CN117899087A - 与g蛋白偶联型雌激素受体结合的治疗乳腺癌的中药提取物及其应用 - Google Patents
与g蛋白偶联型雌激素受体结合的治疗乳腺癌的中药提取物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及16α‑羟基松苓新酸在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。本发明证明了16α‑羟基松苓新酸能够与G蛋白偶联型雌激素受体（GPER）结合并促进其热稳定性，还能够抑制三阴性乳腺癌细胞的生长，从而实现对乳腺癌的治疗。本发明采用的研究手段为探讨复杂药物与特定靶点之间的联系提供了关键的解决步骤和实现手段。同时16α‑羟基松苓新酸与GPER结合作用的发现和研究对与GPER靶点相关的疾病治疗具有重要的意义和极大的开发价值，对GPER相关的乳腺癌治疗药物开发具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及与G蛋白偶联型雌激素受体结合的治疗乳腺癌的中药提取物及其应用。
背景技术
柴归汤（CGD）是传统中医经方的经典组方，在预防和治疗高血压（HTN）方面显示出良好的临床疗效和药用价值。CGD是小柴胡汤和当归芍药散的合方化裁，由柴胡、黄芩、生姜、半夏、沙参、当归、川芎、白芍、茯苓、白术和泽泻11味中药组成。日本汉方随机对照试验（RCT）循证医学报告中，小柴胡汤、当归芍药散是治疗HTN等心血管疾病（CVD）的常用方剂（Okabe T等, 2002, 53: 5）。基于传统中医药理论，本发明人在临床实践中将柴归汤等其他方剂用于高血压的治疗，在一项随机对照试验中，我们发现CGD降低舒张压的作用明显优于西药单药治疗，在临床上显示出良好的疗效(GAO等, 2021)。CGD在中国也被广泛用于治疗女性内分泌、免疫等相关疾病。研究发现，构成CGD的两个处方都有改善雌激素水平和调节雌激素受体表达的作用。雌激素及受体除了调节性发育外，在CVD，如冠状动脉疾病、HTN、中风、肥胖和血脂异常以及许多其他系统疾病中也具有重要作用。而慢性低雌激素状态，短期内会导致更年期症状，长期会对骨骼和心血管健康产生影响。因此据推测，CGD治疗HTN与雌激素效应有关。然而，CGD发挥治疗作用的有效成分和药理机制尚未得到深入的研究和揭示。
根据我们最近的研究显示，自发性高血压大鼠（SHR）在使用CGD后血压（BP），RAAS与肠道代谢物都得到改善，与此同时，其主动脉G蛋白偶联雌激素受体1（GPER）的表达也相应增强。GPER是具有七个跨膜结构域的孤儿G蛋白偶联受体，在2000年首次被发现是雌二醇（E2）介导细胞外信号调节激酶（ERK）快速激活的关键受体，其在脑、心血管等组织及肠上皮细胞中均有表达。GPER作为一种雌激素膜受体，定位于质膜和/或内质网，是一种新型的BP调节剂，在HTN等CVD的病理生理学中起着重要作用（Singh R等. Biomolecules, 2022, 12(3) ；Visniauskas等. J Hum Hypertens, 2022）。GPER激活促进血管舒张涉及下游多种信号通路，包括增强RAAS中Ang1-7/ACE2/MasR轴、促进NO释放、细胞内钙动员和ERK1/2的磷酸化、激活第二信使cAMP限制氧化应激等，具体取决于物种和血管床类型。
目前，关于CGD中的成分是否能结合和激活膜受体GPER的研究有限，介导CGD降低BP作用的关键分子、反应产物和特定信号转导的途径也是未知的。进一步的，也未有研究将CGD中的成分与涉及GPER的相关疾病，例如与雌激素效应相关的多种癌症的抑制和治疗建立联系。
发明内容
为了弥补现有技术中存在的上述不足，本发明提供与G蛋白偶联型雌激素受体结合的治疗乳腺癌的中药提取物及其应用。具体的，本发明提供16α-羟基松苓新酸（16α-Hydroxydehydrotrametenolic acid）在制备治疗乳腺癌的药物中的应用，其中所述药物以16α-羟基松苓新酸为活性成分，配以药学上可接受的辅料制备成制剂使用。
在本发明提供的所述应用中，所述16α-羟基松苓新酸通过与G蛋白偶联型雌激素受体结合发挥作用。
优选的，在本发明提供的所述应用中，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。
优选的，在本发明提供的所述应用中，所述16α-羟基松苓新酸是来自柴归汤的提取物。
优选的，在本发明提供的所述应用中：所述制剂选自注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、丸剂、缓释剂中的一种。
