CN115287197B - 小米发酵桑黄菌株及小米桑黄发酵产品的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种小米发酵桑黄菌株及小米桑黄发酵产品的制备方法，本发明提供了小米发酵桑黄菌株及桑黄发酵高营养功能性小米产品的制备方法，从桑树上的桑黄子实体中培养得到一株适于发酵小米基质的桑黄菌株，通过桑黄菌株活化，破碎，获得桑黄菌丝体液体培养物，接入小米固体发酵培养基，固态发酵后得小米桑黄发酵产品，此外提供一种氮源补充剂弥补小米中碳氮比例较高造成的菌丝体生长受限的问题，所得小米桑黄固态发酵产物经冷冻干燥以尽可能保留产物中的功能活性成分，获得一种高品质功能食品小米桑黄发酵产品，即小米桑黄“菌粮”。
Description
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种小米发酵桑黄菌株及小米桑黄发酵产品的制备方法。
背景技术
桑黄为多孔菌科真菌火木层孔菌的子实体，现代医学研究表明桑黄具有抑制肿瘤细胞、调节巨噬细胞增殖等作用，是一种珍贵的药用真菌。桑黄的使用从汉朝起至今已经有2000多年的历史，中国最早的本草学著作《神农本草经》就已经有了“桑寄生”的药物功效记载。由于桑黄生理生态的特殊性、复杂性以及外部环境条件的制约，自然界中形成的子实体非常稀少，形成可药食用的子实体更是需要较长时间，致使桑黄价格很高。因此，研究桑黄的人工栽培并对其进行功效成分研究、产品开发，具有重大意义。目前桑黄子实体人工栽培多采用桑枝等纤维素类原料，桑黄菌丝体在培养基质中生长后产生子实体，但此过程一般需2–3年时间。桑黄菌丝体含有多种活性成分。研究显示，桑黄菌丝体和子实体均含有蛋白质、多糖、氨基酸、脂肪、纤维、矿物元素等多种营养成分，其组成基本一致。菌丝体中17种氨基酸含量均高于子实体。虽然菌丝体中多糖、黄酮、三萜类活性成分低于子实体，但同样对结肠癌和肝癌细胞有抑制效果。桑黄菌丝体可利用淀粉类原料生长，且生长速度高于纤维素类原料。
中国专利文献CN103461963A公开了一种黄豆玉米桑黄健康食品及其制备方法，以桑黄菌为出发菌株，以食品黄豆、玉米为主要基料，进行液体发酵获得桑黄液体菌丝球，接种至黄豆、玉米固体培养基中发酵培养获得大量黄豆玉米桑黄菌质，最后将黄豆玉米桑黄菌质粉碎制成健康食品。中国专利文献CN108096478A公开了一种富含桑黄黄酮的燕麦桑黄谷菌粉的生产方法，通过培养桑黄液体发酵菌种、培养燕麦固体桑黄菌质、制备燕麦桑黄谷菌粉的过程，获得了富含桑黄黄酮的燕麦桑黄谷菌粉。
现有技术中已有许多在淀粉类原料中培养桑黄菌丝体的报道，如黄豆、玉米、燕麦等，但是不同的桑黄菌株在不同基质上的生长状况不同。小米中含有蛋白质、脂肪、糖类、膳食纤维、维生素及多种微量元素，营养价值高且热量低，小米蛋白能够维持人体血浆胶体渗透压恒定，小米油中富含亚油酸、亚麻酸等多种不饱和脂肪酸，长期食用小米具有益肾和胃，提高人体抵抗力的功效，尤其适合于“三高”、年老、体弱以及孕妇等人群食用。目前利用固态淀粉类基质发酵桑黄菌丝体虽有报道，但缺乏深入研究，特别是缺乏淀粉类基质如小米固态发酵的专用桑黄菌株。同时，如何根据淀粉类基质的成分特点和桑黄生长需求均衡培养基质各成分的组成，以最大限度促进桑黄在淀粉类基质中的生长，以及采用何种干燥技术获得高品质桑黄发酵产品，还有待进一步研究。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了小米发酵桑黄菌株及桑黄发酵高营养功能性小米产品的制备方法。本发明从桑树上的桑黄子实体中培养分离得到一株适于发酵小米基质的桑黄菌株，结合桑黄菌株的生长需要，提供一种桑黄发酵高营养功能性小米产品的制备方法，提供一种氮源补充剂弥补小米中碳氮比例较高造成的菌丝体生长受限的问题，所得小米桑黄固态发酵产物经冷冻干燥以尽可能保留产物中的功能活性成分，获得一种新型高品质功能食品小米桑黄发酵产品，即小米桑黄“菌粮”。
本发明通过以下技术方案实现：
一株桑黄菌株杨树桑黄(Sanghuangporus vaninii)，保藏时间：2021年07月16日，保藏地点：中国微生物菌种保藏中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC23061。
根据本发明优选的，所述桑黄菌株杨树桑黄(Sanghuangporus vaninii)的ITSrDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
