JPH04217683A - 抗生物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は下記式を有する化合物に関する：

【化２】 本化合物の構造はスペクトル特性の詳細な分析で決定さ
れた。 質量スペクトルデータ： 電子衝撃（ＥＩ）質量スペクトルデータは、フィニガン
（Ｆｉｎｎｉｇａｎ）−ＭＡＴＭＡＴ２１２質量スペク
トル計において９０ｅＶで又はフィニガン−ＭＡＴ　　
ＴＳＱ７０において７０ｅＶで得られた。高速原子衝突
（ＦＡＢ）スペクトルはフィニガン−ＭＡＴ　　ＭＡＴ
９０装置でジチオスレイトール：ジチオエリトリトール
（ＭＢ）又はヨウ化セシウム含有ＭＢを用いて記録され
た。 化合物Ｉ 全酸加水分解産物のトリメチルシリル（ＴＭＳ）誘導体
のガスクロマトグラフ質量スペクトル（ＧＣ−ＭＳ）で
は各１当量のトレオニン、３−ヒドロキシプロリン、４
−ヒドロキシプロリン、３−ヒドロキシグルタミン酸及
びＣ１６：０脂肪酸を示した。この化合物はＦＡＢ−Ｍ
Ｓによると分子量１０３２を有する（ｍ／ｚ１０３３で
〔Ｍ＋Ｈ〕＋　、ｍ／ｚ１１６５で〔Ｍ＋Ｃｓ］＋　が
観察される）。実験式Ｃ５０Ｈ８０Ｎ８　Ｏ１５は高分
解能ＦＡＢで〔Ｍ＋Ｃｓ］＋　イオンから決定された：
計算値１０３２．５７４３、実測値１０３２．５８０５
。

【０００２】ＮＭＲスペクトルデータ 　１Ｈ　　ＮＭＲスペクトルはバリアン（Ｖａｒｉａｎ
）　ＸＬ−４００ＮＭＲスペクトル計により４００ＭＨ
ｚ　でＣＤ３ＯＤ　中２１℃にて記録された。化学シフ
トは、内部参照として３．３０ｐｐｍ　の溶媒ピークを
用い、ゼロｐｐｍ　のテトラメチルシラン（ＴＭＳ）と
比較したｐｐｍ　で示される。１３Ｃ　　ＮＭＲスペク
トルはバリアンＸＬ−４００スペクトル計により１００
ＭＨｚ　でＣＤ３ＯＤ　中２１℃にて記録された。化学
シフトは、内部参照として４９．０ｐｐｍの溶媒ピーク
を用い、ゼロｐｐｍ　のテトラメチルシラン（ＴＭＳ）
と比較したｐｐｍで示される。 ＣＤ３ＯＤ　中で得られる　１Ｈ　　ＮＭＲは図１で示
される。 １３Ｃ　　ＮＭＲ化学シフト（ＣＤ３ＯＤ，　１００　
ＭＨｚ）：　１１．５７，　１９．７７，　２０．１８
，　２０．７２，　２４．２３，　２７．０２，　２７
．５７，　２８．０３，　３０．２７，　３０．３５，
　３０．５４，　３０．７５，　３１．１１，　３１．
２５，　３２．９２，　３４．４９，　３６．７４，　
３７．８６，　３８．０６，　３８．５８，　３９．８
６，　４５．９４，　４６．８９，　５２．８３，　５
５．５９，５６．６５，　５７．２０，　５８．３８，
　６２．４７，　６８．０７，　６９．８８，　７０．
６６，　７１．２７，　７４．３３，　７５．８５，　
７６．７９，　１１６．２（ｘ２），　１２９．６（ｘ
２），　１３３．１，　１５８．５，１６９．６，　１
７２．４，　１７２．６，　１７２．９，　１７３．６
，　１７５．３，　１７６．１，　１７６．８　ｐｐｍ
．これらと他のデータに基づき、化合物Ｉはかなりの確
実性で提示された構造を有すると考えられる。

【０００３】本化合物は白色固体物であって、メタノー
ル、エタノール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスル
ホキシド、酢酸エチル等のような有機溶媒に可溶である
。

【０００４】本発明の化合物は糸状菌及び酵母の双方に
対して抗菌性を有する。それはカンジダ・アルビカンス
（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・ル
ゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｒｕｇｏｓａ）、カンジダ・パ
ラプシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｐａｒａｐｓｉｌｏｓ
ｉｓ）等のような病原性真菌感染症を起こす生物に対し
て特に有用であり、高活性が一群の生物株で示される。 更に、カンジダ・アルビカンス及び他の真菌病原体に対
して活性であるが、都合の悪い危険は副作用のせいで効
力が制限されるアンホテリシンＢのようないくつかの抗
菌剤とは異なり、本発明の抗菌剤は非常に有効なだけで
なく、望ましくない副作用を実質上有しない。有害で致
死的可能性のある副作用である赤血球溶解は治療用量に
近い濃度で多数の化合物により示され、この性質は薬剤
としてのこれら化合物の適用性を制限してしまう。本発
明の化合物では、赤血球溶解が起きるまでに治療に要す
るよりもはるかに高い薬物濃度を必要とする。