另一方面，本发明提供一种治疗乳腺癌的药物，所述药物以16α-羟基松苓新酸为活性成分，配以药学上可接受的辅料制备成制剂。
优选的，本发明提供的所述药物中，还含有药学上可接受的辅料。
优选的，本发明提供的所述药物中，所述药物的剂型为注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、丸剂、或缓释剂。
优选的，本发明提供的所述药物中，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。
优选的，本发明提供的所述药物中，所述乳腺癌是与G蛋白偶联雌激素受体相关类型的癌症。
优选的，本发明提供的所述药物中，所述16α-羟基松苓新酸通过与G蛋白偶联型雌激素受体结合发挥作用。
优选的，本发明提供的所述药物中，所述16α-羟基松苓新酸来自柴归汤的提取物。
另一方面，本发明还提供16α-羟基松苓新酸在制备治疗与G蛋白偶联型雌激素受体相关疾病的药物中的应用，其中所述药物以16α-羟基松苓新酸为活性成分，配以药学上可接受的辅料制备成制剂使用。
本发明的有益效果在于：
本发明首次发现并证实了CGD中的成分16α-羟基松苓新酸通过GPER介导其调节和治疗作用，进而可用于抑制和治疗乳腺癌，特别是三阴性乳腺癌。一方面本发明采用的研究手段为探讨复杂药物与特定靶点之间的联系提供了关键的解决步骤和实现手段。另一方面，16α-羟基松苓新酸与GPER的结合作用促进GPER活性的提高，对与GPER靶点相关的疾病治疗具有重要的意义和极大的开发价值，对GPER相关的乳腺癌治疗药物开发具有良好的应用前景。
附图说明
图1显示了16α-羟基松苓新酸与GPER蛋白的分子对接构象。
图2显示了不同温度下16α-羟基松苓新酸与GPER结合的蛋白免疫印迹（WB）结果。
图3显示了16α-羟基松苓新酸促进GPER蛋白的热稳定结果。
图4为16α-羟基松苓新酸抑制三阴乳腺癌（MDA-MB-231）细胞增殖的MTT测定曲线。
具体实施方式
CGD在中国除了用于治疗高血压，也常适用于免疫、内分泌、神经等多系统相关女性疾病的调理。我们猜想CGD对包括HTN在内的多种疾病的治疗作用和GPER的雌激素效应有关。根据相关药物研究发现，许多中药复方具有雌激素类作用，能够通过与雌激素受体结合而产生雌激素效应，即便在高剂量下也具有安全性。结合CGD在临床实践中的良好效果，我们试图找到CGD可以与GPER发生相互作用的证据。
本发明人通过CGD和GPER过表达细胞共孵育后运用UPLC-QTOF/MS分析筛选出CGD中的十几种成分可以直接与过表达细胞结合，并联合计算机模拟分子对接和CESTA技术筛选出与过表达细胞结合具有高结合能力的成分，即16α-羟基松苓新酸。这项研究的结果揭示了CGD治疗相关疾病的潜力以及其激活GPER的潜在机制，进一步揭示了16α-羟基松苓新酸在该途径中发挥重要作用。
在运用UHPLC-Q-TOF-MS数据分析策略对CGD化学组和代谢组进行全面鉴定和筛选的基础上，我们测试了CGD核心成分对GPER表达和活性的影响。发现CGD中的16α-羟基松苓新酸等十几种成分能与GPER基因过表达细胞系相结合。但其中一些成分在过表达细胞和对照细胞中无显著差异。
之后我们进一步开展了分子对接试验，基于半柔性对接理论和拉马克遗传算法模拟计算各组成分与GPER结合的位点、能量以及相互作用力，初步探讨了各成分在CGD作用于GPER这一过程中的贡献。结果显示，GPER与这些成分的结合能大约在-1.92到-5.56 kcal/mol之间，16α-羟基松苓新酸结合的能力特别大。16α-羟基松苓新酸存在 5对氢键和疏水作用与GPER结合，其中3对氢键均来自配体的同一端点。
为了进一步明确这些分子与GPER的结合能力，我们利用CESTA技术检测了分子与GPER共孵育后的热稳定性。结果显示在55至70°C的范围内，用16α-羟基松苓新酸处理后GPER靶蛋白的丰度高于用载体处理的蛋白质的丰度，表明该配体增加了靶蛋白的稳定性，与GPER具有较强的结合能力。
来自茯苓的16α-羟基松苓新酸是类视黄醇X受体的天然选择性激动剂，也可以介导PI3K/Akt/NF-κB 通路而发挥与高血压发病机制密切相关的改善肠道功能的作用。我们的研究推测这些成分可以通过与GPER直接结合以激活相关信号通路从而治疗与GPER相关的疾病。
这是首次通过运用多种与GPER结合的验证试验来报告CGD潜在成分对相关病症的研究。这些结果表明CGD的治疗作用与其成分激活GPER发挥雌激素效应密不可分，揭示了CGD通过GPER信号通路传导治疗相关病症的潜力，为开发治疗该类疾病的新靶点及新药物提供了实验依据。
