻止病症或病狀的發展。
如本文中所使用之術語「治療(treating)」或「治療(treatment)」係指緩解、減輕、逆轉及/或改善易感受試者之病症或病狀或其一或多種症狀，或停止該疾病或病狀之症狀。
如本文中所使用之術語「受試者」係指動物，尤其是哺乳動物。在一個較佳實施例中，術語「受試者」表示人類。
如本文中所使用之術語「治療有效量」係指單獨使用或與其他用於預防或治療牙周炎之治療/藥劑組合使用的活性成分之展現治療功效的量。
如本文中所使用之術語「醫藥學上可接受之載劑」係指溶劑、稀釋劑、黏合劑、黏著劑、佐劑、賦形劑、受體、穩定劑、類似物、調味劑、甜味劑、乳化劑或防腐劑，其為一般熟習此項技術者所熟知，用於製造醫藥或膳食組合物。醫藥學上可接受之載劑之實例包括(但不限於)水、鹽水、緩衝劑及惰性無毒固體。
如本文中所使用之術語「投與(administering)」或「投與(administration)」係指可用於實現本發明之組合物或藥劑至所要生物學作用位點之遞送的方法。
如本文中所使用之術語「病狀」、「疾病」、「病症」或「症候群」可互換使用。桑黃屬之來源
桑黃屬物種之實例包括(但不限於)小囊桑黃(Sanghuangporus microcystideus )、環區桑黃(Sanghuangporus zonatus )、暴馬桑黃(Sanghuangporus baumii )、桑黃屬桑黃(Sanghuangporus sanghuang )、小孔忍冬桑黃(Sanghuangporus lonicericola )、楊樹桑黃(Sanghuangporus vaninii )、韋爾桑黃(Sanghuangporus weirianus )、高山桑黃(Sanghuangporus alpinus )及錦帶花桑黃(Sanghuangporus weigelae )。
在本發明之一個較佳實施例中，桑黃屬為桑黃屬桑黃。製備過程及可從該等製備過程獲得之萃取物
本發明提供一種培養擔子菌桑黃屬桑黃以產生各種次級代謝物的方法。
本發明提供一種用於製備桑黃屬桑黃之液體發酵物的方法，該方法包含在培養液中在適合桑黃屬之條件下培養桑黃屬。
本發明提供一種用於製備桑黃屬萃取物之方法，該方法包含以下步驟： (a)       藉由在培養液中培養桑黃屬而獲得桑黃屬液體發酵物；及 (b)      藉由將該桑黃屬液體發酵物與醇混合而獲得該桑黃屬萃取物。
本發明提供一種用於製備
Figure 02_image005
(化合物1)及
Figure 02_image007
(化合物2)之方法，該方法包含以下步驟： (a)         藉由在培養液中在適合桑黃屬之條件下培養桑黃屬而獲得桑黃屬液體發酵物； (b)        藉由將該桑黃屬液體發酵物與醇混合而獲得醇溶性萃取物； (c)         對該醇溶性萃取物進行矽膠管柱層析； (d)        藉由用溶離溶液溶離該管柱而獲得不同溶離液；及 (e)         藉由薄層層析(二氯甲烷:丙酮：40:1)收集第一溶離級分及第二溶離級分，其中該第一溶離級分包含該化合物1且該第二溶離級分包含該化合物2。
在本發明之步驟(b)中，醇為甲醇、乙醇或正丁醇。
在本發明之步驟(d)中，管柱係用二氯甲烷/乙酸乙酯(1:1)溶離。
在本發明之步驟(d)中，管柱係用2×、3×、4×或5×管柱體積之二氯甲烷/乙酸乙酯(1:1)溶離。
在本發明之步驟(d)中，管柱依序用二氯甲烷/乙酸乙酯(1:1)、二氯甲烷/乙酸乙酯/甲醇 (1:1:0.5)及二氯甲烷/乙酸乙酯/甲醇 (1:1:1)溶離。
在本發明之步驟(d)中，管柱依序用2×、3×、4×或5×管柱體積二氯甲烷/乙酸乙酯(1:1)、2×、3×、4×或5×管柱體積二氯甲烷/乙酸乙酯/甲醇 (1:1:0.5)及2×、3×、4×或5×管柱體積二氯甲烷/乙酸乙酯/甲醇 (1:1:1)溶離。
在一個實施例中，在步驟(d)之後，其進一步包含濃縮該溶離級分及/或乾燥該級分以獲得膏體或固體發酵物的步驟。