【０００５】本化合物は糸状菌、特にコクリオボラス・
ミヤベアナス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ　ｍｉｙａｂ
ｅａｎｕｓ）　、アスペルギラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ
ｕｓ）　種、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）
　種、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種、アルテルナ
リア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）種、ニューロスポラ（Ｎ
ｅｕｒｏｓｐｏｒａ）種等に対しても抗菌的に有効であ
る。

【０００６】式（Ｉ）の化合物は、後天性免疫不全症候
群（エイズ）のような免疫無防備患者にとって特に重度
の肺炎の原因体であるニューモシスティス・カリニイ（
Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ　ｃａｒｉｎｉｉ）の治療剤
としても有用である。

【０００７】化合物Ｉはブダペスト条約に従い１２３０
１パークローン・ドライブ、ロックビル、メリーランド
州２０８５２（１２３０１　ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖ
ｅ，　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，　ＭＤ２０８５２）、アメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔ
ｉｏｎ）のカルチャー・コレクションに寄託されたザレ
リオン・アルボリコラ（Ｚａｌｅｒｉｏｎ　ａｒｂｏｒ
ｉｃｏｌａ）　ＡＴＣＣ２０９５８を培養することで好
都合に産生される。ザレリオン・アルボリコラＡＴＣＣ
２０９５８はザレリオン・アルボリコラＡＴＣＣ２０８
６８の変異株である。化合物ＩはＺ．アルボリコラＡＴ
ＣＣ２０８６８の培養で形成されるが、それは容易に検
出できず、しかも容易に単離しうる量で形成されない。

【０００８】Ｚ．アルボリコラＡＴＣＣ２０８６８の培
養による主産物は下記化合物Ｘである：

【化３】 化合物Ｘは１９８９年６月７日付で出願された同時係属
出願第３６２，６４７号の主題であり、更にこれは現在
放棄された１９８７年１０月１０日付で出願された出願
第１０５，７９５　号の継続である。化合物Ｉの発見は
Ｚ．アルボリコラＡＴＣＣ２０９５８の培養で可能とさ
れた。この変異株Ｚ．アルボリコラＡＴＣＣ２０９５８
　は後で更に詳細に記載されるように、Ｚ．アルボリコ
ラＡＴＣＣ２０８６８の胞子懸濁物を変異誘発物質で処
理し、しかる後プレートでインキュベートしかつ単離す
ることにより産生される。約１００種の異なる変異株が
その操作で得られたが、１つの変異株のみが本発明で達
成される結果を満たすことが発見された。メルク・カル
チャー・コレクションのＭＦ５４０５と同一のこの培養
物は２３０１パークローン・ドライブ，ロックビル，メ
リーランド州２０８５２、アメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクションの永続培養機関に寄託され、受理Ｎ
ｏ．　ＡＴＣＣ２０９５８として入手しうる。

【０００９】変異株の産生のため、紫外線照射、化学変
異誘発物質又は内位付加剤のように変異株を生じる上で
通常用いられるのであればいかなるものをも用いてよい
。適切な化学変異誘発物質としてはＮ−ニトロソ−Ｎ−
メチルウレタン及びＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニ
トロソグアニジンがある。本例においてＺ．アルボリコ
ラ変異株は、０．３Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン（トリス）緩衝液中Ｚ．アルボリコラＡＴＣＣ
２０８６８の胞子懸濁物をＮ−ニトロソ−Ｎ−メチルウ
レタンで処理し、処理された懸濁物をポテトデキストロ
ース寒天上に移し、コロニーを発育させるためインキュ
ベートし、しかる後コロニーを単離し、分離されたコロ
ニーをポテトデキストロース寒天の斜面に移し、Ｚ．ア
ルボリコラ変異株の培養物を得るため１０〜１４日間イ
ンキュベートすることで得られたが、そのうち１つは仮
にＺ１−１８として同定され、後にメルク・カルチャー
・コレクションにＭＦ５４０５として維持され、現在Ａ
ＴＣＣ２０９５８として入手しうる。

【００１０】Ｚ．アルボリコラＡＴＣＣ２０９５８のコ
ロニー性及び形態学的記載は以下のとおりである：ポテ
ト−デキストロース寒天〔ジフコ（Ｄｉｆｃｏ）〕上の
コロニーは２０℃で徐々に増大し、１週間で８〜１２ｍ
ｍの径に達する。ポテト−デキストロース寒天上の成熟
コロニー（３〜４週間）は拡散性で、沈降及び着生菌糸
を有し、表面が毛状、羊毛状又は帯状で、曇った状態か
ら中度の光沢を有し、隆起して非常に密集したコロニー
を形成し、濃分生子形成のせいで準基質組織を有する。 コロニー色は、淡オリーブ−褐色、オリーブ色、オリー
ブ−褐色、最後にオリーブ−黒色、イサベラ色、サヤル
（Ｓａｙａｌ）褐色、黄褐色−オリーブ色、サッカルド
（Ｓａｃｃａｒｄｏ）のアンバー色、セピア色、褐色が
かったオリーブ色、生アンバー色、暗オリーブ色、オリ
ーブ色がかった黒色である〔Ｒ．リジウェイ，１９１２
年、カラー標準及び命名、ワシントン，Ｄ．Ｃ．（Ｒ．
Ｒｉｄｇｗａｙ，　１９１２，　Ｃｏｌｏｒ　Ｓｔａｎ
ｄａｒｄｓ　ａｎｄ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ，　Ｗ
ａｓｈｉｎｇｔｏｎ，　Ｄ．Ｃ．）　からのカラー名〕
。コロニーの背面も同色。臭気、滲出物及び可溶性色素
は存在しない。