三阴性乳腺癌是指癌组织免疫组织化学检查结果为雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和原癌基因Her-2均为阴性的乳腺癌。这类乳腺癌占所有乳腺癌病理类型的10.0%～20.8%，具有特殊的生物学行为和临床病理特征，预后较其他类型差。据研究，GPER可作为三阴性乳腺癌潜在的多种内分泌治疗靶点之一，而乳腺癌也是与GPER信号通路相关的多种疾病类型之一。在此基础上，本发明进一步研究和检测了16α-羟基松苓新酸对三阴性乳腺癌的抑制和治疗作用。
下面结合实施例和附图对本发明的技术方案作出优选的详细说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
材料和方法
1.1 实验试剂与仪器准备
DMEM高糖培养基：南京森贝伽生物科技有限公司；胰酶细胞消化液（（0.25%胰酶）：碧云天生物（C0201））；胎牛血清：南京森贝伽生物科技有限公司；青霉素-链霉素：碧云天生物（C0222）。RIPA裂解液：碧云天生物（P0013B）；PMSF：碧云天生物（ST506）。CO2细胞培养箱：Thermo Fisher（型号：3111）；超净台：佳宝净化设备有限公司（型号：JB-CJ-1FDS）；恒温水浴锅：国华电器有限公司（型号：HH-4）；荧光倒置显微镜：奥林巴斯公司（型号：IX53）；RT-PCR仪：Bio-Rad公司；冷冻高速离心机：Eppendorf（型号：5418R）；高压蒸汽灭菌锅：尚仪医疗科技有限公司（LHS-24B）；电泳仪：上海天能科技有限公司（型号：EPS600）；Western blot转膜仪：Bio-Rad公司；全自动数码凝胶/化学发光图像分析系统：上海天能科技有限公司（型号：Tanon 6600）。
1.2 GPER-1过表达细胞系构建
根据GPER-1基因序列设计引物DNA，按照常规的实验方法克隆获得GPER-1基因序列片段，测定浓度。利用慢病毒重组质粒系统构建并转化获得过表达GPER-1基因的293T细胞系。
1.3 CGD与GPER-1过表达细胞结合组分筛选
采用文献“Zhu H, Chang W, Zhou C, 等. Chemicalome and metabolomeprofiling of Chai-Gui Decoction using an integrated strategy based on UHPLC-Q-TOF-MS/MS analysis[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2021,1185: 122979 ”中记载的实验方法，制备CGD样品成分。
称取制得的1g CGD样品粉末，采用上述文献中记载的方法，利用UPLC-QTOF/MS分析，进行CGD与GPER的结合组分筛选。通过SCIEX OS Analytics提取原始图谱，在原有CGD化学成分表征基础上绘制各化合物提取离子流图（XIC），并转换峰面积。最终比较过表达细胞和对照细胞用蛋白定量（BCA）校准后的峰面积，并进行显著性检验。
1.4分子对接
利用Pubchem 数据库（http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和中医系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）获取上述可与GPPER结合的中药成分三维结构。使用Unirot蛋白质分析数据库（https://www.uniprot.org/）获取GPER受体的预测结构。上述配体和蛋白质受体GPER的结构文件使用Open Babel 3.1.1转为统一的pdb格式，导入PyMol 2.5 和AutoDock Tools 1.5.7进行预处理，包括受体去除水分子、配体平衡电荷与检测扭转键、统一加全氢，随后使用Open Babel 3.1.1将这些改变后的成分转换为分子对接所需的PDBQT格式。将预处理的PDBQT文件导入AutoDock Tools 1.5.7用于分子对接。设置对接活性Box，调整x、y、z轴参数使得Box完全覆盖受体GPER。运行AutoDock 4.2.6使用拉马克遗传算法生成对接结果，每组复合物独立模拟10次对接，计算结合能与氢键数。结合能为负值说明小分子配体可以与靶点蛋白自发结合，结合能越小说明结合越稳定。结果中结合能最低且存在氢键连接的构象视为最优构象。将10个最优构象的结果文件转为pdb格式导入PyMol 2.5和Poseview可视化，分析配体与受体间的相互作用并测算氢键长度。
1.5细胞热位移分析（CESTA）
1.5.1 配体受体准备
