KR100548743B1

KR100548743B1 - 새로운 암세포 사멸유도 활성제 에프-3-2-5, 그의제조방법 및 항암제로서의 용도

Info

Publication number: KR100548743B1
Application number: KR1020040068538A
Authority: KR
Inventors: 임융호; 이철훈; 김범준; 문상익; 임혜영; 신춘식; 강경래
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2004-08-30
Filing date: 2004-08-30
Publication date: 2006-02-02

Abstract

본 발명은 토양 방선균 BG2-41 배양액으로부터 순수 분리된 하기 화학식 1의 화합물 또는 그 염, 그의 제조방법 및 그를 포함하는 항암용 의약조성물에 관한 것으로서, 본 발명에 의한 화학식 1의 화합물 또는 약학적으로 허용되는 그의 염은 암세포 사멸유도 활성이 우수하므로 암세포 사멸유도 활성제뿐만 아니라 항암제로서 유용하게 사용될 수 있다.

<화학식 1>

암세포, 사멸유도, 활성제, 항암제

Description

새로운 암세포 사멸유도 활성제 에프-3-2-5, 그의 제조방법 및 항암제로서의 용도{Novel Inhibitor F-3-2-5 against Cell Cycle Regulating Factor, Preparing Method Thereof and Use for Anti-Cancer Agent}

도 1은 방선균속 BG2-41 균주의 주사현미경 사진이다.

도 2는 방선균속 BG2-41 균주의 16S rRNA 유전자분석 결과이다.

도 3은 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물의 분리 및 제조 과정을 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명의 화학식 1의 화합물의 분취 고성능액체크로마토그램을 나타낸 것이다.

도 5는 본 발명의 화학식 1의 화합물의 질량분석 스펙트럼을 나타낸 것이다.

도 6은 본 발명의 화학식 1의 화합물의 양성자핵자기공명스펙트럼(400MHz)을 나타낸 것이다.

도 7은 본 발명의 화학식 1의 화합물의 탄소핵자기공명스펙트럼(100MHz)을 나타낸 것이다.

도 8은 본 발명의 화학식 1에 의한 세포성장 억제 (cell growth inhibition) 활성을 나타낸 것이다.

도 9는 본 발명의 화학식 1에 의한 HeLa 세포의 형태학적 변화를 나타낸 것이다.

도 10은 본 발명의 화학식 1에 의한 세포사멸(아폽토시스) 유도효과를 나타낸 것이다.

도 11은 본 발명의 화학식 1에 의해 유도되는 세포분포도를 나타낸 것이다.

도 12는 본 발명의 화학식 1에 의한 세포사멸 유도활성 측정(TUNEL Assay) 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 하기 화학식 1의 화합물, 그의 제조방법 및 항암제로서의 용도에 관한 것이다.

암을 치료하기 위한 세포사멸 조절 항암제의 개발이 수년간 시도되져 왔다. 그러나 이러한 약물들의 가장 치명적인 단점은 비선택적으로 암세포와 정상세포의 DNA 합성을 저해하거나 세포에 영향을 준다는 점이다. 이로 인해 부작용과 암세포의 내성을 유도하게 되며 재발의 가능성을 내재하고 있다. 따라서 암을 치료하기 위한 새로운 모색이 시도되고 있는데 세포주기의 이론 도입, 즉 활발히 성장하려는 암세포는 성장이 상대적으로 거의 정지되어 있는 대다수의 정상세포에 비해 엄청나게 빠른 세포주기가 운영되고 있기 때문에, 세포주기의 조절 원천인 cdks(cycling dependent kinases)를 저해하여 암세포만을 선택적으로 cell cycle arrest를 유발시킨다. 이 자극을 바탕으로 소위 세포사멸이 일어나게 되면, 암세포만을 선택적으로 괴사시킬 수 있으므로 기존의 항암 요법의 부작용을 최소화할 수 있다.

이를 바탕으로 정상세포에서 보다 암세포에서 선택적으로 세포사멸을 유도하는 경로를 target으로 하는 시도가 이루어지고 있다. 또한 직접적으로 세포사멸을 유도하기 보다는 간접적으로 세포주기 조절인자의 활성을 억제하여 DNA의 합성을 조절하는 단백질 및 효소 등 신호전달 체계를 차단 혹은 조절함으로써 DNA합성, mitosis 및 세포분열을 억제하여 암세포를 제거하는 기전에 관한 연구가 활발하게 진행되고 있다.