在本發明之步驟(e)中，溶離緩衝液為二氯甲烷:丙酮(10:1)、二氯甲烷:丙酮(20:1)、二氯甲烷:丙酮(30:1)、二氯甲烷:丙酮(40:1)、二氯甲烷:丙酮(50:1)或二氯甲烷:丙酮(60:1)。
在一些實施例中，溶劑為非極性溶劑或極性溶劑。根據本發明，所用矽膠可為矽膠60 GF254、矽膠60 (小於0.063 mm)、矽膠60 (0.2-0.5 mm)、矽膠60 (0.063-0.200 mm)、矽膠60特純、矽膠60 (0.040-0.063 mm)、矽膠60 (35-70 mm)或矽膠60 F254 (0.063-0.200 mm)。
根據本發明，管柱層析中所用之溶離溶液可以包括(但不限於) 二氯甲烷/乙酸乙酯、二氯甲烷/乙酸乙酯/甲醇、正己烷/乙酸乙酯、二氯甲烷:丙酮、甲醇、乙醇及乙醇/乙酸乙酯。
在本發明之一個實施例中，二氯甲烷/乙酸乙酯溶劑中二氯甲烷與乙酸乙酯之間的體積比、正己烷/乙酸乙酯溶劑中正己烷與乙酸乙酯之間的體積比及乙醇/乙酸乙酯溶劑中乙醇與乙酸乙酯之間的體積比可為95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90及95:5。在本發明之一個較佳實施例中，所用二氯甲烷/乙酸乙酯溶劑之比率為50:50。
在本發明之一個實施例中，二氯甲烷/乙酸乙酯/甲醇之體積比可為1:1:0.3、1:1:0.4、1:1:0.5、1:1:0.6、1:1:0.7、1:1:0.8、1:1:0.9、1:1:1、1:0.3:1、1:0.4:1、1:0.5:1、1:0.6:1、1:0.7:1、1:0.8:1、1:0.9:1、0.3:1:1、0.4:1:1、0.5:1:1、0.6:1:1、0.7:1:1、0.8:1:1或0.9:1:1。
本發明亦提供一種獲自上文所描述之製程的桑黃屬液體發酵物或桑黃屬萃取物。
在本發明之一個實施例中，桑黃屬液體發酵物或桑黃屬萃取物包含
Figure 02_image009
及/或
Figure 02_image011
。
本發明亦提供包含化合物1
Figure 02_image013
及化合物2
Figure 02_image015
之組合物。桑黃屬之培養條件
根據一個實施例，桑黃屬桑黃係在麥芽萃取物瓊脂(malt extract agar，MEA)培養基上培養6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天或30天。
桑黃屬桑黃菌落 (6至21天)係在含有液體培養基之培養三角瓶中在22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃下培養7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天或21天。
該液體培養基包含玉米澱粉、玉米漿(corn steep liquor)、酵母萃取物、pH約5.8-6.3之海鹽蒸餾水。ER 平台
本發明提供一種用於篩選具有雌激素受體(ER)活性之化合物的方法，該方法包含以下步驟： (a)         提供表現雌激素反應元件(ERE)及報導基因之轉染細胞； (b)        在該化合物、陽性對照或陰性對照存在下培養該等轉染細胞；及 (c)   量測該轉染細胞中報導基因之活性； 其中與該陰性對照相比該報導基因之升高的活性指示該化合物具有ER活性，且其中該陽性對照為
Figure 02_image017
(化合物1)及/或
Figure 02_image019
(化合物2)。
在本發明之一個實施例中，ERE為5'-GGTCAnnnTGACC-3' (其中n為A、T、C或G) (SEQ ID NO: 7)。
在本發明之一個實施例中，報導基因可為鹼性磷酸酶(SEAP)、β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯轉移酶、綠色螢光蛋白(green fluorescent protein，GFP)或紅色螢光蛋白(red fluorescent protein，RFP)。組合物