在补充有10%（v/v）胎牛血清，1%青霉素-链霉素（v/v）的DMEM高糖培养基中培养HEK-293T（GPER过表达）细胞，环境设置为37℃、5%CO2。选取分子对接结果估值最高的16α-羟基松苓新酸进行试验。
1.5.2 细胞处理
把冻存管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动。液体融化后取来喷酒精放到超净工作台。将上述细胞悬液吸到15ml的离心管中，培养基清洗冻存管，1000bpm离心5min。小心弃去上清，加1ml培养基悬浮细胞，吸到装有8ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布。当培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%后传代。把原有培养基弃掉，用PBS轻轻清洗2遍。加胰蛋白酶消化1分钟左右。加等体积的含血清的培养基终止消化。移液枪吹打细胞悬浮。把细胞吸到15ml的离心管中，1000bpm离心5min。小心弃去上清，加1ml培养基，轻柔吹起细胞。将细胞接种在装有4ml培养基培养皿中，每次接种4个皿用于实验。细胞种入培养皿后放入孵箱培养，给予相应药物或载体处理。将16α-羟基松苓新酸的母液（浓度为10mM）用无血清DMEM培养基稀释至工作液浓度均为10μM，给予浓度为10μM的16α-羟基松苓新酸4ml治疗。给药后放入孵箱培养24h。
1.5.3提取蛋白
配好裂解液1ml（1000μl的RIPA+10μl PMSF），孵育后，弃去含药培养基，用PBS洗涤细胞（2次）以去除过量药物，将皿置于冰上，并在培养皿中加入180μL/皿的裂解液，静置10min，用细胞刮刀快速刮取细胞与裂解液的混合物，将细胞裂解物转移至1.5mlEP管，冰上静置30min，期间每10min涡旋混匀一次，使充分裂解，在4°C下以14000g离心20分钟，将上清液转移至1.5mlEP管中，得到裂解蛋白。
1.5.4裂解蛋白热处理
将裂解蛋白均分为7等份（常温，45℃，50℃，55℃，60℃，65℃，70℃），每份20μL；使用RT-PCR仪进行相应温度的加热处理6min，室温冷却3min，在4°C下以14000g离心40分钟，将上清液吸取至新管（每管16μL），得到非复性蛋白。
1.5.5 WB蛋白定量实验
每管吸取2μL进行BCA蛋白定量，将其余非复性蛋白和上样缓冲液按比例混匀，99℃加热5min以变性蛋白样品，置于-20℃保存。凝胶电泳SDS-PGGE：电泳条件为55V，1h；95V1h，30min。随后按照相应操作转膜：，目的蛋白切分子量为70-40 kda，内参GAPDH切分子量为40-35 kda，300mA恒流转膜1h。在5%脱脂牛奶2h室温摇床封闭3-4h后，抗体孵育（一抗稀释比例：1:500，内参稀释比例：1:5000，4℃过夜孵育。二抗稀释比例：1:13000，4℃孵育1h）。检测成像结果并通过ImageJ量化，分析结果。
结果发现，CGD中存在十多种能与GPER结合的成分。其中，16α-羟基松苓新酸与GPER靶蛋白的结合能力尤为突出，能促进GPER靶蛋白的热稳定，提高GPER活性。本研究获取了CGD与靶蛋白GPER结合的成分，为研究CGD激活GPER和治疗HTN的机制提供了依据，证明了靶分子富集细胞构建-分子垂钓UPLC-QTOF/MS定量分析 -分子对接结合预测-CESTA联合筛选的分子研究策略可用于阐明复杂混合物的某部分机制及关键反应物，尤其适用于成分相对明确而作用机制尚未肯定的中药及中药提取物。
上述实验结果如图1至3所示，证明了16α-羟基松苓新酸与GPER靶蛋白的突出结合能力，在此基础上，进一步研究16α-羟基松苓新酸在涉及GPER通路或途径的相关癌症中的抑制和/或治疗作用。
实施例2
16α-羟基松苓新酸抑制三阴性乳腺癌（MDA-MB-231细胞）细胞增殖的MTT测定
材料和方法
细胞：三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞（来源：武汉博士德生物工程有限公司，货号：CX0046）
试剂：胎牛血清FBS；DMEM高糖培养基；双抗（青霉素-链霉素）；PBS缓冲液；胰蛋白酶-EDTA消化液；16α-羟基松苓新酸；二甲基亚砜DMSO；MTT溶液
材料：9cm培养皿，离心管，细胞计数载玻片，96孔板
仪器：CO2细胞培养箱；恒温水浴锅；显微镜；高速离心机；酶联免疫检测仪
实验步骤
1.细胞培养
配置含有10%（v/v）FBS、100U/ml双抗的DMEM完全培养基。冻存的MDA-MB-231细胞在水浴锅复温至37℃，加入离心管，1000转离心5分钟。吸去上清液，离心管再加1ml培养基悬浮细胞，并接种至含有9ml完全培养基的9cm培养皿中。晃匀后放入37℃细胞培养箱（5%CO2）培养。
