KR101703827B1

KR101703827B1 - 신규한 커큐민 유도체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101703827B1
Application number: KR1020140149401A
Authority: KR
Inventors: 최연성; 구현정; 신사라; 최준영; 이경한; 김병태
Original assignee: 사회복지법인 삼성생명공익재단
Priority date: 2014-10-30
Filing date: 2014-10-30
Publication date: 2017-02-23
Also published as: KR20160058984A

Abstract

본 발명은 신규한 커큐민 유도체를 제공한다. 본 발명의 커큐민 유도체는 커큐민과 비교하여 현저한 혈관신생 억제 효과 및 종양성장 억제 효과를 나타낸다. 본 발명의 커큐민 유도체는 다양한 혈관신생-관련 질환 및 종양성 질환의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.

Description

신규한 커큐민 유도체 및 이의 용도{Novel Curcumin Derivatives and Uses Thereof}

본 발명은 신규한 커큐민 유도체 및 이의 용도에 관한 것이다.

인구의 고령화, 식생활의 서구화 및 환경문제로 인하여 암 환자의 발생은 지속적으로 증가하고 있으나 기존 치료 기술의 낮은 효능 및 부작용으로 인하여 암을 극복하는 데는 한계가 있다. 커큐민(5-히드록시-1,7-비스(4-히드록시-3-메톡시페닐)-1,4,6-헵타트리엔-3-원)은 천연물로서 항암, 항염증, 항산화 효과 등을 가지고 있다고 알려져 있으며, 독성이 매우 낮은 것으로 알려져 있다. 임상시험에서 매일 2-8 g의 경구투여에도 이상반응이 관찰되지 않았다(Anticancer Res. 2001;21:2895-2900). 커큐민은 NF-κB 경로 표적을 통하여 난소암에서 종양 성장과 혈관신생을 억제하였다; 2일 동안 두 번 500 mg/kg 경구 투여시 SKOV3ip1과 HeyA8 마우스 모델에서 각각 49%와 55% 종양 성장을 억제하였다(Clin Cancer Res 2007;13:3423). 또한 U87MG 종양 마우스 모델에서 커큐민의 종양성장 억제에 대한 연구결과가 보고되었다; 마우스에 U87MG 세포 이식 후 3일째부터 커큐민 60 mg/kg를 2일에 한 번씩 투여하여 30일 투여 시 67%의 종양 부피의 감소가 보고되었으며(Mol. Nutr. Food Res. 2010;54:1192), 7일 동안 매일 커큐민 50 mg/kg를 종양 내 투여한 결과, 자가소화작용(autophagy)을 유도함으로써 종양 성장이 억제되었음을 밝혔다(Mol. Pharmacol. 2007;72:29). 그리고 마우스와 랫트에서 대장암, 췌장암, 난소암, 전립선암, 다발성골수종 등에서 기존 의약품(celecoxib, oxaliplatin, gemcitabine, docetaxel 등)과의 병용치료를 통하여 항암효과를 증진하는 효과가 보고되었다(Nutr. Cancer 2010;62:919; Cancer Chemother Pharmacol 2011;68:157). 안드로겐 수용체 길항효과가 있는 커큐민 유도체들로서 커큐민의 페닐 고리에 있는 OH기를 OCH₃또는 OCH₂COOCH₃기로 치환한 유도체, 커큐민 구조의 중앙에 있는 탄소에 COOH, COOC₂H₅,C₂H₄COOC₂H₅,CH=CHCOOC₂H₅기 등이 치환된 유도체가 개발되었으며(J. Med. Chem. 2002;45:5037; J. Med. Chem. 2006;49:3963), 대장암세포에 세포독성이 있는 커큐민 유도체들로서 커큐민 구조의 중앙 탄소에 CH₂COOH,CH₂COOC(CH₃)₃기가 치환된 유도체도 개발되었다(J. Med. Chem. 2011;54:8066). 그러나 커큐민은 체내에서 대사가 매우 빠른 것으로 알려져 있으며 올레핀의 이중결합이 환원되는 대사와 황산염, 글루쿠로니드가 접합하는 대사가 일어나는 것으로 보고되어져 있다(Cancer Res. 2001;61:1058; Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2002;11:105; Mol. Pharmaceut. 2007;4:807; BioFactors 2013;39:14).