根據一個實施例，本發明提供一種組合物，其包含治療有效量之可自本發明之製造方法獲得的桑黃屬萃取物及醫藥學上可接受之載劑。
口服組合物一般包括惰性稀釋劑或可食用載劑。口服組合物可為液體，或可以封裝於明膠膠囊中或壓縮成錠劑。可包括醫藥學上相容之黏合劑及/或佐劑材料作為口服組合物之一部分。錠劑、丸劑、膠囊、糖衣錠及其類似物可含有以下成分或具有類似性質之化合物中的任一者：黏合劑，諸如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑，諸如澱粉或乳糖；崩解劑，諸如褐藻酸、澱粉羥基乙酸鈉(Primogel)或玉米澱粉；潤滑劑，諸如硬脂酸鎂或斯特羅特斯(Sterotes)；滑動劑，諸如膠狀二氧化矽；甜味劑，諸如蔗糖或糖精；及/或調味劑，諸如胡椒薄荷、水楊酸甲酯或橙味調味劑。經黏膜投藥可經由使用鼻噴霧劑或栓劑而實現。對於經皮投藥，通常將活性化合物調配成如此項技術中熟知的軟膏、油膏、凝膠或乳膏。
該組合物可以習知製劑形式向患者經口或非經腸投與，習知製劑形式諸如膠囊、微囊、錠劑、顆粒劑、散劑、糖衣錠、丸劑、栓劑、注射劑、懸浮液及糖漿。適合調配物可藉由常用方法使用諸如以下之習知有機或無機載劑來製備：賦形劑(例如蔗糖、澱粉、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、葡萄糖、纖維素、滑石、磷酸鈣或碳酸鈣)、黏合劑(例如纖維素、甲基纖維素、羥甲基纖維素、聚丙基吡咯啶酮、聚乙烯吡咯啶酮、明膠、阿拉伯膠(gum arabic)、聚乙二醇、蔗糖或澱粉)、崩解劑(例如澱粉、羧甲基纖維素、羥丙基澱粉、經低取代之羥丙基纖維素、碳酸氫鈉、磷酸鈣或檸檬酸鈣)、潤滑劑(例如硬脂酸鎂、輕質無水矽酸、滑石或月桂基硫酸鈉)、調味劑(例如檸檬酸、薄荷腦、甘胺酸或橙粉)、防腐劑(例如苯甲酸鈉、亞硫酸氫鈉、對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯)、穩定劑(例如檸檬酸、檸檬酸鈉或乙酸)、懸浮劑(例如甲基纖維素、聚乙烯吡咯啶酮或硬脂酸鋁)、分散劑(例如羥丙基甲基纖維素)、稀釋劑(例如水)及基礎蠟(例如可可脂、白凡士林或聚乙二醇)。在一些實施例中，本發明之組合物可以採用半固體或固體形式，諸如牙膏、凝膠潔牙劑、牙粉、假牙清潔片、口香糖或固體錠劑或類似物。效用
本發明之萃取物、粗萃取物、液體發酵物及組合物可用於預防、治療有需要之受試者之雌激素依賴性病狀、疾病、病症或症候群，或降低其風險。因此，本發明提供一種用於預防或治療有需要之受試者之雌激素依賴性病狀、疾病、病症或症候群的方法，該方法包含向受試者投與本發明之萃取物、粗萃取物、液體發酵物及組合物。
在一個較佳實施例中，該雌激素依賴性病狀、疾病、病症或症候群包括(但不限於)乳腺痛(乳房疼痛/壓痛)、乳房纖維瘤、乳房發育(乳房增大)、巨乳症(乳房肥大)、心血管疾病、中風、男性女乳症、乳癌、骨質疏鬆症、女孩早熟症、黑斑、月經過多、子宮內膜異位、子宮內膜增生、子宮腺肌症、子宮纖維瘤、子宮癌(例如，子宮內膜癌)、卵巢癌及男性高雌性素症，諸如某些病狀，如硬化及克氏症候群(Klinefelter's syndrome)。
在一個較佳實施例中，心血管疾病包括(但不限於)高血壓(hypertension) (高血壓(high blood pressure))、冠心病(心臟病發作)、腦血管疾病(中風)、周邊血管疾病、心臟衰竭、風濕性心臟病、先天性心臟病、心肌病、高血壓性心臟病、風濕性心臟病、心肌病、心律不整、心臟瓣膜病、心臟炎、主動脈瘤、血栓栓塞病及靜脈血栓形成。
