WO2020040600A1 - 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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WO2020040600A1
WO2020040600A1 PCT/KR2019/010774 KR2019010774W WO2020040600A1 WO 2020040600 A1 WO2020040600 A1 WO 2020040600A1 KR 2019010774 W KR2019010774 W KR 2019010774W WO 2020040600 A1 WO2020040600 A1 WO 2020040600A1
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cancer
formula
alkyl
compound represented
composition
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PCT/KR2019/010774
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윤도영
김수진
오세량
류형원
김두영
안경섭
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건국대학교 산학협력단
한국생명공학연구원
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    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis

Definitions

  • the present invention relates to a novel use of the compound represented by the formula (1) which can be usefully used for the prevention or treatment of cancer.
  • Cancer is one of the leading causes of death and accounts for about 25.6% of deaths worldwide.
  • Breast cancer in particular, is the leading cause of cancer mortality in women around the world. About 20,000 women suffer from breast cancer every year and are expected to increase in number.
  • Breast cancer can be treated with postoperative resection if diagnosed early. However, treatment can be difficult if breast cancer spreads to organs such as lymph glands, bones, lungs, brain, or skin. This refers to the process by which tumor cells from the primary site metastasize to other secondary sites in the host. The invasion of cells into the surrounding tissues is essential in this process and is a major characteristic of malignant cancer cells, and the degradation of the extracellular matrix (ECM) and the basement membrane can promote tumor cell migration and invasion.
  • ECM extracellular matrix
  • Arthraxon hispidus is an annual plant with a monocotyledonous rice plant and is a common weed growing in trenches or roadsides. It is mainly distributed in warm regions of Asia, such as China, Korea, Manchuria, Japan, Mongolia, Siberia, India, and Malaysia. There are 15 species distributed throughout the world, and one species grows domestically. The height is about 20-50 cm. The stalk is rooted at the bottom, roots are spread from the stem node, and the upper part is raised obliquely. The leaves are oval, and the leaves are wrapped around the stems and have hairs on the edges. In September-October, three to twenty spikes of flower run in the shape of a palm.
  • the present inventors completed the present invention by confirming the mechanism of inhibiting metastasis of ER (+) breast cancer and inhibiting metastasis of mLU8C-PU and orientin extracted from clam grass.
  • the present invention is to prevent cancer selected from the group consisting of breast cancer, non-small cell lung cancer, cervical cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, osteosarcoma and hepatocellular carcinoma comprising the compound represented by the formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient Or it provides a pharmaceutical composition for treatment.
  • the present invention is from the group consisting of breast cancer, non-small cell lung cancer, cervical cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, osteosarcoma and hepatocellular carcinoma comprising a compound represented by the formula (2), which is a c-Jun N terminal kinase (JNK) phosphorylation inhibitor as an active ingredient It provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer selected.
  • a compound represented by the formula (2) which is a c-Jun N terminal kinase (JNK) phosphorylation inhibitor as an active ingredient
  • JNK c-Jun N terminal kinase
  • the present invention is a group consisting of breast cancer, non-small cell lung cancer, cervical cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, osteosarcoma and hepatocellular carcinoma comprising a compound represented by the formula (3) as a signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) inhibitory activity as an active ingredient It provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer selected from.
  • STAT3 signal transducer and activator of transcription 3
  • the present invention is a cancer of the cancer selected from the group consisting of breast cancer, non-small cell lung cancer, cervical cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, osteosarcoma and hepatocellular carcinoma comprising a compound represented by the formula (1) or a food acceptable salt thereof as an active ingredient It provides a food composition for prevention or improvement.
  • the present invention is a cancer selected from the group consisting of breast cancer, non-small cell lung cancer, cervical cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, osteosarcoma and hepatocellular carcinoma comprising a compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient
  • a prophylactic or therapeutic pharmaceutical composition comprising a compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient
  • a prophylactic or therapeutic pharmaceutical composition is provided.
  • R 1 is C 1 -C 3 alkyl or hydroxy C 1 -C 3 alkyl
  • R 2 is hydrogen or C 1 -C 3 alkyl
  • Indicates that a bond exists or does not exist Represents a single bond or a double bond, and the single bond or the double bond does not appear continuously.
  • R 1 may be methyl or hydroxy methyl
  • R 2 may be methyl or hydrogen
  • the compound may be a compound represented by the following formula (2) or formula (3).
  • the cancer may be breast cancer.
  • the active ingredient can inhibit metastasis of breast cancer.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer selected from the group.
  • STAT3 signal transducer and activator of transcription 3 activator is a breast cancer, non-small cell lung cancer, cervical cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, osteosarcoma and hepatocellular carcinoma comprising a compound represented by the formula (3) as an active ingredient It provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer selected from the group consisting of.
  • breast cancer, non-small cell lung cancer, cervical cancer, ovarian cancer comprising the step of administering or taking a composition comprising the compound represented by the formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient to an individual
  • a method of preventing or treating cancer selected from the group consisting of pancreatic cancer, osteosarcoma and hepatocellular carcinoma.
  • composition of the composition represented by the formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof of the composition comprising breast cancer, non-small cell lung cancer, cervical cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, osteosarcoma and hepatocellular carcinoma
  • a prophylactic or therapeutic use provided by the composition of the composition represented by the formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof of the composition comprising breast cancer, non-small cell lung cancer, cervical cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, osteosarcoma and hepatocellular carcinoma.
  • the present invention can provide a compound that can be usefully used for the prevention or treatment of cancer.
  • the compound of the present invention since it has an effect of inhibiting the migration and invasion of cancer cells, it can be usefully used as an anticancer agent, a therapeutic agent for inhibiting cancer metastasis, or a health functional food material for preventing / improving breast cancer metastasis.
  • the compound orientin of the present invention inhibits the membrane potential of PCK ⁇ and phosphorylation of ERK and inhibits the nuclear potential of AP-1 and STAT3, thereby inhibiting the levels of MMP-9 and IL-8, thereby mobilizing and invading cancer cells. Can be suppressed.
  • the compound mLU8C-PU of the present invention can inhibit the migration and invasion of cancer cells by reducing the activity of PKC ⁇ and JNK to inhibit the translocation of AP-1 and NF- ⁇ B transcription factors into the cell nucleus.
  • Figure 1 schematically shows the mechanism of action of mLU8C-PU and orientin of the present invention.
  • Figure 2a schematically shows the manufacturing process of the clam fraction.
  • Figure 2b schematically shows the process of obtaining an active fraction from the clam.
  • Figure 3 shows the liquid chromatography fractionation results for clam extract and solvent fractions.
  • ER (+) MCF-7 cells were pretreated with TPA (50 nM) with a single compound at various concentrations (0, 5, 10, 20 and 40 ⁇ M) for 24 hours and then each compound (mLU8C-PU (7-methoxy-) luteolin-8-C- ⁇ - (6-deoxyxylopyranos-3-uloside), AG8C-GS (apigenin-8-C- ⁇ -glucoside), AP8C-FP (apigenin-8-C- ⁇ -fucopyranoside), Orientin, The effect of KF7O-GS and LU7 ⁇ -GS) on the survival rate of MCF-7 breast cancer cells was confirmed by MTS analysis, and also by matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) and interleukin-8 (IL)
  • MMP-9 analysis of the effect of mLU8C-PU and orientin on MMP-9 activity. It was evaluated by gelatin zymography and qRT-PCR analysis in TPA treated MCF-7 breast cancer cells. MCF-7 cells were pretreated with mLU8C-PU or orientin at various concentrations (0, 5, 10, 20 and 40 ⁇ M) followed by TPA (50 nM) for 24 hours. The activity of MMP-9 was quantified by gelatin zymography. MRNA levels of MMP-9 were quantified by qRT-PCR analysis. * P ⁇ 0.05 (TPA alone vs TPA + mLU8C-PU), ** p ⁇ 0.01 (TPA alone vs TPA + mLU8C-PU).
  • TPA-treated MCF-7 breast cancer cells were evaluated by qRT-PCR analysis and ELISA.
  • MCF-7 cells were pretreated with mLU8C-PU or orientin at various concentrations (0, 5, 10, 20 and 40 ⁇ M) followed by TPA (50 nM) for 24 hours.
  • 7A and 7D show the results of analyzing IL-8 protein levels by ELISA.
  • 7B and 7C show the results of analyzing mRNA levels of IL-8 by qRT-PCR analysis.
  • ** p ⁇ 0.01 (TPA only vs TPA + mLU8C-PU).
  • FIG. 8 analyzes the effects of mLU8C-PU and orientin on membrane translocation of PKC ⁇ and translocation of ERK.
  • TPA-treated MCF-7 breast cancer cells were evaluated by western blotting.
  • MCF-7 cells were pretreated with mLU8C-PU or orientin at various concentrations (0, 5, 10, 20 and 40 ⁇ M) followed by TPA (50 nM) for 30 minutes.
  • 8a and 8c show the results of Western blotting analysis of PKC ⁇ (protein kinase C ⁇ ) and PKC ⁇ protein levels.
  • 8b and 8d show Western blot analysis of p-ERK, p-JNK and p-p38 protein levels.
  • ** p ⁇ 0.01 TPA only vs TPA + mLU8C-PU).
  • Figure 9 analyzes the effect of mLU8C-PU and orientin on the expression of transcription factors.
  • TPA-treated MCF-7 breast cancer cells were evaluated by fractionation and immunofluorescence assay. MCF-7 cells were pretreated for 1 hour with various concentrations (0, 5, 10, 20 and 40 ⁇ M) of mLU8C-PU or orientin followed by TPA (50 nM) for 30 minutes.
  • 9A shows the results of fractional evaluation of the levels of activator protein-1 (AP-1), nuclear factor-kappa B (NF- ⁇ B) and STAT3 transcription factors.
  • 9B shows the results of evaluation of the levels of AP-1 and NF- ⁇ B transcription factors by immunofluorescence.
  • 9C shows pretreatment of MCF-7 cells with mLU8C-PU and JNK inhibitor (SP600125) or individually for 1 hour followed by TPA (50nM) for 30 minutes followed by AP-1 and NF- ⁇ B transcription factors.
  • the result of evaluation of the level by fractional method shows the results of fractional evaluation of the levels of AP-1, NF- ⁇ B and STAT3 transcription factors.
  • 9E shows the results of immunofluorescence assay for the levels of AP-1 and STAT3 transcription factors.
  • Figure 9F shows MCF-7 cells pretreated with orientin and ERK inhibitor PD98059 or separately for 1 hour followed by TPA (50nM) for 30 minutes followed by fractionation of levels of AP-1 and STAT3 transcription factors. It is an evaluation result.
  • * p ⁇ 0.05 (TPA only vs TPA + mLU8C-PU)
  • ** p ⁇ 0.01 (TPA only vs TPA + mLU8C-PU).
  • FIG. 10 analyzes the effect of mLU8C-PU and orientin on cell infiltration and MMP-9 and IL-8 expression.
  • the JNK inhibitor SP600125 (or ERK inhibitor PD98059) was used to analyze Matrigel infiltration, qRT-PCR, ELISA and gelatin zymography in TPA-treated MCF-7 breast cancer cells.
  • MCU-7 cells were pretreated with or separately from mLU8C-PU and JNK inhibitor SP600125 (or, Orientin and ERK inhibitor PD98059) at various concentrations (0, 5, 10, 20 and 40 ⁇ M) and then TPA (50 nM). ) was treated for 24 hours.
  • Figure 10a, 10e is the result of cell infiltration analysis by Matrigel (Matrigel) infiltration assay.
  • 10B and 10F show the results of analyzing MMP-9 and IL-8 mRNA levels by qRT-PCR.
  • 10C and 10G show the results of analyzing IL-8 protein levels by ELISA.
