WO2014194551A1 - 一种海洋咔啉生物碱的生物合成基因簇及其应用 - Google Patents

一种海洋咔啉生物碱的生物合成基因簇及其应用 Download PDF

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WO2014194551A1
WO2014194551A1 PCT/CN2013/079434 CN2013079434W WO2014194551A1 WO 2014194551 A1 WO2014194551 A1 WO 2014194551A1 CN 2013079434 W CN2013079434 W CN 2013079434W WO 2014194551 A1 WO2014194551 A1 WO 2014194551A1
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compound
gene
carboline
mcba
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PCT/CN2013/079434
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鞠建华
陈奇
纪昌涛
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中国科学院南海海洋研究所
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/182—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system

Definitions

  • the invention belongs to the field of microbial genetic engineering, and particularly relates to a biosynthetic gene cluster of marine porphyrin alkaloids (MCBs) and application thereof.
  • MBCs marine porphyrin alkaloids
  • ⁇ -porphyrin compounds are a class of indole alkaloids widely found in nature. These compounds have a common ⁇ -carboline tricyclic skeleton system, which can be easily divided into four according to the degree of saturation of the ⁇ -carboline pyridine ring. Hydrogen series, dihydro series and full aromatic series. The fully aromatic ⁇ -carboline tricyclic skeleton system is a completely planar molecule with different acid and basicity. Therefore, the existence form of such compounds is affected by the nature and position of the ⁇ value and the substituent on the ⁇ -carboline ring. Impact.
  • MABs Marine porphyrin alkaloids
  • SCSIO 00652 from the ferment of Marinactinospora thermotolerans SCSIO 00652 from the new genus Synechococcus of Nocardiopsaceae.
  • the basic compound, its structural formula is shown in Figure 1 (1-4), pharmacological activity studies show that these compounds have no cytotoxic activity, but have significant inhibitory effects on Plasmodium falciparum multi-drug resistant strain Dd2 and sensitive strain 3D7.
  • a first object of the present invention is to provide a biosynthetic gene cluster of marine porphyrin alkaloids.
  • the marine porphyrin alkaloid comprises four ⁇ -porphyrin alkaloid compounds, and the structural formula thereof is shown in Formula 1, 2, 3 and 4 in Figure 1, and the four compounds have been patented " ⁇ - ⁇ "Porphyrin alkaloids and their use in the preparation of anti-malarial drugs", the patent number is: ZL 201 1 10132680.9.
  • the invention adopts a marine porphyrin alkaloid derived from actinomycetes as a target molecule, and adopts a combination of molecular biology, microbiology, synthetic biology, biochemistry and organic chemistry to study the organism from the screening of biosynthetic gene clusters.
  • the biosynthetic gene cluster of the marine porphyrin alkaloid of the present invention is derived from the actinomycete Marinactinospora thermotolerans SCSIO 00652, wherein the nucleotide sequence of the biosynthetic gene cluster is 1-4222 of SEQ ID N0.1.
  • the base sequence shows three genes, which are specifically:
  • the gene responsible for the synthesis of the marine porphyrin alkaloid amide bond which is located at the 1-1488 base of the nucleotide sequence of the gene cluster (SEQ ID N0.1, the same below), and has a length of 1488 base pairs.
  • Amide bond synthetase 495 amino acids;
  • the gene responsible for the synthesis of the marine porphyrin alkaloid skeleton which is located at the 1572-2516 base of the nucleotide sequence of the gene cluster, and has a length of 945 base pairs encoding the Pictet-Spengler reaction enzyme.
  • the gene responsible for the decarboxylation of marine porphyrin alkaloids, m C is located at base 2570-4222 of the nucleotide sequence of the gene cluster and is 1653 base pairs in length, encoding a decarboxylase, 550 amino acids.
  • the complement of the base sequence at positions 1-4222 of the sequence shown in SEQ ID N0.1 can be obtained at any time according to the principle of DNA base complementation.
  • the nucleotide sequence or partial nucleotide sequence of positions 1-4222 can be digested by polymerase chain reaction (PCR) or by appropriate restriction enzymes to cleave corresponding DNA or DNA in vitro synthesis techniques or other suitable The technology is obtained.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the present invention provides a method of obtaining a recombinant DNA vector comprising at least a DNA sequence of positions 1-4222 of a sequence represented by SEQ ID NO.
  • the present invention also provides a pathway for producing a disrupted or other genetic modification of a marine porphyrin alkaloid biosynthesis gene, at least one of which comprises a nucleotide of positions 1-4222 of the sequence of SEQ ID N0.1 sequence.
  • the nucleotide sequence or partial nucleotide sequence provided by the present invention can be detected by a polymerase chain reaction (PCR) method or DNA containing positions 1-4222 of the sequence represented by SEQ ID NO.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the needles are obtained from other organisms by Southern hybridization or the like, and the biosynthetic gene clusters of marine porphyrin alkaloids are obtained. Like a gene.
  • the cloned DNA comprising the nucleotide sequence or at least a partial nucleotide sequence provided by the present invention can be used to locate more library plasmids from the actinomycete Marinactinospora thermotolerans SCSIO 00652 genomic library. These library plasmids contain at least a partial sequence of the present invention, and also contain uncloned DNA in adjacent regions of the Nocardia genome.
  • nucleotide sequence or at least part of the nucleotide sequence provided by the present invention may be modified or mutated in vitro, including insertion, substitution or deletion, polymerase chain reaction, error-mediated polymerase chain reaction, site Specific mutations, re-ligation of different sequences, directed evolution of different parts of the sequence or homologous sequences from other sources, or mutagenesis by UV or chemical agents.
  • a clone comprising a nucleotide sequence or at least a partial nucleotide sequence provided by the present invention can be expressed in a foreign host by a suitable expression system to obtain a corresponding enzyme or other higher biologically active substance or yield.
  • exogenous hosts include Escherichia coli, Streptomyces, Micromonospora, Pseudomonas, Bacillus, yeast, plants and animals.
  • amino acid sequences provided by the present invention can be used to isolate the desired protein and can be used in the preparation of antibodies.
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence or at least a partial sequence provided by the present invention may still have biological activity or even new biological activity after removal or replacement of certain amino acids, or increase yield or optimize protein kinetics or other commitments. The properties obtained.
  • a gene or gene cluster comprising a nucleotide sequence or at least a partial nucleotide sequence provided by the present invention can be expressed in a heterologous host and understood for their function in host metabolism.
  • a gene or gene cluster comprising a nucleotide sequence or at least a partial nucleotide sequence provided by the present invention can be constructed by genetic recombination to obtain a novel vector, or can be obtained by insertion, substitution, deletion or inactivation. Other novel biosynthetic pathways or the production of new compounds.
  • DNA fragments or genes can be used to increase the yield of marine porphyrin alkaloids or derivatives thereof, and the present invention provides a means of increasing yield in genetically engineered microorganisms.
  • the invention also provides the use of a marine porphyrin alkaloid biosynthetic gene cluster for the preparation of marine porphyrin alkaloids and analogs thereof.