在一個較佳實施例中，該組合物視情況包含適用於預防或治療雌激素依賴性病狀、疾病、病症或症候群的習知藥物或試劑。此等習知藥物或試劑之正常劑量為此項技術中所熟知。此等習知藥物或試劑包括(但不限於) SERM (諸如克羅米芬(clomifene)、奧美昔芬(ormeloxifene)、雷諾昔酚(raloxifene)、他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、拉索昔芬(lasofoxifene)及奧培米芬(ospemifene))；雌激素受體拮抗劑，諸如氟維司群(fulvestrant)；芳香酶抑制劑，諸如阿那曲唑(anastrozole)及依西美坦(exemestane)；促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)類似物，諸如亮丙瑞林(leuprorelin)及西曲瑞克(cetrorelix)；及/或其他抗促性腺激素(antigonadotropin)，諸如達那唑(danazol)、孕三烯酮(gestrinone)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)及乙酸甲羥孕酮(medroxyprogesterone acetate)。
在一個較佳實施例中，該組合物視情況包含適用於預防或治療骨質疏鬆症之習知藥物或試劑。此等習知藥物或試劑之正常劑量為此項技術中所熟知。此等習知藥物或試劑包括(但不限於)抗骨質吸收劑(antiresoptive agent) (例如，雙磷酸鹽)、核因子κB配體受體活化劑(receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand，RANKL)抑制劑、SERM (諸如克羅米芬、奧美昔芬、雷諾昔酚、他莫昔芬、托瑞米芬、拉索昔芬及奧培米芬)、同化劑(例如，特立帕肽(teriparatide))及雷奈酸鍶(strontium ranelate)。
在一個較佳實施例中，該組合物視情況包含適用於預防或治療乳癌之習知藥物或試劑。此等習知藥物或試劑之正常劑量為此項技術中所熟知。此等習知藥物或試劑包括(但不限於)阿貝馬昔布(Abemaciclib)、阿布拉生(Abraxane) (太平洋紫杉醇(Paclitaxel)白蛋白穩定之奈米粒子調配物)、曲妥珠單抗-美坦新偶聯物(Ado-Trastuzumab Emtansine)、阿飛尼妥(Afinitor) (依維莫司(Everolimus))、阿那曲唑、阿可達(Aredia) (帕米膦酸二鈉(Pamidronate Disodium))、阿麗米克斯(Arimidex) (阿那曲唑)、阿諾新(Aromasin) (依西美坦)、卡培他濱(Capecitabine)、環磷醯胺(Cyclophosphamide)、多西他賽(Docetaxel)、鹽酸小紅莓(Doxorubicin Hydrochloride)、艾倫斯(Ellence) (鹽酸表柔比星(Epirubicin Hydrochloride))、鹽酸表柔比星、甲磺酸艾日布林(Eribulin Mesylate)、依維莫司(Everolimus)、依西美坦、5-FU (氟尿嘧啶注射劑)、法樂通(Fareston) (托瑞米芬)、法洛德克斯(Faslodex) (氟維司群)、弗隆(Femara) (來曲唑(Letrozole))、氟尿嘧啶注射劑、氟維司群、鹽酸吉西他濱(Gemcitabine Hydrochloride)、健擇(Gemzar) (鹽酸吉西他濱)、乙酸戈舍瑞林(Goserelin Acetate)、哈拉溫(Halaven) (甲磺酸艾日布林)、賀癌平(Herceptin) (曲妥珠單抗(Trastuzumab))、艾博蘭斯(Ibrance) (帕泊昔布(Palbociclib))、伊沙匹隆(Ixabepilone)、艾克斯普拉(Ixempra) (伊沙匹隆)、卡德克拉(Kadcyla) (曲妥珠單抗-美坦新偶聯物)、科斯恰里(Kisqali) (瑞博昔布(Ribociclib))、二甲苯磺酸拉帕替尼(Lapatinib Ditosylate)、來曲唑、靈帕雜(Lynparza) (奧拉帕尼(Olaparib))、乙酸甲地孕酮、甲胺喋呤(Methotrexate)、順丁烯二酸來那替尼(Neratinib Maleate)、樂寧克斯(Nerlynx) (順丁烯二酸來那替尼)、奧拉帕尼(Olaparib)、太平洋紫杉醇、太平洋紫杉醇白蛋白穩定之奈米粒子調配物、帕泊昔布、帕米膦酸二鈉、帕傑它(Perjeta) (帕妥珠單抗(Pertuzumab))、帕妥珠單抗、瑞博昔布、檸檬酸他莫昔芬、紫杉醇(Taxol) (太平洋紫杉醇)、紫杉德(Taxotere) (多西他賽)、噻替派(Thiotepa)、托瑞米芬、曲妥珠單抗、曲西樂(Trexall) (甲胺喋呤)、泰克泊(Tykerb) (二甲苯磺酸拉帕替尼)、維澤尼(Verzenio) (阿貝馬昔布)、硫酸長春鹼(Vinblastine Sulfate)、希羅達(Xeloda) (卡培他濱)、諾雷德(Zoladex) (乙酸戈舍瑞林)。