본 발명자들은 세포주기를 조절함으로서 암세포의 증식을 억제할 수 있는 새로운 기전의 항암제를 개발하고자 예의 노력한 결과, 토양방선균 BG2-41로부터 신물질을 분리하고, 상기 신물질이 암세포 사멸유도 활성제로 작용하고 항암특성을 나타낸다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 토양방선균 BG2-41로부터 분리된 암세포 사멸유도 활성을 가지는 신규물질을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 신규물질의 세포사멸 유도 활성제 및 항암제로서의 용도를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 토양 방선균 BG2-41 균주 및 상기 균주로부터 상기 신규물질을 분리 및 정제하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명자들은 세포사멸 유도 활성제를 개발하기 위하여 제주도 토양으로부터 분리한 방선균 BG2-41(KACC 91015)의 배양액을 시험한 결과, 이 배양액으로부터 새로운 물질을 분리하고, 상기 물질이 아래의 화학식 1을 갖고, 암 세포사멸 유도활성을 갖고 항암특성이 우수하다는 사실을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 아래의 화학식 1의 화합물(F-3-2-5로 명명함) 또는 약학적으로 허용 가능한 그의 염을 제공한다.

<화학식 1>

상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염의 예로는 염산, 황산, 인산 등의 무기염 및 수산, 푸마르산, 말레인산, 능금산, 구연산, 주석산, 글루탐산 등의 유기염 등, 약학적으로 허용할 수 있는 산부가염을 들 수 있다.

본 발명은 또한, 화학식 1을 갖는 화합물의 생성능을 가지는 토양 방선균(Streptomyces sp.) BG2 균주(KACC 91015) 및 상기 균주를 배양한 다음, 상기 배양액으로부터 화학식 1의 화합물을 분리 및 정제하는 것을 특징으로 하는 화학식 1의 화합물의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 분리 및 정제는 (a) 배양액을 용매로 추출하는 단계; (b) 상기 추출액을 여과하고 농축시키는 단계; 및 (c) 상기 농축액을 크로마토그래피로 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 방법에 사용할 수 있는 용매의 종류는 화학식 1의 화합물을 효과적으로 추출할 수 있는 용매이면 특별히 제한되지 아니한다. 그 예로는 에탄올, 메탄올, 이소프로판올, 에틸렌글리콜 등을 포함하는 알콜, 염화메틸렌, 클로로포름, 사염화탄소 등을 포함하는 할로겐 원자로 치환된 탄화수소류, 테트라히드로푸란, DMF, DMSO, 에틸아세테이트 등을 들 수 있다. 본 발명의 구체예에서는 50% 이소프로필알코올을 사용하여 추출하였으나, 이것은 예시에 불과할 뿐, 화학식 1의 화합물이 다른 용매, 예를 들면, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 염화메틸렌, 에틸아세테이트, 테트라히드로푸란 등에도 잘 용해되므로 이들을 사용하는 것을 제한하는 것은 아니다.

용매로 추출하여 얻어진 추출액은 여과 및 용매의 증류에 의해 농축된다. 용매의 증류는 통상 감압 증류에 의해 성취되나, 대기압 하에서 증류하는 것을 배 제하는 것은 아니다.

감압 증류된 농축액은 크로마토그래피에 의해 순수한 화합물로 정제된다. 본 발명에서는 농축액을 이온교환수지인 HP-20 Diaion 컬럼 크로마토그래피, 역상의 분리수지인 C-18 컬럼 크로마토그래피 및 분취 고속 액체 크로마토그래피(컬럼: Waters C18, 19mm X 300mm, 유속: 20ml/분, 이동상: 45% 아세토니트릴, 검출 파장: UV 230nm, 머무름 시간(RT): 9.3분)에 순차 적용하였으나, 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 크로마토그래피에 사용되는 물질 및 전개 용매를 다양하게 변형할 수 있음은 자명할 것이다. 또한, 필요할 경우, 재결정에 의해 보다 순수한 화합물을 얻을 수 있다.

분리한 물질의 양성자 핵자기공명 스펙트럼과 탄소 핵자기공명 스펙트럼을 분석한 결과, 분자량이 248.1이고 C₁₅H₂₀O₃의 분자식으로 표시되는 상기 화학식 1의 고리탄화수소 구조를 갖는 신물질임을 확인하였다.