  • the present invention also provides an amide bond synthetase gene characterized in that the nucleotide sequence thereof is represented by bases 1-1488 of SEQ ID N0.1.
  • the above amide bond synthetase gene mcbA encodes an amide bond synthase McbA.
  • the present invention also provides a Pictet-Spengler reaction enzyme gene mc characterized by a nucleotide sequence as shown at nucleotides 1572-2516 of SEQ ID N0.1.
  • the Pictet-Spengler reaction enzyme McbB encoded by the above Pictet-Spengler reaction enzyme gene mcbB.
  • the ⁇ -porphyrin core is a compound represented by the formula (II) 6
  • the ⁇ -carboline derivative is the compound 5 or 7 represented by the formula (II).
  • genes and proteins information related to the biosynthesis of MCBs can help people understand the biosynthesis mechanism of the natural products of the small molecule alkaloid family, and provide a material and theoretical basis for further genetic modification.
  • the genes and proteins thereof provided by the present invention can also be used to find and discover compounds, genes or proteins that can be used in medicine, industry or agriculture.
  • the Nocardiopsaceae family of the cardiobacteria of the present invention Marinactinospora thermotolerans SCSIO 00652
  • Marinactinospora thermotolerans SCSIO 00652 is a new genus, and is disclosed in the non-patent literature (the establishment of the genetic operating system of the marine actinomycete Marinactinospora tAermoto/era/ ⁇ SCSIO 00652.
  • Li Jun, Zhu Tsinghua, Zhang Yun, Ma Junying, Tian Xinpeng, Li Wenjun, Zhang Changsheng, Qi Jianhua. Chinese Antibiotic Journal. 2012. No. 2, 105-111 Page the applicant guarantees to the public from the date of application of the invention.
  • Figure 1 is a structural formula of the four ⁇ -carboline alkaloids 1-4 of the marine porphyrin alkaloid and the chemical formula of the related intermediate or derivative 5-14.
  • Figure 3 is a HPLC analysis of the crude extract of the mutant strain obtained by MCBs biosynthetic gene cluster in the genetically modified Man'wactwo3 ⁇ 4rora thermotolerans SCSIO 00652 in the fermentation medium: I: wild type Man'wactww/wratAermoto/era/M SCSIO 00652; II: mutant strain AmcL4; III: mutant strain Amc ⁇ S; IV: mutant strain AmcK:, the Arabic numerals in the figure indicate MCBs or intermediates thereof, wherein 1, 3, and 6 represent formula 1 in Fig. 1, respectively.
  • Figure 4 is a HPLC analysis of the fermentation product of the fermentation of mcbB, mc6Ag and mcMSC in E.co/BL21 (DE3) in LB: I: E. coli Lll (DE3) / pET28a ( + ); II: E. coli B 2 ⁇ (DE3) /pET28a ( + ) I mcbB III: E. coli B 2 ⁇ (DE3) /pET28a (+ ) ImcbAB; IV: E.
  • Figure 5 is a catalytic effect of the ⁇ -porphyrin core 6 (the compound represented by Formula 6 in Figure 1) as a substrate and an aromatic amine compound (i.e., a different substituent of ⁇ -phenylethylamine) in the amide bond synthase McbA.
  • an aromatic amine compound i.e., a different substituent of ⁇ -phenylethylamine
  • Figures 6-8 are the results of nuclear magnetic resonance spectra of 1 H, 13 C and B HMBC of Compound 6, respectively.
  • Figures 9-11 are the results of nuclear magnetic resonance spectra of 1 H, 13 C and B HMBC of Compound 7, respectively.
  • Figure 12 is a high resolution mass spectrum of Compounds 1-4, 8-14 and a low resolution mass spectrum of Compound 5.
  • I Compound 1 HR-ESI-MS [M+Na] + : m/z 380.1371 , MF: C22H19N3O2;
  • II Compound 2 HR- ⁇ ESI-MS[M+Na] + : m/z 396.1321, MF: C22H19N3O3; III compound 3,
  • FIG. 13 shows the SDS-PAGE results of McbA.
  • Figures 18-19 are the results of nuclear magnetic resonance spectra of 3 ⁇ 4 and 13 C of compound 10.
  • 22-23 are the results of nuclear magnetic resonance spectra of compound 12 and 13 C.
  • Figures 24-25 are the results of nuclear magnetic resonance spectra of compound 13 and 13 C.
  • Figures 26-27 are the results of nuclear magnetic resonance spectra of compound 14 and 13 C. detailed description: The following examples are intended to further illustrate the invention and not to limit the invention.
  • mcbA 495 amide bond synthase 42/55 SRIM_40803 (ZP-20970382.1) mcbB 314 Pictet-Spengler reaction enzyme 48/62 BBA 06474 (EJP64480.1) mcbC 550 decarboxylase 32/50 Gad2 (ZP 01998647.1 ) a number of amino acids; Contains the GeneBank accession number of the homologous protein; c identity / similarity.
  • the present invention explores the biosynthesis mechanism of MCBs and uses PCR-targeting technology to target three biosynthetic genes.
  • the inactivating mutations (see Table 2 for the detection primers and Table 3 for the inactivation primers) obtained the relevant mutant strains.
  • mcbAR TATGCTCGTCGGATGAAGGCG
  • mcbB mcbBF CGGTGAGGCAGATCGAAATCG
  • mcbBR CGGTCATGCGTCCAGATAGCG
  • mcbA mcbAdelF GCGGTCCAGGCCATCGGCTGTCACTACGTGGGCCTGCGTattccggggatccgtcgacc mcbAdelR: GACCAGGGCGCAGGTGTTCGGGATCGGGGTCGGCGCCtgtaggctggagctgcttc
  • McbA was responsible for the formation of the amide bond between the left half of the ⁇ -porphyrin core 6 and the right half of the aromatic amine compound, all products (removal of compound 5 Both were identified by high resolution mass spectrometry and Compounds 8-14 were simultaneously identified by NMR ( Figure 5, Figures 14-27).
  • thermotolerans SCSIO 00652 were inoculated into 50 mL of TSB medium (pancreatic protein 17 g, plant peptone 3 g, chlorinated) at a dose of 5%.
  • TSB medium pancreatic protein 17 g, plant peptone 3 g, chlorinated
  • Sodium 5 g, dipotassium hydrogen phosphate 2.5 g, glucose 2.5 g, water to 1 L, pH 7.2-7.4 28-30 ° C, shaking culture for about 2 d, centrifugation at 4000 r/min for 10 min to collect mycelium .
  • the mycelium was washed twice with STE solution (NaCl 75 mmol/L, EDTA 25 mmol/L, Tris-Cl 20 mmol/L, balance water), and 30 mL of STE solution was added to the washed mycelium.
  • the final concentration of 3 mg/mL lysozyme was vortexed uniformly, and the bath was heated at 37 °C for 3 h.
  • the protein was added to the final concentration of 0.1-0.2 mg/mL proteinase K, mixed, and warmed at 37 °C for 10 min, and added to the final concentration of 1 - 2% SDS, mix well, put in a 55 °C water bath for about 1 h, and invert it several times.