提供以下實例以幫助熟習此項技術者實踐本發明。即使如此，該等實例仍不應視為對本發明的不當限制，因為一般熟習此項技術者可以在不脫離本發明之精神或範疇之情況下對本文中所論述之實施例進行修改及變化。實例 1 ：微生物材料
在此研究中所用之真菌係從桑屬物種之葉片分離，且基於rDNA內轉錄間隔區(internal transcribed spacer，ITS)序列及核糖體大次單位(large subunit，LSU)序列而被鑑定為是桑黃屬桑黃(Sanghuangporus sanghuang /S. sanghuang )。
鑑定
分析來自真菌株之rDNA ITS序列及LSU序列。下表1中顯示所用引子序列。
表1
Figure 107142648-A0304-0001
使用V9G/LR1引子組或LR5/LROR引子組按以下條件進行PCR反應：(1) 94℃，5分鐘，1個循環；(2) 94℃，30秒；50℃，1分鐘；及72℃，1分鐘，35個循環；及(3) 72℃，10分鐘，1個循環。
擴增區段ITS1-5.8S-ITS2 (643 bp)。在比較之後，發現區段ITS1-5.8S-ITS2與NCBI GenBank資料庫中之模式菌株Wu0903-1 (寄存號碼JN794061)具有99% (639/642)之序列相似性。
擴增區段LSU (877 bp)。在比較之後，發現存在兩種突變(M=A或C，Y為T或C)且區段LSU具有84.6% (720/851)之覆蓋率且與模式菌株Wu0903-1具有99% (718/720)之序列相似性。
桑黃屬桑黃38847具有以下ITS序列及LSU序列： ITS序列(SEQ ID NO: 5)：
Figure 02_image021
LSU序列(SEQ ID NO: 6)：
Figure 02_image023
Figure 02_image025
桑黃屬桑黃38847在2018年8月29日根據布達佩斯條約寄存於德國微生物菌種保藏中心(DSMZ)且分配得到寄存號碼DSM 32914，並在2018年11月6日以寄存號碼BCRC930200寄存於食品工業發展研究所(FIRDI)之生物資源保存及研究中心(BCRC)。實例 2 ：製備發酵液
將9-cm皮氏培養皿(Petri dish)中之麥芽萃取物瓊脂(MEA)培養基上的各桑黃屬桑黃38847株之21日齡菌落切割至含有200 ml蒸餾水之瓶中並摻合30秒以製備真菌接種物用於液體發酵。將10 ml真菌接種物添加至含有200 ml液體培養基(30 g玉米澱粉、10 g玉米浸漬液、5 g酵母萃取物及在1 L蒸餾水中之2 g海鹽，pH 6)之500-ml三角瓶中。將所接種之培養基在25℃下在旋轉震盪器上在100 rpm之速度下培育兩週。收穫14 L之發酵液，隨後過濾以移除真菌菌絲體，獲得發酵產物。實例 3 ：萃取及分離
用BuOH萃取自實例2獲得之桑黃屬桑黃株之發酵產物中之每一者(14 L)，得到BuOH萃取物(11.6 g)及H2 O溶性級分(22.7 g)。對BuOH萃取物(11.6 g)進行矽膠管柱層析，其中(二氯甲烷/乙酸乙酯：1:1)用作主要溶離溶液且甲醇用於逐漸增加溶離劑極性(二氯甲烷/乙酸乙酯：1:1→二氯甲烷/乙酸乙酯/甲醇：1:1:0.5→二氯甲烷/乙酸乙酯/甲醇：1:1:1→甲醇，產生17個溶離級分(溶離級分編號1至17))。藉由製備型TLC (二氯甲烷/丙酮：40:1)純化級分1，得到兩個溶離級分，其中第一溶離級分包含化合物1 (36.4 mg)且第二溶離級分包含化合物2 (12.8 mg)。化合物1 為微黃色油狀物。化合物2 為無色油狀物。實例 4 ：表徵化合物 1 及化合物 2