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 체내에서 빠르게 대사되는 커큐민의 단점을 극복하고, 효과적으로 종양의 성장을 억제시킬 수 있는 커큐민 유도체를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 커큐민 골격의 올레핀 탄소에 메틸기를 도입하여 이중결합을 환원하는 효소의 접근을 어렵게 함으로써 체내에서 대사가 지연되거나 일부 방지되는 신규한 커큐민 유도체를 발굴하였으며, 이 유도체가 커큐민과 비교하여 현저한 혈관신생 억제 효과 및 종양 성장 억제 효과를 갖는다는 것을 규명함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 신규한 커큐민 유도체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 커큐민 유도체를 포함하는 혈관신생 억제용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 커큐민 유도체를 포함하는 종양성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 화학식 1로 표시되는 커큐민 유도체를 제공한다:

[화학식 1]

상기 화학식 1에서, R₁내지 R₄는 각각 독립적으로H 또는 C₁-C₅ 알킬이고; R₅및 R₆은각각 독립적으로 OH, C₁-C₅알콕시, C₁-C₅할로알콕시, 폴리에틸렌옥시, 할로폴리에틸렌옥시, 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 피페리딘, 피페라진, 모르폴린, 피롤, 이미다졸, 벤즈이미다졸, 또는 인돌이고; R₇및 R₈은각각 독립적으로 H, OH 또는 C₁-C₅알콕시이며; 상기 폴리에틸렌옥시는 (에톡시)n-OH(상기 n은 1 내지 5의 정수이다)이다.
본 발명자들은 체내에서 빠르게 대사되는 커큐민의 단점을 극복하고, 효과적으로 종양의 성장을 억제시킬 수 있는 커큐민 유도체를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 커큐민 골격의 올레핀 탄소에 메틸기를 도입하여 이중결합을 환원하는 효소의 접근을 어렵게 함으로써 체내에서 대사가 지연되거나 일부 방지되는 신규한 커큐민 유도체를 발굴하였으며, 이 유도체가 커큐민과 비교하여 현저한 혈관신생 억제 효과 및 종양 성장 억제 효과를 갖는다는 것을 규명하였다.

삭제

본 발명의 화합물을 정의하는 화학식 1에서, 용어 “C₁-C₅ 알킬”은 탄소수 1-5의 직쇄 또는 분쇄 포화 탄화수소기를 의미하며, 바람직하게는 “C₁-C₅ 직쇄 또는 가지쇄 알킬”이고, 이는 저가 알킬로서 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 이소부틸, n-부틸, t-부틸, n-펜틸, 이소펜틸 및 네오펜틸을 포함한다. 용어, “알콕시”는 -O알킬기를 의미한다. 용어 “할로”는 할로겐족 원소를 나타내며, 예컨대, 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오도를 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 R₁및 R₂는 각각 독립적으로H 또는 C₁-C₅ 알킬이고, 보다 바람직하게는 각각 독립적으로 H 또는 C₁-C₂ 알킬이며, 보다 더 바람직하게는 각각 독립적으로 H 또는 C₁ 알킬이고, 가장 바람직하게는 C₁ 알킬이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 R₃및 R₄는 각각 독립적으로H 또는 C₁-C₅ 알킬이고, 보다 바람직하게는 각각 독립적으로 H 또는 C₁-C₂ 알킬이며, 보다 더 바람직하게는 각각 독립적으로 H 또는 C₁ 알킬이고, 가장 바람직하게는 H이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 R₅및 R₆은각각 독립적으로 OH, C₁-C₅알콕시, C₁-C₅할로알콕시, 폴리에틸렌옥시, 할로폴리에틸렌옥시, 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 피페리딘, 피페라진, 모르폴린, 피롤, 이미다졸, 벤즈이미다졸, 또는 인돌이고, 상기 폴리에틸렌옥시는 (에톡시)n-OH(상기 n은 1 내지 5의 정수이다)이며; 보다 바람직하게는 각각 독립적으로 OH 또는 C₁-C₅알콕시이며, 보다 더 바람직하게는 각각 독립적으로 OH 또는 C₁ 알콕시이고, 가장 바람직하게는 OH이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 R₇및 R₈은 각각 독립적으로 H, OH 또는 C₁-C₅알콕시이고; 보다 바람직하게는 각각 독립적으로 OH 또는 C₁-C₅알콕시이며, 보다 더 바람직하게는 각각 독립적으로 OH 또는 C₁ 알콕시이고, 가장 바람직하게는 OCH₃이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 커큐민 유도체는 다음 화학식 2 내지 4로 표시된다:

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 커큐민 유도체는 화학식 4로 표시되는 화합물이다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상기 커큐민 유도체의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 종양성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

삭제

본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상기 화학식 1의 화합물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구, 비경구 투여 또는 피부패치로 사용할 수 있으며, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여, 점막 투여 및 점안 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.0001-100 ㎎/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 포함되는 알킬 및 디알킬 커큐민 유도체는 화학식 2 내지 4로 표시되는 화합물 중 하나이다.