  • the restriction endonuclease S m3A I was first determined by a series of dilution experiments containing 17 ⁇ L of Streptomyces Marinactinospora thermotolerans SCSIO 00652 genomic DNA, 2 of 10x reaction buffer and 1 different dilution in a 20 ⁇ L system.
  • the degree of Sau3A I, which terminated the reaction was 4 ⁇ L of 0.5 mol/L EDTA and a suitable loading buffer. It was determined by groping that the enzyme activity unit of 0.025-0.05 U is suitable. On this basis, a genomic DNA fragment slightly larger than 40 kb was obtained by a large number of partial digestions, and dephosphorylation was carried out by dephosphorylation.
  • the vector SuperCos 1 plasmid used to construct the library was first cut with restriction endonuclease ⁇ I from the middle of the two C sequences, followed by dephosphorylation, and then restriction endonuclease Sam was used from the multiple cloning site. HI cuts and gets two arms.
  • the treated vector was ligated to the previously prepared partially ligated about 40 kb genomic DNA fragment, and the ligation system was 10, containing 1.25 ⁇ ⁇ prepared genomic DNA fragment and 0.5 ⁇ ⁇ treated SuperCos 1 plasmid, 1 of 10xBuffer , 0.3 U of ligase.
  • the ligation product was treated at 65 °C for 15 min to inactivate the ligase.
  • the strain E. coli LM392 frozen at -80 was coated and resuscitated on LB medium.
  • the monoclonal seed was inoculated into LB medium (0.2% maltose and 10 mmol/L MgS0 4 ), cultured overnight at 37 °0, and 5 mL of the overnight culture solution was taken on the packaging reaction day.
  • LB medium (0.2% maltose and 10 mmol/L MgS0 4
  • 5 mL of the overnight culture solution was taken on the packaging reaction day.
  • Adding to 50 mL of fresh LB medium (adding 0.2% maltose and 10 mmmol/L MgS0 4 ) shaking at 37 °C, 200 r/min until the culture OD6QQ reaches 0.8-1, the host bacterial solution is obtained.
  • a genome-wide scan and annotation of the actinomycete Marineactinospora thermotolerans SCSIO 00652 was performed to screen from the above genomic library, in which a 4 kb clone was identified and identified as a clone of the biosynthetic gene cluster containing marincarbolines, named cosmid MCBs, and sequenced, the nucleotide sequence of which is shown in SEQ ID N0.1, wherein the nucleotide sequence of the biosynthetic gene cluster of marincarbolines is shown as the base sequence of positions 1-4222 of SEQ ID NO: , contains 3 open reading frames (ORFs) (Table 1). According to bioinformatics analysis, mcbA, mcbB, and mcbC are responsible for the biosynthesis of MCBs.
  • In vitro knockout mutants were obtained by PCR-targeting. Based on the obtained biosynthetic gene cluster sequences of MCBs, a pair of m C gene knockout primers were designed according to the PCR-targeting system reported in the literature, and the primer sequences are shown in the m C inactivation primers in Table 3.
  • the in vitro knockout plasmid was then constructed by reference to the PCR-targeting method and then transferred to the donor bacteria for conjugative transfer. The specific steps are as follows: (1) The cosmid plasmid (cosmid MCBs) containing the biosynthetic gene cluster of MCBs was transferred into E. coli BW25113/pIJ790 to obtain the E.
  • the C 5 m amplification cycle is 94 .
  • the 1.4 kb PCR product was recovered and purified for use.
  • (3) The PCR product was electroporated into the competent cells prepared in the step (1) to cause recombination, and applied to the LB screening plate (containing 100 g/mL ampicillin, 50 g/mL kanamycin, 50 g /mL apramycin; incubated at 37 °C overnight. A positive monoclonal was picked from the plate, and the plasmid was extracted.
  • the recombinant plasmid was named delm C, and a partial fragment of the mcbC gene in the plasmid was replaced with a transfer origin and an apramycin resistance gene.
  • the constructed recombinant mutant plasmid ddmcbC was transformed into E. coli ET12567/pUZ8002 and constructed into E. co/ET12567/pUZ8002/delmc6C as a donor strain for conjugative transfer.
  • Wild-type actinomycete Marineactinospora thermotolerans SCSIO 00652 strain in M-ISP4 medium soluble starch 10 g, yeast extract 0.5 g, peptone 1 g, NaCl 1 g, MgS0 4 -7H 2 0 lg, (NH 4 ) 2 S0 4 2 g, K2HPO4 1 g, CaCOs 2 g, sea salt 30g, trace elements, water to 1 L, pH 7.2
  • grown spores were collected with TSB cultured with sterile cotton swabs In the base, vortex oscillates to disperse the spores. The mycelium and spores were separated by filtration.
  • the spores were suspended in 5 mL of TSB medium, heat shocked at 50 °C for 10 min, and then germinated at 28 °C for 2-4 h as a recipient strain for metastasis.
  • the donor strain K coli ET12567/pUZ8002/delmc3 ⁇ 4C contains 50 g/mL kanamycin in 50 mL.
  • the LB liquid medium of 25 g/mL chloramphenicol and 50 g/mL apramycin was grown at 37 °C until the OD 6 QQ value was about 0.8, and the cells were collected by centrifugation (4000 r/min, 10 min).
  • the cells were washed 3 times with LB, suspended in 300 L of LB medium, and used as donor bacteria for conjugation transfer.
  • the above-mentioned recipient bacteria 400 and the donor bacteria 100 ⁇ were uniformly mixed, coated on M-ISP4 solid medium without any antibiotics, dried, and then cultured at 28 ° C for 18-20 h.
  • the plate was then removed and the plate was covered with antibiotic-containing water to a final concentration of 35 ⁇ ⁇ / ⁇ apramycin and 50 g/mL trimethoprim, dried and placed in a 28 ° incubator. After 3-4 days of culture, observe.
  • the inactivation primers and detection primers of the other respective genes are shown in Tables 3 and 2, and the mutant strains of each gene knockout were obtained by PCR-targeting technique with reference to the above methods.
  • the mcM-amide bond synthetase gene was knocked out, the obtained mutant strain AmcM, and the m S-pictet-spengler reaction enzyme gene was knocked out, and the obtained mutant strain Amc ⁇ was obtained.
  • the detection conditions were: Alltima C18 (250 x 4.6 mm, 5 ⁇ ) reversed phase column, mobile phase ⁇ phase was 15% acetonitrile, containing 0.1% acetic acid, mobile phase B phase It is 85% acetonitrile with 0.1% acetic acid; flow rate is 1 mL/min, detection wavelength is 285 nm and 375 nm.
  • HPLC procedure 0 - 20 min, 20% - 100% B phase; 20 - 25 min, 100% B phase 25 - 25.01 min, 100% - 20% Phase B, 25.01-30 min is 20% Phase B.