본 발명자들은 상기 화학식 1의 화합물이 세포사멸 유도 활성제로 작용하여 세포증식을 억제한다는 사실을 확인하였고, 이러한 결과로부터 본 발명의 화학식 1의 화합물이 세포의 증식을 억제하는 효과가 뛰어나며 항암제로서 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 또한, 상기 화학식 1의 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 그 염을 유효성분으로 함유하는 암세포 사멸유도 활성제를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 화학식 1의 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 그 염 을 유효성분으로 포함하는 항암제용 의약조성물을 제공한다. 상기 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여(근육내, 피하, 정맥내, 좌약 등)에 의해 투여될 수 있다. 적당한 투여량은 환자의 상태, 예를 들면 연령, 나이 및 증상의 정도 등에 따라 적절히 조절할 수 있지만, 통상 성인의 경우 100~500mg의 용량 범위에서 일반적으로 일회 또는 수 회로 나누어 1일당 100~1,000mg의 양으로 투여될 수 있다. 바람직하게는 1일 300~1,000mg의 양으로 투여되는 것이다.

또한, 본 발명의 조성물을 경구용 제제로서 조제하는 경우에는 부형제, 또한 필요에 따라서 결합제, 붕괴제,활택제, 착색제, 교미교취제 등을 가한 후, 통상적인 방법에 의해 정제, 피복 정제, 과립제, 캡슐제 등으로 한다. 부형제로서는 예를 들면 젖당, 옥수수 전분, 백당, 포도당, 솔비트, 결정 셀룰로스 등이, 결합제로서는 예를 들면 폴리비닐알콜, 폴리비닐에테르, 에틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 아라비아 고무, 트라가칸트, 젤라틴, 셸락, 하이드록시프로필셀룰로스, 하이드록시프로필스타치, 폴리비닐피리돈 등이, 붕괴제로서는 예를 들면 전분, 한천, 젤라틴 분말, 결정 셀룰로스,탄산칼슘, 탄산수소나트륨, 구연산칼슘, 덱스트란, 펙틴 등이, 활택제로서는 예를 들면 스테아린산 마그네슘, 활석, 폴리에틸렌글리콜, 실리카, 경화 식물유 등이, 착색제로서는 의약품에 첨가하는 것이 허가되어 있는 것이, 교미교취제로서는 예를 들면 코코아 분말, 박하뇌, 방향산, 박하유, 용뇌, 계피 분말 등이 사용된다. 이들의 정제는, 과립제에는 당의, 젤라틴의, 기타 필요에 따라 적절히 코팅하는 것을 배제하는 것은 아니다. 주사제로 조제하는 경우에는 필요에 따라, pH 조정제, 완충제, 안정화제, 보존제 등을 첨가하고, 통상적인 방법에 의해,피하, 근육내, 정맥 주사제로 한다. 본 발명의 화학식 1의 화합물은 필요에 따라, 염산, 황산, 인산 등의 무기염, 및 수산, 푸마르산, 말레인산, 능금산, 구연산, 주석산, 글루탐산 등의 유기염 등, 약학적으로 허용할 수 있는 산부가염으로서도 약효를 충분히 발휘시킬 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 실시예에 의하여 구체적으로 제한되지 않는다는 것은, 당 업계에서 통상적인 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

실시예 1: 방선균 BG2-41의 분리 및 동정

제주도 토양으로부터 분리된 방선균속(Streptomyces sp.) BG2-41 균주(KACC91015)의 배양을 위하여, 방선균 배양에 이용되는 Bennet 배지를 이용하였다. 배지조성은 beef extract 1g/L, yeast extract 1g/L, tryptone 2g/L, glycerol 10g/L이며, 배양온도 28℃와 pH 7.2에서 진탕시키며 10일간 배양하였다. 상기 배양된 BG2-41 균주의 주사현미경 (Scanning Electron Microscope) 관찰결과, 방선균속(Streptomyces sp.)과 매우 유사하였다 (도 1).

방선균속 (Streptomyces sp.) BG2-41균의 유전적 분석을 실시하고, 이를 동정하기 위하여 16S rRNA 유전자의 염기서열을 다음과 같이 분석하였다. DNA 추출을 위하여 Bennet 배지에 7일간 현탁배양한 후 배양액을 원심분리 하여 cell을 분리하 였다. DNA 추출은 Genomic DNA Extraction Kit (Intron)를 이용하여 추출하였다.