본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 포함되는 커큐민 유도체는 화학식 4로 표시되는 화합물이다.

본 발명의 약제학적 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 종양성 질환은 위장관 간질종양(gatrointestinal stromal tumors, GISTs), 소세포 폐암(small cell lung cancer), 비-소세포성 폐암, 급성 골수성 백혈병(acute myelocytic leukemia), 급성 림프구성 백혈병, 골수이형성증후군(myelodyplastic syndrome), 만성 골수성 백혈병, 대장 암종, 위 암종, 고환암(testicular cancer), 신경교종(glioblastoma), 성상세포종(astrocytoma) 또는 비만세포종(mastocytosis)이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 종양의 성장을 효과적으로 억제한다. 본 발명의 실시예에서 확인하는 바와 같이, 종양을 이식한 마우스에 본 발명의 조성물을 처리한 경우, 대조군 뿐만 아니라 커큐민 치료군과 비교하여도 종양의 부피가 현저히 감소하였다(도 6).

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 혈관신생을 억제한다. 암 조직이 성장하기 위해서는 기존 혈관의 세포들이 증식하고 이동하면서 새로운 혈관을 만들어 나가는 혈관신생(angiogenesis)이 반드시 필요하다. 본 발명의 실시예에서 확인하는 바와 같이, 마트리겔을 이식한 마우스에서 적출한 마트리겔 플러그에 함유된 헤모글로빈 양을 정량한 결과, 대조군 및 커큐민을 처리한 마트리겔 플러그에서의 헤모글로빈 함량 보다 본 발명의 조성물을 처리한 마우스의 마트리겔 플러그에서는 헤모글로빈 함량이 현저히 감소한다는 사실을 관찰함으로써(도 5), 본 발명의 조성물이 체내에서 혈관신생을 억제하고 이로 인하여 종양조직의 성장을 억제함을 확인하였다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상기 커큐민 유도체의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 혈관신생 억제용 약제학적 조성물을 제공한다.

삭제

본 발명의 약제학적 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 질병, 질환 또는 상태는 혈관신생과 관련된 다양한 질환을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 질환은, 암, 당뇨병성 망막증, 미숙아 망막증, 각막 이식 거부, 신생혈관 녹내장, 홍색증, 증식성 망막증, 건선, 혈우병성 관절, 아테롬성 동맥경화 플라크 내에서의 모세혈관 증식, 켈로이드, 상처 과립화, 혈관 접착, 류마티스 관절염, 골관절염, 크론씨병, 재발협착증, 아테롬성 동맥경화, 장관 접착, 캣 스크래치 질환, 궤양, 간경병증, 사구체신염, 당뇨병성 신장병증, 악성 신경화증, 혈전성 미소혈관증, 기관 이식 거부, 신사구체병증, 당뇨병, 염증 또는 신경퇴행성 질환이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물은 내피세포의 이동, 침윤(invasion) 및 튜브 형성(tube formation)을 억제한다(도 2 내지 도 4).
본 발명의 약제학적 조성물은 혈관신생의 과정에서 중요한 단계인 내피세포의 이동 및 침윤과 튜브형성을 효과적으로 차단함으로써 효과적으로 그리고 인체에 안전한 방식으로 혈관신생을 억제하여 다양한 혈관신생-관련 질환 또는 질병의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (i) 본 발명의 커큐민 유도체; 및 (ii) 식품학적으로 허용되는 식품보조 첨가제를 포함하는 종양 예방용 건강기능식품을 제공한다.

삭제

본 발명의 건강기능식품은 상술한 커큐민 유도체를 포함하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 건강기능식품은 특별히 이에 제한되지 않으나, 건강 기능성 식품, 영양 보조제, 영양제, 파머푸드(pharmafood), 건강식품, 뉴트라슈티칼(nutraceutical), 디자이너 푸드, 식품 첨가제 등의 모든 형태의 식품이 될 수 있는데, 바람직하게는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 될 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 유효성분으로서 커큐민 유도체뿐만 아니라, 식품 제조시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다.
상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토 스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 식품은 여러 가지 영양제, 비타민류, 광물(전해질), 식이성분, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
식품에 대한 용이한 접근성을 고려한다면, 본 발명의 식품은 종양 성장의 억제, 및 종양성 질환의 예방 및 치료에 매우 유용하다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 신규한 커큐민 유도체를 제공한다.