  • mcbABC SEQ ID NO: SEQ ID NO: 1-4 222
  • mcM SEQ ID NO. 1, 1-2516
  • mcbB SEQ ID NO. 1, 1572- 2516 in E. coli B 21 ( Expression and detection in DE3):
  • mcM C, mcMS and mc were cloned into the Ndel and Hindm sites of pET28a ( + ) according to the conventional method to obtain pET28a ( + )/mcbABC, pET28a( + ) /mcbAB and ET28a (+ ) I mcbB , and then transformed To E. co/ BL21 (DE3) to express, transform strain E.co/ BL21 (DE3) / pET28a ( + ) ImcbABC, E.
  • FIG. 4 The results are shown in Fig. 4. As can be seen from Fig. 4, the fermentation products of E.co/ BL21 ( DE3 ) /pET28a ( + ) ImcbABC and E.co/ BL21 (DE3) /pET28a ( + ) / mcbAB can be detected. To compound 1 (the NMR data is shown in Table 4), E.co/z BL21 (DE3) /pET28a ( + ) /mc can produce intermediates 5, 6 and 7. Purified by normal phase silica gel column chromatography, reversed phase medium pressure liquid chromatography and high performance liquid chromatography.
  • AFrl mainly contains compound 5, and AFr2-AFr7 is prepared by reversed phase HPLC to obtain three fractions of BFrl, BFr2 and BFr3.
  • Reverse preparation HPLC for KNAUER LC3000 high performance liquid color Spectrometer preparation column is YMC C18 250x20 mm 5 ⁇ , ⁇ mobile phase is 100% ddH 2 O+0.1% acetic acid, B mobile phase is 100% acetonitrile + 0.1% acetic acid, preparation conditions: 30%-80% mobile phase B, 20 min; 80-100% mobile phase B, 2 min; 100% mobile phase B, 5 min; 0% mobile phase B, 3 min; flow rate 8 mL/min, thus obtaining BFrl (retention time 5-15 min) ), BFr2 (retention time 18-22 min), BFr3 (retention time 23-30 min) three fractions.
  • AFrl, BFrl, BFr2, and BFr3 were finally prepared by reverse half preparative HPLC to obtain compounds 5 and 6.
  • the reverse preparation high performance liquid chromatograph is Hitachi semi-preparative type, the preparation column is YMC C18 250x 10 mm 5 ⁇ , the ⁇ mobile phase is 100% ddH 2 O+0.1% acetic acid, and the B mobile phase is 100% acetonitrile + 0.1% acetic acid.
  • Preparation conditions 30%-80% mobile phase B, 20 min; 80-100% mobile phase B, 2 min; 100% mobile phase B, 5 min; 0% mobile phase B, 3 min; flow rate 2 mL/min, Thus, a fraction of compound 5 (retention time 21-22 min) and a fraction of compound 6 (retention time 18-19 min) were obtained, respectively.
  • the prepared fraction was heated and distilled under reduced pressure by a rotary evaporator to obtain Compounds 5 and 6, which were transferred to a small glass bottle with chloroform-methanol, dried, weighed, and transferred to a nuclear magnetic tube for use.
  • AFr2 mainly contains compound 7, which is obtained by reversed-phase medium pressure liquid chromatography, and then prepared by Hitachi semi-preparative high performance liquid chromatography.
  • the preparation column is YMC C18 250x 10 mm 5 ⁇ , and the mobile phase is 100% ddH 2 O+ 0.1% acetic acid, B mobile phase is 100% acetonitrile + 0.1% acetic acid, preparation conditions: 30%-80% mobile phase B, 20 min; 80-100% mobile phase B, 2 min; 100% mobile phase B, 5 min 0% mobile phase B, 3 min; flow rate 2 mL/min, respectively, to obtain the compound 7 fraction (retention time 13-15 min), and the prepared compound 7 fraction was heated and distilled under reduced pressure by a rotary evaporator to obtain a pure product.
  • Compound 7 Compound 7.
  • the gene mcbA (at the 1-1488th base of SEQ ID N0.1) was cloned into the ⁇ and H wdIII sites of pET28a ( + ) according to a conventional method to obtain pET28a ( + ) /mcbA , which was then transformed into E. coli BL21 (DE3) was expressed to obtain the IJ transformed strain £.co/ BL21 (DE3 ) /pET28a ( + ) /mcbA.
  • Binding Buffer (20 mmol/L Tris-HCl, 500 mmol/L NaCl, 5 mmol/L imidazole, pH 8.0), 0 ultrasonically lysed the cells. After the cells were lysed, centrifuge at 40 °C for 10 min. Then, the protein was purified according to the following procedure: (1) Packing: The supernatant was added to the Ni-NTA affinity column to collect the filtrate; (2) Washing: 5-15 mL Binding BufferC was added to about 5-15 column volumes), and the filtrate was collected.
  • the SDS-PAGE of the protein McbA is shown in Figure 13, and the purified McbA protein has a concentration of about 25 ⁇ M.
  • HPLC conditions were Phenomenex (150 x 4.6 mm, 5 ⁇ ) reversed-phase column, mobile phase ⁇ phase was 15% acetonitrile, containing 0.1% acetic acid, mobile phase B phase was 85% acetonitrile, containing 0.1% acetic acid; flow rate was 1 mL /min, detection wavelengths are 215 nm and 285 nm.
  • HPLC procedure 0 - 20 min, 2% - 80% Phase B; 20 - 21 min, 80% - 100% Phase B; 21 - 26 min, 100% Phase B; 26 - 26.01 min, 100% - 0% B Phase, 26.01-30 min is 0% phase B.
  • the Arabic numerals in the figure indicate MCBs or their intermediates, wherein 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, and 14 represent the Formula 1, Formula 2, Formula 3, Formula 4, Formula 5, Formula 6, Formula 7, Formula 8, Formula 9, Formula 10, Formula 11, Formula 12.
  • the compounds represented by Formula 13 and Formula 14, the separation of Formula 1-14 can be prepared by HPLC and then identified by high resolution mass spectrometry.
  • the results of NMR spectra of Compounds 1 and 7 of 1 H, 13 C and HMBC are shown in the figure. 6-11, the high resolution mass spectrum of the compound 1-4, 8-14 and the low resolution mass spectrum result of the compound 5 are shown in FIG.
  • the enzyme McbA is responsible for the formation of an amide bond between the left half of the ⁇ -porphyrin core 6 and the right half of the aromatic amine compound.