PCR은 반응용액(10mM Tris, pH 8.3; 50mM KCl; 1.5mM MgCl₂; 0.2mM dNTPs; 1 unit Taq DNA polymerase)에 0.2㎍ genomic DNA , 0.25μM 16S rRNA 유전자 primer 4 쌍이 표 1과 같이 조합하여 증폭하였다. 증폭된 DNA 절편의 크기가 A조합은 900bp, B조합은 480bp, C조합은 1200bp, D조합은 800bp가 되도록 하였다. PCR(초기 94℃ 5분 1회; 94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 1분, 35cycle; 72℃ 5분 1회)을 실시한 후, 증폭된 16S rRNA 유전자 일부분을 pGEM-T Easy vector (Promega)에 ligation한 다음, 대장균 DH5α에 형질전환하였다.

형질전환된 대장균은 선발배지(1.5% agar, 50mg/L ampicillin, 100μM IPTG, 50mg/L X-gal)에 도발하여 37℃에서 12 시간 배양하였다. 증폭된 16S rRNA 유전자조각의 vector로의 삽입은 blue/white colony로 1차 선발하고, 이중 white colony만을 LB배지에 접종하여 배양하였다. 배양액은 plasmid 분리를 위하여 원심분리한 후 alkaline lysis방법을 이용하였다. 분리된 plasmid를 제한효소 EcoR1으로 절단 후 전기영동을 통하여 증폭된 16S rRNA 유전자 조각의 삽입을 확인하였다. 증폭된 16S rRNA 유전자 염기서열(서열번호 1)의 확인을 위하여, NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 BLAST를 이용하여 homology를 확인한 결과, 방선균 스트렙토마이세스 네야가와엔스(Streptomyces neyagawaens)와 98%의 상동성을 보였다 (도 2).

16S rRNA 유전자의 PCR 및 염기서열분석에 사용된 primer

Primer pair	염 기 서 열	서열번호
A	5'-CAAGCGTTGTCCGGAATTAT	2
A	5'-TTCGGGTGTTACCGACTTTC	3
B	5'-CAAGCGTTGTCCGGAATTAT	2
B	5'-ATCTCTGGATGTTTCCGGT	4
C	5'-GATACGACTCAGGACCGCAT	5
C	5'-TTCGGGTGTTACCGACTTTC	3
D	5'-GATACGACTCAGGACCGCAT	5
D	5'-ATCTCTGGATGTTTCCGGT	4

실시예 2: 화학식 1을 갖는 화합물(F-3-2-5)의 제조방법

실시예 1과 같은 방법으로 배양한 BG2-41 균주 배양액 40L를 동량의 50% 이소프로필알코올로 추출하여 얻은 추출물로부터 다음과 같은 방법으로 항암 활성물질인 화학식 1을 갖는 화합물을 분리 및 제조하였다. 제조과정을 확립하기 위한 분석방법으로는, 각 단계에 있어서 암세포를 이용한 MTT 분석실험을 통한 세포성장 저해분석(cell growth inhibition assay)을 운용하였다.

방선균 BG2-41의 배양액 40L를 동량의 50% 이소프로필알코올로 추출하여 얻은 추출물을 이온교환수지인 HP-20 Diaion 컬럼 크로마토그래피, 역상의 분리수지인 C-18 컬럼 크로마토그래피 및 분취고속 액체크로마토그래피(컬럼: Waters C18, 19mm X 300mm, 유속: 20ml/분, 이동상: 45% 아세토니트릴, 검출파장: UV 230nm, 머무름 시간(RT): 9.3분)에 순차 적용하였다. 필요할 경우, 재결정에 의해 보다 순수한 화합물을 얻을 수 있다. 화학식 1의 화합물은 도 3에 도시한 것과 같은 과정에 의하여 분리 및 정제하였다.

분리한 물질 F-3-2-5는 양성자 핵자기공명 스펙트럼과 탄소 핵자기공명 스펙트럼 분석결과, 분자량이 248.1이고 C₁₅H₂₀O₃의 분자식으로 표시되는 상기 화학식 1의 고리탄화수소 구조를 갖는 신물질임을 확인하였다. 구체적인 물성 테스트 데이터는 다음과 같다.

(1) 분취 고성능액체크로마토그라피 상의 특징은 도 4에 도시된 바와 같다.