将桑黄菌株杨树桑黄(Sanghuangporus vaninii)应用至小米桑黄发酵产品中，具体如下：
小米桑黄发酵产品的制备方法，包括步骤如下：
(1)将上述桑黄菌株活化，得到含有菌丝团的桑黄液体培养物，破碎后获得桑黄菌丝体液体培养物；
(2)将小米与去离子水混合，加入大豆蛋白肽水解物，灭菌冷却至室温得小米固体发酵培养基；
(3)将步骤(1)的桑黄菌丝体液体培养物接种入步骤(2)的小米固体发酵培养基，固态发酵后得发酵产物；将发酵产物经冷冻干燥、研磨处理后得浅黄色粉状小米桑黄发酵产品。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述桑黄菌株活化的方法为丝状真菌常规菌种活化方法，本发明优选的方法为将斜面保藏的桑黄菌株菌丝块接种于PDA液体培养基中，培养温度20～30℃，摇床转速120～180转/分钟，培养时间3～7d，获得含有菌丝团的桑黄液体培养物。
本发明步骤(1)中所述破碎可采用匀浆机、破碎机等常用食品破碎设备。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述小米与去离子水的质量比可1：1～3。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述小米优选的氮源为大豆蛋白水解物，与大豆蛋白水解物的质量比为1：0.01～0.05。
根据本发明优选的，步骤(2)所述灭菌采用高压蒸汽灭菌，115～121℃灭菌20分钟。
根据本发明优选的，步骤(3)中所述桑黄菌丝体液体培养物的接种量为0.5％～5％(质量比)。
根据本发明优选的，步骤(3)中所述固态发酵的条件为：发酵温度20～30℃，发酵时间5～10d，发酵在避光条件下完成。
根据本发明优选的，步骤(3)中所述冷冻干燥的方法为：将发酵产物于冰箱-40～-20℃预冷12～20h后，置于冷冻干燥机-50～-40℃预冷2～5h，然后进行冷冻干燥，冷阱温度-80℃，真空度15Pa，时间为24～48h。
本发明中的桑黄菌种为从桑树林桑黄子实体中培养获得的，并且在小米基质中生长速度较优；小米可采用不同产地的品种，大豆蛋白肽水解物为市售棕褐色液态产品。
有益效果：
1.本发明从桑树上的桑黄子实体中培养得到一株适于发酵小米基质的桑黄菌株杨树桑黄(Sanghuangporus vaninii)，该桑黄菌株经过小米发酵基质的优化，在小米基质中生长速度较快，缩短了发酵周期，降低了发酵成本。将上述桑黄菌株在小米固体发酵培养基上进行固态发酵，将桑黄的药用功能与小米的营养功能相结合，形成一种新型复合功能的小米桑黄发酵产品“菌粮”，可降低桑黄“菌粮”的生产成本，提升小米的附加值。
2.在小米中碳氮含量的比例较高，即碳源(淀粉)含量较高而氮源含量较少，本发明优选大豆蛋白肽水解物为氮源补充剂，解决了小米中碳氮比例较高造成的菌丝体生长受限的问题，同时，本发明通过多次试验得出大豆蛋白肽水解物的最佳添加比例，平衡小米固体发酵培养基碳氮比，促进桑黄菌丝体生长。
3.现有技术中桑黄固体发酵产物采用常规干燥方法进行处理，例如在50～60℃烘箱中烘干，最终得到的产品为黄褐色，营养物质也有一定的损失。为解决上述问题，本发明采用冷冻干燥技术对发酵产物进行处理，获得的小米桑黄发酵产品色泽鲜艳、颜色浅黄、质地蓬松、营养物质丰富，且营养物质保留较好，产品外观和营养品质获得提升。
附图说明
图1为不同干燥方式下的桑黄发酵小米粉。
其中(A)真空干燥方式下的小米粉
(B)真空冷冻干燥方式下的小米粉
(C)真空微波干燥方式下的小米粉
(D)热风干燥方式下的小米粉
(E)自然干燥方式下的小米粉
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但是本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例中涉及的药品及材料，若无特殊说明，均为普通市售产品；涉及的实验方法，若无特殊说明，均为本领域常规操作。
菌种信息：一株桑黄菌株，杨树桑黄(Sanghuangporus vaninii)，保藏时间：30年，保藏地点：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。保藏编号：CGMCC23061。
实施例中的大豆蛋白肽水解物为市售棕褐色液态产品，可购自中食都庆(山东)生物技术有限公司。
实施例中的PDA固体培养基含有马铃薯淀粉5克/升，葡萄糖10克/升，琼脂15克/升。