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Abstract

一种海洋咔啉生物碱（marinacarbolines，MCBs）的生物合成基因簇及其应用。该基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第1-4222位所示，包含3个基因：负责MCBs酰胺键合成的基因mcbA、负责MCBs Pictet-Spengler反应的基因mcbB、负责MCBs脱羧的基因mcbC。

Description

一种海洋咔啉生物碱的生物合成基因簇及其应用 技术领域：
本发明属于微生物基因工程领域， 具体涉及一种海洋咔啉生物碱 (marinacarbolines, MCBs ) 的生物合成基因簇及其应用. 背景技术：
β-咔啉化合物是一类自然界中广泛存在的吲哚生物碱，这类化合物具有共同 的 β-咔啉三环骨架系统， 根据 β-咔啉吡啶环饱和程度的不同， 可简单分为四氢系 列、 二氢系列和全芳香型系列。 全芳香型的 β-咔啉三环骨架系统是一个完全的平 面分子， 具有不同的酸碱性， 因此， 这类化合物的存在形式受 ρΗ值和 β-咔啉环 上取代基的性质和位置的影响。对其研究及药理学探索发现， β-咔啉类衍生物具 有重要的抗菌、抗肿瘤、抗病毒、抗炎和作为一些酶的抑制剂等多方面生物活性， 相应的具体机制正在深入研究之中。海洋咔啉生物碱（marinacarbolines, MCBs ) 是从拟诺卡氏菌禾斗 ( Nocardiopsaceae ) 方文线菌新属新禾中 Marinactinospora thermotolerans SCSIO 00652发酵物中分离得到的四个新的 β-咔啉生物碱类化合 物，其结构式如图 1 ( 1-4 )所示， 药理活性研究表明， 这些化合物无细胞毒活性， 但对疟原虫 Plasmodium falciparum多重耐药株 Dd2及敏感株 3D7具有明显的抑 制作用， 显示出较好的抗疟活性， 可将为抗疟药物研究开发的先导化合物（这四 个化合物已经申请专利" β-咔啉生物碱类化合物及其在制备抗疟疾药物中的应 用"， 授权号为： ZL 201 1 10132680.9 ) 。
迄今为止，有关深海放线菌来源的海洋咔啉生物碱编码基因簇和生物合成的 研究国内外尚未见报道。 发明内容：
本发明的第一个目的是提供一种海洋咔啉生物碱的生物合成基因簇。
所述的海洋咔啉生物碱， 包括四个 β-咔啉生物碱类化合物， 其结构式如图 1 中的式 1、 2、 3和 4所示， 这四个化合物已经申请专利 "β-咔啉生物碱类化合物 及其在制备抗疟疾药物中的应用"， 授权专利号为： ZL 201 1 10132680.9。 本发明是以放线菌来源的海洋咔啉生物碱为目标分子，从筛选生物合成基因 簇出发， 采用分子生物学、 微生物学、 合成生物学、 生物化学以及有机化学相结 合的方法研究其生物合成， 通过对其生物合成机制的研究， 阐明了深海来源的 β- 咔啉生物碱 MCBs形成的主要分子机制， 对一些酶的体外反应的研究证实了其 相应的催化功能， 在此基础上应用酶学反应获得了一系列 β-咔啉类似物， 为利用 组合生物合成的方法对 MCBs的化学结构进行修饰和改造提供了依据， 也为药 物筛选提供了一些化合物实体。
本发明的海洋咔啉生物碱的生物合成基因簇来源于放线菌 Marinactinospora thermotolerans SCSIO 00652 , 其特征在于， 该生物合成基因簇的核苷酸序列如 SEQ ID N0.1的第 1-4222位的碱基序列所示， 包含 3个基因， 具体为：
( 1 ) 负责海洋咔啉生物碱酰胺键合成的基因， 即 位于基因簇核苷 酸序列 （SEQ ID N0.1 , 下同） 第 1-1488个碱基处， 长度为 1488个碱基对， 酰 胺键合成酶， 495个氨基酸；
( 2 ) 负责海洋咔啉生物碱骨架合成的基因， 即 位于基因簇核苷酸 序列第 1572- 2516个碱基处，长度为 945个碱基对，编码 Pictet-Spengler反应酶，
314个氨基酸；
( 3 ) 负责海洋咔啉生物碱脱羧的基因， 即 m C, 位于基因簇核苷酸序列 第 2570-4222个碱基处， 长度为 1653个碱基对， 编码脱羧酶， 550个氨基酸。
SEQ ID N0.1 (序列表）所示序列的第 1-4222位的碱基序列的互补序列可根 据 DNA碱基互补原则随时得到。且第 1-4222位的核苷酸序列或部分核苷酸序列 可以通过聚合酶链式反应 （PCR) 或用合适的限制性内切酶酶切相应的 DNA或 DNA体外合成技术或使用其他合适的技术得到。 本发明提供了得到至少包含部 分 SEQ ID N0.1所示序列的第 1-4222位中 DNA序列的重组 DNA载体的途径。
本发明还提供了产生海洋咔啉生物碱生物合成基因被中断或其他基因改造 的途径， 至少其中之一的基因包含有 SEQ ID N0.1所示序列的第 1-4222位中的 核苷酸序列。
本发明所提供的核苷酸列或部分核苷酸序列，可利用聚合酶链式反应（PCR) 的方法或包含本发明 SEQ ID N0.1所示序列的第 1-4222位的 DNA作为探针以 Southern杂交等方法从其他生物体中得到与海洋咔啉生物碱的生物合基因簇相 似的基因。
包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆 DNA可用于 从放线菌 Marinactinospora thermotolerans SCSIO 00652基因组文库中定位更多 的文库质粒。这些文库质粒至少包含本发明中的部分序列， 也包含有拟诺卡氏菌 基因组中邻近区域未克隆的 DNA。
包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列可以被体内体外修 饰或进行突变， 包括插入、 置换或缺失， 聚合酶链式反应， 错误介导聚合酶链式 反应， 位点特异性突变， 不同序列的重新连接， 序列的不同部分或与其他来源的 同源序列进行定向进化， 或通过紫外线或化学试剂诱变等。
包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆可以通过合 适的表达体系在外源宿主中表达以得到相应的酶或其他更高的生物活性物质或 产量。 这些外源宿主包括大肠杆菌、 链霉菌、 小单孢菌、 假单孢菌、 芽孢杆菌、 酵母、 植物和动物等。
本发明所提供的氨基酸序列可以用来分离所需要的蛋白并可用于抗体的制 备。
包含本发明所提供的氨基酸序列或至少部分序列的多肽可能在去除或替代 某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物学活性，或者提高了产量或优化了 蛋白动力学特征或其他致力于得到的性质。
包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可 以在异源宿主中表达并了解它们在宿主代谢中的功能。
包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可 以通过遗传重组来构建重组载体以获得新型生物合成途径， 也可以通过插入、置 换、 缺失或失活进而获得其他新型生物合成途径或者产生新的化合物。