(2) 용해성: 상기 화학식 1의 화합물은 메탄올, 에탄올, 디메틸설폭사이드,이소프로판올, 염화메틸렌, 에틸아세테이트, 테트라히드로푸란 등에 잘 용해되었다.

(3) 질량분석

측정기기는 JMS-700 Mstation (JEOL Ltd., Japan)이었고, EI/MS를 위한 용매는 메탄올을 사용하였다. 그 결과, 질량(m/z)은 248.1 (도 5에서 분자 이온(M⁺) 질량 = 248.1)로 관찰되었다. 질량분석 스펙트럼은 도 5와 같다.

(4) 핵자기공명 스펙트럼

측정기기는 브루커(Bruker, Germany)사의 Avance 400(9.4T)이었고, 용매는 중수소메틸 알코올을 사용하였다.

양성자 핵자기공명 스펙트럼의 결과는 도 6에 나타내었으며, 이를 정리하면 다음과 같다: ¹H-NMR(400MHz) δ: 1.66(m), 1.93(d), 2.78(dd), 2.94(dd), 3.35(s), 3.67(t), 3.69(s), 4.20(m), 7.07(q), 7.12(m), 7.14(m), 7.20(m).

탄소 핵자기공명 스펙트럼의 결과는 도 7에 나타내었으며, 이를 정리하면 다 음과 같다: ¹³C-NMR(100MHz) δ: 14.6(q), 30.8(t), 39.8(t), 45.2(t), 59.3(t), 66.5(d), 126.1(d), 128.5(d), 128.5(d), 128.6(d), 128.6(d), 140.5(s), 141.4(s), 142.4(d), 201.2(s).

(5) 화학식 1을 갖는 화합물의 구조

양성자 핵자기공명 스펙트럼에서 7ppm 근처에 복잡한 첨두들이 모여 있는 것으로부터 아로마틱 고리(aromatic ring)가 존재할 것으로 추정된다. 또한, HMQC(heteronuclear multiple quantum coherence)에서 120ppm과 130ppm 사이의 탄소들과 7ppm의 수소들이 연결되었고, 탄소 핵자기공명 스펙트럼에서 128.5ppm과 128.6ppm의 탄소들이 두 배의 크기를 보였고, 따라서 페닐고리(phenyl ring) 하나가 존재함을 알 수 있었다. 다음으로, COSY(correlated spectroscopy)에서 H5, H6, H7, H8의 순차적인 연결관계를 확인하였고, TOCSY(total correlated spectroscopy)에서는 긴거리 관계(long range coupling)를 확인할 수 있었으며, 결과적으로 C5, C6, C7, C8의 연결구조를 확인할 수 있었다.

C6와 C8의 경우 화학적 이동(chemical shift) 값이 66.5ppm과 59.3ppm으로 하이드록실그룹(hydroxyl group)이 결합되어 있는 것을 알 수 있었고, DEPT (distorsionless enhancement of polarization transfer) 실험을 통해 C6는 1차 탄소(primary carbon)이고, C8은 2차 탄소(secondary carbon)임을 확인하였다. C6과 C8에 연결된 두 개의 하이드록실 그룹 첨두들은 3.35ppm에 단일첨두 (singlet)로 나타나는 것을 확인하였다. 201.2ppm에 뚜렷한 카보닐탄소(carbonyl carbon)가 관 찰되었고, 이는 HMBC(heteronuclear multiple bonded connectivity) 스펙트럼을 통해 C5와 연결되어 있음을 알 수 있었다. 다음으로 142.4ppm에 있는 1차 탄소는 HMQC 스펙트럼에서 7.07ppm의 수소와 연결되었고, 이는 1.93ppm에 해당하는 메틸기와 비시날 관계(vicinal coupling) (³ J = 6.9 Hz)를 하고 있음을 확인하였다. HMBC 스펙트럼에서 30.8ppm에 해당되는 C9와 페닐고리의 H2',6'이 연결되었고, 128.5ppm에 해당되는 C2',6'과 H9가 연결되었으며 141.4ppm에 해당되는 C3과 H9가 연결되었다. 또한, TOCSY 시펙트럼에서도 H9와 H2',6',3',5'가 연결되는 것을 통해 페닐고리 주변의 연결구조를 확인할 수 있었다. 또한, HMBC 스펙트럼에서 C2와 H9 그리고 C4와 H2사이의 연결을 통해 부분 구조들의 전체적인 연결을 확인할 수가 있었다. C2와 C3사이의 이중결합(double bond) 때문에 생기는 구조 이성질체(conformational isomer)를 결정하기 위해 분자모사(molecular modeling)를 이용한 구조계산을 수행하였다. 기기로는 O2 R12,000 Silicon Graphics workstation 컴퓨터를 사용하였고, 소프트웨어는 Insight II (Accelrys, San Diego, USA)에 포함된 Discover program을 사용하였다. 분자모사 결과, Z 형태일 때는 H1과 H5 사이의 거리가 2.29Å인 반면 E 형태일 경우는 5.31Å 값을 가졌다. 그런데, 실제 NOESY(nuclear overhauser exchange spectroscopy) 스펙트럼에서 두 첨두들 사이의 연결이 전혀 관측되지 않았다. 따라서 활성물질의 구조를 E 형태로 결정하였다.

