CN114306398A

CN114306398A - 桑黄菌发酵提取物的应用

Info

Publication number: CN114306398A
Application number: CN202210117380.1A
Authority: CN
Inventors: 和法涛; 李学震; 刘光鹏; 马艳蕊; 靳梦; 初乐; 赵岩; 吕绪强
Original assignee: JINAN INSTITUTE OF FRUIT PRODUCTS CHINA COOP
Current assignee: JINAN INSTITUTE OF FRUIT PRODUCTS CHINA COOP
Priority date: 2022-02-08
Filing date: 2022-02-08
Publication date: 2022-04-12

Abstract

本发明涉及一种桑黄菌发酵提取物制备改善运动神经元功能的药物/食品中的应用，属于菌类物质提取物的应用技术领域。所述的桑黄菌发酵提取物的制备方法为：桑黄菌菌丝体经过研磨、过筛、微波预处理、超声辅助乙醇提取，通过本发明制备的获得的提取物多酚含量为5.02 mg/g，本发明的桑黄菌发酵提取物改善了运动神经元功能，进一步的，发现了桑黄菌活性成分治疗脑血管疾病的应用，并具有优异的有益效果，为桑黄菌有效成分的应用提供了科学依据。

Description

桑黄菌发酵提取物的应用

技术领域

本发明属于菌类物质提取物的应用技术领域，涉及桑黄菌发酵提取物在制备改善运动神经元功能的药物/食品中的应用，还涉及在制备治疗脑血管疾病的药物或食品中的应用。

背景技术

桑黄菌(Sanghuangprous spp.)是一类黄褐色多年生稀有真菌，通常生长在桑树上，属真菌界(Fungi)担子门(Basidiomycota)伞菌纲(Agaricomycetes)锈革孔菌目(Hymenochaetales)锈革孔菌科(Hymenochaetaceae)桑黄属(Sanghuangporus)。在《神农本草经》和《本草纲目》中有记载，桑黄主治崩漏带下、脾虚泄泻，还可以调理五脏、排除毒素、活血养血。现代研究表明，桑黄菌含有丰富的多糖、黄酮、多酚和贴类物质，这些成分有抗癌、抗氧化、抗炎症、保护肝脏和降血脂等多种功效。

CN110477233A公开了一种桑黄发酵饮料，口感醇正，风味独特，外观品质佳，无明显杂质，药用成分提取率高，药效稳定不刺激，便于吸收，无毒副作用，便于长期引用，提供多种不同口味，克服了口味单一的问题。

CN112791108A公开了一种桑黄活性成分的制备方法及在辅助降血糖药物或食品中的应用，将保藏号为CGMCCNO.21068桑黄菌株(Sanghuangporus sanghung)发酵液过滤得发酵液，加热浓缩后，加95％的乙醇浸泡处理，离心得上清液，旋蒸蒸发进行乙醇回收，收集醇溶物，加水溶解后-20℃冷冻，真空冷冻干燥后粉粹得到桑黄发酵液醇溶样，萃取分级后，进行细胞实验和小鼠实验，证明桑黄菌发酵液提取物有降血糖功效，可用于辅助降血糖食品或药品的研发。

综上所述，桑黄菌的应用主要集中在，发酵饮料研制、发酵产物提取及应用和发酵培养基优化等方面，根据已公开的专利，并没有桑黄菌发酵提取物在改善运动神经元功能的药物或食品中的应用，同样也并没有相关的文献披露桑黄菌发酵提取物在制备治疗脑血管疾病的药物或食品中的应用。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种桑黄菌发酵提取物，实现了其在改善运动神经元功能的药物或食品中的应用；本发明还提供了桑黄菌发酵提取物在制备治疗脑血管疾病的药物或食品中的应用。

将桑黄菌丝体中的有效成分通过微波-超声联合处理，再用有机溶剂提取，得到桑黄菌活性成分。本发明首次利用联合处理提取的方式，用斑马鱼实验检测桑黄菌活性成分改善运动神经元的功能，进一步的，发现了桑黄菌活性成分治疗脑血管疾病的应用，为桑黄菌有效成分的应用提供了科学依据。

本发明中的桑黄菌菌株，由临清市哲硕农产品有限公司提供，其表观特征为：生长初期为浅黄色，中期生长为亮光色，后期生长为深黄色，边缘整齐圆形。经过基因测序和基因对比鉴定为瓦尼桑黄菌(Sanghuangpours Vaninii)。