包含 DNA片段或基因可以用来提高海洋咔啉生物碱或其衍生物的产量， 本 发明提供了在基因工程微生物中提高产量的途径。
本发明还提供了海洋咔啉生物碱生物合成基因簇在制备海洋咔啉生物碱及 其类似物中的应用。
本发明还提供一种酰胺键合成酶基因 其特征在于， 其核苷酸序列如 SEQ ID N0.1的第 1-1488位碱基所示。 上述酰胺键合成酶基因 mcbA编码酰胺键合成酶 McbA。
酰胺键合成酶 McbA在催化如式 （ I ) 所示的 β-咔啉母核 （化合物 6 ) 和芳香胺 类化合物之间酰胺键的形成而产生 β-咔啉生物碱类似物中的应用。
Figure imgf000005_0001
式 （ I )
本发明还提供了一种 Pictet-Spengler反应酶基因 mc ， 其特征在与， 其核 苷酸序列如 SEQ ID N0.1的第 1572- 2516位碱基所示。
上述 Pictet-Spengler反应酶基因 mcbB编码的 Pictet-Spengler反应酶 McbB。 Pictet-Spengler反应酶 McbB在制备 β-咔啉母核或 β-咔啉衍生物中的应用。 所述的 β-咔啉母核为如式 （ II ) 所示的化合物 6， β-咔啉衍生物为如式 （ II ) 所 示的化合物 5或 7。
Figure imgf000005_0002
5 6
式 （Π )
总之， 本发明所提供的包含 MCBs生物合成相关的所有基因和蛋白信息， 可以帮助人们理解小分子生物碱家族天然产物的生物合成机制，为进一步遗传改 造提供了材料和理论基础。本发明所提供的基因及其蛋白质也可以用来寻找和发 现可用于医药、 工业或农业的化合物、 基因或蛋白。
本发明的拟诺卡氏菌科 (Nocardiopsaceae) Marinactinospora thermotolerans SCSIO 00652是新属新种， 公开于非专利文献 （深海放线菌 Marinactinospora tAermoto/era/ω SCSIO 00652遗传操作系统的建立. 李军，朱清华，张云，马俊英， 田新朋， 李文均， 张长生， 鞠建华.中国抗生素杂志. 2012年.第 2期第 105-111 页）， 申请人保证自本发明申请日起向公众提供。 该菌现保存于中国广东省广州 市中国科学院南海海洋研究所中国科学院海洋微生物研究中心 （RNAM Center for Marine Microbiology, CAS), 编号为： SCSIO 00652， 该菌株对外销售， 任何 人都可以从该保藏中心购买到。 附图说明：
图 1是海洋咔啉生物碱的四个 β-咔啉生物碱类化合物 1-4的结构式和相关的中间 体或衍生物 5-14的化学结构式。
图 2 Marinactinospora thermotolerans SCSIO 00652中海洋咔啉生物碱（MCBs) 的生物合成基因簇。
图 3是部分基因遗传改造 Man'wactwo¾rora thermotolerans SCSIO 00652中 MCBs 生物合成基因簇得到的突变株在发酵培养基中发酵粗提物的 HPLC分析图： I： 野生型 Man'wactww/wratAermoto/era/M SCSIO 00652; II： 突变株 AmcL4; III： 突变株 Amc^S; IV： 突变株 AmcK：， 图中阿拉伯数字表示 MCBs或其中间体，其 中 1、 3、 6分别代表图 1中的式 1、 式 3和式 6表示的化合物。
图 4 是 mcbB、 mc6Ag和 mcMSC在 E.co/ BL21 (DE3) 中的表达得到的菌株 在 LB中发酵的发酵产物的 HPLC分析图： I: E. coli Lll (DE3) /pET28a ( + ); II： E. coli B 2\ (DE3) /pET28a ( + ) I mcbB III： E. coli B 2\ (DE3) /pET28a (+ ) ImcbAB; IV： E. co/z BL21 (DE3) /pET28a ( + ) ImcbABC, 图中阿拉伯数 字表示 MCBs或其中间体， 其中 1、 5、 6、 7分别代表图 1中的式 1、 式 5、 式 6 和式 7表示的化合物。
图 5是 β-咔啉母核 6 (图 1中的式 6表示的化合物） 作为底物和芳香胺类化合物 (即 β-苯乙胺的不同取代物）在酰胺键合成酶 McbA的催化作用下生成相应的 β- 咔啉类似物的 HPLC分析图， I： 对照； Π: β-咔啉母核 6和 β-苯乙胺反应得到的 产物 1; III： β-咔啉母核 6和酪胺反应得到的产物 2; IV： β-咔啉母核 6和 4-甲 氧基苯乙胺反应得到的产物 3; V： β-咔啉母核 6和色胺反应得到的产物 4; VI： β-咔啉母核 6和 4-溴苯乙胺反应得到的产物 8; VII： β-咔啉母核 6和 4-甲基苯乙 胺反应得到的产物 9; VIII： β-咔啉母核 6和 3-溴苯乙胺反应得到的产物 10; IX： β-咔啉母核 6和 3-三氟甲基苯乙胺反应得到的产物 11; X： β-咔啉母核 6和 2-甲 基苯乙胺反应得到的产物 12; XI： β-咔啉母核 6和 2-甲氧基苯乙胺反应得到的 产物 13; XII： β-咔啉母核 6和 2-溴苯乙胺反应得到的产物 14， 图中阿拉伯数字 表示 MCBs或其中间体， 其中 1、 2、 3、 4、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14 分别代表图 1中的式 1、 式 2、 式 3、 式 4、 式 5、 式 6、 式 7、 式 8、 式 9、 式 10、 式 11、 式 12、 式 13和式 14表示的化合物。
图 6-8分别是化合物 6 的1 H， 13C 禾 B HMBC 的核磁共振谱的结果。
图 9-11分别是化合物 7的1 H， 13C 禾 B HMBC 的核磁共振谱的结果。
图 12是化合物 1-4， 8-14的高分辨质谱及化合物 5的低分辨质谱结果。 I 化合物 1， HR-ESI-MS[M+Na]+： m/z 380.1371 , MF： C22H19N3O2； II化合物 2， HR- ■ESI-MS[M+Na]+： ： m/z 396.1321， MF： C22H19N3O3； III 化合物 3，
HR- ■ESI-MS[M+Na]+ ： m/z 410.1477， MF ： C23H21N3O3； IV 化合物 4，
HR- ■ESI-MS[M+Na]+ ： m/z 419.1479， MF ： C24H20N4O2； V 化合物 8，
HR- ■ESI-MS[M+Na]+： m/z 458.0474， MF： C22H18BrN302： ； VI 化合物 9，
HR- ■ESI-MS[M+Na]+： m/z 394.1526， MF： C23H21N3O2； VII化合物 10， HR- ■ESI-MS[M+Na]+： m/z 458.0474， MF : C22H18BrN302； VIII化合物 11，
HR- ■ESI-MS[M+Na]+： m/z 448.1239 , MF： C22H18F3N3O2； IX 化合物 12，
HR- ■ESI-MS[M+Na]+： ： m/z 394.1524， MF： C23H21N3O2； X 化合物 13，