  • 10D and 10H show the results of analyzing MMP-9 activity by gelatin zymography. * p ⁇ 0.05 (TPA only vs TPA + mLU8C-PU), ** p ⁇ 0.01 (TPA only vs TPA + mLU8C-PU).
  • 11 is a comparative analysis of the cancer metastasis inhibitory effect of orientin, luteolin, LU8C-FP through wound-healing analysis and infiltration analysis.
  • Figure 13 compares the cancer metastasis inhibitory effect of mLU8C-PU, luteolin, LU8C-FP through wound-healing analysis and infiltration analysis.
  • Figure 14 shows zymography, qPCR, ELISA analysis for mLU8C-PU, luteolin, LU8C-FP.
  • the present invention is a cancer selected from the group consisting of breast cancer, non-small cell lung cancer, cervical cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, osteosarcoma and hepatocellular carcinoma comprising a compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient
  • a prophylactic or therapeutic pharmaceutical composition comprising a compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient
  • the active ingredient can suppress metastasis of cancer.
  • R 1 is C 1 -C 3 alkyl or hydroxy C 1 -C 3 alkyl
  • R 2 is hydrogen or C 1 -C 3 alkyl
  • Indicates that a bond exists or does not exist Represents a single bond or a double bond, and the single bond or the double bond does not appear continuously.
  • R 1 may be methyl or hydroxy methyl
  • R 2 may be methyl or hydrogen
  • the compound may be a compound represented by the following formula (2) or formula (3).
  • the compounds can inhibit MMP-9 and IL-8, which are metastatic factors of various cancers, and through inhibition of MMP-9 and IL-8, breast cancer, non-small cell lung cancer, cervical cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, osteosarcoma and hepatocytes Cancer can be prevented or treated selected from the group consisting of cancer.
  • the cancer may be breast cancer, more preferably ER (+) breast cancer.
  • the active ingredient can suppress metastasis of cancer, preferably breast cancer, more preferably ER (+) breast cancer.
  • sugars are decomposed by microbial secretion enzymes or strong acids in the intestine because they are flavones in the form of C-glycosides of CC bonds rather than O-glycosides.
  • microbial secretion enzymes or strong acids in the intestine because they are flavones in the form of C-glycosides of CC bonds rather than O-glycosides.
  • the compounds represented by Formula 1, Formula 2 and Formula 3 may be luteolin glycosides derived from clam.
  • Compounds represented by Formula 1, Formula 2 and Formula 3 may be a component extracted from the clam grass using a solvent containing at least one selected from the group consisting of water, distilled water and C1 ⁇ C6 alcohol.
  • composition may further comprise one or more selected from the group consisting of pharmaceutically acceptable carriers, excipients and diluents.
  • cancer metastasis refers to a condition in which a malignant tumor has spread to other tissues away from the organ. As a malignant tumor originating from one organ progresses, it spreads from the first organ, which is the first site, to other tissues. Metastasis is a phenomenon that accompanies the progression of malignant tumors. As malignant tumor cells proliferate and cancer progresses, metastasis may occur as a result of acquiring new genetic traits. Metastasis can occur when tumor cells with new genetic traits invade blood vessels and lymph glands, circulate along blood and lymph, and settle and proliferate in other tissues.
  • composition of the present invention can not only prevent and treat cancer spread by inhibiting metastasis, but can also improve, prevent and treat cancer-related diseases derived from metastasis.
  • the term “inhibition” refers to any action that inhibits the development of cancer-related diseases derived from such cancer metastasis or metastasis by administration of a composition according to the invention.
  • prevention refers to any action that inhibits or delays the development of a cancer-related disease derived from the cancer metastasis or metastasis by administration of a composition according to the invention.
  • treatment refers to any action that improves or advantageously alters the symptoms of a cancer-related disease derived from the cancer metastasis or metastasis by administration of a composition according to the invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may also be used as a single agent, and may be prepared and used as a complex preparation, further including a pharmaceutical composition known to have a recognized anti-transduction effect.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated in a pharmaceutical unit dosage form by adding a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, or diluent.
  • pharmaceutically acceptable is meant that it does not significantly irritate the organism and does not inhibit the biological activity and properties of the administered active substance.
  • composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier in the present invention may be a variety of oral or parenteral formulations.
  • diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents and surfactants are usually used.
  • Solid form preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, which form at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose (at least one compound). lactose) and gelatin.
  • lubricants such as magnesium stearate, talc and the like are also used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions, and syrups, and various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin, may be included.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • non-aqueous solvent and the suspension solvent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, Tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the pharmaceutical composition is any one selected from the group consisting of tablets, pills, powders, granules, capsules, suspensions, liquid solutions, emulsions, syrups, sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized preparations and suppositories. It may have a formulation of.
  • At least one component selected from the group consisting of a compound represented by Formula 1, a compound represented by Formula 2, a compound represented by Formula 3, and a pharmaceutically acceptable salt thereof may be a pharmaceutical. It may be included in an academically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount refers to an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and an effective dose level refers to an individual type and severity, age, sex, activity of the drug. , Drug sensitivity, time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, factors including concurrent use of drugs, and other factors well known in the medical arts.
  • compositions of the present invention may be administered as individual therapeutic agents or in combination with other therapeutic agents and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And single or multiple administrations. In consideration of all the above factors, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect in a minimum amount without side effects, and can be easily determined by those skilled in the art.
  • Preferably in the present invention may be included in 0.001 to 50% by weight, more preferably 0.001 to 20% by weight based on the total weight of the pharmaceutical composition.
  • the present invention provides a method of preventing or treating cancer by administering the composition to a subject in need thereof.
  • the present invention also provides a method of preventing or treating cancer metastases derived from metastasis by administering the composition to a subject in need of preventing or treating cancer related disorders derived from cancer metastasis suppression or metastasis.
  • the subject is an individual in need of preventing or treating cancer, or an individual in need of preventing or treating a cancer-related disease derived from cancer metastasis inhibition or metastasis, and a human-related disease and similar symptoms derived from cancer metastasis or metastasis as well as humans.
  • Mammals such as cattle, horses, sheep, pigs, goats, camels, antelopes, dogs, cats, etc. that require treatment of, may be, but are not limited thereto.
  • the term "administration" refers to introducing a pharmaceutical composition of the present invention to a patient in any suitable manner, and the route of administration of the composition of the present invention may be various oral or parenteral routes as long as the target tissue can be reached. It can be administered through.
  • the method of treatment comprises administering the composition in a pharmaceutically effective amount. It will be apparent to those skilled in the art that a suitable total daily usage may be determined by the practitioner within the scope of good medical judgment. It may also be administered once or in divided doses. However, for the purposes of the present invention, the specific therapeutically effective amount for a particular patient is determined by the specific composition, including the type and severity of the reaction to be achieved, whether or not other agents are used in some cases, the age, weight, general state of health, It is desirable to apply differently depending on various factors and similar factors well known in the medical field, including sex and diet, time of administration, route of administration and rate of composition, duration of treatment, drugs used with or co-specific with the specific composition.
  • the present invention is a breast cancer, non-small cell lung cancer, cervical cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, osteosarcoma and hepatocytes comprising the compound represented by the formula (2), which is a c-Jun N terminal kinase (JNK) phosphorylation inhibitor as an active ingredient
  • JNK c-Jun N terminal kinase
  • the present invention is a breast transducer, non-small cell lung cancer, cervical cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, osteosarcoma and hepatocytes comprising a compound represented by the formula (3) as a signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) inhibitor It provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer selected from the group consisting of cancer.
  • STAT3 signal transducer and activator of transcription 3
  • the present invention is a group consisting of breast cancer, non-small cell lung cancer, cervical cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, osteosarcoma and hepatocellular carcinoma comprising the compound represented by Formula 1 or a food acceptable salt thereof as an active ingredient It provides a food composition for the prevention or improvement of cancer selected from.
  • the food composition may have a function of helping to prevent or ameliorate cancer, or to suppress metastasis or occurrence of metastasis-related diseases described above.
  • the food composition of the present invention includes the form of pills, powders, granules, acupuncture, tablets, capsules or liquids, and the like to which the composition of the present invention can be added, for example, various foods, for example, Drinks, gums, teas, vitamin complexes, and dietary supplements.
  • the food composition may be added to other ingredients that do not interfere with the activity of the active ingredient, the kind is not particularly limited.
  • various herbal extracts, food acceptable additives, natural carbohydrates, and the like may be contained as additional ingredients, such as conventional foods.
  • the term "food supplement” means a component that can be added to food supplements, and can be appropriately selected and used by those skilled in the art as being added to prepare a health functional food of each formulation.
  • food additives include flavors such as various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), synthetic and natural flavors, colorants and fillers, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners. , pH regulators, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated beverages, and the like, but is not limited to the kind of food additives of the present invention by the above examples.
  • natural carbohydrates examples include monosaccharides such as glucose, fructose, and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose and the like; And conventional sugars such as polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • natural flavoring agents tauumatin, stevia extract (e.g., rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be advantageously used. .
  • the food composition of the present invention may include a health functional food.
  • the term "health functional food” refers to a food prepared and processed in the form of tablets, capsules, powders, granules, liquids, and pills using raw materials or ingredients having useful functions for the human body.
  • functional means to obtain a useful effect for health purposes such as nutrient control or physiological action on the structure and function of the human body.
  • the health functional food of the present invention can be prepared by a method commonly used in the art, and the preparation can be prepared by adding raw materials and ingredients commonly added in the art.
  • unlike the general medicine has the advantage that there is no side effect that can occur when taking a long-term use of the drug as a raw material, and can be excellent in portability.
  • the mixed amount of the active ingredient can be determined suitably according to the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment).
  • the components of the present invention (compound represented by the following formula 1, at least one of two compounds represented by the following formula 2) is 1 to 10% by weight, preferably 5 to 10% by weight of the raw material composition Is added in an amount of%.
  • the amount may be used below the above range.
  • the food to which the substance may be added include meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, dairy products including ice cream, various soups, beverages, teas, drinks, Alcoholic beverages and vitamin complexes, and the like and include all of the health foods in the conventional sense.
  • the present invention may provide a c-Jun N terminal kinase (JNK) phosphorylation inhibitor comprising a compound represented by the formula (2).
  • JNK c-Jun N terminal kinase
  • the present invention can provide a method of inhibiting c-Jun N terminal kinase (JNK) phosphorylation by treating the inhibitor in vitro.
  • JNK c-Jun N terminal kinase
  • the present invention can provide a signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) inhibitory activity comprising the compound represented by the formula (3).
  • STAT3 signal transducer and activator of transcription 3
  • the present invention can also provide a method of inhibiting the activity of STAT3 by treating the inhibitor in vitro.
  • Shellfish (Arthraxon hispidus (Thunb.)) was harvested in Janhowon-eup, Icheon-si in December 2017 (A voucher specimen (KRIB 0079082), and stored in KRIBB herbarium (Daejeon, Korea). 55 ° C.), dried to remove water, and then ground to a size of about 1 cm, and 32 L of methanol was added based on the dry weight of the ground powder sample, and extracted three times at room temperature. , And dried to 40 °C to obtain 404.5 g (extract yield 10.37%) of shellfish extract (methanol extract).
  • distilled water 0.5 L was added to the methanol extract (100 g), and then suspended.
  • the hexane fraction was removed and ethyl acetate was added to the remaining water layer in the same amount to obtain an ethyl acetate fraction (30.2 g).
  • Flash column chromatography was performed to separate and prepare an active fraction from the fraction.
  • the clam extract and column fractions obtained above were analyzed by ultra performance liquid chromatography (UPLC).
  • the clam extract and solvent fractions were filtered once with a 0.25 mm membrane filter for UPLC, and then a column (Waters BEH C18 column, 2.1 ⁇ 100 mm, 1.7 ⁇ m) was mounted on the UPLC instrument (Waters UPLC-QTOF-MS). Each filtered fraction was then loaded in 5 ⁇ l amounts.