本发明是通过以下技术方案实现的：

桑黄菌发酵提取物在制备改善运动神经元功能的药物/食品中的应用，其中，所述桑黄菌发酵提取物的制备步骤如下：

(1)桑黄菌液态发酵6～7d，得到液体发酵菌丝体，将发酵液抽滤，分离，用蒸馏水清洗3～5次，洗净后放入-40℃冰箱预冷冻，之后冷冻干燥，得菌丝体冻干粉；

(2)菌丝体冻干粉，研磨，过60目筛后，微波预处理，再以乙醇为提取剂，超声提取，得到桑黄菌发酵提取物。

其中，液体发酵菌丝体中总多酚的含量为4.9～5.1mg/g。

优选的，所述步骤(2)中微波预处理时间为3min，微波功率为1000W

优选的，所述步骤(2)中乙醇浓度为50％。

优选的，所述步骤(2)中菌丝体冻干粉与乙醇比例为1:55g/mL

优选的，所述步骤(2)中超声提取功率为35kHz，超声温度70℃，超声时间30min。

优选的，所述桑黄菌株发酵的菌丝体的发酵过程为：接种量按体积百分比6～12％；培养时间5～7d，摇床转速120～180r/min，培养温度25～30℃。

优选的，所述的液体发酵菌丝体的制备方法为：

(1)在无菌超净台内，将斜边菌种接种与固体培养基中，接种块大小为0.5cm²，接种完成后，26℃静置培养7～11d；

(2)用平板打孔器取0.5cm²的菌块4块，接入装有100mLPDB培养基的250mL三角瓶中，25～30℃，150r/min进行发酵培养7d，获得发酵种子液；

(3)采用500mL三角瓶装入200mL液体培养基，桑黄菌接种11.6％(体积)，28℃下，150r/min摇瓶培养7d。

更优选的，(3)中所述的液体培养基制备方法为：小米粉24.00g加入到100℃沸水中，20min；采用4层纱布过滤一次后，向过滤液中加入酵母粉10g、桑叶粉10g、KH₂PO₄ 1.08g、MgSO₄·7H₂O 1g、CaCl₂ 1g，用蒸馏水定容至1000mL，调pH值为6.5，后进行500mL三角瓶分装。

本发明所提供的桑黄菌发酵提取物实现在制备治疗脑血管疾病的药物或食品中的应用，同样也是本发明所要重点保护的内容。

上述的桑黄菌发酵提取物，是通过如下的步骤制备所获得的：

液体发酵菌丝体中总多酚的含量为4.9～5.1mg/g，多糖含量为39.54～56.77mg/g；

优选的，所述步骤(2)中乙醇浓度为50％。

优选的，所述步骤(2)中菌丝体冻干粉与乙醇比例为1:55g/mL

优选的，所述的液体发酵菌丝体的制备方法为：

(1)在无菌超净台内，将斜边菌种接种于固体培养基中，接种块大小为0.5cm²，接种完成后，26℃静置培养7～11d；

(2)用平板打孔器取0.5cm²的菌块4块，接入装有100mLPDB培养基的250mL三角瓶中，25～30℃，150r/min进行发酵培养7d，获得发酵种子液。

优选的，液体发酵菌丝体中总多酚的含量为5.02％。

本发明的有益效果在于：

本发明首次利用联合处理提取桑黄菌有效物质的方式，得到了桑黄菌发酵提取物，经过斑马鱼实验检测，本发明的桑黄菌发酵提取物具有改善运动神经元的功能，进一步的，本发明的桑黄菌发酵提取物还具有治疗脑血管疾病的功能。

本发明菌丝体总多酚得率为4.9～5.1mg/g，本发明人通过3组平行实验，得出了菌丝体总多酚得率分别为4.98mg/g、5.02mg/g和5.05mg/g，平均为5.02mg/g，菌丝体总多酚在该含量范围内的液体发酵菌丝体，其发酵液经过抽滤、分离、冷冻、研磨、微波预处理后，再以乙醇为提取剂，超声提取得到的桑黄菌发酵提取物，验证桑黄菌提取物改善斑马鱼运动神经效果中的作用，证明了本发明所提供的桑黄菌发酵提取物在改善运动神经元功能、治疗脑血管疾病方面有显著的效果。