(ⅱ) 본 발명의 알킬 및 디알킬 커큐민 유도체는 체내에서 커큐민의 환원대사에 관여하는 알코올디하이드로제나제에 의하여 환원되지 않는다.

(ⅲ) 본 발명의 커큐민 유도체는 커큐민과 비교하여 현저한 혈관신생 억제 효과 및 종양성장 억제 효과를 나타낸다.

(ⅳ) 본 발명의 커큐민 유도체는 종양성 질환 및 다양한 혈관신생-관련 질환의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.

도 1은 알코올디하이드로제나제에 의한 2,6-디메틸커큐민과 2-메틸커큐민의 환원을 측정한 결과이다.
커큐민(왼쪽), 2,6-디메틸커큐민(중앙)과 2-메틸커큐민(오른쪽)의 HPLC 크로마토그램: (a) 커큐민; (b) 2,6-디메틸커큐민(1); (c) 2-메틸커큐민(2); (d) 커큐민 + 알코올디하이드로제나제 + NADPH; (e) 1 + 알코올디하이드로제나제 + NADPH; (f) 2 + 알코올디하이드로제나제 + NADPH; (g) 테트라하이드로커큐민 표준물질; (h) 1 + 알코올디하이드로제나제; (i) 알코올디하이드로제나제
도 2는 상처치유 분석(wound healing assay) 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 트랜스웰 침윤 분석(transwell invasion assay) 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 마트리겔을 이용한 튜브 형성 분석(tube formation assay) 결과를 나타낸 것이다(40배 확대).
도 5는 마우스에서 적출한 마트리겔 플러그를 분석한 결과이다.
(a) 마트리겔 플러그. 대조군: bFGF + 헤파린; 커큐민 처리군: bFGF + 헤파린 + 커큐민 (10 μM); 2,6-디메틸커큐민 처리군: bFGF + 헤파린 + 2,6-디메틸커큐민 (10 μM); (b) 헤모글로빈 양 ^*P < 0.05 (대조군 대비); ^#P < 0.05 (커큐민 처리군 대비)
도 6은 커큐민 및 2,6-디메틸 커큐민 투여에 따른 마우스 종양의 성장 억제 효능을 분석한 결과이다.
네모는 대조군으로 주사 용매 올리브 오일을 복강주사한 군(n=4), 세모는 커큐민 50 mg/kg을 복강주사한 군(n=4), 원은 2,6-디메틸커큐민 50 mg/kg을 복강주사한 군(n=4). ^*P < 0.05, ^**P < 0.01, ^***P < 0.001 (대조군 대비). ^#P < 0.05, ^##P < 0.01 (커큐민 투여군 대비).
도 7은 커큐민 및 2,6-디메틸커큐민 투여에 따른 마우스의 무게 변화를 측정한 결과이다.
네모는 대조군으로 주사제 용매인 올리브 오일을 복강주사한 군(n=4), 세모는 커큐민 50 mg/kg을 복강주사한 군(n=4), 원은 2,6-디메틸커큐민 50 mg/kg을 복강주사한 군(n=4).
도 8은 커큐민 및 2,6-디메틸커큐민 투여에 따른 종양의 무게 변화를 측정한 결과이다.
(a) 각 군의 마우스에서 채취한 종양의 크기 및 육안으로 관측된 혈관신생 정도 비교; (b) 각 군의 마우스에서 채취한 종양의 무게. 검정색 막대는 대조군으로 주사제 용매인 올리브 오일을 복강주사한 군(n=4), 회색 막대는 커큐민 50 mg/kg을 복강주사한 군(n=4), 흰색 막대는 2,6-디메틸커큐민 50 mg/kg을 복강주사한 군(n=4). ^**P < 0.01 (대조군 대비). ^##P < 0.01 (커큐민 투여군 대비)
도 9는 커큐민 및 2,6-디메틸커큐민 투여에 따른 종양 조직에서의 혈관 밀도 변화를 형광현미경을 사용하여 촬영한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