实施例中的PDA液体培养基含有马铃薯淀粉5克/升，葡萄糖10克/升。
实施例1
桑黄菌株的筛选，步骤如下：
采集山东省临清市桑树林中古桑树上生长的桑黄子实体，将采集的子实体用75％酒精进行表面消毒，以无菌手术刀横切，从切面的中心位置切取约1厘米边长的立方体菌块，置于PDA固体培养基表面，25℃避光条件下培养。待菌丝萌发后，挑取菌丝至新的PDA固体培养基，纯化3次后，将菌丝体接种于PDA斜面固体培养基，25℃避光条件下培养5d，于4℃冰箱保藏备用，共获得6株菌落形态不同的桑黄菌株。
将获得的6株桑黄菌株分别接种于小米固体培养基中，小米固体培养基由水、小米和大豆蛋白水解肽按照质量比30：30：1混合后经121℃灭菌15min后制得，接种时在小米固体培养基中央位置放置约0.5厘米边长的菌丝体块，25℃避光条件下培养，每天观察记录桑黄菌落大小，选取菌落在小米固体培养基中生长速度快、菌丝体生长密实旺盛且菌丝体深入小米固体培养基生长的3株桑黄菌株，并对3株生长速度快的桑黄发酵小米总酚、多糖、蛋白质、抗氧化活性(DPPH、FRAP)指标进行检测分析，结果见表1所示：
表1不同筛选桑黄菌株发酵小米的营养与功能性分析
从上述数据可以看出，选择的三株桑黄菌株中，SH1的各项活性成分的含量均高于其他两株菌株，尤其是多糖含量比其他菌株高出70％～130％，因此确定一株最适合小米发酵的桑黄菌株为SH1；
利用PCR扩增SH1的ITS rDNA片段，并进行测序，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，经分子比对鉴定为该桑黄菌株为粗毛纤孔菌(Inonotushispidus)，命名为GYSH-1。
实施例2
小米桑黄固态发酵培养基的优化，步骤如下：
在实施例1的小米固体培养基中分别加入不同浓度的大豆蛋白水解物，小米与大豆蛋白水解物的质量比分别设置为1：0(不添加)、1：0.01、1：0.03、1：0.05，接种桑黄菌株杨树桑黄(Sanghuangporus vaninii)，接种时在小米基质中央位置放置约0.5厘米边长的菌丝体块，在25℃避光条件下进行固态发酵，每天测定菌丝体生长情况，测定结果如表2所示。由表2可知，在小米与大豆蛋白水解物的质量比为1：0.03时，桑黄菌丝体生长速度最快，继续增加大豆蛋白水解物含量对菌丝体生长促进不明显，故1：0.03为优选大豆蛋白水解物添加量。
表2不同大豆蛋白水解物对小米基质桑黄菌丝体生长速度的影响
从以上表格中可以看出，大豆蛋白水解物对桑黄菌株的生长起到了重要作用，小米与大豆蛋白水解物的质量比为1：0.03，菌落半径大小明显优于其他含量，且该质量比在此时达到最优含量范围，再增加含量对菌丝体生长促进不明显，因此从成本考虑，选择1：0.03为优选大豆蛋白水解物添加量。
实施例3
小米桑黄发酵产品的制备方法，其步骤如下：
(1)将斜面保藏的桑黄菌株杨树桑黄(Sanghuangporus vaninii)菌丝块接种于PDA液体培养基中，培养温度26℃，摇床转速150转/分钟，培养时间5d，获得含有菌丝团的桑黄液体培养物，采用匀浆机破碎后获得桑黄菌丝体液体培养物；
(2)将小米与去离子水混合，小米与去离子水的质量比为1：2，加入大豆蛋白肽水解物，小米与大豆蛋白水解物的质量比为1：0.03，121℃高压蒸汽灭菌20分钟，冷却至室温得小米固体发酵培养基；
(3)将步骤(1)的桑黄菌丝体液体培养物按照接种量1％接种入步骤(2)的小米固体发酵培养基，进行固态发酵，发酵温度25℃，发酵时间10d，发酵在避光条件下完成，得发酵产物；将发酵产物放入金属托盘，于-20℃预冷12h，-40℃预冷2h，置于真空冷冻干燥设备，设定设备参数为：冷阱温度-80℃，真空度15Pa，冷冻干燥时间24h，冷冻干燥结束后于粉碎机中研磨至粉状，获得浅黄色粉状小米桑黄发酵产品。
对比例1
小米桑黄发酵产品的制备方法与实施例相同，不同之处在于，采用其它6株桑黄菌株进行桑黄发酵小米产品的制备。对自筛桑黄菌株与其他6株桑黄菌株发酵小米的总酚、多糖、蛋白质、抗氧化活性(DPPH、FRAP)指标分别进行检测分析，结果见表3所示：
表3筛选的桑黄菌株与微生物保藏中心桑黄菌株发酵小米的营养与功能性分析
从以上数据得出，以菌株GYSH-1发酵小米的总酚、多糖的含量最高，分别为4.18mg/g和213.16mg/g；以菌株CGMCC 5.891发酵小米的蛋白质含量最高，为107.71mg/g；以CGMCC 5.1264发酵小米的DPPH自由基清除活性最高，为96.23％；以CGMCC 5.1263发酵小米的FRAP还原性最好，为104.53mg Trolox/L；但上述的几种菌株的总酚和多糖含量较低，综合各菌株发酵小米的营养与功能性，确定以筛选菌种GYSH-1为最适合用于发酵高营养功能性小米。