【００１１】菌糸（３％ＫＯＨ　中）は淡黄褐色からオ
リーブ褐色で中隔があり、分岐し、普通不規則な側部又
は末端ローブを有し、１〜３μｍ幅の薄いからやや厚い
壁があり、その壁は平滑〜やや外皮形成又は突起状であ
る。 着生菌子は普通束で一緒に付着している。剛毛及び下柄
は存在しない。分生子細胞は単芽球で、分散〜密集し、
集中し、末端に及び介在して、まっすぐからやや急角度
で未分化菌糸から直接生じている。分生子は不規則な鎖
、フィラメント又はコイルとして生じ、しかる後細胞６
〜２５の密集した不規則な集合として発育する。個々の
分生子細胞は３〜６μｍ径で、球状、準球状又はやや不
規則からローブ状で平滑〜細かな突起があり、黄褐色〜
オリーブ褐色である。

【００１２】化合物Ｉは、実質的量の抗菌活性が培地で
検出されるまで後記の条件下適切な栄養培地中でＺ．ア
ルボリコラＡＴＣＣ２０９５８を培養し、発酵培地から
活性成分を適切な溶媒で抽出して回収し、望ましい成分
を含んだ溶液を濃縮し、しかる後培地中に存在する他の
代謝産物から化合物Ｉを単離するため濃縮物質をクロマ
トグラフィー分離に付すことにより得られる。

【００１３】産　　　　生 化合物Ｉは、微生物で同化しうる炭素及び窒素源を含有
しかつ低レベルの無機塩も含有した適切な栄養培地でＺ
．アルボリコラＭＦ２０９５８を培養することにより産
生される。培地は微量金属で補充してもよいが、但し炭
素及び窒素の複合源が用いられる場合には、通常微量金
属が複合源中に存在している。炭素源としてはグリセロ
ール、糖、糖アルコール、デンプン及び他の炭水化物又
はデキストラン、セレロースのような炭水化物誘導体並
びにオート粉、コーンミール、雑穀、コーン等のような
複合栄養素がある。培地で利用される炭素源の正確な量
は培地中の他成分に一部依存しているが、但し培地の０
．５〜４０重量％の炭水化物量で満足しうることが通常
わかっている。これらの炭素源は個別的に用いても又は
それら数種の炭素源が同一培地で組合されてもよい。窒
素源としてはグリシン、アルギニン、トレオニン、メチ
オニン等のようなアミノ酸、アンモニウム塩並びに酵母
加水分解産物、酵母自己分解産物、酵母細胞、トマトペ
ースト、大豆ミール、カゼイン加水分解産物、酵母抽出
物、コーン浸漬液、蒸留可溶成分、綿実ミール、肉エキ
ス等のような複合源がある。様々な窒素源が培地の０．
２〜１０重量％範囲内の量で単独で又は組合せて用いら
れる。培地に配合してよい栄養無機塩としては、ナトリ
ウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、リン酸、
硫酸、塩化物、炭酸等のイオンを生じうる慣用的な塩が
ある。コバルト、マンガン、鉄、モリブデン、亜鉛、カ
ドミウム等のような微量金属も含まれる。

【００１４】増殖培地は前記栄養素から常法で調製され
るが、ある栄養素及び／又は混合栄養素の存在が化合物
Ｉの産生に都合よい。このため、アンモニウム塩は直接
的窒素源として重要であり、一塩基性リン酸カリウムは
ｐＨ調節に重要である。マンニトールは、形成される所
望産物の量を増すばかりでなく所望産物の産生速度を改
善するためにも組成物で特に有用である。培地は液体で
も又は固体であってもよい。

【００１５】化合物Ｉの産生に適した代表的なマンニト
ール含有培地は以下である：

【００１６】 　　＊カゼイン加水分解産物−ハンコ・シェフィールド
、メンフィス、テネシー州（Ｈｕｍｋｏ　Ｓｈｅｆｆｉ
ｅｌｄ　Ｍｅｍｐｈｉｓ，　Ｔｅｎｎ．）

【００１７】式Ｉの化合物の産生に好ましい他の培地は
炭素源としてＤ−マンニトール、複合窒素源としてペプ
トン化ミルク、アミノ酸としてグリシン及び緩衝液を含
有した培地であるが、好ましくは乳酸、微量元素及び大
豆、ピーナツ、ヒマワリ油から選択される植物油を含有
した培地が最も満足しえる。各成分に関して有用な範囲
は下記のとおりである：