HR- ■ESI-MS[M+Na]+： m/z 410.1477， , MF ： C23H21N3O3； XI 化合物 14，
HR-ESI-MS[M+Na]+: m/z 458.0474, MF: C22H18BrN302; XII 化合物 5的低分 辨质谱结果， [Μ+Η]+: 211.05 ο
图 13 是 McbA的 SDS-PAGE结果。
图 14-15是化合物 8的1 H和 13C 的核磁共振谱结果。
图 16-17是化合物 9的1 H和 13C 的核磁共振谱结果。
图 18-19是化合物 10的 ¾和 13C 的核磁共振谱结果。
图 20-21是化合物 11的 ¾和 13C的核磁共振谱结果。
图 22-23是化合物 12的 和 13C 的核磁共振谱结果。
图 24-25是化合物 13的 和 13C 的核磁共振谱结果。
图 26-27是化合物 14的 和 13C 的核磁共振谱结果。 具体实施方式: 以下实施例是对本发明的进一步说明， 而不是对本发明的限制。
1. 放线菌 Marinactinospora thermotolerans SCSIO 00652基因组序列扫描 及 MCBs的生物合成基因簇序列分析和功能分析。
通过对放线菌 Marinactinospora thermotolerans SCSIO 00652进行全基因组扫描 和注释， 在其中找到了 4 kb的 marincarbolines的生物合成基因簇， 包含了 3个 开放阅读框 （open reading frames, ORFs ) (表 1 )。 根据生物信息学分析， 其中 mcbA、 mcbB、 mc6C负责 MCBs的生物合成。
表 1 : MCBs生物合成基因簇的基因及其功能 基因 大小 Ω 推测功能 同源性 e 同源蛋白 6
mcbA 495 酰胺键合成酶 42/55 SRIM_40803 (ZP— 20970382.1) mcbB 314 Pictet-Spengler反应酶 48/62 BBA 06474 (EJP64480.1 ) mcbC 550 脱羧酶 32/50 Gad2 (ZP 01998647.1 ) a 氨基酸数目； 6括号中包含了同源蛋白的 GeneBank登录号； c一致性 /相似性 （ identity /similarity )。
2. MCBs的生物合成基因簇中各基因的功能分析。
在分析了完整的 MCBs的生物合成基因簇， 研究了各基因编码蛋白可能的 功能的基础上，本发明对 MCBs的生物合成机制进行了探讨，采用 PCR-targeting 技术针对 3个生物合成基因， 进行了灭活突变（检测引物参见表 2， 灭活引物参 见表 3 )， 获得了相关突变株。
表 2: 构建突变株所需的检测引物名称和序列
引物配对和名称序列（5'→3')
mcbA mcbAF: CGTGGTAAGAATTCGCTGGGC
mcbAR: TATGCTCGTCGGATGAAGGCG
mcbB mcbBF: CGGTGAGGCAGATCGAAATCG
mcbBR: CGGTCATGCGTCCAGATAGCG
mcbC mcbCF: ACCTCCACTTCTTCCCGTGGC
mcbCR: CTTCACCTCGACCATGCGTCC
表 3 : 构建突变株所需的灭活引物名称和序列
基因 引物配对， 名称和序列 （5'→3')
mcbA mcbAdelF： GCGGTCCAGGCCATCGGCTGTCACTACGTGGGCCTGCGTattccggggatccgtcgacc mcbAdelR: GACCAGGGCGCGCAGGTGTTCGGGATCGGGGTCGGCGCCtgtaggctggagctgcttc
3. mcbB在 E.CO/ BL21 ( DE3 )中异源表达得到的重组菌株的部分发酵产 物的鉴定。
在获取 MCBs生物合成基因簇的信息之后，分别将 mcbABC、mcbAB和 mcbB 克隆到 pET28a ( + ) 的 AWd和 H din位点并转化至 E. co/ BL21 ( DE3 ) 以表 达。对它们发酵粗提物的 HPLC分析发现， E.co/ BL21 ( DE3 )/pET28a( + )/mcbABC 和 E.co/ BL21 (DE3 )/pET28a( + )/mc^5的发酵产物可以检测到化合物 1， E.coli BL21 (DE3) /pET28a ( + ) /mc 则可以产生中间体 5、 6禾卩 7。 采用正相硅胶 柱层析、 反相中压液相色谱和高效液相色谱纯化后得到 6和 7， 并采用了核磁共 振波谱法进行鉴定 （图 6-11)。 对化合物 1的鉴定是采用的高分辨质谱法， 对化 合物 5的鉴定是采用的低分辨质谱法 （图 12)。
4. McbA的体外酶反应和产物的鉴定。
在获取以上信息的基础上， 将 mcM克隆到 pET28a ( + ) 的 AWd和 HmUII 位点并转化至 E. CO/ BL21 (DE3) 以表达获得 McbA粗酶液， 通过镍亲和层析 纯化、 SDS-PAGE电泳、 Bradford含量测定、 体外酶反应及产物鉴定证明， 酶 McbA负责左半部分 β-咔啉母核 6和右半部分芳香胺类化合物之间酰胺键的形 成， 所有产物 （除去化合物 5) 均通过高分辨质谱鉴定， 化合物 8-14同时通过 NMR鉴定 （图 5， 图 14-27)。
我们通过对突变株进行发酵和代谢产物的分析鉴定，阐明了部分生物合成基 因的功能， 为进一步通过对生物合成基因簇进行遗传修饰获得 MCBs活性类似 物提供了可能： （1)敲除了 mcM-酰胺键合成酶基因， 获得的突变株 Amc^发酵 不能生产 MCBs,但是产生一个中间体 6(1-酰基 -3-羧基 -β-咔啉，图 1中的式 6);
(2) 敲除了 mc^-Pictet-Spengler反应酶基因， 获得的突变株 Amc 发酵不能 产生化合物 MCBs或其中间体； （3) 敲除了 m C-脱羧酶基因， 获得的突变株 AmcbC发酵不能生产 MCBs,但是产生一个中间体 6 ( 1-酰基 -3-羧基 -β-咔啉） (图 3)。 以下进一步提供实施例， 这些实施实例有助于理解本发明， 仅用作说明而不 限制本发明的应用范围。
实施例 1
MCBs产生菌 Marinactinospora thermotolerans SCSIO 00652基因组 DNA的 提取：
将新鲜放线菌 Μαπ7α£Λ70 0Γα thermotolerans SCSIO 00652的孢子按照 5% 的接种量接种于 50mL的 TSB培养基 （胰蛋白胨 17 g， 植物蛋白胨 3 g， 氯化 钠 5 g， 磷酸氢二钾 2.5 g， 葡萄糖 2.5 g， 加水至 1 L， pH 7.2-7.4 ) 中， 28-30 °C， 振荡培养约 2 d， 4000 r/min离心 10 min收集菌丝体。菌丝体用 STE溶液 （NaCl 75 mmol/L， EDTA 25 mmol/L, Tris-Cl 20 mmol/L， 余量为水） 洗涤两次， 向洗 涤后的菌丝体中加入 30 mL STE溶液和终浓度 3 mg/mL的溶菌酶， 涡旋均匀， 37 °C温浴 3 h，加入至终浓度 0.1-0.2 mg/mL的蛋白酶 K，混匀， 37 °C温浴 10 min, 加入至终浓度 1-2%的 SDS , 混匀， 放入 55 °C水浴约 1 h， 期间颠倒数次。 加入 等体积的酚-氯仿-异戊醇（V/V/V=25 : 24： 1 )， 混合均匀， 置于冰上冷却 30 min。