对比例2
小米桑黄发酵产品的制备方法与实施例相同，不同之处在于小米的固体培养基中加入不同种类的氮源(加入的量相同)。由表4得出，不同氮源对桑黄发酵菌丝体生长速度的影响差异较大，以小米的固体培养基中加入大豆蛋白水解物最有利于桑黄小米的发酵。
表4不同氮源对小米基质桑黄菌丝体生长速度的影响
对比例3
小米桑黄发酵产品的制备方法与实施例3相同，不同之处在于，将经过固体发酵得到的发酵产物于自然干燥、热风干燥(45℃，干燥12h)、微波干燥(功率500W，干燥5min)、真空微波干燥(98.2～99.2kPa真空度，功率500W，干燥3min)，所用干燥条件均为最优条件，干燥至水分6％，粉碎，得小米桑黄发酵产品。对比不同干燥方式桑黄发酵小米产品的营养与功能性，结果见表5所示，通过对比分析不通干燥方式对小米发酵桑黄产品，确定真空冷冻干燥为桑黄发酵小米产品最优的干燥方式。
表5不同干燥方式下小米发酵桑黄产品活性成分、蛋白质的含量及抗氧化活性
从以上表格中的数据可以看出，真空冷冻干燥方式下，小米发酵桑黄产品活性成分、蛋白质的含量及抗氧化活性最高。产品的总酚含量达到了4.18mg/g，多糖含量高达213.16mg/g，并且蛋白质的含量也是所列举的干燥方式中最高的，高达106.32；此外，DPPH(％)达到了96％，FRAP也达到了104.12mg Trolox/L。
桑黄菌株ITS rDNA片段的核苷酸序列如下：
cgggtaatcctacatgattgaggtcaaaggtgtcaagaaaaaggaggtaacaacaactccttgtccgaccaagcggaccgttagaagcaagctcgttaggcaagcgctcgttggtgaacggaatcaactattacaccgtaagcgcgagccaaagcccagctaatgtatttaagaggagccgacccccttcgaaaggcggccagcagtaaacctccaagtccaaacctcaagcccttcaattaaagaaagacgagcggtttgagataaacatgacactcaaacaggcatgcccctcggaataccaaggggcgcaaggtgcgttcaaagattcgatgattcactgaattctgcaattcacattacttatcgcatttcgctgcgttcttcatcgatgcgagagccaagagatccgttgttgaaagttgtattgattttcgcccacgaggagcattacattcacaaagacaatataagggggggtttgtaacaacaagcccaagtcttcacccgacgcactcccgctcgctttcattttcgaagggttacctaacgagcaacactcgctcgctttcgcccttctactcattacttacaagacagacctcagactactaacttcgactcgcgatatrataaggtgcacagggggtttgagagttggatttgagcgcgaaggccgtgcacatgcgcaaaaattcattcgcgccagcagcaagtctcgctttcaaaactcgataatgatccttccgc
序列表
<110> 中华全国供销合作总社济南果品研究所
<120> 小米发酵桑黄菌株及小米桑黄发酵产品的制备方法
<141> 2022-06-01
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 750
<212> DNA
<213> 杨树桑黄(Sanghuangporus vaninii)
<400> 1
cgggtaatcc tacatgattg aggtcaaagg tgtcaagaaa aaggaggtaa caacaactcc 60
ttgtccgacc aagcggaccg ttagaagcaa gctcgttagg caagcgctcg ttggtgaacg 120
gaatcaacta ttacaccgta agcgcgagcc aaagcccagc taatgtattt aagaggagcc 180
gacccccttc gaaaggcggc cagcagtaaa cctccaagtc caaacctcaa gcccttcaat 240