【００１８】有用な固体培地の代表例は以下である：　
　＊＊ニュージャージー州クリフトンのイースト・プロ
ダクツ社（Ｙｅａｓｔ　ＰｒｏｄｕｃｔｓＩｎｃ．）製
の酵母自己分解産物

【００１９】前記又は類似の培地の
１つを用いて、発酵は最初に栄養種培地をＺ．アルボリ
コラＡＴＣＣ２０９５８の前解凍増殖性菌糸体で接種し
て行われ、接種された培地は式（Ｉ）の化合物の産生で
種として役立つ生物を産生するため少なくとも３日間イ
ンキュベートされる。種培地は通常５〜８．１、最適に
は６〜７．５のｐＨ範囲である。代表的な種培地は下記
組成の１つである：＊前記

【００２０】本プロセスを行う場合、ＡＴＣＣ２０９５
８の保存培養物の斜面部分が適切な種培地に接種され、
フラスコは約１５〜約３０℃で２〜３０日間、好ましく
は２０〜２８℃で２〜１４日間攪拌下又は非攪拌下にお
いてインキュベートされる。攪拌は用いられる場合好ま
しくは約２００〜２２０ｒｐｍ　であるが、但し４００
ｒｐｍ　以内である。増殖物が豊富化したとき、即ち通
常２〜５日目に、増殖物は本発明の化合物の産生のため
産生培地に接種するのに用いられる。しかしながら好ま
しくは、第二段階発酵が行われ、培養増殖物の一部で接
種し、しかる後同様の条件を用いるが、但し通常約１〜
３日の短いインキュベート期間が適用される。次いで増
殖物は産生培地に接種するために用いられる。

【００２１】培養増殖物で接種された発酵産生培地は、
攪拌下又は非攪拌下で３〜３０日間、通常７〜１４日間
インキュベートされる。発酵は約２０〜約４０℃の温度
範囲で好気的に行われる。最良の結果のためには、これ
らの発酵を約２４〜約３０℃の範囲内の温度で行うこと
が最も都合よい。約２４〜２８℃の温度が最も好ましい
。本化合物の産生に適した栄養培地のｐＨは約５．０〜
８．５で変更してよいが、好ましくは約６．０〜７．５
の範囲である。望ましい化合物の産生に適した期間後、
これは後で更に詳細に記載されるようにして発酵培地か
ら回収される。

【００２２】回収及び単離 培養終了後、化合物Ｉは培地から回収かつ単離される。 正確な工程は、発酵が液体又は固体培地のいずれで行わ
れるかに応じてやや異なる。発酵が固体培地で行われる
場合、第一工程ではアルコール溶媒を発酵培地に加え、
十分に混合し、しかる後濾過し、回収して、水性アルコ
ール濾液を濃縮する。濃縮された濾液は、アルカン可溶
性不純物を除去するためヘキサン又は他のアルカンのよ
うな低級脂肪族炭化水素溶媒で逆抽出又は洗浄される。 アルカン洗浄濾液は非水混和性含酸素有機溶媒で抽出又
は分配され、得られた溶液は濃縮され、しかる後少なく
とも１回、通常数回クロマトグラフィー分離工程のため
カラムにのせられる。適切なカラムはシリカゲル、逆相
樹脂及び“セファデックス”ＬＨ−２０〔デキストラン
吸着剤、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　〕であ
る。

【００２３】発酵が液体培地で行われる場合、一方法と
して菌糸体固形分は濾過され、発酵培地から回収される
。アルコールが菌糸体の塊りに加えられ、菌糸体固形分
はアルコールと十分に混合され、濾過され、濾液が集め
られ、濃縮される。別法において、全発酵液は等容量の
アルカノール、好ましくはメタノールの添加で抽出でき
、固体不純物を除去するため濾過される。次いでアルカ
ノール抽出物は“ダイアイオン”（Ｄｉａｉｏｎ）ＨＰ
−２０（三菱化成）樹脂に吸着され、１００％アルカノ
ールで溶出される。“ダイアイオン”ＳＰ−２０７（臭
素化）又は他の市販スチレン−ジビニルベンゼンコポリ
マーも用いてよい。第二の希釈／ＨＰ−２０吸着／溶出
工程は、クロマトグラフィー分離の用意にサンプルを濃
縮するため用いられる。時には、第三の希釈／ＨＰ−２
０吸着／溶出工程が容量減少のために望ましい。

【００２４】固体栄養培地又は菌糸体パッドからの活性
剤の初期抽出に用いられるアルコール溶媒は、メタノー
ル、エタノール、イソプロパノール等のような低級アル
コールのいずれであってもよい。メタノールが好ましい
。活性剤が水性アルカノール又は水性メタノール溶液か
ら分配される場合に適切な溶媒は、酢酸エチル、酢酸イ
ソプロピル、酢酸ブチルのようなエステル類又はメチル
エチルケトンのようなケトン類である。