附图说明

图1为微波预处理/温度/超声提取/料液比浓度单因素实验折线图；

图2为桑黄菌提取物浓度/斑马鱼致死率折线图；

图3不同试验组斑马鱼神经元长度的显微图；

图4不同试验组斑马鱼脑血管显微图像。

图5为斑马鱼行为学统计图，其中，A为斑马鱼在20min内游动总距离，B为斑马鱼在20min内游动轨迹图，C为斑马鱼每分钟的平均速度；*表示与Ctl组相比有显著性，#表示与MPTP组相比有显著性，p＜0.0001。

图6为超声时间/乙醇浓度/料液比/超声温度浓度单因素实验折线图；

具体实施方式

为了使本领域技术人员更了解本发明，本发明人将通过具体实施例对本发明进行更进一步的说明，但并不以此限制本发明。

实施例1

桑黄菌发酵提取物的制备方法，包括以下的步骤：

(1)在无菌超净台内，将斜边菌种接种与固体培养基中，接种块大小为0.5cm²，接种完成后，26℃静置培养7d；

(2)用平板打孔器取0.5cm²的菌块4块，接入装有100mLPDB培养基的250mL三角瓶中，25℃，150r/min进行发酵培养7d，获得发酵种子液；

(3)制备液体培养基，将小米粉24.00g加入到100℃沸水中，20min；采用4层纱布过滤一次后，向过滤也中加入酵母粉10g、桑叶粉10g、KH₂PO₄ 1.08g、MgSO₄·7H₂O 1g、CaCl₂1g，用蒸馏水定容至1000mL，调pH值为6.5，后进行500mL三角瓶分装，采用500mL三角瓶装入200mL液体培养基，桑黄菌接种11.6％(体积)；

(4)桑黄菌液态发酵28℃，150r/min摇瓶培养7d，得到液体发酵菌丝体，将发酵液抽滤，分离，用蒸馏水清洗3次，洗净后放入-40℃冰箱预冷冻，之后冷冻干燥，得菌丝体冻干粉；

(5)菌丝体冻干粉，研磨，过60目筛后，1000W微波预处理3min，再加入55mL 50％的乙醇作为提取剂，70℃下，35kHz超声提取30min，得到桑黄菌发酵提取物。

通过检测，桑黄发酵提取物有效物质如下表：

表1：桑黄菌多酚提取物的主要化合物

实施例2

按实施例1的步骤，以单因素试验探究菌丝总多酚提取率的最优方案，以微波功率、温度、超声提取时间，料液比作为变量，实验结果如下：

由图1a可知，当微波功率一定时，预处理时间从1min上升到9min的过程中，桑黄菌菌丝体总多酚提取率先升高后降低，在3min时，达到最大。当微波预处理时间超过3min后，菌丝体总多酚提取率随预处理时间增加而逐渐降低。

由图1b可知，在设定的40～80℃范围内总多酚提取率呈现先升高再降低的趋势，随者温度的升高总多酚提取率不断升高，在60℃时到达最高，之后随着温度的升高逐渐降低。

由图1c可知，超声提取时间从10增加到20min，菌丝总多酚提取率明显提升，20min以后开始缓慢下降。与未经微波预处理的样品相比，样品提取率的最高点从30min降低到20min。

由图1d可知，当料液比从1:25g/mL下降到1:65g/mL过程中，菌丝体总多酚提取率明显上升，料液比为1:55g/mL时提取率达到最高点，在表1中，料液比是指菌丝体冻干粉与乙醇的重量体积比(g/mL)。

表2：正交试验设计结果及极差分析

微波预处理-超声提取桑黄菌丝总多酚的提取率与微波时间(a)、超声温度(b)、超声时间(c)和料液比(d)有密切关系，因此采用L9(3⁴)正交表进行微波预处理-超声提取最佳工艺研究，结果如表所示，每次实验进行三组平行实验，结果取平均值。由正交实验极差的结果可知，上述四种因素对杨树桑黄菌丝体总多酚得率的显著性次序为b＞d＞c＞a，即超声温度＞料液比＞超声时间＞微波时间。根据分析结果，选择出提取工艺的最佳组合为a₂b₃c₃d₂，即微波预处理时间3min，超声温度70℃，超声时间30min，料液比1:55g/mL。该组合没出现在正交表中，故进行验证实验。按照所得的最优提取工艺，进行3组平行实验，菌丝体总多酚得率分别为4.98mg/g、5.02mg/g和5.05mg/g，平均为5.02mg/g。

