KR100836568B1 - 왕겨 추출물을 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 왕겨 추출물을 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물에 관한 것으로, 왕겨로부터 추출한 모미락톤 B를 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물을 제공함으로써, 고형암에 선택적으로 항암활성을 증가시킬 수 있는 의약품 등에 응용할 수 있게 되었다.

모미락톤 B, 항암, 왕겨

Description

왕겨 추출물을 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물{Anticancer agent with rice hull extracts as active ingredient from rice hulls}

도 1은 본 발명에 따른 왕겨 추출물의 대장암 세포주 HT-29의 세포성장 억제능을 나타낸 그래프이다.

도 2는 본 발명의 왕겨 추출물에서 항암성을 가지는 물질을 1차 NMR 측정하여 ¹H NMR 스펙트럼(A)과 ¹³C NMR 스펙트럼(B)을 나타낸 그래프이다.

도 3은 본 발명의 왕겨 추출물에서 항암성을 가지는 물질을 1차 NMR 측정하여 HMBC(A), HMQC(B) 및 COSY(C)의 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.

도 4는 본 발명의 모미락톤 B를 대장암 세포주 HT-29와 SW620에 처리하고 24시간 후(A), 48시간 후(B) 및 72시간 후(C) 세포성장 억제능을 나타낸 그래프이다.

도 5는 본 발명의 모미락톤 B를 대장암 세포주 HT-29와 SW620에 처리하고, 콜로니 형성의 억제능을 나타낸 그래프이다.

도 6은 본 발명의 모미락톤 B를 정상세포주 CCD986sk에 처리하고, 이의 세포성장 억제능을 나타낸 그래프이다.

본 발명은 왕겨 및 모미락톤 B를 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 농산 가공 부산물인 왕겨를 알콜로 추출하고, 이로부터 모미락톤 B를 분리한 다음, 부가가치가 높은 항암용 조성물로 개발하는 것에 관한 것이다.

최근 암 화학요법이 진보됨에 따라 신규 항암제 혹은 치료법이 개발되어 암에 대한 치료나 수명 연장이 기대되고 있는 가운데, 특히 백혈병, 악성 임파종, 전림선암 등 일부의 암에 대하여는 높은 치료효과를 얻고 있다. 그 반면, 치료 중에 항암제에 저항성을 나타내는 내성암이 나타나기도 하고, 항암제에 거의 반응하지 않는 소화기암을 대표하는 고형암이 존재하고 있어 여전히 암은 선진국의 사망원인의 제 1위를 차지하고 있다. 그 가운데서도 염산이리노데칸(CPT-Ⅱ), 파크리탁셀(택솔) 등의 새로운 항암제가 발견됨에 따라 혈액암 뿐만 아니라 일부의 고형암에 대하여도 어느 정도는 기대할 수 있게 되었지만, 약제 저항성과 정상세포와의 선택성의 문제는 아직도 많은 문제점으로 남아 있다. 그 가운데서도 임상에 사용되고 있는 항암제들의 가장 큰 문제점은 암세포와 정상세포를 선택적으로 구분 할 수 없는 것이 가장 큰 문제점이라 할 수 있다. 이와 같은 문제점을 해결하기 위하여 여러 각도에서 암 생물학에 관한 연구가 진행되어 세포의 암화, 약제내성이나 전이 등 분자수준에서의 암의 특성에 대하여 연구되어 왔다. 암 분자 표적 약제로서 성공한 예로는 Bcr-Abl 저해제인 Gleevec과 EGF receptor tyrosine kinase 저해제인 Iressa 등을 들 수가 있다.

현재 천연물을 중심으로 하는 항암제의 개발은 전통적으로 오랜 기간 민간요법 등으로 사용되어져 오던 식물 등의 추출물들을 현대 세포생물학적 연구의 발달로 확립된 암 유전자, 암 억제 유전자, 시그날 전달인자, 약제 내성 감수성 인자 및 apoptosis 관련 인자 등 암 분자표적을 중심으로 스크리닝하여 활성물질을 분리, 정제하고 그 활성물질의 구조를 결정하는 항암제의 개발이라 할 수 있다. 특히, 천연소재 중 쌀은 아시아, 아프리카 및 라틴 아메리카 지역의 주식으로 이용되고 있는 중요한 곡물로서 우리나라에서도 연간 약 530만 톤 이상 생산되며, 쌀의 도정 시 발생하는 왕겨는 쌀 생산량의 18-20%를 차지하는 것으로서, 연간 100만 톤 이상 발생되는 것으로 추정하고 있다.