【００２５】クロマトグラフィー分離は非イオン系樹脂
で慣用的なカラムクロマトグラフィーを用いるか又は逆
相樹脂を用いる高性能液体クロマトグラフィーによって
行われる。抗生物質化合物Ｉ含有分画は、カンジダ・ア
ルビカンスを用いた抗菌検定で検出される。通常、２以
上のクロマトグラフィー分離工程が用いられる。最も好
ましい操作では、１回以上の分離がカラムクロマトグラ
フィーを用いて行われ、最終分離はＣ１８逆相樹脂によ
る高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて
行われる。慣用的なカラムクロマトグラフィーがクロマ
トグラフィー分離で用いられる場合には、シリカゲルが
好ましい吸着剤である。通常２回以上のクロマトグラフ
ィー分離が用いられる。シリカゲルはすべての分離で用
いてよいが、但し異なる溶出剤を用いる。しかしながら
、それは商品名“セファデックス”ＬＨ−２０として市
販されるデキストラン吸着剤のような異なる吸着剤の使
用と有利に組合せることができる。他の吸着剤、例えば
“ダイアイオン”ＨＰ−２０、ＨＰ−３０、ＨＰ−４０
、ＳＰ−２０７及び“アンバーライト”（Ａｍｂｅｒｌ
ｉｔｅ）　ＸＡＤ−２、ＸＡＤ−４、ＸＡＤ−１６〔ロ
ーム・アンド・ハース社（Ｒｏｈｍ　ａｎｄ　Ｈａａｓ
　Ｃｏ．）］として市販されるアルミナ、スチレン−ジ
ビニルベンゼンコポリマーも用いてよい。シリカゲルク
ロマトグラフィーによる活性成分の分別化及び回収にお
いては、アルコール濃度を高めていくエステル／アルコ
ール混合物が良好な分離能を示す。酢酸エチル及びメタ
ノールの混合物が特に有用とわかった。これらは均等な
段階勾配でも又は連続勾配系で用いてもよい。“セファ
デックス”ＬＨ−２０のようなデキストラン吸着剤が用
いられる場合には、クロロ炭化水素／炭化水素／アルコ
ール溶媒系が用いられる。塩化メチレン／ヘキサン／メ
タノールの混合物が特に有用とわかった。

【００２６】ＨＰＬＣ分離を行う場合には、慣用的なク
ロマトグラフィーから回収された物質を含むアルコール
溶液が濃縮され、残渣が移動相と同比率のメタノール／
水に溶解され、市販逆相樹脂で充填されたカラム又は文
献で詳細に報告されるように調製されたシリカゲル／Ｃ
１８逆相樹脂で充填されたカラムにのせられる。一方、
アルコール溶液は水で５０％希釈して、カラムにポンプ
導入してもよい。カラムはメタノール：水１：１を用い
て洗浄され、８００〜２００ｐｓｉ　（約５６〜１４０
ｋｇ／ｃｍ２）で約２０ｍｌ／ｍｉｎ　の流速を生じさ
せ更に高割合のメタノールで溶出させる。分離は２１０
ｎｍでモニターされる。分画はカンジダ・アルビカンス
を用いて活性に関して調べられる。産物は、カンジダ・
アルビカンス活性分画を合わせ、減圧下で濃縮すること
により、いずれかのクロマトグラフィー操作から回収さ
れる。

【００２７】化合物Ｉは多数の真菌に対して、更にニュ
ーモシスティス・カリニイに対しても活性である。抗菌
性は、１％デキストロース含有酵母窒素ベース（ＹＮＢ
Ｄ）（ジフコ）で行われるマイクロブロス希釈アッセイ
における、あるカンジダ生物に対する最少殺菌濃度（Ｍ
ＦＣ）測定から実証される。アッセイを行う場合、化合
物Ｉは１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解
され、２５６０μｇ／ｍｌに希釈された。次いで化合物
はＹＮＢＤで２５６μｇ／ｍｌに希釈された。懸濁液０
．１５ｍｌが９６穴プレートの最上列に分配され（各穴
はＹＮＤＢ０．１５ｍｌを含有する）、１２８μｇ／ｍ
ｌの薬物濃度とされた。次いで２倍希釈が最上列から行
われ、１２８〜０．０６μｇ／ｍｌ範囲の最終薬物濃度
を得た。サブロー（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ）デキストロー
ス寒天で維持された酵母培養物はＹＭブロス（ジフコ）
に移され、振盪（２５０ｒｐｍ　）しながら３５℃で一
夜インキュベートされた。インキュベート後、各培養物
は滅菌水で希釈され、１〜５×１０６　コロニー形成単
位（ＣＦＵ）／ｍｌの最終濃度を得た。