  • the solvent is water + 0.1% formic acid (A) / acetonitrile + 0.1% formic acid (B) [0-1 minutes, 5% B; 1-11 minutes, 5-100% B; 11-13.2 minutes, 100%; 13.2-13.33 min, 100-5%; 13.3-15 min, 5%], and the elution rate was 0.4 ml / min.
  • a UV and mass spectrometry (MS) as a detector was confirmed the degree of separation of the solvent fractions in the chromatographic format of the material separated from the UPLC (Fig. 3).
  • active fraction AE13B-2-i-m active fraction AE13B-2-i-m
  • Chemical Formula 1 7-methoxy-luteolin-8-C- ⁇ -6-deoxy- xylo-pyranos-3-uloside, mLU8C-PU
  • Compound 1 the compound represented by the following formula (luteolin 8-C- ⁇ -glucopyranoside) (Compound 2, 10.0 mg)
  • apigenin 8-C - ⁇ fucopyranoside apigenin 8-C- ⁇ -fucopyranoside (233 mg)
  • apigenin 8-C-glucoside apigenin 8-C-glucoside, 13.6 mg
  • the 1D ( 1 H, 13 C, and DEPT) and 2D (COSY, HMQC, and HMBC) NMR spectra for the obtained compounds were obtained using TMS (tetramethylsilane) as internal standard, Bruker AM 400 / Bruker Obtained with DRX 500 spectrometers (Bruker).
  • HRESIMS was measured using UPLC-QTOF-MS (ultra performance liquid chromatography quadrupole time of flight mass spectrometer) (Waters, Milford, MA, USA) in negative-ion mode.
  • MCF-7 cell line which is a human-derived breast cancer, was used, and TPA (phorbol-12-myristate-13-acetate) was used as an inducer for inducing metastasis to confirm metastasis inhibition effect.
  • MCF-7 cell line was obtained from Korea Cell Line Bank (KCLB, No. 40071) (Seoul, Korea) and 10% heat-inactivated FBS, 1% penicillin and streptomycin ( cultured in DMEM medium containing streptomycin). Cells were cultured under 37 ° C. and 5% CO 2 , medium was changed every 2 days, and passaged to eliminate overdose due to cell proliferation.
  • MCF-7 cells The degree of infiltration of MCF-7 cells was measured using Transwell chamber plates coated with an insert chamber with Matrigel. 1.5 ⁇ 10 5 cells were added per well and the cells were treated with TPA. After incubation for 24 hours, the cells passed through the Matrigel and moved to the lower chamber were identified through a microscope.
  • MMP-9 a representative enzyme involved in breast cancer metastasis.
  • the cells were suspended in DMEM containing MCF-7 cells and then divided into 6 well plates so that the number of cells was 6 ⁇ 10 5 cells / ml and incubated in a 37 ° C. 5% CO 2 incubator for 24 hours. After exchange with fresh DMEM medium, the material was treated with cells and incubated for 1 hour, then treated with stimulant TPA and incubated for 24 hours. After 24 hours, only the supernatant was collected and electrophoresed on 0.1% gelatin-containing SDS-polyacrylamide gel to separate proteins by size.
  • gelatin incubation buffer containing 5 mM CaCl 2 , 0.2M NaCl, 50mM Tris ( pH 7.5) and reacted by shaking at 70 rpm in a 37 ° C. incubator for 20 to 24 hours. After the reaction, the gel was stained with Coomassie blue solution.
  • RT-PCR Reverse transcription-polymerase chain reaction
  • This experiment is to qualitatively check mRNA levels of MMP-9 and IL-8, which are representative factors involved in breast cancer metastasis.
  • the cells were suspended in DMEM containing MCF-7 cells, and then divided into 6 well plates so as to have a cell number of 6 ⁇ 10 5 cells / ml and incubated in a 37 ° C. 5% CO 2 incubator for 24 hours. After exchange with fresh DMEM medium, the material was treated with cells and incubated for 1 hour, then treated with stimulant TPA and incubated for 24 hours. After removing the supernatant, 1 ml of Easy-Blue was added and left for 2 minutes, followed by chloroform, vortexed for 10 seconds, and centrifuged at 12,000 rpm for 15 minutes.
  • the supernatant was taken and the same amount of isopropanol was mixed and shaken. The supernatant was removed by centrifugation at 12,000 rpm for 10 minutes and the pellet was dissolved in 20 ml of diethyl pyrocarbonate (DPC) -DW and used for RT-PCR. After reacting for 30 minutes at 45 °C, 5 minutes at 94 °C using RT-PCR kit (kit) denaturation for 30 seconds at 94 °C, annealing (annealing) at 55 ⁇ 62 °C 30 seconds Next, after 30-35 cycles of the extension for 1 minute at 72 ° C, the last extension was carried out in a PCR machine at 72 ° C for 5 minutes. Each PCR product was loaded on 2% agarose gel and analyzed by electrophoresis for 30 minutes at 100 V.
  • DPC diethyl pyrocarbonate
  • MCF-7 cells were suspended in DMEM and then aliquoted in 3 wells of 6 ⁇ 10 5 cells / ml in 6 well plates (Corning, USA) and incubated in a 37 ° C. 5% CO 2 incubator for 24 hours. After exchange with fresh DMEM medium, the material was treated with cells and incubated for 1 hour, then treated with stimulant TPA and incubated for 24 hours. After removing the supernatant, 1 ml of Easy-Blue was added and left for 2 minutes, followed by chloroform, vortexed for 10 seconds, and centrifuged at 12,000 rpm for 15 minutes.
  • the supernatant was taken and the same amount of isopropanol was mixed and shaken. The supernatant was removed by centrifugation at 12,000 rpm for 10 minutes, and the pellet was dissolved in 20 ml of diethyl pyrocarbonate (DPC) -DW and used for RT-PCR. The mRNA produced was quantitatively confirmed.
  • DPC diethyl pyrocarbonate
  • IL-8 a representative cytokine involved in breast cancer metastasis.
  • the secretion of IL-8 was quantitatively identified through a sandwich ELISA, followed by a supernatant.
  • the secretion of IL-8, a metastasis-related cytokine produced from MCF-7 cells induced by TPA, was measured as follows. The plate was inoculated at 6 ⁇ 10 5 cells / mL using DMEM medium and incubated 24 hours before in a 5% CO 2 incubator incubator, and then incubated with TPA and material for 24 hours.
  • the secretion amount of IL-8 cytokine in cell culture was measured using an ELISA kit.
  • an anti-mouse IL-8 was dispensed with a capture antibody in an ELISA microplate and coated overnight at 4 ° C. It was washed with PBST with 0.05% Tween 20 and blocked with 10% FBS solution. After washing with PBST, the culture supernatant was dispensed on each microplate and allowed to react for 2 hours at room temperature. After reaction, biotinylated anti-mouse IL-8 detection antibody and streptavidin-horseradish peroxidase conjugate were washed and diluted with PBST. The reaction was carried out at room temperature for 1 hour. Then washed again with PBST and OPD solution was added to the dark reaction for 30 minutes at room temperature. 2 NH 2 SO 4 was dispensed to terminate the reaction and then absorbance was measured at 490 nm using a microplate reader.
  • MCF-7 cells were suspended in DMEM and then seeded in a cell culture dish to a cell number of 6 ⁇ 10 5 cells / ml and incubated in a 37 ° C. 5% CO 2 incubator for 24 hours. After exchange with fresh DMEM medium, the material was treated with cells and incubated for 1 hour, and then treated with stimulant TPA and incubated. One hour exposure to TPA was performed to determine MAPK activity.
  • Transferred membranes were placed in 5% skim milk dissolved in Tris-buffered saline Tween (TBST) -20 (20 mM Tris, pH 7.6, 136 mM NaCl, 0.1% Tween 20). After blocking at room temperature for an hour, anti-phospho-ERK and anti-ERK, anti-phospho-JNK and anti-JNK (anti-JNK), anti-phospho-p38 and anti-p38 MAP kinase and ⁇ -actin primary antibody (1: 1000) dilution) overnight at 4 ° C. and then washed three times with TBST and room temperature for 1 hour with HRP-conjugated secondary antibody (1: 1000 dilution). Reaction at After washing three times with TBST, immunoreactive protein bands were detected on the X-ray films using enhanced chemiuminescence regents (ECL) (Amersham, Little Chalfont, UK).
  • ECL enhanced chemiuminescence regents
  • MCF-7 cells were suspended in DMEM and then dispensed in a cell culture dish to a cell number of 6 ⁇ 10 5 cells / ml and incubated in a 37 ° C. 5% CO 2 incubator for 24 hours. After exchange with fresh DMEM medium, the material was treated with cells and incubated for 1 hour, and then treated with stimulant TPA and incubated. TPA was exposed for 30 minutes to measure MAPK activity.
  • the medium is removed and washed with cold PBS, followed by Nuclear, Cytoplasmic Extraction Reagents kit, plasma membrane and cytoplasmic extraction reagents kit, and the nuclear, cytosol, and plasma membranes. ) was separated.
  • TPA 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate
  • IL-8 interleukin-8
  • AP-1 activator protein-1
  • STAT3 signal transducer and activator of transcription 3
  • ERK extracellular signal-regulated kinase
  • MAPKs mitogen-activated protein kinases.
  • MMP-9 matrix metalloproteinase-9;
  • MMP-9 and IL-8 were examined through zymography, RT-qPRC, and ELISA experiments.
  • the degree of MMP-9 and IL-8 markedly increased by TPA was orientin.
  • concentration-dependently reduced by mLU8C-PU FIGS. 6 and 7. From these results, orientin and mLU8C-PU decreased the activity of MMP-9 and IL-8 in MCF-7 breast cancer cells. It can be seen that it inhibits the migration and invasion of TPA-induced cells.
  • Orientin reduces the activity of PKC ⁇ (protein kinase C ⁇ ) and ERK (extracellular signal-regulated kinase).
  • AP-1 activator protein-1
  • STAT3 transcription 3
  • ERK inhibits AP-1, STAT3, MMP-9 and IL-8 as a higher regulatory factor in the effect of orientin resistance.
  • mLU8C-PU was found to reduce the activity of PKC ⁇ (protein kinase C ⁇ ) and JNK (c-Jun N terminal kinase). Moreover, mLU8C-PU inhibited the translocation of activator protein-1 (AP-1) and nuclear factor-kappa B (NF- ⁇ B) transcription factors into the cell nucleus. In addition, it was confirmed that JNK inhibits AP-1, NF- ⁇ B, MMP-9 and IL-8 as the upper regulatory factors in the mechanism of the anti-allergic effect of mLU8C-PU.
  • PKC ⁇ protein kinase C ⁇
  • JNK c-Jun N terminal kinase
  • the changes of cellular signaling proteins involved in the activity of MMP-9, IL-8, MAPK, PKC, and transcription factors were analyzed.
  • the above ingredients are mixed and filled in an airtight cloth to prepare a powder.
  • tablets are prepared by tableting according to a conventional method for producing tablets.
  • the capsules are prepared by filling the gelatin capsules according to a conventional method for preparing capsules.
  • Foods containing mLU8C-PU or orientin of the present invention are prepared as follows.
  • 0.05-5.0 parts by weight of mLU8C-PU or orientin of the present invention is added to the flour and this mixture is used to prepare bread, cakes, cookies, crackers and noodles.
  • mLU8C-PU or orientin of the present invention 0.05 to 5.0 parts by weight is added to milk, and the milk is used to prepare various dairy products such as butter and ice cream.