모든 기기분석을 종합한 결과, 본 발명에 따른 F-3-2-5의 화학구조는(E)-3-benzyl-6,8-dihydroxyoct-2-en-4-one으로 결정되었으며, 결정된 화합물의 구조는 화학식 1과 같다.

실시예 3: F-3-2-5에 의한 세포성장 억제 (cell growth inhibition) 활성

F-3-2-5에 의한 세포성장 억제활성을 관찰하기 위해 정상세포인 lymphocyte와 다양한 종류의 암세포 [HeLa(ATCC CCL 2), HepG2 (ATCC HB-8065), HL-60(ATCC CCL 240), H1299(ATCC CRL-5803), AGS(ATCC CRL 1739), A549(ATCC CCL 185), HT-29(ATCC HTB-38), Normal lymphocyte(ATCC CRL-8083)]를 이용하여 MTT assay를 수행하였다. 96웰 플레이트(96 well plate)에 암세포를 1.4 × 10⁵ cells/ml로 조절한 배지 100㎕와 다양한 농도의 F-3-2-5 1㎕를 넣고, 37℃, CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다.

24시간 후, 배양된 세포의 성장 억제율을 측정하기 위해 각 웰에 MTT 시약을 15㎕씩 분주한 후, 포마잔(formazan) 형성을 위해 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 3시간 후 상층액을 제거, 반응 정지 용액으로서 디메틸설폭사이드(DMSO)를 각 웰에 100㎕씩 분주하고, 형성된 포마잔이 잘 녹을 때까지 흔들어 주었다. 억제 농도를 측정하기 위해 엘라이저(ELISA, molecular device, USA)를 사용하였다.

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, F-3-2-5의 세포성장 억제율은 대조군의 세포성장 억제율의 50%의 억제율을 나타내는 농도인 IC₅₀치가 정상세포인 lymphocyte에서는 0.48mM 이상이었으나, 여러 암세포 중에서는 골수 백혈 암세포인 HL-60 및 간암세포인 HepG2 세포에서는 각각 80μM 및 96.8μM이었고, 또한 자궁경 부암 세포인 HeLa 세포 및 폐암 세포주인 A549 세포에서는 각각 60μM 및 65μM의 IC₅₀값을 나타냈다.

즉, 본 실험결과, 정상세포인 normal lymphocyte에서는 약물에 대한 영향이 거의 없었으나, HepG2, A549, HL-60 그리고 특히 HeLa 세포에서는 낮은 농도에서 성장을 억제시켰다.

실시예 4: F-3-2-5에 의한 HeLa 세포의 형태학적 관찰

F-3-2-5에 의한 암세포의 형태적 변화양상을 관찰하기 위해 DAPI 염색방법을 실시하였다. F-3-2-5 80μM을 HeLa 세포에 처리하여 24시간 배양한 후 세포를 모으고 PBS 5ml로 세척하였다. 원심분리하여 PBS를 제거하고 0.5ml PBS로 부유시킨 후 5ml의 고정액(메탄올:아세트산 = 3:1)을 넣어 4시간 이상 고정시켰다. 고정시킨 세포를 1800rpm에서 5분간 원심분리하여 고정액을 제거하고 고정액 0.4ml로 세포를 부유시켰다. 슬라이드 글라스에 세포 부유액을 한방울 떨어뜨린 후 1시간 동안 37℃에서 건조시켰다. 고정시킨 세포에 DNA-specific flurochrome DAPI로 염색하고 염색된 슬라이드를 형광 현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 대조군에서의 세포형태는 원형을 유지한 반면, F-3-2-5 80μM을 처리한 세포에서는 세포사멸(아폽토시스, apoptosis)의 전형적인 형태인 DNA 프레그멘테이션(fragmentation)과 다양한 크기의 아폽토틱 바디(apoptotic body)들을 관찰할 수 있었다. 즉, 암세포에 처리한 F-3-2-5에 의하여 세포괴사(네크로시스, necrosis)가 아닌 세포사멸이 유도되고 있음을 형광현미경을 통하여 확인하였다.