【００２８】９６穴マイクロプレートは、１．５μｌ／
穴を放出して１．５〜７．５×１０３　細胞の最終接種
原／穴を与えるＭＩＣ−２０００〔ダイナテック（Ｄｙ
ｎａｔｅｃｈ）〕を用いて接種された。マイクロプレー
トは３５℃で２４時間インキュベートされた。最少阻害
濃度（ＭＩＣ）は可視的な増殖を示さない薬物の最少濃
度として記録された。ＭＩＣを記録した後、プレートは
細胞を懸濁するため振盪された。しかる後９６穴マイク
ロプレートの各穴からサンプル１．５μｌがサブローデ
キストロース寒天含有の単一ウェルトレーに移された。 接種されたトレーは２８℃で２４時間インキュベートさ
れ、しかる後読取られた。ＭＦＣは増殖を示さないか又
は４コロニー／スポット以下しか示さない薬物の最少濃
度として規定される。結果（３サンプル）は下記表でみ
られる：

【００２９】化合物Ｉはニューモシスティス・
カリニイ感染を阻害又は軽減する上で有用である。代表
的研究において、化合物Ｉの有効性がラットで調べられ
た。ＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラット（体
重約１５０ｇ）は飲料水中のデキサゾン（２ｍｇ／ｍｌ
）で免疫抑制し、低タンパク食で６週間維持して、潜伏
感染からニューモシスティス肺炎への進行を誘導させた
。薬物処置前に、ラット３匹をニューモシスティス・カ
リニイ肺炎（ＰＣＰ）の存在を確認するために殺したが
、ラット３匹のすべてが感染していた。ラット５匹の群
が５日間にわたり１日２回賦形剤０．５ｍｌ（水中１０
％ＤＭＳＯ）中の化合物で腹腔内注射された。ラット５
匹のコントロール群は賦形剤のみであった。すべての動
物は薬物処置期間中飲料水でデキサゾン及び低タンパク
食を摂取し続けた。処置終了後、すべての動物を殺し、
肺を摘出し、処理して、疾患の程度を染色スライドの顕
微鏡分析で調べた。この研究の結果、化合物ＩはＥＤ９
０値が≦１．０ｍｇ／ｋｇである良好な抗ニューモシス
ティス活性を有した。

【００３０】顕著な性質は、本化合物が慣用的医薬配合
技術に従い薬学上許容されるキャリアと共に新規医薬組
成物に処方された場合に最も有効に利用される。新規組
成物は少なくとも治療抗菌又は抗ニューモシスティス量
の活性化合物を含有している。通常、組成物は少なくと
も１重量％の化合物Ｉを含有している。使用前の希釈用
に適した濃縮組成物は９０重量％以上含有していてもよ
い。本組成物としては経口、経直腸、局所、非経口（皮
下、筋肉内及び静腸内を含む）、経肺（経鼻又は経口腔
吸入）、経鼻投与又は通気に適した組成物がある。本組
成物は、化合物Ｉを望ましい媒体に適した成分と完全に
混合することで前充填してもよい。

【００３１】化合物が抗菌用である場合には、いかなる
投与方法が用いられてもよい。真菌感染を治療するには
、経口投与が好ましいことが多い。経口投与が用いられ
る場合、それは液体組成物であってもよい。液体製剤の
場合、治療剤は水、グリコール、油、アルコール等のよ
うな液体キャリアで処方され、カプセル及び錠剤のよう
な固体製剤ではデンプン、糖、カオリン、エチルセルロ
ース、炭酸カルシウム及びナトリウム、リン酸カルシウ
ム、カオリン、タルク、ラクトースのような固体キャリ
アで通常ステアリン酸カルシウムのような滑沢剤、結合
剤、崩壊剤等と共に処方される。それらの投与容易性に
より、錠剤及びカプセルが最も有利な経口剤形を表す。 投与容易性及び投与量均一性のためには、（後記のよう
な）単位剤形で組成物を処方することが特に有利である
。単位剤形の組成物は本発明の一面を構成する。

【００３２】化合物Ｉは静脈内又は腹腔内注射用の治療
組成物として処方しても、必要であれば保存剤を添加し
てアンプル又は多用量容器の単位剤形として供与しても
よい。組成物は水中で０．８５％塩化ナトリウム又は５
％デキストロースのような油性又は水性賦形剤中の懸濁
液、溶液又は乳濁液のような形をとってもよく、懸濁剤
、安定剤及び／又は分散剤のような処方剤を含有してい
てもよい。塩水又はグルコースのような緩衝剤及び添加
剤も溶液を等張化するために加えてよい。薬物は点滴静
脈内投与用にアルコール／プロピレングリコール又はポ
リエチレングリコールに溶解してもよい。一方、活性成
分は投与前に適切な賦形剤で再調製される粉末形でもよ
い。

【００３３】本明細書及び請求の範囲で用いられる“単
位剤形”という用語は物理的に別個の単位に関し、各単
位は望ましい治療効果を示すように計算された既定量の
活性成分を製剤キャリアと共に含有している。このよう
な単位剤形の例は錠剤、カプセル、ピル、粉末包、カシ
ェ剤、アンプル又は多用量容器内の計測単位等である。 本発明の単位剤形は通常本化合物の１種１００〜２００
ｍｇを含有している。