2,6-디메틸커큐민 및 2-메틸커큐민의 합성

실시예 1-1: 2,6-디메틸커큐민의 합성

3,5-헵탄디온(634.24 μL, 4.60 mmol)을 에틸아세테이트(2 mL)에 용해하고 B₂O₃(384.30 mg,5.52 mmol)를 첨가한 후 80℃에서 40분 동안 교반하였다. 이 용액에 바닐린(1.61 g, 10.58 mmol)과 (n-BuO)₃B(2.98 mL, 11.04 mmol)를 에틸아세테이트 (2.7 mL)에 용해하여 첨가한 후, 80℃에서 40분 동안 교반하였다. n-부틸아민(0.36 mL, 3.68 mmol)을 상온에서 천천히 가한 후, 80℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응액을 1 N HCl(4.50 mL)로 처리한 후 50℃에서 30분 동안 교반하였다. 반응이 끝나면 NaHCO₃ 포화용액을 가하고 에틸아세테이트로 추출한 후, 플래쉬 컬럼크로마토그래피를 사용하여 정제하고 재결정하여 형광성을 가지는 노란색 고체(920 mg, 50%)의 생성물을 얻었다. ¹H NMR 분석 결과 2,6-디메틸 커큐민은 상온에서 2.7:1의 비율로 에놀형과 케토형으로 존재함을 확인하였다. 또한 2D ROESY(rotating-frame nuclear Overhauser effect spectroscopy) 실험 결과 2번과 6번 탄소의 메틸기가 모두 E-배치(configuration)를 가지고 있음을 확인하였다.

¹H NMR (500 MHz, DMSO-d ₆ ) enol form; δ 2.15(s, 6H), 3.81(s, 6H), 6.59(s, 1H), 6.86 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.04(dd, J = 8.0 및 1.5 Hz, 2H), 7.12(d, J = 1.5 Hz, 2H), 7.61(s, 2H); keto form δ 2.02(s, 6H), 3.80(s, 6H), 4.48(s, 2H), 6.87(d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.06(dd, J = 9.0 및 1.5 Hz, 2H), 7.13(d, J = 1.5 Hz, 2H), 7.62(s, 2H); MS(FAB) m/z 397(M⁺ + H); HRMS 이론값 C₂₃H₂₅O₆, 397.1651; 측정값 397.1656.

실시예 1-2: 2-메틸커큐민의 합성

2-메틸커큐민은 3,5-헵탄디온 대신 2,4-헥산디온을 사용하여 2,6-디메틸커큐민과 동일하게 합성하였다. 플래쉬 컬럼크로마토그래피를 사용하여 정제하고 재결정하여 형광성을 가지는 주황색 고체(850 mg, 42%)의 생성물을 얻었다.

¹H NMR (500 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 2.13 (s, 3H), 3.81 (s, 3H), 3.84 (s, 3H), 6.40 (s, 1H), 6.80 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 6.82 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.86 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.04 (dd, J = 10.0 및 2.0 Hz, 1H), 7.12 (dd, J = 8.0 및 1.5 Hz, 1H), 7.13 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 7.31 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.53 (d, J = 15.5 Hz, 1H), 7.60 (s, 1H); MS (FAB) m/z 383 (M+ + H); HRMS 이론값 C₂₂H₂₃O₆, 383.1495; 측정값 383.1503.

실시예 1-3: 커큐민의 합성

커큐민은 3,5-헵탄디온 대신 2,4-펜탄디온을 사용하여 2,6-디메틸커큐민과 동일하게 합성하였다. 플래쉬 컬럼크로마토그래피를 사용하여 정제하고 재결정하여 형광성을 가지는 주황색 고체(713 mg, 42%)의 생성물을 얻었다.

¹H NMR (500 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 3.83(s,6H), 6.06 (s, 1H), 6.74 (d, J = 15.5 Hz, 2H), 6.82(d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.14(dd, J = 8.0 및 1.5 Hz, 2H), 7.31(d, J = 1.5 Hz, 2H), 7.54(d, J = 16 Hz, 2H); MS (FAB) m/z 369(M⁺+ H); HRMS 이론값 C₂₁H₂₁O₆, 369.1338; 측정값 369.1338.