실시예 5: F-3-2-5에 의한 세포사멸 유도효과

F-3-2-5를 처리한 암세포의 세포주기별 분포비율 및 아폽토시스 발생비율을 분석하기 위해 프로피디움 요오드(propidium iodide)를 이용하여 실시하였다. F-3-2-5를 농도별로 처리한 암세포주를 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 하에서 배양한 뒤, 회수한 다음, 모은 세포를 PBS로 2회 세척, 70% 에탄올을 넣은 후 4℃에서 4시간 고정시켰다. 고정된 세포는 PBS로 세척하고, 250㎍/ml RNaseA와 25㎍/ml 프로피듐 요오드가 포함된 PBS로 4℃에서 30분간 반응시켰다. 염색된 DNA 함량분석은 488 활성화, 15mW인 FASTAR 플로우 사이토미터(flow cytometer)(Becton dickinson)를 이용하여 측정하고 셀 퀘스트 소프트웨어(Cell Quest software)로 분석하였다.

그 결과 도 10에 나타난 바와 같이, HL-60 세포를 F-3-2-5 20.1μM로 처리한 경우에는 아폽토시스가 유도된 세포의 비율이 10.43%이었지만, 농도 40.3μM 및 60.5μM로 처리한 경우에는 각각 21.93% 및 30.34%로 점차적으로 증가하였다. 또한 HeLa 세포에서도 아폽토시스가 유도되어, F-3-2-5 32.3μM로 처리한 경우에는 5.02%를 보였으나, 80μM 및 121μM로 처리한 경우에는 각각 34.31% 및 53.68%로 급격하게 증가하였다. 이상의 결과는 골수 백혈 암세포인 HL-60과 자궁경부암 세포인 HeLa에 F-3-2-5를 처리하면 농도 의존적으로 세포사멸이 유도된다는 사실을 확 인시켜준다.

이 외에도 폐암세포인 A549 및 간암세포인 HepG2 세포에서도 동일한 실험을 수행한 결과, 상기와 유사한 결과를 나타내었으며, 결국 A549 및 HepG2 세포에서도 세포사멸이 유도된다는 사실을 확인하였다.

실시예 6: F-3-2-5에 의해 유도되는 세포분포도

HeLa 세포에 F-3-2-5 32.3ㅅM을 처리하여 시간별(0, 3, 6, 12, 24, 48시간)로 배양하면서 세포의 주기변화와 세포사멸로 유도되는 세포의 분포를 측정하였다.

그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, HeLa 세포에 F-3-2-5를 처리하지 않은 대조군(0 hr)의 G1기는 34.25%, 아폽토시스로 유도되는 비율은 2.61%이었으나, F-3-2-5를 32.3μM 처리한 경우에는 6시간 경과된 다음부터 G1기의 수치가 점차적으로 증가하여, 12시간 및 24시간 경과된 후에는 각각 42.5% 및 46.35%를 나타냈다. 한편 아폽토시스는 24시간을 경과한 후에 나타났으며, 48시간에서 16%의 비율을 보였다. 이상의 결과는 자궁경부암 세포인 HeLa에 F-3-2-5를 처리하면 시간 의존적으로 G1기에서 세포주기 조절을 억제하는 것은 물론이며, 이에 따라 세포사멸이 유도된다는 사실을 확인시켜준다.

실시예 7: 턴널 어세이(TUNEL Assay)를 통한 F-3-2-5의 세포사멸 유도활성

세포사멸의 특징인 DNA 프래그멘테이션(DNA fragmentation)을 확인하기 위하여 턴널분석을 시행하였다. 즉, 세포사멸이 유도된 세포의 fragment된 DNA에 TdT(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase) enzyme을 이용하여 DNA 3'OH 말단에 fluorescein-12-dUTP를 labling하는 방법으로 측정하였다.