镜下观察到细胞生长达到80%汇合后，按适当比例传代。吸去培养基，用10ml PBS清洗贴壁细胞1次。加1ml胰蛋白酶-EDTA消化液摇匀以充分接触细胞，放入37℃细胞培养箱消化5min。加等体积培养基终止消化，移液枪吹打20次后，吸至离心管，1000转离心5分钟。吸去上清液，离心管再加培养基悬浮细胞，等比例接种至各个培养皿，放入培养箱继续培养。
传代5次，胰蛋白酶-EDTA消化液分离细胞后，吸取1μl于细胞计数载玻片，镜下计数。以40000个/ml浓度稀释细胞，接种至96孔板（四周边缘孔不接种，用PBS填充）。每孔加入100μl细胞悬液，置于培养箱培养24h。
24h后，吸去孔内原有培养基。0.1% DMSO溶解药物。加16α-羟基松苓新酸溶解液处理细胞。每孔加入800μl含药培养基。药物浓度梯度设置为100，80，40，20，10，5，2.5，1，0.5μmol/L，并设置对照孔（不含药物），共10组，每组6孔，继续培养24h。
培养结束，吸去培养基，每孔加 DMEM高糖溶液100μl和MTT 溶液20μl，继续培养4小时。终止培养，吸去孔内溶液。每孔加150μl DMSO置摇床震荡10min充分融解结晶物。在酶联免疫检测仪上测量各孔在波长490nm处吸光度。
计算各浓度相对细胞增殖抑制率（%）=（对照孔平均吸光度-实验孔吸光度）/对照孔平均吸光度。以药物浓度为横坐标，细胞生存率（1-抑制率）为纵坐标绘图。从而得到不同浓度16α-羟基松苓新酸抑制三阴乳腺癌细胞增殖能力的曲线。
结果如图4所示，16α-羟基松苓新酸具有显著的抑制三阴乳腺癌细胞增殖的能力。在10μmol/L浓度时16α-羟基松苓新酸即具有抑制三阴乳腺癌细胞增殖的能力，且抑制癌细胞的能力随浓度增高而增加，在40μmol/L浓度时，16α-羟基松苓新酸的抑制癌细胞增殖的能力即接近最大抑制能力，和100μmol/L浓度相当。因此，16α-羟基松苓新酸具有非常优秀的抑制三阴乳腺癌细胞增殖的能力，具有巨大的药物开发前景。
最后需要说明的是，以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非加以限制，尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，所属领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求所请求保护的范围之内。
Claims (10)
1.16α-羟基松苓新酸在制备治疗乳腺癌的药物中的应用，其特征在于：所述药物以16α-羟基松苓新酸为活性成分，配以药学上可接受的辅料制备成制剂使用。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述16α-羟基松苓新酸通过与G蛋白偶联型雌激素受体结合发挥作用。
3.根据权利要求1所述的应用，其中，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。
4.根据权利要求1所述的应用，其中，所述16α-羟基松苓新酸是来自柴归汤的提取物。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述制剂选自注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、丸剂、缓释剂中的一种。
6.一种治疗乳腺癌的药物，其特征在于，所述药物以16α-羟基松苓新酸为活性成分，配以药学上可接受的辅料制备成制剂。
7.根据权利要求6所述的药物，其中，所述药物还含有药学上可接受的辅料。
8.根据权利要求6所述的药物，其中，所述药物的剂型为注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、丸剂、或缓释剂。
9.根据权利要求6所述的药物，其中，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌，并且所述乳腺癌是与G蛋白偶联雌激素受体相关的。
10.16α-羟基松苓新酸在制备治疗与G蛋白偶联型雌激素受体相关疾病的药物中的应用，其特征在于：所述药物以16α-羟基松苓新酸为活性成分，配以药学上可接受的辅料制备成制剂使用。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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