化合物 1
化合物1之結構經過判別為(E )-5-(2,2-二甲基-6-亞甲基環己基)-3-甲基戊-2-烯酸(又名桑黃靈(sanghuanglin))，其具有以下結構：
Figure 02_image027
。 表2中顯示化合物1 在CDCl3 中之1 H-及13 C-NMR光譜數據。 表2
Figure 107142648-A0304-0002
 藉由HSQC、HMBC及COSY實驗進行碳氫歸屬(assignment)。
化合物 2
化合物2結構經判別為(+)-(2E ,4E )-5-((S )-2,2-二甲基-6-亞甲基環己基)-3-甲基戊-2,4-二烯酸(亦稱為MDA)，其具有以下結構：
Figure 02_image029
。 表3中顯示化合物2 在CDCl3 中之1 H-及13 C-NMR光譜數據。 表3
Figure 107142648-A0304-0003
 藉由HSQC、HMBC及COSY實驗進行碳氫歸屬。實例 5 ： ER 總活性分析
雌激素受體 (ER) 模型
ER為配體活化的強化子蛋白，其為類固醇/核受體超家族之成員。ER以高親和力結合於稱為雌激素反應元件(ERE)之特異性DNA序列(5'-GGTCAnnnTGACC-3'，SEQ ID NO: 7)且響應於雌二醇(E2)轉活化基因表現(Nucleic Acids Res. 2001年7月15日; 29(14): 2905-2919)。分泌性鹼性磷酸酶(secreted alkaline phosphatase，SEAP)為被廣泛用於研究啟動子活性或基因表現的報導子(reporter)。
將1 ml 0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液添加至T75細胞培養角瓶中之80%匯合度(confluence)(若細胞處於對數期，則在第5天)的MCF-7細胞中，在37℃下持續5分鐘。分離細胞後，添加5 ml經炭處理之含有FBS之培養基以懸浮細胞。以經活性碳處理過之FBS所配置之培養基2 ml製備細胞懸浮液，使細胞懸浮液之最終體積為10 ml。用8通道移液器將混合物分配至96孔盤之各孔中(100微升/孔，2×104 個細胞/孔)，且將96孔盤置放於37℃及5% CO2 下隔夜以獲得約70%匯合度。
為了轉染表現受ERE調控報導基因之細胞，製備轉染混合物。TransIT®-LT1轉染試劑為一種廣譜試劑，其能夠在包括初級細胞在內的諸多哺乳動物細胞類型中提供高效質體DNA遞送。具體而言，將1 ml Opti-MEM®、14 μlTrans IT®-LT1轉染試劑及5 μg pERE-TA-SEAP添加至1.5 ml艾本德管(Eppendorf)中且使轉染混合物靜置15-30分鐘。
將含有Trans IT-DNA之轉染混合物分配至96孔盤之各孔中(10微升/孔)，且將96孔盤在37℃及5% CO2 下置放24小時。使用8通道移液器從96孔盤移除上清液。向96孔盤之各孔添加90 μl經活性碳處理之含有FBS之培養基(不含酚紅)、視情況選用之0.1 nM E2刺激劑(視篩選目的而定)及10 μl樣品(E2、38847發酵液、化合物1及化合物2)，在37℃、5% CO2 培育箱中持續48小時。
結果 表4
Figure 107142648-A0304-0004
 a 相對雌激素受體(ER)活性由所關注樣品之活性與未處理細胞(僅培養基)之活性之間的比率表示
如從表4可以看出，38847發酵液之發酵液具有優異ER活性。
如圖1中所示，化合物1及化合物2在不同濃度(2 μg/ml、5 μg/ml及10 μg/ml)下展現顯著的ER活性。令人驚訝地發現，化合物1及化合物2相較於17-β雌二醇(陽性對照)達到更佳之ER活性。實例 6 ：評估 SERM 活性
細胞培養