HeLa, HepG2 및 HL-60 세포에 F-3-2-5를 각각 처리하여 37℃, 5% CO₂ 하에서 시간별(0, 6, 12, 24시간)로 배양한 뒤, 회수한 다음, 모은 세포를 PBS로 두 번 세척 후, 0.5ml PBS로 세포 부유액을 만들었다. 이 세포 부유액에 5ml의 1% 포름아마이드(formamide)가 첨가된 PBS 5ml을 넣고 얼음에 20분간 반응시켜 세포를 고정시켰다. 고정된 세포를 1800rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 제거한 후, PBS 5ml로 다시 한번 세척하였다. 세척한 세포를 0.5ml PBS로 세포 부유액을 만들어 5ml의 70% 에탄올을 넣고 -20℃에서 4시간 이상 고정시켰다. 고정시킨 세포를 2000rpm에서 10분간 원심분리한 후 PBS 5ml로 세척 후 다시 2000rpm에서 10분간 원심분리하여 PBS를 제거하였다. 남겨진 세포에 80㎕의 equilibration buffer를 넣고 잘 현탁시켜 상온에서 5분간 반응시킨 후 상층액을 제거하였다. 침전된 세포에 50㎕의 TdT incubation buffer (45㎕ equilibration buffer, 5㎕ nucleotide Mix, 1㎕ TdT enzyme)를 넣어 부유시킨 다음 빛을 차단하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 종료되면 20mM EDTA용액 1ml을 넣고 조심스럽게 섞어준 후 800rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 여기에 250㎍의 DNase-free RNase A를 포함한 0.5ml의 프로피듐 요오드 용액(5㎍ 프로피듐 요오드, 1ml PBS)을 넣고 잘 섞어 주어 빛을 차단한 채 상온에서 30분간 반응시켰다. 모든 반응이 끝난 후 FASTAR 플로우 사이토미터(flow cytometer)(Becton dickinson)를 이용하여 측정하 고 셀 퀘스트 소프트웨어(Cell Quest software)로 분석하였다 (도 12).

HeLa 세포와 HL-60 세포에는 80ㅅM을, HepG2 세포에는 141μM의 F-3-2-5를 각각 처리하여 시간별로 세포사멸의 정도를 관찰한 결과, 각 세포의 세포사멸 유도를 나타내는 분포도가 X축을 따라 오른쪽으로 확연히 이동하는 것을 관찰할 수 있어 각 세포의 DNA 프레그멘테이션을 확인할 수 있었다. 이상의 결과는 실시예 4 내지 6의 결과를 뒷받침함은 물론이며, F-3-2-5에 의한 암세포의 세포사멸 유도활성을 명료하게 확인시켜준다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 토양 방선균 BG2-41 배양액으로부터 순수 분리된 암세포 사멸유도 활성을 가지는 화학식 1의 화합물 또는 그의 약학적 허용염 및 그 제조방법을 제공하는 효과가 있다.

본 발명에 따른 화학식 1의 화합물(F-3-2-5)은 세포주기 조절을 억제하며 세포사멸을 유도하는 활성을 갖는 항암특성을 나타내므로 세포사멸 유도 활성제뿐만 아니라 항암제로서 유용하게 사용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

화학식 1을 갖는 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 그의 염:

<화학식 1>
제1항에 있어서, 상기 약학적으로 허용 가능한 염은 염산, 황산 및 인산을 포함하는 무기염과 수산, 푸마르산, 말레인산, 능금산, 구연산, 주석산 및 글루탐산을 포함하는 유기염으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
화학식 1을 갖는 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 그의 염을 유효성분으로 포함하는 암세포 사멸유도 활성제.
화학식 1을 갖는 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 그의 염을 유효성분으로 포함하는 항암용 의약조성물.
화학식 1을 갖는 화합물의 생성능을 가지는 토양 방선균(Streptomyces sp.) BG2 균주(KACC 91015).
제5항의 방선균 BG2-41(KACC 91015)을 배양한 다음, 상기 배양액으로부터 화학식 1의 화합물을 분리 및 정제하는 것을 특징으로 하는 화학식 1의 화합물의 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 분리 및 정제는 (a) 배양액을 용매로 추출하는 단계; (b) 상기 추출액을 여과하고 농축시키는 단계; 및 (c) 상기 농축액을 크로마토그래피로 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.