【００３４】本化合物がニューモシスティス感染のコン
トロールに用いられる場合には、肺及び気管支を直接治
療することが望ましい。この理由から、吸入法が好まし
い。吸入投与の場合、本発明の化合物はネブライザーの
加圧パックからエアゾールスプレーの形で放出されるこ
とが都合よい。本化合物は処方された粉末として放出し
てもよく、粉末組成物は通気粉末吸入装置の補助で吸入
してもよい。吸入用に好ましいデリバリー系は計測用量
吸入（ＭＤＩ）エアゾールであるが、これはフッ化炭素
又は炭化水素のような適切な噴射剤中で化合物Ｉの懸濁
液又は溶液として処方される。

【００３５】もう１つの投与方法は、特に感染が耳及び
他の体腔に広がった場合の通気である。

【００３６】適用部が局所である場合、薬物は白色ワセ
リン、無水ラノリン、セチルアルコール、コールドクリ
ーム、モノステアリン酸グリセリル、ローズ水等のよう
な慣用的クリーム及び軟膏として処方してもよい。通常
１〜２％クリーム溶液が製造され、治療すべき領域に適
用される。

【００３７】下記実施例は本発明について示すが、但し
これは制限として解釈されるべきでない。 実施例１ Ａ．変異株Ｚ．アルボリコラＡＴＣＣ２０９５８の産生
Ｚ．アルボリコラＡＴＣＣ２０８６８の培養物をペトリ
皿のポテトデキストロース寒天上２５℃で３週間増殖さ
せた。ｐＨ７の０．３Ｍトリス緩衝液１０ｍｌをプレー
トに加え、胞子を無菌綿棒で表面をこすりつけて緩衝液
中に移した。緩衝液中の懸濁液をデカントし、操作を２
回繰返した。胞子懸濁液を合わせ、ガラスウールで濾過
し、大集団の胞子を除去した。濾液を最初６００ｒｐｍ
　、しかる後７００ｒｐｍ　、最後に８００ｒｐｍ　で
各々３分間遠心し、ペレットを各遠心後に捨てた。次い
で３回目の遠心からの上澄を３０００ｒｐｍ　で５分間
遠心した。この遠心からのペレットをｐＨ７の０．３Ｍ
トリス緩衝液３ｍｌに再懸濁し、変異誘発処理に用いた
。この懸濁液は胞子１０３　〜１０４　／ｍｌを含有し
ていた。

【００３８】胞子懸濁液にＮ−ニトロソ−Ｎ−メチルウ
レタン５０μｇ／ｍｌを加え、得られた混合液を室温、
３００ｒｐｍ　で２０分間振盪した。次いで混合液を遠
心し、上澄液を除去した。ペレットをｐＨ７．０の０．
３Ｍトリス緩衝液で２回洗浄し、しかる後同緩衝液に再
懸濁し、適切な希釈後単離されるコロニーを形成させる
ためポテトデキストロース寒天にいれた。プレートをコ
ロニー形成のため２５℃で２週間インキュベートした。 コロニーはポテトデキストロース寒天の斜面に各コロニ
ーを別々に移すことで単離した。接種された斜面を２５
℃で１０〜１４日間インキュベートし、斜面からプラグ
を別々に取出し、ＨＰＬＣアッセイで化合物Ｘ及び他の
成分の産生に関して試験した。斜面の１つからのプラグ
は最初Ｚ１−１８と命名され、これはＭＦ５４０５とし
てメルク・カルチャー・コレクションにおかれ、しかる
後アメリカン−タイプ−カルチャー−コレクションに寄
託され、ＡＴＣＣ２０９５８と決められた。以後記載し
た様に化合物Ｉを産生するための発酵においてこれを使
用した。

【００３９】実施例２ ＭＦ５４０５の斜面培養物からの胞子の懸濁物を１２１
℃、１５ｐｓｉ（約１ｋｇ／ｃｍ２）で２０分間滅菌さ
れた（前記で詳述された）ＫＦ種培地５４ｍｌ含有２５
０ｍｌエルレンマイヤーフラスコに接種した。接種され
た種フラスコを２２０ｒｐｍ　、２５℃で振盪しながら
９６時間インキュベートした。次いでこの培養物７ｍｌ
を種培地５００ｍｌ含有２リットルフラスコに移した。 フラスコを２２０ｒｐｍ　、２５℃で振盪しながら更に
９６時間培養した。しかる後培養物１０ｍｌを種培地５
００ｍｌ含有のもう１つの２リットルエルレンマイヤー
フラスコに移し、このフラスコを２００ｒｐｍ　、２５
℃で振盪しながら７２時間インキュベートした。次いで
フラスコの全内容物を下記組成（ｇ／リットルで表示）
の産生培地１５リットル含有２２リットルバイオリアク
ターに移した：マンニトール４０．０；ＮＺアミン（タ
イプＥ）３３．０；酵母エキス〔フィドコ（Ｆｉｄｃｏ
）］１０．０；（ＮＨ４）２ＳＯ４　５．０；ＫＨ２Ｐ
Ｏ４　９．０及びＰ２０００（ポリエチレングリコール
、ダウ・ケミカル）２．０ｍｌ、培地はｐＨを調製せず
に１２２℃、１５ｐｓｉ　で３０分間滅菌した。滅菌後
の培地ｐＨは６．６であった。次いで接種された培地を
振盪しながら２５℃、３００ｒｐｍ　、風量４．５リッ
トル／ｍｉｎ　及び背圧５ｐｓｉ　（約０．３５ｋｇ／
ｃｍ２）で培養した。１６５時間後、発酵ブロスを産物
回収のため採取した。