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Abstract

본 발명은 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있는 화학식 1로 표시되는 화합물의 신규 용도에 관한 것이다. 더욱 구체적으로 본 발명의 화합물은 MMP-9와 IL-8의 수준을 억제하거나 PKCα와 JNK의 활성을 감소시켜 암 세포의 이동 및 침윤을 억제할 수 있다.

Description

화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물
본 출원은 2018년 8월 23일 출원된 대한민국 특허출원 제10-2018-0098751 호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
본 발명은 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있는 화학식 1로 표시되는 화합물의 신규 용도에 관한 것이다.
암은 주요 사망 원인 중 하나이며 전 세계 사망자의 약 25.6 %를 차지한다. 특히 유방암은 전 세계 여성 암 사망률의 주요 원인이다. 유방암으로 매년 약 2 만 명의 여성이 고통을 겪고 있으며 그 수가 증가 할 것으로 예상되고 있다. 유방암은 일찍 진단 될 경우 수술 후 절제를 통해 치료될 수 있다. 그러나 유방암이 림프선, 뼈, 폐, 뇌, 피부 등과 같은 장기로 전이되는 경우 치료가 어려울 수 있다. 이는 원발 부위의 종양 세포가 숙주의 다른 2 차 부위로 전이되는 과정을 의미한다. 이 과정에서 주변 조직으로 세포가 침입하는 것이 필수적이며 악성 암 세포의 주요 특성이며, 세포 외 기질 (ECM)과 기저막의 분해는 종양 세포 이동과 침입을 촉진시킬 수 있다.
한편 조개풀(Arthraxon hispidus)은 외떡잎식물 벼목 화본과의 한해살이 풀이며 도랑이나 길가에서 흔히 자라는 잡초이다. 주로 아시아의 온난지역 즉 중국, 한국, 만주, 일본, 몽고, 시베리아, 인도 및 말레이시아 등 아시아 지역에 널리 분포되어 있으며 전 세계에서는 15종이 분포되어 있고 국내에는 1종이 자생하고 있다. 키는 약 20~50 ㎝이다. 꽃줄기는 밑 부분이 지면을 기고 줄기 마디에서 뿌리가 나서 퍼지며 윗부분은 비스듬히 올라가게 된다. 잎은 달걀꼴이며 잎 밑은 줄기를 싸고 가장자리에 센털이 있다. 9~10월 줄기 끝에 3~20개로 된 꽃 이삭이 손바닥 모양으로 달린다. 작은 이삭은 쌍으로 되어 꽃이삭 마디에 달리나, 자루가 있는 작은 이삭은 퇴화하여 짧은 자루만으로 된다. 겉겨의 등면은 둥글고 센털이 난다. 잎과 줄기는 노랑물감용으로 많이 쓰인다. 또한 중국 <본경>이라는 책에는 기침과 가래를 멎게 하고 살충해독효과가 있다고 기재되어 있다. 조개풀의 성분이 아코니트산(aconitic acid), 알트락신(arthraxin), 루테올린(luteolin), 루테올린-7-글리코사이드(luteolin-7-glucoside)가 함유되어 있으며, 주 화합물은 플라본(flavone) 류에 속한다. 이 식물은 천연 노란색 염색제로서 천을 염색하는 데 사용되어 왔다.
루테올린(Luteolin) 배당체의 항암 및 항염증 효능에 대해서는 이미 많이 밝혀진 바 있다. 하지만 조개풀(Arthraxon hispous)에서 추출한 mLU8C-PU (7-methoxy-luteolin-8-C-β-6-deoxy-xylo-pyranos-3-uloside)와 의약용 약초, 야채, 과일 등에서 발견되는 오리엔틴(orientin)의 유방암 전이억제에 대한 연구는 아직 확인되지 않았다. 유방암은 조기진단 시 간단한 외과 절제술을 통해 비교적 쉽게 치료가 가능 하지만 유방암의 전이로 인해 사망률이 급격히 증가한다. 특히나 전이성 유방암은 항암제 내성 인자를 함유하기에 그 치료가 까다롭다. 따라서 전체 유방암의 70% 이상을 차지하는 ER-positive breast cancer (Curr Med Chem. 2013)를 타깃으로 하는 유방암의 전이 억제를 위한 새로운 후보물질 검증이 필수적이다. 이에 본 발명자들은 조개풀에서 추출한 mLU8C-PU와 오리엔틴의 ER(+) 유방암 전이 억제 메카니즘 및 암전이 억제 효능을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
선행기술문헌
특허문헌 대한민국 공개특허 제10-2011-0015846호
본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 유방암, 비소세포폐암, 자궁경부암, 난소암, 췌장암, 골육종 및 간세포암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 JNK(c-Jun N terminal kinase) 인산화 억제제인 화학식 2로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 유방암, 비소세포폐암, 자궁경부암, 난소암, 췌장암, 골육종 및 간세포암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 STAT3(signal transducer and activator of transcription 3) 활성억제제인 화학식 3으로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 유방암, 비소세포폐암, 자궁경부암, 난소암, 췌장암, 골육종 및 간세포암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 유방암, 비소세포폐암, 자궁경부암, 난소암, 췌장암, 골육종 및 간세포암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 유방암, 비소세포폐암, 자궁경부암, 난소암, 췌장암, 골육종 및 간세포암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2019010774-appb-I000001
상기 화학식 1에서, R1은 C1-C3 알킬 또는 하이드록시 C1-C3 알킬이고, R2는 수소 또는 C1-C3 알킬이며,
Figure PCTKR2019010774-appb-I000002
는 결합이 존재하거나 존재하지 않음을 나타내고,
Figure PCTKR2019010774-appb-I000003
는 단일결합 또는 이중결합을 나타내며, 상기 단일결합 또는 이중결합은 연속적으로 나타나지 않는다.
바람직하게는, 상기 화학식 1에서, R1이 메틸 또는 하이드록시 메틸이고, R2가 메틸 또는 수소일 수 있다.
더욱 바람직하게는, 상기 화합물은 하기 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 화합물일 수 있다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2019010774-appb-I000004
[화학식 3]
Figure PCTKR2019010774-appb-I000005
상기 암은 유방암일 수 있다.
상기 유효성분은 유방암의 전이를 억제할 수 있다.
또한 본 발명은, JNK(c-Jun N terminal kinase) 인산화 억제제인 상기 화학식 2로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 유방암, 비소세포폐암, 자궁경부암, 난소암, 췌장암, 골육종 및 간세포암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은, STAT3(signal transducer and activator of transcription 3) 활성억제제인 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 유방암, 비소세포폐암, 자궁경부암, 난소암, 췌장암, 골육종 및 간세포암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여 또는 복용시키는 단계를 포함하는 유방암, 비소세포폐암, 자궁경부암, 난소암, 췌장암, 골육종 및 간세포암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물의 유방암, 비소세포폐암, 자궁경부암, 난소암, 췌장암, 골육종 및 간세포암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
본 발명은 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있는 화합물을 제공할 수 있다. 또한 본 발명의 화합물은 암 세포의 이동 및 침윤을 억제하는 효과가 있으므로, 항암제, 암전이 억제용 치료제 또는 유방암 전이 예방/개선용 건강기능식품 소재로 유용하게 이용할 수 있다. 더욱 구체적으로 본 발명의 화합물 오리엔틴은 PCKα의 막 전위 와 ERK의 인산화를 억제하고 AP-1과 STAT3의 핵 전위를 차단함으로써 MMP-9와 IL-8의 수준을 억제하여 암 세포의 이동 및 침윤을 억제할 수 있다. 또한 본 발명의 화합물mLU8C-PU는 PKCα와 JNK의 활성을 감소시켜 AP-1, NF-κB 전사인자의 세포핵으로의 전위를 억제함으로써 암 세포의 이동 및 침윤을 억제할 수 있다.
도 1은 본 발명의 mLU8C-PU 및 오리엔틴의 작용 메카니즘을 개략적으로 나타내는 것이다.
도 2a는 조개풀 분획물의 제조 과정을 개략적으로 나타내는 것이다.
도 2b는 조개풀로부터 활성분획물이 수득되는 과정을 개략적으로 나타내는 것이다.
도 3은 조개풀 추출물 및 용매 분획물에 대한 액체크로마토그래피 분 분 결과를 나타내는 것이다.
도 4는 TPA(12-O-tetradecanoylphorbol-13- acetate)로 처리한 MCF-7 유방암 세포에서 MTS 분석과 RT-PCR을 통해 각 단일 화합물이 세포 생존력 및 mRNA 수준에 미치는 영향을 분석한 결과이다. ER(+) MCF-7 세포를 다양한 농도(0, 5, 10, 20 및 40μM)의 단일 화합물과 TPA (50nM)로 24 시간 동안 전 처리한 후, 각 화합물(mLU8C-PU(7-methoxy-luteolin-8-C-β-(6-deoxyxylopyranos-3-uloside), AG8C-GS(apigenin-8-C-β-glucoside), AP8C-FP(apigenin-8-C-β-fucopyranoside), Orientin, KF7O-GS 및 LU7β-GS)이 MCF-7 유방암 세포의 생존율에 미치는 영향을 MTS 분석으로 확인하였다. 또한 qRT-PCR 분석에 의해 MMP-9(matrix metalloproteinase-9) 및 IL-8(interleukin-8) 의 mRNA 수준을 정량화하였다. * p <0.05 (TPA 단독 vs TPA + mLU8C-PU), ** p <0.01 (TPA 단독 vs TPA + mLU8C-PU).
도 5는 세포 침윤 및 이동에 대한 mLU8C-PU 및 오리엔틴의 효과를 분석한 것이다. TPA 처리된 MCF-7 유방암 세포에서의 매트리겔(Matrigel) 침윤분석(invasion assays) 및 상처-치유 이동분석(wound-healing migration assays)에 의해 평가하였다. MCF-7 세포를 다양한 농도 (0, 5, 10, 20 및 40 μM)의 mLU8C-PU 또는 오리엔틴으로 전 처리한 다음 TPA (50 nM) 24시간 동안 처리하였다. 세포이동은 상처-치유 분석(wound-healin assays)으로 확인되었다(도 5a, 5c). 세포 침윤성은 매트리겔 침윤 분석에 의해 수행되었다(도 5b, 5d). * p <0.05 (TPA 단독 vs TPA + mLU8C-PU), ** p <0.01 (TPA 단독 vs TPA + mLU8C-PU).
도 6은 MMP-9 활성에 대한 mLU8C-PU 및 오리엔틴의 효과를 분석한 것이다. TPA로 처리한 MCF-7 유방암 세포에서의 젤라틴 자이모그래피(zymography) 및 qRT-PCR 분석에 의해 평가되었다. MCF-7 세포를 다양한 농도 (0, 5, 10, 20 및 40 μM)의 mLU8C-PU 또는 오리엔틴으로 전 처리한 후 24시간 동안 TPA (50 nM)로 처리하였다. MMP-9의 활성은 젤라틴 자이모그래피(zymography)에 의해 정량화되었다. MMP-9의 mRNA 수준은 qRT-PCR 분석에 의해 정량화되었다.* p <0.05 (TPA 단독 vs TPA + mLU8C-PU), ** p <0.01 (TPA 단독 vs TPA + mLU8C-PU).
도 7은 IL-8 발현에 대한 mLU8C-PU 및 오리엔틴의 효과를 분석한 것이다. TPA-처리된 MCF-7 유방암 세포에서 qRT-PCR 분석 및 ELISA에 의해 평가되었다. MCF-7 세포를 다양한 농도 (0, 5, 10, 20 및 40 μM)의 mLU8C-PU 또는 오리엔틴으로 전 처리한 후 24시간 동안 TPA (50 nM)로 처리하였다. 도 7a 및 7d는 ELISA에 의해 IL-8 단백질 수준을 분석한 결과이다. 도 7b, 7c는 qRT-PCR 분석에 의해 IL-8의 mRNA 수준을 분석한 결과이다. * p <0.05 (TPA 단독 vs TPA + mLU8C-PU), ** p <0.01 (TPA 단독 vs TPA + mLU8C-PU).