최근의 연구 결과에 따르면, 쌀의 도정 시 발생되는 왕겨는 외부 환경의 산화적 작용에 대항하기 위하여 천연적으로 많은 항산화물질과 생리활성물질을 보유하고 있는 것으로 알려져 미활용 생리활성물질의 중요한 자원으로 생각되어 지고 있다.

이에 본 발명자들은 버려지는 미활용 농산 가공물인 왕겨의 메탄올 추출물로부터 신규 고부가가치 항암활성물질을 분리해 내어 화학구조 및 이화학적 특성을 규명한 결과 본 화합물이 모미락톤 B(momilactone B)라는 것과 생물활성 등을 규명한 결과, 대장암세포주의 성장을 억제하는 활성을 나타냄을 밝혀 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 미활용 자원인 왕겨를 소재로 하여 추출물로부터 대장암 세포주의 성장을 억제하는 활성이 우수한 신규한 용도의 화합물을 제공하는데 있다.

또한 본 발명의 다른 목적은 상기 강력한 대장암 세포주의 성장을 억제하는 활성과 정상세포에는 영향을 주지 않는 유효한 성분으로 함유하는 추출물을 제공하는데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 왕겨 추출물을 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.

이때, 여기서 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가진다.

또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.

본 발명에서 왕겨(rice hulls)는 벼의 겉겨를 말한다.

본 발명은 모미락톤 B를 사용하여 암 질환을 치료하는 항암용 조성물로 개발할 수 있도록 한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 모미락톤 B를 거의 폐기되고 있는 왕겨로부터 추출할 수 있게 한 것이다.

이때, 본 발명에서는 왕겨를 유기 용매로부터 모미락톤 B을 추출하는 것이 바람직하다. 구체적으로 메탄올 또는 에탄올 등의 알콜을 사용할 수 있다.

따라서, 본 발명은 보다 구체적으로 모미락톤 B를 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 왕겨로부터 항암 성분 중에 하나인 모미락톤 B를 추출하기 위하여, 먼저 왕겨를 알콜에 추출하는 단계; 상기 메탄올 추출물을 에틸아세테이트로 분액 추출하고 실리카겔 컬럼 크로마토그래피, 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피, 역상 TLC를 실시하여 분리하고 다시 아세토니트릴 용매 하에 HPLC를 실시하여 본 발명 화합물 모미락톤 B(momilactone B)를 정제하는 단계; 를 포함한다.

하지만, 본 발명의 왕겨 추출물과 모미락톤 B 화합물은 왕겨로부터 분리 및 추출하는 것은 상술한 방법에 의해 국한 되는 것은 아니며, 이 외의 공지의 방법을 단독 또는 적합하게 조합하여 획득할 수 있다.

또한, 레밍톤 약제학 핸드북 (Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook, Mack Pub, Co.,N.Y., USA)에 개시된 것과 같이, 본 발명의 모미락톤 B를 유효성분으로 하여, 투여방법, 투여형태 및 치료목적에 따라 적절한 약제학적 조성물의 형태로 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 혼합하여 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입하여 사용한다.

그리고, 상기 담체가 희석제로 사용되는 경우에는 염수, 완충제, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 링거액, 락토즈, 수크로즈, 칼슘 실리케이트, 메틸 셀룰로오즈 또는 에탄올을 담체를 사용하여 경구투여와 비경구투여용으로 분말, 과립, 주사액, 시럽, 용액제, 정제, 좌약 등과 같은 제형으로 제조한다. 다만, 본 발명의 담체가 상기의 담체로 한정되는 것은 아니다.

이때, 비경구 투여는 경구 이외에 직장, 정맥, 복막, 근육, 동맥, 경피, 비강, 흡입 등을 통해 약제의 투여를 의미한다.

그리고, 상기 제형에 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함하여 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 제형화할 수 있다.

한편, 본 발명의 항암용 조성물에서 모미락톤 B의 유효량은 암의 종류, 투여경로, 제형, 사용하는 목적, 환자의 질환 경중(輕重)에 따라 당업자에 의해 결정할 수 있을 것이다.