实施例3

按实施例1的步骤，以单因素试验探究菌丝总多酚提取率的最优方案，以超声辅助提取时间、乙醇浓度、超声辅助提取温度，料液比作为变量，研究对桑黄菌菌丝体总多酚得率的影响，实验结果如下：

(1)超声辅助提取时间对桑黄菌菌丝体总多酚得率的影响

由图6a可知，在设定的超声时间10-50min范围内，菌丝体总多酚的得率随着时间的延长而增加，从10min开始到30min随着时间的延长杨树桑黄菌丝多酚得率不断上升，30-50min随着时间的延长多酚得又不断下降，这是因为长时间的超声波会破坏多酚类化合物结构，也会导致三萜、醇溶性蛋白等物质溶解出来，阻碍多酚类化合物的溶出，增加后续分离和纯化的工作难度。

(2)乙醇浓度对总多酚得率的影响

乙醇浓度对杨树桑黄总多酚得率的影响见图6b，在设定的50-90％乙醇浓度范围内菌丝总多酚呈现先上升后减小的趋势，当乙醇浓度为60％时，得率最大。杨树桑黄菌丝体内含有多糖、蛋白和萜类等水溶性物质，乙醇浓度小于60％时，有利于菌丝体内水溶性物质的溶出。然而多数酚类物质都带有羟基基团，因此当乙醇浓度过高时，这些具有极性基团的多酚类物质就不能溶出，从而导致总多酚得率下降。

(3)料液比对总多酚得率的影响

图6c，料液比从1:15g/mL降低至1:45g/mL，菌丝总多酚得率不断上升，在1:45g/mL时达到最大值，高于1:45g/mL以后菌丝总多酚得率趋于平缓，没有得到明显的提升。经分析，试验点1:45g/mL与1:35g/mL的p＜0.05，差异显著，与1:55g/mL的p＞0.05，差异不显著。

(4)超声辅助提取温度对总多酚得率的影响

超声温度对菌丝总多酚得率的结果见图6d。在设定的40-80℃范围内，总多酚得率呈现先上升再减小的趋势，当温度从40℃提升到50℃后，总多酚的得率明显提升，这表明乙醇溶液的渗透能力随着温度的升高而加强；同时在热效应的作用下，有利于细胞内多酚类物质向胞外扩散。当温度超过50℃后，总多酚的得率明显下降，且呈现线性关系，这是因为在超声波和热的双重作用下破坏了酚类物质的结构，从而导致得率降低。

表3：超声辅助提取正交试验结果及极差分析结果

由单因素试验结果可知，超声辅助提取桑黄菌丝总多酚的得率与超声时间(a)、乙醇浓度(b)、液料比(c)和提取温度(d)有密切关联，因此采用L9(3⁴)正交试验对超声提取法进行工艺优化，结果如表3所示，每个试验共三组平行，结果取平均值。

通过正交试验结果的极差分析可知，上述四个因素对杨树桑黄菌丝体多酚得率影响显著性次序为b＞d＞c＞a，即乙醇浓度＞提取温度＞液料比＞超声时间。根据总多酚的得率，选择出最佳提取工艺：a₃b₁c₃d₃，即：超声时间20min，乙醇浓度50％，液料比1:55g/mL，提取温度60℃。该组合没有出现在上述正交表中，故进行验证试验。

按如下多酚检测方法检测多酚含量：

准确称量1mg没食子酸，溶于10mL 70％乙醇作为母液。取9支100mL容量瓶分别移取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6上述标准液，添加5mL Folin-Ciocalteu试剂，50mL蒸馏水，摇匀后加15mL浓度为1mol/L的Na₂CO₃溶液，用蒸馏水定容至刻度线，于室温下避光反应2h后，在765nm下测吸光度，以吸光度为纵坐标，没食子酸浓度为横坐标绘制标准曲线，并进行线性回归分析。标准曲线为：y＝1.3208x+0.0006，R2＝0.9985。