도 8은 PKCα의 막 전위(membrane translocation)와 ERK의 전위(translocation)에 대한 mLU8C-PU 및 오리엔틴의 효과를 분석한 것이다. TPA-처리된 MCF-7 유방암 세포에서 웨스턴 블로팅으로 평가하였다. MCF-7 세포를 다양한 농도(0, 5, 10, 20 및 40 μM)의 mLU8C-PU 또는 오리엔틴으로 전 처리한 후 30 분 동안 TPA (50 nM)로 처리하였다. 도 8a, 8c는 PKCα(protein kinase Cα) 및 PKCδ 단백질 수준을 웨스턴 블로팅으로 분석한 결과이다. 도 8b, 8d는 p-ERK, p-JNK 및 p-p38 단백질 수준을 웨스턴 블로팅으로 분석한 결과이다. * p <0.05 (TPA 단독 vs TPA + mLU8C-PU), ** p <0.01 (TPA 단독 vs TPA + mLU8C-PU).
도 9는 mLU8C-PU 및 오리엔틴이 전사 인자의 발현에 미치는 영향을 분석한 것이다. TPA-처리된 MCF-7 유방암 세포에서 분획법(fractionation) 및 면역형광분석(immunofluorescence assay)에 의해 평가되었다. MCF-7 세포를 다양한 농도(0, 5, 10, 20 및 40 μM)의 mLU8C-PU 또는 오리엔틴으로 1 시간 동안 전 처리한 다음 TPA (50 nM)로 30 분 동안 처리하였다. 도 9a는 AP-1(activator protein-1), NF-κB (nuclear factor-kappa B) 및 STAT3 전사인자의 수준을 분획법으로 평가한 결과이다. 도 9b는 AP-1 및 NF-κB 전사인자의 수준을 면역형광분석법으로 평가한 결과이다. 도 9c는 MCF-7 세포를 mLU8C-PU 및 JNK 억제제(SP600125)와 함께 또는 개별적으로 1시간 동안 전 처리한 후 TPA (50nM)를 30 분 동안 처리한 다음 AP-1 및 NF-κB 전사인자의 수준을 분획법으로 평가한 결과이다. 도 9d는 AP-1, NF-κB 및 STAT3 전사인자의 수준을 분획법으로 평가한 결과이다. 도 9e는 AP-1 및 STAT3 전사인자의 수준을 면역형광분석법으로 평가한 결과이다. 도 9f는 MCF-7 세포를 오리엔틴 및 ERK 억제제 PD98059와 함께 또는 개별적으로 1시간 동안 전 처리한 후 TPA (50nM)를 30 분 동안 처리한 다음 AP-1 및 STAT3 전사인자의 수준을 분획법으로 평가한 결과이다. * p <0.05 (TPA 단독 vs TPA + mLU8C-PU), ** p <0.01 (TPA 단독 vs TPA + mLU8C-PU).
도 10은 세포 침윤과 MMP-9 및 IL-8 발현에 대한 mLU8C-PU 및 오리엔틴의 효과를 분석한 것이다. JNK 억제제 SP600125 (또는 ERK 억제제 PD98059)를 사용하여 TPA-처리된 MCF-7 유방암 세포에서 매트리겔 침윤 분석, qRT-PCR, ELISA 및 젤라틴 자이모그래피(zymography)로 분석하였다. MCU-7 세포를 다양한 농도(0, 5, 10, 20 및 40 μM)의 mLU8C-PU 와 JNK 억제제 SP600125 (또는, 오리엔틴과 ERK 억제제 PD98059)를 함께 또는 개별적으로 전 처리한 후 TPA (50 nM)를 24 시간 동안 처리하였다. 도 10a, 10e는 매트리겔(Matrigel) 침윤분석에 의한 세포침윤 분석 결과이다. 도 10b, 10f는 qRT-PCR에 의해 MMP-9 및 IL-8 mRNA 수준을 분석한 결과이다. 도 10c, 10g는 ELISA에 의해 IL-8 단백질 수준을 분석한 결과이다. 도 10d, 10h는 MMP-9 활성을 젤라틴 자이모그래피에 의해 분석한 결과이다. * p <0.05 (TPA 단독 vs TPA + mLU8C-PU), ** p <0.01 (TPA 단독 vs TPA + mLU8C-PU).
도 11은 상처-치유 분석 및 침윤 분석을 통해 오리엔틴, 루테올린, LU8C-FP의 암전이 억제 효과를 비교 분석한 것이다.
도 12는 오리엔틴, 루테올린, LU8C-FP에 대한 자이모그래피, qPCR, ELISA 분석 결과이다.
도 13은 상처-치유 분석 및 침윤 분석을 통해 mLU8C-PU, 루테올린, LU8C-FP의 암전이 억제 효과를 비교 분석한 것이다.
도 14는 mLU8C-PU, 루테올린, LU8C-FP에 대한 자이모그래피, qPCR, ELISA 분석 결과이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 유방암, 비소세포폐암, 자궁경부암, 난소암, 췌장암, 골육종 및 간세포암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 또한 상기 유효성분은 암의 전이를 억제할 수 있다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2019010774-appb-I000006
상기 화학식 1에서, R1은 C1-C3 알킬 또는 하이드록시 C1-C3 알킬이고, R2는 수소 또는 C1-C3 알킬이며,
Figure PCTKR2019010774-appb-I000007
는 결합이 존재하거나 존재하지 않음을 나타내고,
Figure PCTKR2019010774-appb-I000008
는 단일결합 또는 이중결합을 나타내며, 상기 단일결합 또는 이중결합은 연속적으로 나타나지 않는다.
바람직하게는, 상기 화학식 1에서, R1이 메틸 또는 하이드록시 메틸이고, R2가 메틸 또는 수소일 수 있다.
더욱 바람직하게는, 상기 화합물은 하기 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 화합물일 수 있다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2019010774-appb-I000009
[화학식 3]
Figure PCTKR2019010774-appb-I000010
상기 화합물들은 각종 암의 전이인자인 MMP-9 및 IL-8 을 억제할 수 있으며, MMP-9 및 IL-8의 억제를 통해 유방암, 비소세포폐암, 자궁경부암, 난소암, 췌장암, 골육종 및 간세포암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암을 예방 또는 치료할 수 있다.
바람직하게, 상기 암은 유방암일 수 있고, 더욱 바람직하게는 ER(+) 유방암일 수 있다. 또한 상기 유효성분은 암, 바람직하게는 유방암, 더욱 바람직하게는 ER(+) 유방암의 전이를 억제할 수 있다.
상기 조성물에 포함되는 상기 화학식들을 보면 O-글리코사이드(glycoside)가 아닌 C-C 결합(bond)의 C-글리코사이드(glycoside)형태의 플라본(flavone)이므로 장 내에서 미생물 분비 효소나 강산에 의해서 당이 분해되지 않으며(Bioorg Med Chem. 2007;15:7138; Atherosclerosis. 2015;242:418), 또한 당이 한 개 정도인 배당체는 흡수에 문제가 안 되어 천연물의약품 -대체의약품(건강기능식품)-으로 제공가능하다.
상기 화학식 1, 화학식 2 및 화학식 3으로 표시되는 화합물은 조개풀 유래의 루테올린 배당체일 수 있다.
상기 화학식 1, 화학식 2 및 화학식 3으로 표시되는 화합물은 물, 증류수 및 C1 ~ C6의 알코올로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 용매를 이용하여 조개풀로부터 추출한 성분일 수 있다.
상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 및 희석제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서, "암전이"란 악성 종양이 발병한 장기에서 떨어진 다른 조직으로 전파한 상태를 말한다. 하나의 장기에서 시작한 악성 종양이 진행함에 따라 처음 발생한 원발 부위인 장기로부터 다른 조직으로 퍼져 나가는데, 이렇게 원발 부위로부터 다른 조직으로 퍼져 나가는 것을 전이라 할 수 있다. 전이는 악성 종양의 진행에 수반되는 현상이라고 할 수 있는데, 악성 종양 세포가 증식하고 암이 진행함에 따라 새로운 유전 형질을 획득하면서 전이가 일어날 수 있다. 새로운 유전 형질을 획득한 종양 세포가 혈관과 림프선으로 침입하고 혈액과 림프를 따라 순환하다가 다른 조직에 정착, 증식하게 되면 전이가 일어날 수 있다.
본 발명의 조성물은 전이를 억제하여 암이 퍼지는 것을 예방 및 치료할 수 있을 뿐만 아니라, 전이로부터 파생되는 암 관련 질환을 개선, 예방, 치료할 수 있다.
본 발명에서 용어, "억제"는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 상기 암전이 또는 전이로부터 파생한 암 관련 질환의 발병을 억제시키는 모든 행위를 말한다.
본 발명에서 용어, "예방"은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 상기 암전이 또는 전이로부터 파생한 암 관련 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.
본 발명에서 용어, "치료"는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 상기 암전이 또는 전이로부터 파생한 암 관련 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.
본 발명의 약학 조성물은 단일제로도 사용할 수 있으며, 공인된 항전이 효과를 가진다고 알려진 약학 조성물을 추가로 포함하여 복합제제로 제조하여 사용할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에는 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 또는 희석제를 추가하여, 약제학적 단위 투여형으로 제형화 할 수 있다.
상기 "약학적으로 허용 가능한"이란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 활성 물질의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 것을 의미한다.
본 발명에서 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(Tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물에서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 상기 화학식 2로 표시되는 화합물, 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 성분은 약제학적으로 유효한 양으로 포함될 수 있다. 본 발명에서 용어 "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 바람직하게는 본 발명에서 약학 조성물 전체 중량 기준으로 0.001 내지 50중량%로 포함될 수 있으며, 보다 바람직하게 0.001 내지 20중량%로 포함될 수 있다.
다른 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 암의 예방 또는 치료가 필요한 개체에 투여하여 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 또한 상기 조성물을 암전이 억제 또는 전이로부터 파생한 암 관련 질환의 예방 또는 치료가 필요한 개체에 투여하여 암 전이를 억제하거나 또는 전이로부터 파생한 암 관련 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 개체는 암의 예방 또는 치료가 필요한 개체이거나, 암전이 억제 또는 전이로부터 파생한 암 관련 질환의 예방 또는 치료가 필요한 개체로서, 인간뿐만 아니라 암전이 또는 전이로부터 파생한 암 관련 질환 및 이와 유사한 증상의 치료를 필요로 하는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
상기 치료방법은 상기조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단 범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 또한, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 JNK(c-Jun N terminal kinase) 인산화 억제제인 상기 화학식 2로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 유방암, 비소세포폐암, 자궁경부암, 난소암, 췌장암, 골육종 및 간세포암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 STAT3(signal transducer and activator of transcription 3) 활성억제제인 화학식 3으로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 유방암, 비소세포폐암, 자궁경부암, 난소암, 췌장암, 골육종 및 간세포암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 유방암, 비소세포폐암, 자궁경부암, 난소암, 췌장암, 골육종 및 간세포암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 식품 조성물은 암의 예방 또는 개선에 도움을 주거나, 전이, 또는 상기 설명한 전이 관련 질환의 발생 억제에 도움을 주는 기능을 가질 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다.
상기 식품 조성물에는 유효성분의 활성에 방해가 되지 않는 다른 성분을 추가할 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약 추출물, 식품학적으로 허용 가능한 식품보조첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
본 발명에서 용어 "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.
상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알코올이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 Ａ, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 건강기능성 식품이 포함될 수 있다. 본 발명에서 용어 "건강기능성 식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 기능성이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능성 식품은 당업계에서 통상적 으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조 시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.