taaagaaaga cgagcggttt gagataaaca tgacactcaa acaggcatgc ccctcggaat 300
accaaggggc gcaaggtgcg ttcaaagatt cgatgattca ctgaattctg caattcacat 360
tacttatcgc atttcgctgc gttcttcatc gatgcgagag ccaagagatc cgttgttgaa 420
agttgtattg attttcgccc acgaggagca ttacattcac aaagacaata taaggggggg 480
tttgtaacaa caagcccaag tcttcacccg acgcactccc gctcgctttc attttcgaag 540
ggttacctaa cgagcaacac tcgctcgctt tcgcccttct actcattact tacaagacag 600
acctcagact actaacttcg actcgcgata trataaggtg cacagggggt ttgagagttg 660
gatttgagcg cgaaggccgt gcacatgcgc aaaaattcat tcgcgccagc agcaagtctc 720
gctttcaaaa ctcgataatg atccttccgc 750
Claims (9)
1.一株桑黄菌株粗毛纤孔菌（Inonotushispidus）GYSH-1，保藏时间：2021年7月16日，保藏地点：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC No.23061。
2.如权利要求1所述的桑黄菌株粗毛纤孔菌（Inonotushispidus）GYSH-1在发酵小米中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述桑黄菌株粗毛纤孔菌（Inonotushispidus）GYSH-1经过活化后应用于小米发酵中，桑黄菌株粗毛纤孔菌（Inonotushispidus）GYSH-1的活化方法为：将斜面保藏的桑黄菌株粗毛纤孔菌（Inonotushispidus）GYSH-1的菌块接种于PDA液体培养基中，培养温度20～30℃，摇床转速120～180 r/min，培养3～7d，获得含有菌丝团的桑黄液体培养物。
4.小米桑黄发酵产品的制备方法，包括如下的步骤：
（1）将权利要求1所述的桑黄菌株粗毛纤孔菌（Inonotushispidus）GYSH-1活化，得到含有菌丝团的桑黄液体培养物，破碎后获得桑黄菌丝体液体培养物；
（2）将小米与去离子水混合，加入氮源，灭菌，冷却至20~25℃，获得小米固体发酵培养基；
（3）将步骤（1）中的桑黄菌丝体液体培养物接种到步骤（2）的小米固体发酵培养基中，固态发酵后得发酵产物；发酵产物经冷冻干燥、研磨处理后得浅黄色粉状小米桑黄发酵产品。
5.如权利要求4所述的小米桑黄发酵产品的制备方法，其特征在于，（1）中，菌株活化的方法为：将斜面保藏的桑黄菌株菌丝块接种于PDA液体培养基中，培养温度20～30℃，摇床转速120～180 r/min，培养3～7d，获得含有菌丝团的桑黄液体培养物。
6.如权利要求4所述的小米桑黄发酵产品的制备方法，其特征在于，（1）中，采用匀浆机或破碎机对含有菌丝团的桑黄液体培养物进行破碎。
7.如权利要求4所述的小米桑黄发酵产品的制备方法，其特征在于，（2）中，所述小米与去离子水的质量比为1：1～3；氮源为大豆蛋白肽水解物，且小米与大豆蛋白肽水解物的质量比为1：0.01～0.05；灭菌方式为：于115～121℃下高压蒸汽灭菌20 min。
8.如权利要求4所述的小米桑黄发酵产品的制备方法，其特征在于，（3）中，按质量比，所述桑黄菌丝体液体培养物接种的接种量为0.5%～5%；
所述固态发酵的条件为：发酵温度20～30℃，发酵5～10d，发酵在避光条件下完成。
9.如权利要求4所述的小米桑黄发酵产品的制备方法，其特征在于，（3）中，所述冷冻干燥的方法为：将发酵产物于-40～-20℃预冻12～20h后，置于冷冻干燥机-50～-40℃预冷2～5h，然后进行冷冻干燥，冷阱温度-80℃，真空度15Pa，时间为24～48h。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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