【００４０】発酵ブロスを等容量のメタノールと共に一
夜攪拌することで抽出した。メタノール抽出液を１イン
チのセライト層で濾過し、濾液を４リットル“ダイアイ
オン”ＳＰ−２０７カラムに吸着させた。カラムを６５
％水性メタノールで洗浄し、化合物Ｉを１００％メタノ
ールで溶出させた。溶出分画はＨＰＬＣアッセイを用い
て化合物Ｉの存在について調べた〔“ゾルバックス”Ｒ
Ｐ−１８分析カラム、４．６ｍｍ×２５ｃｍ；５０／５
０アセトニトリル／水；保持時間＝１１．７ｍｉｎ　〕
。化合物Ｉ　　０．９６ｇに相当する豊富な分画を合わ
せ、蒸留水で５０％水性メタノールの最終濃度まで希釈
し、“ダイアイオン”ＨＰ−２０カラムに吸着させた。 カラムを６５％水性メタノールで洗浄し、１００％メタ
ノールで溶出させた。溶出液は同ＨＰＬＣアッセイ法を
用いて化合物Ｉの存在に関しモニターした。化合物Ｉに
富む分画を合わせ、減圧下で濃縮乾固し、４リットルプ
レパラティブ液体クロマトグラフィーカラムにより直線
勾配（５０／５０メタノール／水〜１００％メタノール
で１時間）を用いてクロマトグラフィーに付した。分画
を化合物Ｉの存在について調べ、豊富な分画を合わせ、
更にセミプレパラティブＲＰ−１８ＬＣカラム（“ゾル
バックス”２．５４×２５ｃｍ；７０／３０メタノール
／水））で精製した。こうして得られた純度９５％以上
の産物は、本化合物のＮＭＲスペクトル及び質量スペク
トルを調べかつ既に前記された値を得るために用いた。

【００４１】実施例３ 化合物Ｉ　　５００ｍｇを各々含有した１０００個の圧
縮錠剤は下記処方から製造される： 　　化合物　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　グラム　　化合物Ｉ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５
００デンプン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　７５０二塩基性リン酸カルシウ
ム水和物　　　　　　５０００ステアリン酸カルシウム
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２．５微細
粉末成分をよく混合し、１０％デンプンペーストで造粒
した。顆粒を乾燥し、錠剤に圧縮する。

【００４２】実施例４ 化合物Ｉ　　５００ｍｇを各々含有した１０００個の硬
ゼラチンカプセルは下記処方から製造される：　　化合
物　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　グラム　　化合物Ｉ　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５００デン
プン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　２５０ラクトース　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　７５０タルク　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　２５０ステアリン酸カルシウム　　　　　
　　　　　　　　　　　　　１０諸成分の均一混合物を
ブレンドして調製し、ツーピース硬ゼラチンカプセルに
充填するために用いる。

【００４３】実施例５ 注射用懸濁液２５０ｍｌは慣用的操作に従い下記処方か
ら製造される： ５％ＤＭＳＯ／水　　　　　　　　２５０ｍｌ化合物Ｉ
　　　　　　　　　　　　　　　　４００ｍｇ諸成分を
ブレンドし、しかる後使用のため滅菌する。

【００４４】実施例６ 局所適用に適した軟膏は市販ポリエチレン／炭化水素ゲ
ル１ｇに化合物Ｉ　　１３ｍｇを完全に分散させて製造
される。

【００４５】実施例７ エアゾール組成は下記処方から製造される：

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は本化合物の　１Ｈ　　ＮＭＲスペクトル
図である。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　下記式を有する化合物：【化１】
2. 【請求項２】　　炭素、窒素の同化源及び無機塩を含有
   した栄養培地中好気性条件下で十分量の請求項１記載の
   化合物が産生されるまでザレリオン・アルボリコラＡＴ
   ＣＣ２０９５８を培養し、しかる後産物を培地から分離
   することを特徴とする、一次産物としての請求項１記載
   の化合物の産生方法。
3. 【請求項３】　　哺乳動物に抗感染量の請求項１記載の
   化合物を投与することを特徴とする、哺乳動物における
   ニューモシスティス・カリニイ感染の治療又は予防方法
   。
4. 【請求項４】　　増殖が制御されるべき領域に抗菌上有
   効量の請求項１記載の化合物を適用することを特徴とす
   る真菌増殖の阻害方法。
5. 【請求項５】　　請求項１記載の化合物を生物学上不活
   性なキャリアと共に含むことを特徴とする抗菌組成物。
6. 【請求項６】　　キャリアが薬学上許容されるキャリア
   である、請求項５記載の組成物。