使CV-1細胞(草原猴(Cercopithecus aethiops)腎細胞)以70-80%之匯合生長且在濃度為5×104 個細胞/毫升之細胞懸浮液中收穫該等細胞。將細胞懸浮液添加至96孔盤之各孔(100微升/孔)且將96孔盤在37℃、5% CO2 培育箱中培育隔夜。
製備用於轉染之 DNA 混合物
在1.5 ml艾本德管中混合500 μl jetPRIME®緩衝液、5 μg pERE-TA-SEAP及5 μg ERα DNA質體(或ERβ DNA質體)，隨後添加20 μl jetPRIME®轉染試劑及1.5 ml培養基。將DNA混合物添加至96孔盤之各孔(20 μl)且將96孔盤在37℃、5% CO2 培育箱中培育4小時。
細胞收穫
從96孔盤之各孔移除上清液溶液，隨後向96孔盤之各孔添加90 μl經活性碳處理之不含酚紅的FBS培養基。將待測試樣品添加至96孔盤之孔，將其在37℃、5% CO2 培育箱中培育48至72小時。收穫細胞用於後續報導基因分析及細胞毒性分析。
報導基因分析
從96孔盤收集25 μl細胞培養上清液，且隨後將其添加至新的發光微量培養盤，將其在65℃水浴下培育30分鐘以移除活性內源性鹼性磷酸酶，且在冰上置放5分鐘並離心(1,000 rpm)一分鐘。在室溫下添加25 μl Phospha-Light™分析緩衝液，持續5分鐘，且在室溫下添加25μl含有CSPD (3-(4-甲氧基螺{1,2-二氧雜環丁烷-3,2'-(5'-氯)三環[3.3.1.13,7]癸}-4-基)苯基磷酸二鈉)之Phospha-Light™反應緩衝液，持續20分鐘。將發光微量培養盤置放於Victor™ Light 1420發光計數器中且量測SEAP酶活性。
結果
Figure 107142648-A0304-0005
 a ：相對雌激素受體(ER)活性由所關注樣品之活性與未處理細胞(僅培養基)之活性之間的比率表示b ：化合物1 = 桑黃靈；c ：化合物2 = (+)-(2E ,4E )-5-((S )-2,2-二甲基-6-亞甲基環己基)-3-甲基戊-2,4-二烯酸(亦稱為MDA)
17-β雌二醇(E2)作為陽性對照顯示出1.3之ER-β/ER-α比。出人意料的是，化合物1 及化合物2 分別顯示3.1及2.2之ER-β/ER-α比。結果證明，化合物1 及化合物2 的ER-β活性優於ER-α活性，從而具有SERM活性。
預期熟習此項技術者能想到如上述說明性實例中所闡述之本發明之許多修改及變化。因此，本發明應僅受隨附申請專利範圍限制。
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圖 1 顯示本發明之化合物1及化合物2之ER活性。
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<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 1
Figure 107142648-A0305-02-0026-1
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 2
Figure 107142648-A0305-02-0026-2
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 3
Figure 107142648-A0305-02-0026-3
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 4
Figure 107142648-A0305-02-0027-17
<210> 5
<211> 643
<212> DNA
<213> 桑黃屬ITS序列
<400> 5
Figure 107142648-A0305-02-0027-18
<210> 6
<211> 877
<212> DNA
<213> 桑黃屬LSU序列
<400> 6
Figure 107142648-A0305-02-0027-19
Figure 107142648-A0305-02-0028-20
<210> 7
<211> 13