2,6-디메틸커큐민 및 2-메틸커큐민의 환원 연구

실시예 2: 알코올디하이드로제나제를 사용한 환원 연구

커큐민의 환원 대사는 알코올디하이드로제나제에 의하여 일어난다고 알려져 있다(J. Agric. Food Chem. 2006;54:756-764). 따라서 이 효소를 사용하여 디메틸커큐민 및 메틸커큐민의 환원 연구를 수행하여 커큐민의 결과와 비교하였다. 2,6-디메틸커큐민(100 μM)을 0.1% DMSO/인산염 버퍼에 용해한 후 알코올디하이드로제나제(5 unit/mL)를 넣고 37℃에서 3분 동안 배양한 후에 NADPH(5 mM)를 넣고 60분 동안 배양하였다. 반응혼합물을 아세테이트 버퍼(pH 4.5)로 처리하고 에틸아세테이트:2-프로판올 혼합액을 사용하여 추출한 후 HPLC로 분석하였다. HPLC 분석은 1% 암모늄 아세테이트-0.05% 초산을 포함한 아세토니트릴 혼합액을 사용하여 수행하였으며, 280 nm에서 관찰하였다. 2-메틸커큐민 및 커큐민도 같은 방법으로 실험하였다.

커큐민은 케토-에놀 호변이성체(keto-enol tautomer)로 존재하며, 산성 또는 중성에서는 케토 형태가 우세하게 존재하는 것으로 알려져 있다(Mol. Pharmaceut. 2007;4:807-818). HPLC 분석 결과, 커큐민은 대부분이 케토형으로 존재하며(38.6-39.5분), 1% 이하가 에놀형으로 관찰되었다(28.8-29.7분)(도 1a). 2,6-디메틸커큐민은 12%가 에놀형(33.8-34.2분), 나머지가 케토형(44.0-44.4분)으로 존재하였다(도 1b). 2-메틸커큐민은 4%가 에놀형(32.8-33.8분), 나머지가 케토형(41.2-43.4분)으로 존재하였다(도 1c).

알코올디하이드로제나제만 반응하였을 때 31.9-32.2분에 피크가 관찰되었으며, 이 피크는 커큐민, 2-메틸커큐민 또는 2,6-디메틸커큐민과는 무관하며 알코올디하이드로제나제에서 파생된 것으로 판단된다(도 1i). 다른 대조군으로 2,6-디메틸커큐민과 알코올디하이드로제나제만 반응하였을 때는 2,6-디메틸커큐민과 31.9-32.2분 피크만 관찰되었고(도 1h), 2,6-디메틸커큐민과 NADPH만 반응하였을 때는 2,6-디메틸커큐민만 관찰되었다. 2-메틸커큐민 또는 커큐민을 사용하였을 때도 동일한 결과를 보였다.

커큐민은 알코올디하이드로제나제에 의하여 테트라하이드로커큐민(t_R = 32.5-34.2분)으로 모두 환원되었음을(도 1d) 테트라하이드로커큐민 표준물질(t_R = 32.8-34.2분)을 사용하여 확인하였다(도 1g). 반면에 2,6-디메틸커큐민과 2-메틸커큐민은 전혀 환원되지 않았다(도 1e, f).

이 결과는 커큐민 골격의 올레핀 탄소에 한 개의 메틸기만 치환되어도 알코올디하이드로제나제에 의하여 환원되지 않음을 알 수 있었다.

2,6-디메틸커큐민의 체외 혈관신생 억제 연구

실시예 3: 상처치유 어세이(Wound healing assay)

HUVEC(human umbilical vein endothelial cell)을 48-웰 플레이트에서 배양한 후, 200 μL-파이펫 팁으로 세포에 상처를 만들고 PBS로 2회 세척하였다. 세포를 vehicle(DMSO), 커큐민(10 μM), 또는 2.6-디메틸커큐민(10 μM)을 함유하는 EGM2와 37℃에서 24시간 배양한 후 현미경을 이용하여 영상을 얻었다(도 2). 세포이동 능력은 (24시간에 이동한 거리-0시간에 이동한 거리)/0시간에 이동한 거리 x 100으로 나타냈다.

세포 이동거리를 ImageJ program을 사용하여 정량하여 대조군을 100%로 할 때 커큐민은 56%이었고(^***P < 0.001), 2,6-디메틸커큐민은 16%로 세포이동을 억제하는 능력이 대조군 보다 컸으며(^***P < 0.001), 커큐민 보다도 유의하게 컸다 (^##P < 0.01)(도 2).