按照得出的最优工艺条件进行3组平行试验，总多酚得率分别为4.89mg/g、4.85mg/g、4.87mg/g,平均得率为4.87mg/g。

实施例4

桑黄菌提取物改善运动神经效果和安全浓度的测定，步骤如下：

1.构建斑马鱼动物模型：

成年野生AB型斑马鱼、转基因Vmat斑马鱼和Vegf型斑马鱼根据标准化流程进行养殖。鱼房实用日光灯照射，光亮周期为14h，光暗周期为10h，温度维持在28±1℃，早晚各饲喂一次专用鱼饲料。将斑马鱼雌鱼：雄鱼(1:1/1:2)的比例放入鱼缸种进行自然产卵，收集的鱼卵清洗后保存在含有2mg/L的次甲基蓝养殖水中，培养箱28℃孵育12h后脱膜使用。

斑马鱼在脱膜72h后多巴胺神经元基本发育完全。因此，在脱膜后按照筛选出的3个浓度分别对对转基因Vmat斑马鱼和Vegf斑马鱼进行MPTP造模和给药处理，在培养72h后在荧光显微镜下分别观察神经元和脑血管的发育状况。

2.给药处理

采用100-1000μg/mL较广的药物浓度，给药24h后，100μg/mL实验组的死亡率为33.30％，其余浓度组全部死亡。采用75-95μg/mL浓度组给药72h后小鱼均有存活，80-95μg/mL开始有大量死亡现象，培养70和75μg/mL浓度组死亡率分别为15.60％和60％，随后采用5-60μg/mL较小的浓度组进行试验，给药120h后，60μg/mL时的死亡率小于10％。最后可以确定，60μg/mL以下为安全浓度，因此，选择15、30、60μg/mL进行后续实验。

由图3和表4的统计数据可知，与空白组相比造模组的斑马鱼神经元长度明显缩短，与空白组比值为0.62±0.04(p＜0.001)，这表明运动缺陷斑马鱼模型造模成功，在经过桑黄菌菌丝体提取物处理后，三个浓度组均有不同程度的改善，与空白组的比值分别为，0.81±0.06,0.98±0.06和0.93±0.04，这表明经过提取物处理后斑马鱼运动神经元恢复良好。其中，30μg/mL浓度组恢复效果最好，与空白组相比没有显著性(p＜0.001)。

图4表示不同试验组斑马鱼脑血管显微图像，可以明显看出对照组的斑马鱼脑血管完成充盈，排列有序；相比之下，造模组脑部血管前部、中部和后部有着不同程度的缺失。经过桑黄菌菌丝体提取物处理后，脑血管数量均有不同程度的恢复。

表4：斑马鱼神经元长度和荧光度

注：*表示与空白组比有显著性，#表示与空白组比值有显著性，p＜0.0001。

实施例5

为进一步证明桑黄发酵提取物对运动神经元的改善效果，本研究对不同试验组给药五天后的AB型斑马鱼进行行为学测试：

如图5所示，与对照组相比，经MPTP处理后野生型斑马鱼游动距离明显减少；不同浓度(15μg/mL、30μg/mL、60μg/mL)桑黄多酚提取物与MPTP共处理后斑马鱼游动距离显著增加。其中15μg/mL和30μg/mL浓度组之间没有显著性差异，而60μg/mL浓度组的游动总距离高于对照组。以上结果表明，桑黄菌多酚提取物可以显著改善帕金森斑马鱼的行为状态。

实施例6

测定桑黄发酵提取物多糖的方法步骤如下：

依据NY/T 1676-2008《食用菌中粗多糖含量的测定》标准进行指导和操作。

菌丝体多糖质量测定：

取扩大培养后待测的桑黄发酵液进行抽滤，抽滤所得的菌丝体70℃烘干至恒重，称重。

将烘干后的菌丝体转移至50mL置塞离心管中，采用超声辅助热水浸提法提取菌丝体多糖。将样品溶液置超声提取器中超声提取30min，后于4000r/min离心10min，弃上清液，不溶物再用10mL乙醇洗涤，离心。将不溶物转移至锥形瓶中，加入50mL蒸馏水，沸水浴中提取2h。冷却至室温、过滤，上清液转移至100mL容量瓶，残渣洗涤2～3次，洗涤液转至容量瓶中，加水定容。此溶液为样品测定液。取稀释后的菌丝体样品溶液1mL，加入1.0mL 5％苯酚溶液，然后快速加入5.0mL浓硫酸。使用涡旋振荡器振摇，静置10min后在30℃水浴20min，于490nm处测定吸光度。以葡萄糖标准溶液为参比绘制标准曲线，得到线性回归方程：y＝8.84X+0.007(R²＝0.9992)。计算多糖含量(mg/mL，以葡萄糖计)。