<212> DNA
<213> 雌激素反應元件(EREs)
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(8)
<223> n為a、c、g或t
<400> 7
Figure 107142648-A0305-02-0028-21

Claims (16)

  1. 一種製備桑黃屬(Sanghuangporus)液體發酵物的方法，其包含在培養液中培養桑黃屬，其中桑黃屬係桑黃屬桑黃(S.sanghuang)38847(食品工業發展研究所寄存號碼BCRC 930200)。
  2. 一種製備桑黃屬萃取物之方法，其包含以下步驟：(a)藉由在培養液中培養桑黃屬而獲得桑黃屬液體發酵物；及(b)藉由將該桑黃屬液體發酵物與醇混合而獲得該桑黃屬萃取物，其中桑黃屬係桑黃屬桑黃(S.sanghuang)38847(食品工業發展研究所寄存號碼BCRC 930200)。
  3. 一種製備
    Figure 107142648-A0305-02-0029-8
    及
    Figure 107142648-A0305-02-0029-22
    之方法，其包含以下步驟：(a)藉由在培養液中培養桑黃屬而獲得桑黃屬液體發酵物；(b)藉由將該桑黃屬液體發酵物與醇混合而獲得醇溶性萃取物；(c)對該醇溶性萃取物進行矽膠管柱層析；(d)藉由用溶離溶液溶離該管柱而獲得不同溶離液；及(e)以二氯甲烷：丙酮(40：1)為溶離緩衝液藉由薄層層析收集第一溶離級分及第二溶離級分，其中該第一溶離級分包含該化合物1且該第二溶離 級分包含該化合物2；其中桑黃屬係桑黃屬桑黃(S.sanghuang)38847(食品工業發展研究所寄存號碼BCRC 930200)。
  4. 如請求項2或3之方法，其中在步驟(b)中，該等醇係選自由甲醇、乙醇及丁醇組成之群。
  5. 如請求項3之方法，其中在步驟(d)中，該管柱係用二氯甲烷/乙酸乙酯(1：1)溶離。
  6. 如請求項3之方法，其中在步驟(d)中，該管柱依序用二氯甲烷/乙酸乙酯(1：1)、二氯甲烷/乙酸乙酯/甲醇(1：1：0.5)及二氯甲烷/乙酸乙酯/甲醇(1：1：1)溶離。
  7. 如請求項3之方法，在步驟(e)之後，其進一步包含濃縮該溶離級分及/或乾燥該級分以獲得膏體或固體發酵物的步驟。
  8. 一種桑黃屬液體發酵物，其獲自如請求項1之方法。
  9. 一種桑黃屬萃取物，其獲自如請求項2之方法。
  10. 如請求項8之桑黃屬液體發酵物，其包含
    Figure 107142648-A0305-02-0030-10
    (化合物1)及/或
    Figure 107142648-A0305-02-0031-14
    。
  11. 如請求項9之桑黃屬萃取物，其包含
    Figure 107142648-A0305-02-0031-15
    (化 合物1)及/或
    Figure 107142648-A0305-02-0031-16
    。
  12. 一種醫藥組合物，其包含如請求項8之桑黃屬液體發酵物或如請求項9之桑黃屬萃取物及醫藥學上可接受之載劑。
  13. 一種如請求項8之桑黃屬液體發酵物或如請求項9之桑黃屬萃取物的用途，其係用於製造用於預防或治療雌激素依賴性病狀、疾病、病症或症候群之藥劑。
  14. 如請求項13之用途，其中該雌激素依賴性病狀、疾病、病症或症候群係選自由以下組成之群：心血管疾病、男性女乳症、乳癌、骨質疏鬆症及子宮內膜異位。
  15. 如請求項13之用途，其中該液體發酵物具有雌激素受體(estrogen receptor，ER)活性及選擇性雌激素受體調節劑(selective estrogen receptor modulator，SERM)活性。
  16. 一種桑黃屬桑黃(S.sanghuang)38847，其寄存於食品工業發展研究所並具有寄存號碼BCRC 930200。
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