유효 성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
일반적으로, 식품의 제조 시에 본 발명의 성분(하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 하기 화학식 2로 표시되는 화합물 둘 중 하나 이상)은 원료 조성물 중 1 ~ 10 중량%, 바람직하게는 5 ~ 10중량%의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림 류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 2로 표시되는 화합물을 포함하는 JNK(c-Jun N terminal kinase) 인산화 억제제를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 인 비트로(in vitro)에서, 상기 억제제를 처리하여 JNK(c-Jun N terminal kinase) 인산화를 억제하는 방법을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물을 포함하는 STAT3(signal transducer and activator of transcription 3) 활성억제제를 제공할 수 있다.
또한 본 발명은, 인 비트로(in vitro)에서, 상기 억제제를 처리하여 STAT3의 활성을 억제하는 방법을 제공할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 본 발명의 목적, 특징, 장점은 이하의 실시예를 통하여 쉽게 이해될 것이다. 본 발명은 여기서 설명하는 실시예에 한정되지 않고, 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 여기서 소개되는 실시예는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 따라서 이하의 실시예에 의해 본 발명이 제한되어서는 안 된다.
<실시예> 조개풀 유래 mLU8C-PU 및 오리엔틴 화합물 분리
조개풀( Arthraxon hispous ) 추출물의 제조
조개풀(Arthraxon hispidus (Thunb.))은 2017년 12월 이천시 장호원읍에서 수확하였으며(A voucher specimen (KRIB 0079082), KRIBB herbarium (Daejeon, Korea)에 보관하였다. 이후 조개풀(3.99 kg)을 건조기(50-55℃)로 음건하여 수분을 제거한 후 약 1 cm의 크기로 분쇄하고, 분쇄된 분말시료의 건조 중량을 기준으로 메탄올 32 ℓ를 가한 후 상온에서 3회 반복 추출하였다. 그런 다음 여과 및 감압농축 후, 40℃로 건조시켜 조개풀 추출물(메탄올 추출물) 404.5 g(추출수율 10.37%)을 수득하였다.
조개풀 분획물의 제조
상기에서 수득한 조개풀 메탄올 추출물로부터 분획물을 하기와 같은 방법으로 제조하였다.
구체적으로 조개풀 메탄올 추출물(100 g)에 증류수(0.5 L)를 가하여 현탁한 후 동량의 헥산을 가하여 헥산 층과 물 층으로 분리하였고, 이를 여과 및 감압농축하여 헥산 분획물(20.8 g)을 수득하였다. 그런 다음, 상기 헥산 분획물을 제거하고 남은 물 층에 에틸아세테이트를 동량 가하여 상기와 동일한 방법으로 에틸아세테이트 분획물(30.2 g)을 수득하였다. 그런 다음, 상기 에틸아세테이트 분획물을 제거하고 남은 물 층에 부탄올을 동량 가하여 상기와 동일한 방법으로 부탄올 분획물(20.1 g)을 수득하고, 남은 물 층을 농축하여 물 분획물(8.8 g)을 수득하였다(도 2a).
활성분획물의 제조
상기 분획물로부터 활성분획물을 분리, 제조하기 위해 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(flash column chromatography)를 실시하였다.
구체적으로, 개방형 컬럼[open column, 10 cm × 50 cm; 레진(Resin); 실리카겔(silica gel), 400 g]을 장착한 후 상기에서 수득한 분획물 중 에틸아세테이트층을 30.2 g의 양으로 로딩하였다. 용매로는 헥산/에틸아세테이트(5:1→3:1→1:1), 에틸아세테이트/메탄올(10:1→5:1→3:1→1:1), 클로로포름/에틸아세테이트(30:1→10:1→ 5:1→1:1), 클로로포름/메탄올/물(75:25:1)을 사용하여 16개의 활성분획물(AE Frs.1-16)을 수득하였다(도 2b).
조개풀 추출물 및 칼럼분획물의 분석
상기에서 수득한 조개풀 추출물 및 컬럼분획물을 분석하기 위하여 고성능 액체크로마토그래피(ultra performance liquid chromatography, UPLC)로 분석하였다.
구체적으로, 조개풀 추출물 및 용매분획물을 UPLC용 0.25 mm 멤브레인 필터로 1회 여과한 후 UPLC 기기(Waters UPLC-QTOF-MS)에 컬럼(Waters BEH C18 column, 2.1 × 100 mm, 1.7 ㎛m)을 장착한 후 여과된 각각의 분획물을 5 ㎕ 양으로 로딩하였다. 이때, 용매로는 물 + 0.1% 포름산(A)/ 아세토니트릴 + 0.1% 포름산(B) [0-1분, 5% B; 1-11분, 5-100% B; 11-13.2분, 100%; 13.2-13.33분, 100-5%; 13.3-15분, 5%]을 사용하고, 용리 속도는 0.4 ㎖/분으로 하였다. 검출기로는 UV와 MS(Mass Spectrometry)를 이용하여 UPLC로부터 분리되어진 물질들을 크로마토그래피 형식으로 용매 분획물들의 분리도를 확인하였다(도 3).
소분획물(AE13B-2-i∼m)에서 화합물들 분리
상기에서 수득한 활성분획물에서 하기와 같은 방법으로 소분획물들을 분리하였다.
구체적으로, HSCCC (TBE-1000A, hexane:EtOAc:MeOH:H2O = 1:5:3:5:, v/v/v/v, upper phase for stationary phase, lower phase for mobile phase, flow rate: 5 mL/min, 501 rpm, forward)를 장착한 후 활성분획물 AE13B-2-i∼m을 반복 로딩하여 하기 화학식 1로 표시되는 화합물(7-methoxy-luteolin-8-C-β-6-deoxy-xylo-pyranos-3-uloside, mLU8C-PU) (화합물 1, 16.9 mg), 하기 화학식 2로 표시되는 화합물(luteolin 8-C-β-glucopyranoside)(화합물 2, 10.0 mg), 아피제닌 8-C-β 푸코피라노시드(apigenin 8-C-β-fucopyranoside (233 mg), 아피제닌 8-C-글루코시드 (apigenin 8-C-glucoside, 13.6 mg), 루테올린 luteolin 8-C-β- 8-C-β-fucopyranoside (410.0 mg)을 수득하였다(도 2b).
수득된 화합물에 대한 1D (1H,13C,andDEPT)와 2D (COSY, HMQC, and HMBC) NMR 스펙트라(spectra)는 TMS(tetramethylsilane)를 내부 표준(internal standard)으로 이용, Bruker AM 400/ Bruker DRX 500 spectrometers (Bruker)로 얻었다. HRESIMS는 음이온 모드(negative-ion mode)로 UPLC-QTOF-MS (ultraperformance liquid chromatography quadrupole time of flight mass spectrometer) (Waters, Milford, MA, USA)를 이용하여 측정하였다.
mLU8C-PU
(7-methoxy-luteolin-8-C-β-6-deoxy-xylopyranos-3-uloside)
[화학식 2]
Figure PCTKR2019010774-appb-I000011
mLU8C-PU 데이터
황색 파우더(Yellow powder); mp 160-162 ℃; [α ]25 D +58.5˚(MeOH,c 1.00); HRESIMS, m/z 443.0979 [M-H]-(calculated for C22H20O10 443.0978).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δH 1.40 (3H, d, J = 6.0 Hz, H-6''), 3.50 (1H, dq, H-5''), 3.87 (3H, s, 7''-OCH3), 4.08 (1H,dd,J=10.0,1.0Hz,H-4''), 4.78(1H,dd,J=10.0,1.0Hz,H-2''), 4.89 (1H,d,J=10.0Hz,H-1''), 6.55(1H,s,H-6), 6.77(1H,s,H-3),6.92(1H,d,J=8.0Hz,H-5'),7.50(2H,m,H-2',6').
13C NMR(DMSO-d6, 100 MHz) δC 19.3 (C-6''), 56.7 (7''-OCH3), 74.0(C-2''),75.1(C-1''),78.8(C-4''),78.7(C-5''),95.1(C-6),102.9(C-3),104.4(C-8,10),114.0(C-2'),115.8(C-5'),119.2(C-6'),121.9(C-1'),146.0(C-3'),149.9(C-4'),155.0(C-9),161.8(C-5),163.2(C-7),164.4(C-2),182.1(C-4).
오리엔틴(Orientin)
(luteolin 8-C-β-glucopyranoside)
[화학식 3]
Figure PCTKR2019010774-appb-I000012
NMR 데이터: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δH 3.25 (1H, t, J = 10.95 Hz), 3.26 (1H, t, J = 7.10 Hz), 3.37 (1H, t), 3.52 (1H, d, J = 14.50 Hz, a), 3.77 (1H, d, J = 14.15 Hz, b), 3.82 (1H, t)m 4.68 (1H, d, J = 6.35 Hz), 6.27 (1H, s) 6.65 (1H, s), 6.87 (1H, d, J = 10.45 Hz), 7.48 (1H, d, J = 2.85 Hz), 7.53 (1H, dd, J = 2.80, 10.40 Hz).
13C NMR(DMSO-d6, 100 MHz) δC 61.6 (C-6''), 70.7 (C-4''), 70.8 (C-2''), 73.4 (C-1''), 78.8 (C-3''), 82.0 (C-5''), 98.1 (C-3), 102.4 (C-6), 104.1 (C-10), 104.6 (C-8), 114.1 (C-2'), 115.7 (C-5'), 119.4 (C-6'), 122.0 (C-1'), 145.8 (C-3'), 149.6 (C-4'), 156.0 (C-9), 160.4 (C-5), 162.6 (C-7), 164.1 (C-2), 182.1 (C-4).
<실험예>
실험방법
세포 배양(cell culture)
인간 유래 유방암인 MCF-7 세포주를 이용하였으며, 전이억제 효과를 확인하기 위해 전이반응을 일으키기 위한 유도물질로 TPA (phorbol-12-myristate-13-acetate)를 이용하였다. MCF-7 세포주는 한국세포주은행 (Korea Cell Line Bank, KCLB, No. 40071) (Seoul, Korea)에서 분양 받았으며 세포의 배양을 위하여 10% heat-inactivated FBS과 1% 페니실린(penicillin) 및 스트렙토마이신(streptomycin)을 포함한 DMEM 배양액에서 배양하였다. 세포는 37℃, 5% CO2조건하에서 배양 하였고, 2일 마다 배지를 교환하였으며, 세포의 증식에 따른 과밀도 현상을 해소하기 위하여 계대 배양하였다.
MTS 어세이
HPLC 분석결과 순도 98.0% 이상의 오리엔틴(Orientin)과 mLU8C-PU를 다이메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide; DMSO, 최종농도 0.01%)에 녹여서 활성을 측정하였다. 물질의 세포독성(cytotoxicity)를 측정하여 실험물질 농도를 설정하기 위한 실험이다. 세포 배양용 96 웰 플레이트(well plate)에 웰(well) 당 1.5 × 104개의 MCF-7 세포를 분주하고 37℃에서 24시간 동안 안정화시킨 후, 새로운 DMEM 배지로 교환한 후 물질을 세포에 처리하여 1 시간 동안 배양한 후 자극제 TPA를 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 각각의 웰(WELL)에 20 μL AQueous One Solution reagent를 첨가하고 1시간 반응시킨 다음 492 nm 흡광도(absorbance)를 확인하였다. 본 실험을 통해 세포독성(cytotoxicity)이 없는 5, 10, 20, 40 μM을 실험 농도로 결정하였다.
상처-치유 어세이(Wound-healing assay)
유방암 세포의 이동성(migration)을 확인하기 위한 실험이다. 세포를 well당 1.5×105 개씩 넣고 상처(wound)를 만들어서 물질 처리에 따른 치유(healing) 정도를 현미경을 통해 확인하였다.