이하, 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 보다 더 상세히 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에서 당업자에게 명백한 것이다.

[실시예 1] 본 발명 왕겨 메탄올 추출물로부터 대장암 세포주의 생육억제활성

본 실시예에서는 본 발명 왕겨 메탄올 추출물의 대장암세포주의 생육억제능을 측정하기 위하여 인간 유래의 대장암 세포주 HT-29을 사용하여 엠티티 리덕션 에세이(MTT reduction assay)를 실시하였다. 본 세포를 RPMI1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂의 항온기에서 배양하여 96-well 플레이트에 1.5×10⁴ cells/well의 농도로 넣어 24시간 배양한 후, 본 발명 왕겨 메탄올 추출물을 처리하였다. 24시간 후 96-well 플레이트에 있는 배지를 제거하고, 엠티티 용액을 10㎕ 씩 넣은 후, 다시 37℃, 5% CO₂의 항온기에서 1시간 배양하여 폴마젼을 형성을 확인한 뒤 96-well 플레이트에 디엠에스오 용액 100㎕씩 넣은 후 마이크로플래트리더를 이용하여 570 nm에서 활성을 측정하였다.

이의 결과, 도 1에 도시한 바와 같이, 왕겨 추출물을 처리하지 않은 대조구에 비해, 본 발명의 왕겨 메탄올 추출물을 0.5, 5, 50 및 500 mg/ml로 처리한 대장암 세포주에서는 엠티티 리덕션이 반비례적으로 낮아지는 것을 알 수 있었다.

즉, 본 발명 왕겨 메탄올 추출물이 대장암 세포주에서 강한 항암활성이 있음을 알 수 있었다.

[실시예 2] 본 발명 왕겨 메탄올 추출물로부터 대장암 세포주 생육억제 물질의 분리

상기 본 발명 왕겨 메탄올 추출물 20 g을 에틸아세테이트로 분액 추출하고 상기 추출액을 감압하에서 농축하여 용매를 제거한 다음, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하였다. 이때 용출용매 조건은 크로로포름-메탄올(50:1)의 혼합용매에서부터 메탄올의 비율을 높여 극성을 높이면서 크로로포름-메탄올(1:1) 혼합용매까지 용출하여 분획하였다. 그리고, 각 분획 중 대장암 세포주 생육억제능을 나타 내는 분획만을 모으고, 이를 100% 메탄올 용매로 포화시킨 세파덱스 LH-20 컬럼에서 크로마토그래피를 실시하여 활성 분획만을 모았다. 이때, 모아진 활성분획을 70% 메탄올 용매로 하여 HPLC를 실시함으로써 순수하게 정제된 무색 화합물 BL-1(7 mg)을 수득하였다.

그리고, 상기 수득된 무색 화합물 BL-1의 화학구조를 규명하기 위하여 ¹H NMR 스펙트럼, ¹³C NMR 스펙트럼 등의 1차원 NMR(도 1) 및 HMBC, HMQC, COSY 스펙트럼과 같은 2차원 NMR(도 2)를 측정하였다.

이의 결과로부터 BL-1의 화합물 구조가 모미락톤 B(momilactone B)라는 것을 확인할 수 있었다.

[실시예 3] 본 발명의 화합물 모미락톤 B(momilactone B)의 대장암 세포주 생육억제 활성

본 실시예에서는 본 발명 화합물 모미락톤 B의 항암활성을 측정하기 위하여 먼저, 인간 대장암 세포주 유래의 HT-29과 SW620 세포주를 이용하였으며 세포사 측정은 엠티티 리덕션 에세이를 실시하였다. 본 세포주들을 RPMI1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂의 항온기에서 배양하여 96-well 플레이트에 1.5×10⁴ cells/well의 농도로 넣어 72시간 배양한 후, 본 발명 왕겨 메탄올 추출물을 처리하였다. 24, 48, 72시간 후 96-well 플레이트에 있는 배지를 제거하고, 엠티티 용액을 10㎕ 씩 넣은 후, 다시 37℃, 5% CO₂의 항온기에서 1시간 배양하여 폴마젼 형성을 확인하고, 96-well 플레이트에 디엠에스오 용액 100㎕씩 넣은 후 마이크로플래트리더를 이용하여 570 nm에서 활성을 측정하였다.