실시예 4: 트랜스웰 침윤 어세이(Transwell invasion assay)

트랜스웰 멤브레인을 마트리겔로 덮은 후에 마트리겔을 37℃에서 30분 동안 굳혔다. Vehicle, 커큐민(10 μM), 또는 2.6-디메틸커큐민(10 μM)을 함유하는 배지에 섞은 HUVEC을 위 챔버에 넣고, 아래 챔버에는 EGM2를 넣었다. 37℃에서 24시간 후에 멤브레인의 아래면으로 이동한 세포를 염색하여 사진을 찍고 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 염색된 세포의 흡광도를 정량하여 대조군의 세포 침투 능력을 100%로 할 때, 커큐민의 침투능력은 67%(^**P < 0.01), 2,6-디메틸커큐민의 세포 침투 능력은 44%이었으며(^**P < 0.01), 2,6-디메틸커큐민의 세포침윤 억제 능력이 커큐민 보다 우세하였다(^#P < 0.05)(도 3).

실시예 5: 마트리겔을 이용한 튜브형성 어세이(tube formation assay)

96-웰 플레이트에 마트리겔 50 μL을 넣은 다음, 37℃에서 30분 동안 두어 굳혔다. 이후 HUVEC에 커큐민 또는 2,6-디메틸커큐민 10 μM를 30분 동안 처리한 다음, 이를 마트리겔 상부에 가하였다. 16시간 동안 배양한 후 튜브 형성 정도를 사진 촬영하였다. 2,6-디메틸커큐민이 커큐민에 비하여 튜브 형성 억제 효과가 더 우수하였다. 또한 ImageJ 프로그램을 사용하여 세포 튜브의 길이를 측정한 결과 커큐민은 대조군에 비하여 58%(^***P < 0.001), 2,6-디메틸커큐민은 34%로(^***P < 0.001), 2,6-디메틸커큐민의 튜브 형성 억제효과는 커큐민 보다 컸다(^###P < 0.001)(도 4).

2,6-디메틸커큐민의 체내 혈관신생 억제 연구 및 종양치료 효능 연구

실시예 6: 마트리겔 플러그 어세이

bFGF와 헤파린을 혼합한 마트리겔에 커큐민 또는 2,6-디메틸커큐민(10 μM, DMSO 용해)을 섞은 혼합물을 7주령(male, n = 4) C57/BL6 마우스의 복부 중앙(midventral abdominal region) 피하에 0.4 mL씩 주사하였다. 주사 후 14일에 마우스로부터 마트리겔 플러그를 적출한 후, 사진촬영하여 관찰하였으며 마트리겔 무게 당 헤모글로빈 양을 정량하였다. 혈관신생 정도는 대조군에서 가장 많았고(100%), 커큐민 투여군(55%), 2,6-디메틸커큐민(30%) 투여군 순서로 감소하였다. 2,6-디메틸커큐민의 헤모글로빈 양은 대조군 (^*P < 0.05) 및 커큐민 처리군에 비하여 (^#P < 0.05) 유의하게 낮았다(도 5).

실시예 7: 종양이식 마우스에서 종양 치료효능

생후 6주된 BALB/c 누드마우스의 우측 대퇴부 피하에 U87MG 세포(0.1 ml, 5 x 10⁶세포)를 이식하였다. 종양 크기가 90-100 mm³가 되었을 때 마우스를 3군으로 나누었다; 주사 용매 올리브 오일을 복강주사한 군(그룹 1, 대조군), 커큐민 50 mg/kg을 복강주사한 군(그룹 2), 2,6-디메틸커큐민 50 mg/kg을 복강주사한 군(그룹 3)으로 구분하였으며 각 군의 마우스의 수는 4마리로 구성하였다. 각 군의 마우스에 2일마다 올리브 오일, 올리브 오일에 용해한 커큐민(50 mg/kg) 또는 2,6-디메틸커큐민(50 mg/kg)을 100 μL씩 복강주사하였으며 주사할 때 마다 마우스의 종양의 크기 및 몸무게를 측정하였다. 실험이 끝난 후 종양을 제거하고 종양의 부피, 종양의 무게, 종양의 성장억제율, 마우스의 체중 변화 등을 조사하였다.

종양의 부피와 종양성장률(tumor growth rate)은 아래의 공식을 이용하여 계산하였다.

종양의 부피(mm³) = 길이(length)×폭(width)²/2

성장억제율(growth inhibition rate)은 아래 공식을 이용하여 계산하였다.