매트리겔 침윤성 어세이(Matrigel invasion assay)
유방암 세포의 침윤성(invasion)을 확인하기 위한 실험이다. MCF-7 세포의 침윤 정도는 매트리겔(Matrigel)로 인서트 챔버(insert chamber)를 코팅 시킨 트랜스웰 챔버 플레이트(Transwell chamber plates)를 이용하여 측정하였다. 세포를 well당 1.5×105 개씩 넣고 TPA와 물질을 처리하였다. 24시간 동안 배양한 후, 매트리겔(Matrigel)을 통과하여 로어 챔(lower chamber)로 이동한 세포를 현미경을 통해 확인하였다.
젤라틴 자이모그래피(gelatin zymography)
유방암 전이에 관여하는 대표적인 효소(enzyme)인 MMP-9의 효소활성(enzymatic activity)를 확인하기 위한 실험이다. MCF-7 세포를 포함한 DMEM에 현탁 시킨 후 6 웰 플레이트(well plate)에 6 × 105cell/ml의 세포수가 되도록 분주하여 37℃ 5% CO2 인큐베이터(incubator)에서 24 시간 배양하였다. 새로운 DMEM 배지로 교환한 후 물질을 세포에 처리하여 1시간 동안 배양한 후 자극제 TPA를 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 상등액만을 따로 모아 0.1%의 젤라틴(gelatin)이 함유된 SDS-폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel)에 전기영동하여 단백질들을 크기 별로 분리하였다. 그 후 2.5% 트리톤(triton) X-100에 30분씩 3번 씻은 후 증류수로 씻어주어 SDS를 제거하였으며 5 mM CaCl2,0.2M NaCl,50mM Tris가 함유된 제라틴 인큐베이터 버퍼(gelatin incubation buffer) (pH 7.5)에 담구어 20 ∼ 24시간 동안 37℃ 인큐베이터에서 70 rpm으로 쉐이킹(shaking)하여 반응시켰다. 반응 후 겔(gel)을 쿠마시 블루 용액(coomassie blue solution)으로 염색하였다.
RT-PCR(Reverse transcription-polymerase chain reaction) 분석
유방암 전이에 관여하는 대표적인 인자(factor)인 MMP-9과 IL-8의 mRNA 수준을 정성적으로 확인하기 위한 실험이다. MCF-7 세포를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 6 웰 플레이트(well plate)에 6×105 cell/ml의 세포수가 되도록 분주하여 37℃ 5% CO2 인큐베이터에서 24 시간 배양하였다. 새로운 DMEM 배지로 교환한 후 물질을 세포에 처리하여 1시간 동안 배양한 후 자극제 TPA를 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 상층액을 제거한 후 1 ml의 이지-블루(Easy-Blue)를 넣고 2분 동안 방치한 후 클로로포름(chloroform)을 넣고 10초 동안 볼텍싱(vortexing)하고 12,000 rpm에서 15분 동안 원심분리한 후, 상층액을 취하여 동량의 이소프로판올(isopropanol)을 혼합하여 흔들어 주었다. 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고 펠렛(pellet)은 DEPC (diethyl pyrocarbonate)-DW 20 ml에 녹여 RT-PCR에 사용하였다. RT-PCR 키트(kit)를 사용하여 45℃에서 30분, 94℃에서 5분 동안 반응시킨 후 94℃에서 30초 동안 변성(denaturation)시키고, 55 ~ 62℃에서 30초 동안 어닐링(annealing)시킨 다음, 72℃에서 1분 동안 익스텐션(extension)시키는 사이클(cycle)을 30~35회 반복한 뒤, 마지막 익스텐션(extension)은 72℃에서 5분 동안 PCR 머신(machine)에서 수행하였다. 각 PCR 생성물(products)는 2% 아가로오스 겔(agarose gel)에 로딩(loading)하여 100 V 조건에서 30분 동안 전기영동을 통하여 분석하였다.
RNA 분리(isolation) 및 qRT-PCR(quantitative real-time reverse transcription-polymerase chain reactionqRT-PCR) 분석
유방암 전이에 관여하는 대표적인 인자(factor)인 MMP-9과 IL-8의 mRNA 수준을 정량적으로 확인하기 위한 실험이다. MCF-7 세포를 DMEM에 현탁시킨 후 6 웰 플레이트 (Corning, USA)에 6×105 cell/ml의 세포수가 되도록 3 ml씩 분주하여 37℃ 5% CO2 인큐베이터에서 24 시간 배양하였다. 새로운 DMEM 배지로 교환한 후 물질을 세포에 처리하여 1시간 동안 배양한 후 자극제 TPA를 처리하고 24시간동안 배양하였다. 상층액을 제거한 후 1 ml의 이지-블루(Easy-Blue)를 넣고 2분 동안 방치한 후 클로로포름(chloroform)을 넣고 10초 동안 볼텍싱(vortexing)하고 12,000 rpm에서 15분 동안 원심분리한 후, 상층액을 취하여 동량의 이소프로판올(isopropanol)을 혼합하여 흔들어 주었다. 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고 펠렛(pellet)은 DEPC(diethyl pyrocarbonate)-DW 20 ml에 녹여 RT-PCR에 사용하였다. 만들어진 mRNA를 정량적으로 확인하였다.
ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)
유방암 전이에 관여하는 대표적인 사이토카인(cytokine)인 IL-8의 분비 수준(secretion level)을 확인하기 위한 실험이다. 물질을 처리한 후 상층액(supernatant)을 따서 샌드위치(sandwich) ELISA를 통해 IL-8의 분비 수준(secretion level)을 정량적으로 확인하였다. TPA에 의해 침윤(Invasion)이 유도된 MCF-7 세포로 부터 생성된 전이 관련 사이토카인인 IL-8의 분비량 측정은 다음과 같이 실시하였다. DMEM 배지를 이용하여 6×105 cell/mL로 조절한 플레이트(plate)에 접종하고 5% CO2 incubator인큐베이터에서 24시간 전 배 양한 후, TPA와 물질을 처리하여 24시간 재 배양하였다. 세포배양액 내의 IL-8 사이토카인의 분비량을 ELISA 키트(kit)를 이용하여 측정하였다. 이를 위해 ELISA 마이크로플레이트(microplate)에 포획 항체(capture antibody)로 항-마우스(anti-mouse) IL-8을 분주하여 4℃에서 하룻밤 동안 코팅(coating)시켰다. 이를 0.05% 트윈(Tween) 20이 포함된 PBST로 세척하고 10% FBS 용액으로 블로킹(blocking)하였다. PBST로 세척한 뒤, 각 마이크로플레이트(microplate)에 배양 상층액을 분주하고 실온에서 2시간 반응시켰다. 반응 후 PBST로 세척하고 희석한 비오틴화된 항- 마우스 IL-8 검출 항체(biotinylated anti-mouse IL-8 detection antibody) 및 스트렙타비딘-홀스래디시 퍼옥시다아제 컨쥬게이트(streptavidin- horseradish peroxidase conjugate)를 분주하여 실온에서 1시간 반응시켰다. 그 후 다시 PBST로 세척하고 OPD 용액을 첨가하여 실온에서 30분 동안 암반응 시켰다. 반응 종료를 위해 2 N H2SO4을 분주한 뒤 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
웨스턴 블로팅(Western blotting)
MAPK, PKC Families 등의 단백질 발현 정도를 확인하기 위한 실험이다. MCF-7 세포를 DMEM에 현탁시킨 후 세포 배양 접시(cell culture dish)에 6×105 cell/ml의 세포수가 되도록 분주하여 37℃ 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 새로운 DMEM 배지로 교환한 후 물질을 세포에 처리하여 1시간 동안 배양한 후 자극제 TPA를 처리하고 배양하였다. MAPK 활성을 측정하기 위하여 TPA에 한 시간 동안 노출(expose)하였다. 반응이 종료된 후 배지를 제거하고 콜드(Cold) PBS로 세척한 후 세포 용해물(cell lysates)은 용균 버퍼(lysis buffer) (10 mM pH 7.4 Tris-HCl, 5 mM NaF, 1 mM Na3VO4,1 mM EDTA abd 1 mM EGTA)를 첨가하여 단백질(protein)을 추출하였다. 단백질 함유량(Protein content)을 브래드퍼드(Bradford)법으로 정량하여 20-50 mg의 단백질을 l0% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 분리하고, Hybond-PVDF 멤브레인(Amersham, Little Chalfont, UK)으로 트랜스퍼(transfer)하였다. 트랜스퍼(transfer)된 멤브레인(membrane)은 TBST(Tris-buffered saline Tween)-20 (20 mM Tris, pH 7.6, 136 mM NaCl, 0.1% Tween 20)에 용해된 5% 스킴 밀크(skim milk)에 1시간 동안 실온에서 블로킹(blocking)한 후 항-포스포-ERK (anti- phospho-ERK)와 항-ERK (anti-ERK), 항-포스포-JNK (anti-phospho- JNK)와 항-JNK(anti-JNK), 항-포스포-p38(anti-phospho-p38)과 항-p38 MAP 키나아제(anti-p38 MAP kinase)와 β-액틴 1차 항체(β-actin primary antibody) (1 : 1000 dilution)로 4 ℃에서 하룻밤 동안(overnight) 반응시킨 후 TBST로 3회 세척(washing)하고, HRP-컨쥬게이트된 2차 항체(HRP-conjugated secondary antibody)(1 : 1000 dilution)로 1 시간 동안 실온에서 반응시켰다. TBST로 3회 세척한 후 면역반응성 단백질 밴드는 X-ray 필름(films)에서 ECL(enhanced chemiuminescence regents)(Amersham, Little Chalfont, UK)을 이용하여 검출하였다.
핵 및 세포질 분획법 / 원형질막 및 세포질 분획법
핵과 세포질을 구분하여 확인하고자 하는 단백질의 위치를 파악하는 실험이다. MAPK, PKC Families 등의 단백질 발현 정도를 확인하기 위한 실험이다. MCF-7 세포를 DMEM에 현탁 시킨 후 세포 배양 접시(cell culture dish)에 6×105 cell/ml의 세포수가 되도록 분주하여 37℃ 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 새로운 DMEM 배지로 교환한 후 물질을 세포에 처리하여 1시간 동안 배양한 후 자극제 TPA를 처리하고 배양하였다. MAPK 활성을 측정하기 위하여 TPA에 30분 동안 노출(expose)하였다. 반응이 종료된 후 배지를 제거하고 콜드(cold) PBS로 세척한 후 Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents kit와 plasma membrane and cytoplasmic extraction reagents kit를 이용하여 핵(Nuclear), 세포기질(cytosol), 원형질막(Plasma membrane)을 분리하였다.
통계처리
본 실험의 결과는 세 번의 실험 중 평균적인 결과 값을 사용하였다. 통계처리는 원 웨이-아노바(one way-ANOVA)를 사용하였으며 p＜0.05인 경우 유의성이 있는 것으로 판단하였다.
약어(Abbreviations)
TPA, 12-O-tetradecanoylphorbol-13- acetate; IL-8, interleukin-8; AP-1, activator protein-1; STAT3, signal transducer and activator of transcription 3; ERK, extracellular signal-regulated kinase; MAPKs, mitogen-activated protein kinases. MMP-9, matrix metalloproteinase-9;
실험결과
세포독성 및 MCF-7 세포의 이동/침윤 억제 능력 분석
새로운 항암물질들을 개발하고자 하는 연구가 계속되고 있지만 강한 세포 독성을 수반하는 경우 치료제로서 임상적 접근이 어려워지는 문제점이 있다. 루테올린(Luteolin)은 항암 및 항염증 등의 효능에 대해서는 이미 많이 밝혀진 바 있기 때문에 루테올린(Luteolin) 배당체인 오리엔틴(Orientin)과 mLU8C-PU가 전이성 유방암의 세포 침윤을 억제하는지 조사하였으며, Orientin과 mLU8C-PU가 암세포의 침윤을 억제하는 기전을 밝히기 위하여 암세포의 초기 침윤 및 전이에 중요한 MMP-9, IL-8의 발현 및 이에 관여하는 세포 신호전달 단백질들의 변화를 조사하였다. 먼저, DMEM 배지에서 ER(+) MCF-7 유방암세포에 오리엔틴(Orientin)과 mLU8C-PU를 농도별로 처리한 후 MTS assay로 세포 생존율을 측정한 결과, 40 μM 이하의 농도에서는 세포 독성을 보이지 않는다는 것을 확인 후 5, 10, 20, 40 μM을 실험 농도로 결정하였다.