测得上述实施例桑黄发酵提取物的多糖含量范围为：39.54～56.77mg/g。

Claims

1.桑黄菌发酵提取物在制备改善运动神经元功能的药物/食品中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述桑黄菌发酵提取物是通过下述的提取方法制备获得的：

（1）桑黄菌液态发酵6~7d，得到液体发酵菌丝体，将发酵液抽滤，分离，用蒸馏水清洗3~5次，洗净后-40℃下预冷冻，之后冷冻干燥，得菌丝体冻干粉；

（2）菌丝体冻干粉，研磨，过60目筛后，微波预处理，再以乙醇为提取剂，超声提取，得到桑黄菌发酵提取物；

桑黄菌发酵提取物中总多酚的含量为4.9～5.1 mg/g。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，（1）中，所述的液体发酵菌丝体的制备方法为：

S1：在无菌超净台内，将斜边菌种接种于固体培养基中，接种块大小为0.5 cm²，接种完成后，26℃静置培养7~11 d；所述桑黄菌株发酵的菌丝体的发酵过程为：接种量按体积百分比6~12%；培养时间5~7 d，摇床转速120~180 r/min，培养温度25-30℃；

S2：用平板打孔器取0.5 cm²的菌块4块，接入装有100mL PDB培养基的250 mL三角瓶中，25~30℃，150 r/min进行发酵培养7 d，获得发酵种子液；

S3：采用500 mL三角瓶装入200 mL液体培养基，接种量按体积百分比11.6%，28℃，150r/min摇瓶培养7 d，得到液体发酵菌丝体。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，S3中，所述的液体培养基的制备方法为：小米粉24.00 g加入到100℃沸水中，20 min；采用4层纱布过滤一次后，向过滤液中加入10g酵母粉、10g桑叶粉、1.08g KH₂PO₄、1g MgSO₄∙7H₂O、1g CaCl₂，用蒸馏水定容至1000 mL，调pH值为6.5，后用500 mL三角瓶分装。

5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，（2）中，微波预处理时间为3 min，微波功率为1000 W；

乙醇浓度为50%；

菌丝体冻干粉与乙醇比例为1:55 g/mL；

超声提取功率为35 kHz，超声温度70℃，超声时间30 min。

6.桑黄菌发酵提取物在制备治疗脑血管疾病的药物或食品中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述桑黄菌发酵提取物是通过下述的提取方法制备获得的：

（1）桑黄菌液态发酵6~7d，得到液体发酵菌丝体，将发酵液抽滤，分离，用蒸馏水清洗3~5次，洗净后放入-40℃冰箱预冷冻，之后冷冻干燥，得菌丝体冻干粉；

（2）菌丝体冻干粉，研磨，过60目筛后，微波预处理，再以乙醇为提取剂，超声提取，得到桑黄菌发酵提取物。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，（1）中，所述的液体发酵菌丝体的制备方法为：

S1：在无菌超净台内，将斜边菌种接种与固体培养基中，接种块大小为0.5 cm²，接种完成后，26℃静置培养7~11 d；所述桑黄菌株发酵的菌丝体的发酵过程为：接种量按体积百分比6~12%；培养时间5~7 d，摇床转速120~180 r/min，培养温度25-30℃；

S3：采用500 mL三角瓶装入200 mL液体培养基，接种量按体积百分比11.6%，28℃，150r/min摇瓶培养7 d。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，S3中，所述的液体培养基的制备方法为：小米粉24.00 g加入到100℃沸水中，20 min；采用4层纱布过滤一次后，向过滤也中加入10g酵母粉、10g桑叶粉、1.08g KH₂PO₄、1g MgSO₄∙7H₂O、1g CaCl₂，用蒸馏水定容至1000 mL，调pH值为6.5，后用500 mL三角瓶分装。

10.如权利要求7所述的应用，其特征在于，（2）中，微波预处理时间为3 min，微波功率为1000 W；

（2）中，乙醇浓度为50%；

菌丝体冻干粉与乙醇比例为1:55 g/mL；

超声提取功率为35 kHz，超声温度70℃，超声时间30 min。