성장억제율 = (CV-TV/CV)×100

(CV = 종양측정 마지막 날 대조군의 종양크기-종양측정 시작 날 대조군의 종양크기, TV = 종양측정 마지막 날 치료군의 종양크기-종양측정 시작 날 치료군의 종양크기)

종양의 부피는 대조군에 비하여 커큐민 투여군은 21%, 2,6-디메틸커큐민 투여군은 54% 감소하였으며, 2,6-디메틸커큐민은 대조군(^*P < 0.05, ^**P < 0.01, ^***P < 0.001) 및 커큐민 투여군(^#P < 0.05, ^##P < 0.01)에 비하여 종양의 부피가 유의하게 감소하였다(도 6). 각 마우스 군에서 마우스의 무게에는 큰 변화가 없었다(19.8 g 23.3 g)(도 7).

각군의 마우스에서 채취한 종양의 크기 및 육안으로 관측된 혈관신생 정도는 2,6-디메틸커큐민 투여군에서 현저하게 작았다(도 8a). 또한 종양의 무게(mean ± S.E.M)는 대조군에서 0.428±0.06 g, 커큐민 투여군은 0.286±0.02 g, 2,6-디메틸커큐민 투여군은 0.172±0.02 g으로 종양성장 억제율은 대조군에 비하여 커큐민 투여군은 33%, 2,6-디메틸커큐민 투여군은 60%이었다. 따라서 2,6-디메틸커큐민의 종양성장억제 효능은 대조군(^**P < 0.01) 및 커큐민 투여군(^##P < 0.01)에 비하여 유의하게 컸다(도 8b).

실시예 8: 면역형광염색

실시예 7의 마우스에서 종양을 제거하여 파리핀으로 처리한 후 5 μm 두께로 잘랐다. CD31 항체(Abcam)와 FITC-항체(Santa Cruz Biotechnology)로 처리한 후 형광현미경으로 관측하였다.

혈관 밀도는 대조군에서 가장 높았으며, 커큐민 투여군, 2,6-디메틸커큐민 투여군 순으로 낮았다(도 9). 이 결과는 2,6-디메틸커큐민이 혈관신생 억제작용에 의하여 마우스 종양 성장을 억제하였음을 보였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

다음 화학식 1로 표시되는 디알킬 커큐민 유도체:
[화학식 1]

상기 화학식 1에서,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 C1-C5 알킬이고;
R3 및 R4는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C5 알킬이고;
R5 및 R6는 각각 독립적으로 OH 또는 C1-C5 알콕시이고;
R7 및 R8은 각각 독립적으로 OH 또는 C1-C5 알콕시이고;
R5 내지 R8는 동시에 C1-C5 알콕시가 아니다.
제 1 항에 있어서,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 C1-C5 알킬이고;
R3 및 R4는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C5 알킬이며,
R5 및 R6은 각각 독립적으로 OH 또는 C1 알콕시이며,
R7 및 R8은 각각 독립적으로 OH 또는 C1 알콕시이고,
R5 내지 R8는 동시에 C1 알콕시가 아닌 것인,
디알킬 커큐민 유도체.
제 1 항에 있어서, 상기 화학식 Ⅰ로 표시되는 디알킬 커큐민 유도체는 하기 화학식 4로 표시되는 화합물인 것인, 디알킬 커큐민 유도체.
[화학식 4]
하기 화학식 4로 표시되는 디알킬 커큐민 유도체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 약제학적 유효량으로 포함하는 종양성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
[화학식 4]
제 4 항에 있어서, 상기 종양성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물은 종양의 성장을 억제시키는 것인 종양성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제 4 항에 있어서, 상기 종양성 질환은 위장관 간질종양(gatro intestinal stromal tumors, GISTs), 소세포 폐암(small cell lung cancer), 비-소세포성 폐암, 급성 골수성 백혈병(acute myelocytic leukemia), 급성 림프구성 백혈병, 골수이형성증후군(myelodyplastic syndrome), 만성 골수성 백혈병, 대장 암종, 위 암종, 고환암(testicular cancer), 신경교종(glioblastoma), 성상세포종 (astrocytoma) 또는 비만세포종(mastocytosis)인 것인, 종양성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
하기 화학식 4로 표시되는 디알킬 커큐민 유도체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 약제학적 유효량으로 포함하는 혈관신생 억제용 약제학적 조성물.
[화학식 4]
하기 화학식 4로 표시되는 디알킬 커큐민 유도체 및 식품학적으로 허용되는 식품보조 첨가제를 포함하는 종양 예방용 건강기능식품.
[화학식 4]