MCF-7 세포에 대한 오리엔틴(Orientin)과 mLU8C-PU의 세포독성을 조사한 후, TPA에 의해 증가된 MCF-7 세포의 이동과 침윤을 오리엔틴(Orientin)과 mLU8C-PU가 억제하는지 조사한 결과, 세포 독성을 보이지 않는 농도에서 농도 의존적으로 MCF-7세포의 이동과 침윤이 억제하였다(도 4, 도 5).
MMP-9과 IL-8의 활성 분석
또한, 자이모그래피(zymography), RT-qPRC, ELISA 실험을 통해 MMP-9과 IL-8의 활성을 조사한 결과, TPA에 의해 현저히 증가된 MMP-9과 IL-8의 정도가 오리엔틴(Orientin) 또는 mLU8C-PU에 의해 농도 의존적으로 감소되는 것으로 확인되었다(도 6, 도 7) 이러한 결과로부터 MCF-7 유방암 세포에서 오리엔틴과 mLU8C-PU가 MMP-9와 IL-8의 활성을 감소시켜 TPA로 유도된 세포의 이동과 침윤을 억제시킨다는 것을 알 수 있다.
오리엔틴 및 mLU8C-PU의 항전이 효과의 세부 메커니즘 확인
유방암 세포에서 MMP-9, IL-8의 발현 및 침윤은 TPA에 의해 유도된 PKC(protein kinase C), MAPK(mitogen-activated protein kinase), 다양한 전사인자의 활성에 의해 유도된다는 결과들이 보고된 바 있다. 따라서 오리엔틴과 mLU8C-PU의 항전이 효과의 세부 메커니즘을 확인하기 위하여 실험을 진행하고 그 결과 도 8 내지 도 10에 나타내었다.
오리엔틴(orientin)은 PKCα (protein kinase Cα)와 ERK (extracellular signal-regulated kinase)의 활성을 감소시키는 것으로 AP-1 (activator protein-1). STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3) 전사인자의 세포핵으로의 전위를 억제하였다. 또한 오리엔틴의 항전의 효과 기전에서 ERK가 상위 조절 인자로서 AP-1, STAT3, MMP-9와 IL-8를 억제함을 확인하였다.
mLU8C-PU는 PKCα (protein kinase Cα)와 JNK (c-Jun N terminal kinase)의 활성을 감소시키는 것으로 확인되었다. 더욱이 mLU8C-PU는 AP-1(activator protein-1), NF-κB(nuclear factor-kappa B) 전사인자의 세포핵으로의 전위를 억제하였다. 또한 mLU8C-PU의 항전의 효과 기전에서 JNK가 상위 조절 인자로서 AP-1, NF-κB, MMP-9와 IL-8을 억제함을 확인하였다. 종합해 보면, 본 실험을 통해 오리엔틴과 mLU8C-PU는 PKCα/MAPK/AP-1/NF-κb/STAT3 신호경로를 조절하고 MMP-9과 IL-8 발현 조절을 통해 유방암세포의 이동과 침윤을 억제하는 효과가 있음을 확인하였다.
오리엔틴과 유사한 루테올린, LU8C-FP (Luteolin 8-C-β- fucopyranoside)와의 유방암 전이 억제 효과 비교
오리엔틴과 유사한 루테올린, LU8C-FP (Luteolin 8-C-β- fucopyranoside)와의 유방암 전이 억제 효과를 분석하고 그 결과를 도 11, 도 12, 표 1 및 표 2에 나타내었다. 분석 결과 오리엔틴이 루테올린에 비해 전이 억제 효과가 우수한 것으로 확인되었다(도 11). 또한 오리엔틴은 LU8C-FP에 비해 MMP-9에 대한 억제 효과가 우수한 것으로 확인되었으며, 오리엔틴은 IL-8 억제 효과가 있으나 루테올린은 IL-8을 억제하지 못하는 것으로 확인되었다(도 12).
[표 1]
Figure PCTKR2019010774-appb-I000013
[표 2]
Figure PCTKR2019010774-appb-I000014
mLU8C-PU와 유사한 루테올린, LU8C-FP (Luteolin 8-C-β- fucopyranoside)와의 유방암 전이 억제 효과 비교
mLU8C-PU와 유사한 루테올린, LU8C-FP (Luteolin 8-C-β- fucopyranoside)와의 유방암 전이 억제 효과를 분석하고 그 결과를 도 13, 도 14, 표 3 및 표 4에 나타내었다. 분석 결과 mLU8C-PU가 루테올린에 비해 암세포 이동, 침윤 및 전이 등에 대한 억제 효과가 우수한 것으로 확인되었다(도 13). 또한 LU8C-PU는 LU8C-FP에 비해 암세포의 이동 및 전이에 중요한 역할을 하는 대표적인 케모카인인 IL-8 억제 효과가 우수한 것으로 확인되었고, 루테올린은 IL-8을 억제하지 못하는 것으로 확인되었다(도 14).
[표 3]
Figure PCTKR2019010774-appb-I000015
[표 4]
Figure PCTKR2019010774-appb-I000016
본 발명에서는 유방암의 전이 억제에 대한 치료제로 널리 사용되는 루테올린(Luteolin) 성분을 가진 배당체 오리엔틴과 mLU8C-PU가 전이성 유방암 세포의 침윤을 억제하는지 조사하였으며 오리엔틴과 mLU8C-PU가 암세포의 침윤을 억제하는 기전을 밝히기 위하여 MMP-9, IL-8, MAPK, PKC, 전사인자의 활성에 관여하는 세포신호전달 단백질의 변화를 분석하였다.
오리엔틴과 mLU8C-PU는 TPA로 자극한 MCF-7 유방암 세포의 침윤을 세포독성이 없는 농도에서 유의적으로 억제하였으며, TPA에 의해 증가된 MMP-9과 IL-8의 정도를 농도 의존적으로 억제하였다. TPA로 처리에 의해 유도된 MMP-9와 IL-8의 증가는 MAPK와 PKCα 활성화를 통한 AP-1, STAT3, NF-κB에 의한 전사 활성의 증가 때문으로 확인되었다. 오리엔틴과 mLU8C-PU는 TPA로 자극한 MCF-7 세포에서 PKCα와 MAPK와 AP-1, STAT3, NF-κB 경로(pathway)를 억제함으로써 MMP-9와 IL-8의 활성을 억제하고 결과적으로 유방암 세포의 침윤을 억제하였다. 따라서 오리엔틴과 mLU8C-PU가 유방암 세포의 전이를 억제한다는 사실을 확인할 수 있고 전이억제를 위한 새로운 치료 가능 약물로 이용될 수 있음을 제시하였다.
<제조예>
1. 약학적 제제의 제조
<1-1> 산제의 제조
mLU8C-PU 또는 오리엔틴 0.2 g
유당 1 g
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
<1-2> 정제의 제조
mLU8C-PU 또는 오리엔틴 10㎎
옥수수전분 100 ㎎
유당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
<1-3> 캡슐제의 제조
mLU8C-PU 또는 오리엔틴 10㎎
옥수수전분 100 ㎎
유당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
2. 식품의 제조
본 발명의 mLU8C-PU 또는 오리엔틴을 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조한다.
<2-1> 밀가루 식품의 제조
본 발명의 mLU8C-PU 또는 오리엔틴 0.05 ~5.0 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조한다.
<2-2> 유제품(dairy products)의 제조
본 발명의 mLU8C-PU 또는 오리엔틴 0.05 ~5.0 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조한다.

Claims (10)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 유방암, 비소세포폐암, 자궁경부암, 난소암, 췌장암, 골육종 및 간세포암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2019010774-appb-I000017
    상기 화학식 1에서, R1은 C1-C3 알킬 또는 하이드록시 C1-C3 알킬이고, R2는 수소 또는 C1-C3 알킬이며,
    Figure PCTKR2019010774-appb-I000018
    는 결합이 존재하거나 존재하지 않음을 나타내고,
    Figure PCTKR2019010774-appb-I000019
    는 단일결합 또는 이중결합을 나타내며, 상기 단일결합 또는 이중결합은 연속적으로 나타나지 않는다.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 화학식 1에서, R1이 메틸 또는 하이드록시 메틸이고, R2가 메틸 또는 수소인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 화합물은, 하기 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 조성물.
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2019010774-appb-I000020
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2019010774-appb-I000021
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 암은 유방암인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 유효성분은 유방암의 전이를 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. JNK(c-Jun N terminal kinase) 인산화 억제제인 하기 화학식 2로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 유방암, 비소세포폐암, 자궁경부암, 난소암, 췌장암, 골육종 및 간세포암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물:
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2019010774-appb-I000022
  7. STAT3(signal transducer and activator of transcription 3) 활성억제제인 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 유방암, 비소세포폐암, 자궁경부암, 난소암, 췌장암, 골육종 및 간세포암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물:
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2019010774-appb-I000023
  8. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 유방암, 비소세포폐암, 자궁경부암, 난소암, 췌장암, 골육종 및 간세포암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2019010774-appb-I000024
    상기 화학식 1에서, R1은 C1-C3 알킬 또는 하이드록시 C1-C3 알킬이고, R2는 수소 또는 C1-C3 알킬이며,
    Figure PCTKR2019010774-appb-I000025
    는 결합이 존재하거나 존재하지 않음을 나타내고,
    Figure PCTKR2019010774-appb-I000026
    는 단일결합 또는 이중결합을 나타내며, 상기 단일결합 또는 이중결합은 연속적으로 나타나지 않는다.
  9. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여 또는 복용시키는 단계를 포함하는 유방암, 비소세포폐암, 자궁경부암, 난소암, 췌장암, 골육종 및 간세포암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암의 예방 또는 치료 방법.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2019010774-appb-I000027
    상기 화학식 1에서, R1은 C1-C3 알킬 또는 하이드록시 C1-C3 알킬이고, R2는 수소 또는 C1-C3 알킬이며,
    Figure PCTKR2019010774-appb-I000028
    는 결합이 존재하거나 존재하지 않음을 나타내고,
    Figure PCTKR2019010774-appb-I000029
    는 단일결합 또는 이중결합을 나타내며, 상기 단일결합 또는 이중결합은 연속적으로 나타나지 않는다.
  10. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물의 유방암, 비소세포폐암, 자궁경부암, 난소암, 췌장암, 골육종 및 간세포암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암의 예방 또는 치료 용도.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2019010774-appb-I000030
    상기 화학식 1에서, R1은 C1-C3 알킬 또는 하이드록시 C1-C3 알킬이고, R2는 수소 또는 C1-C3 알킬이며,
    Figure PCTKR2019010774-appb-I000031
    는 결합이 존재하거나 존재하지 않음을 나타내고,
    Figure PCTKR2019010774-appb-I000032
    는 단일결합 또는 이중결합을 나타내며, 상기 단일결합 또는 이중결합은 연속적으로 나타나지 않는다.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2016178713A1 (en) * 2015-05-02 2016-11-10 Flavocure Biotech Llc Therapeutic agents containing cannabis flavonoid derivatives targeting kinases, sirtuins and oncogenic agents for the treatment of cancers

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