이의 결과, 도 4에 도시된 바와 같이, 모미락톤 B을 처리하지 않은 대조구에 비해 모미락톤 B를 0.5, 1, 5 및 10 mM로 처리한 대장암 세포주들에서는 현저히 높은 항암활성을 나타내었으며, 특히 HT-29 세포주보다 SW620 세포주에서 높은 활성을 확인하였다.

또한, 본 발명의 화합물 모미락톤 B의 항암활성을 측정하기 위하여 인간 대장암 세포주 유래의 HT-29과 SW620 세포주를 이용한 콜로니 형성능을 측정하였다. 먼저, 본 세포주들을 RPMI1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂의 항온기에서 배양하고 6-well 플레이트에 1×10⁵ cells/well의 농도로 넣어 24시간 배양한 후, 본 발명 모미락톤 B를 처리하여 하였다. 그리고, 24 시간 후 6-well 플레이트에 있는 배지를 제거하고, 트립신 처리를 하여 세포들을 모은 뒤 다시 12-well 플레이트에서 7 일간 배양하였다. 이때, 형성된 콜로니를 4% 파라포름알데히드로 고정한 다음 트립판블루 용액으로 염색하여 활성을 확인하였다.

이의 결과, 도 5에 도시한 바와 같이, 모미락톤 B을 처리하지 않은 대조구에 비해 모미락톤 B를 0.5, 1 및 5 mM로 처리한 대장암 세포주들에서는 현저히 높은 항암활성을 나타내었으며 HT-29 세포주보다 SW620 세포주에서 높은 활성을 확인하였다.

그리고, 본 발명의 화합물 모미락톤 B의 정상 세포주 독성을 측정하기 위하여 인간 피부 유래의 파이브로브라스트 세포주(fibroblast)인 CCD986sk 세포주를 이용 하였으며, 세포사 측정은 엠티티 리덕션 에세이를 실시하였다. 먼저, 본 세포주를 RPMI1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂의 항온기에서 배양하여 96-well 플레이트에 1.5×10⁴ cells/well의 농도로 넣어 24시간 배양한 후, 본 발명 모미락톤 B를 처리하였다. 24 시간 후 96-well 플레이트에 있는 배지를 제거하고, 엠티티 용액을 10㎕ 씩 넣은 후, 다시 37℃, 5% CO₂의 항온기에서 1시간 배양하여 폴마젼을 형성을 확인하고 96-well 플레이트에 디엠에스오 용액 100㎕씩 넣은 후 마이크로플래트리더를 이용하여 570 nm에서 활성을 측정하였다.

이의 결과, 도 6에 도시한 바와 같이, 모미락톤 B을 처리하지 않은 대조구에 비해, 모미락톤 B를 5와 10 mM로 처리한 파이브로브라스트 세포주에서 낮은 세포독성을 확인하였다.

상술한 바와 같이, 본 발명은 국내에서 생산되는 농산 가공 부산물인 왕겨 추출물에서 항암활성의 특성을 확인하고, 상기 왕겨 추출물로부터 모미락톤 B 화합물을 분리하고, 이로부터 인간 대장암 세포주 유래의 HT-29와 SW620 세포주에 대해서 항암활성을 보이는 반면 정상 세포주에서는 세포독성은 거의 없는 효능을 입증함으로써, 고형암에 선택적으로 항암활성을 증가시킬 수 있는 의약품 등에 응용할 수 있게 된 것이다.

또한, 본 발명은 거의 폐기되고 있는 왕겨로부터 고가의 의약품을 제조할 수 있게 되어, 경제적 가치는 물론 산업상 매우 유용한 것이다.

그리고, 전술한 개시에 대해서 일정 범위의 수정, 변화 및 치환이 가능하며, 어떤 경우에는 본 발명의 특징 중 일부만이 사용될 수도 있다. 따라서, 첨부된 청구항들이 넓게 또한 본 발명의 사상과 범위에 부합되게 해석되어야 한다.

Claims (4)

1. 삭제
2. 왕겨 추출물을 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물.
3. 제 2 항에 있어서,

   상기 왕겨 추출물은 유기 용매로 추출한 것임을 특징으로 하는 항암용 조성물.
4. 제 3 항에 있어서,

   상기 유기 용매는 메탄올 또는 에탄올인 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.

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