12000 r/min, 4°C离心 lO min, 然后用剪过的大口径枪头小心吸取上清到新的离 心管中， 用同样的方法反复处理 3次， 然后用等体积的氯仿洗涤两次， 12000 r/min, 4 °C离心 10 min。 用剪过的大口径枪头将水相吸出转移至新的离心管，加 入 1/10体积 3 mol/L NaAc (pH5.2)， 混匀后再加入等体积的异丙醇， 混匀后冰 上放置，沉淀 DNA。小心地用玻璃棒将 DNA纤维团转移至新的离心管中，用 70% 乙醇洗涤两次， 将液体倾出， 在 37 °C下略微烘干， 加 5 mL TE溶解， 并加入 3-5 U的 R A酶， 由此得到放线菌 Marinactinospora thermotolerans SCSIO 00652基 因组 DNA。
实施例 2
Marincarbolines Υ^^ί Marinactinospora thermotolerans SCSIO 00652基因组 文库的建立：
首先通过一系列的稀释实验来确定限制性核酸内切酶 S m3A I的用量，在 20 μL体系中， 含有 17 μL的链霉菌 Marinactinospora thermotolerans SCSIO 00652 基因组 DNA， 2 的 10x反应缓冲液和 1 不同稀释度的 Sau3A I， 其终止反 应为 4 μL 0.5 mol/L EDTA和合适的上样缓冲液。 通过摸索确定了 0.025-0.05 U 的酶活单位比较合适。在此基础上通过大量部分酶切得到略大于 40 kb的基因组 DNA片段， 用去磷酸化酶进行去磷酸化处理。
用于构建文库的载体 SuperCos 1质粒先用限制性核酸内切酶 α I从两个 C 序列中间切开，然后进行去磷酸化处理， 再从多克隆位点处用限制性核酸内切酶 Sam HI切开， 获得两个臂。 处理后的载体与之前制备的部分酶切的约 40 kb的 基因组 DNA片段连接过夜，连接体系为 10 ，含有 1.25 μ§制备的基因组 DNA 片段和 0.5 μ§处理后的 SuperCos 1质粒， 1 的 10xBuffer， 0.3 U的连接酶。 连接产物于 65 °C处理 15 min, 使连接酶失活。 从 -80 °0冰箱中取出一管包装混 合物 （50 μυ 置于冰上， 将包装混合物在指间迅速融化， 小心吸取一半包装 混合物 （25 L) 至一个新的离心管中， 加入 10 热处理后的连接产物， 其余 包装混合物于 -80 °C保存。 小心混匀， 30 °C温浴 90 min， 加入另外一半包装混合 物（25 μυ， 30 温浴继续 90 min。加入 500 μ 噬菌体稀释缓冲液（ 100 mmol/L NaCl, 10 mmol/L MgCl2， 10 mmol/L H 8.3 Tris-HCl,余量为水），再加入 25 μ 氯仿， 轻轻混匀， 得包装液， 于 4 °C保存。
将冻存于 -80 的菌株 E. coli LM392涂布在 LB培养基上复苏。 包装反应前 一天，挑取单克隆接种于 LB培养基中（添加 0. 2%麦芽糖和 10 mmol/L MgS04)， 37 °0振荡培养过夜，包装反应当天，取 5 mL过夜培养的菌液加入到 50 mL新鲜 的 LB培养基中 （添加 0. 2%麦芽糖和 10 mmmol/L MgS04)， 37 °C， 200 r/min振 荡至培养物 OD6QQ达到 0.8-1时， 得宿主菌液， 4 °C保存备用。 取 100 ^如上处 理的宿主菌液和 100 适度稀释的包装液轻轻混匀， 于 37 °C温浴 15 min,然后 涂布于含有 100 g/mL氨苄青霉素和 50 g/mL卡那霉素的 LB平板上， 37°C培 养过夜。 将长出来的单个克隆子， 用无菌牙签点种于 25块含以上上述抗生素的 LB培养基的 96孔板上， 37 °C培养过夜，加入终浓度为 20% 的甘油，混合均匀， 置于 -80 °C保存。
从 Marincarbolines产生菌她 n 7act wo¾rora thermotolerans SCSIO 00652基因 组文库中筛选含有海洋咔啉生物碱的生物合成基因簇的阳性克隆子；
通过对放线菌 Marinactinospora thermotolerans SCSIO 00652进行全基因组 扫描和注释， 从上述基因组文库中进行筛选， 在其中找到了 4 kb的克隆子， 确 定为包含 marincarbolines的生物合成基因簇的克隆子， 命名为 cosmid MCBs,并 进行测序，其核苷酸序列如 SEQ ID N0.1所示，其中 marincarbolines的生物合成 基因簇的核苷酸序列如 SEQ ID N0.1的第 1-4222位的碱基序列所示， 包含了 3 个开放阅读框 （open reading frames, ORFs) (表 1 )。 根据生物信息学分析， 其 中 mcbA、 mcbB、 mcbC负责 MCBs的生物合成
实施例 3
MCBs产生菌 Mar wact ww/wra thermotolerans SCSIO 00652遗传转移系统的 建立及基因中断突变菌株的获得， 以敲除 m C脱羧酶基因获得突变菌株 Am C 为例：
利用 PCR-targeting的方法获得体外敲除突变株。 根据获得的 MCBs的生物 合成基因簇序列，参照文献报道的 PCR-targeting系统，设计一对 m C基因的敲 除引物， 引物序列见于表 3中的 m C灭活引物。然后参照 PCR-targeting的方法 构建体外敲除质粒然后转入到接合转移的供体菌中。 具体步骤如下： （1 ) 将含 有 MCBs 的生物合成基因簇的 cosmid质粒（cosmid MCBs )转入大肠杆菌 E. coli BW25113/pIJ790中获得含有目的质粒的 E. coli BW25113/pIJ790/ MCBs菌株，用 10 mmol/L的 L-阿拉伯糖诱导 λ-red重组系统表达， 并将其制备成为电转感受态 细胞待用。（ 2 ) 用内切酶 EcoR I和 Hind III酶切质粒 pIJ773， 回收其中约 1.4 kb 含有转移原点和阿泊拉霉素抗性基因的 DNA片段， 以此作为 PCR模板， 用 mcbCdelF和 mcbCdelR (表 3所示） 引物通过 PCR扩增出 1.4 kb的 PCR产物， 50 μ 的 PCR反应体系： 高保真 DNA聚合酶 3 U, lOxBuffer 5 μΐ, dNTPs 0.5 mmol/L, DMSO 2.5 μ , 引物各 0.5 μηιοΙ/L, DNA模板约 1 ng，加水补至 50 μ o PCR反应条件为： 预变性 94 。C 5 m 扩增循环为 94 。C 变性 45 s， 58 °C退火 45 s， 72 °C延伸 90 s， 30个循环； 最后 72 °C延伸 10 min。 将 1.4 kb的 PCR产物 回收纯化待用。 （3 )将 PCR产物电转入（1 )步骤中制备的感受态细胞使其发生 重组， 涂布于 LB筛选平板（含 100 g/mL氨苄青霉素， 50 g/mL卡那霉素， 50 g/mL阿泊拉霉素） 上， 37 °C过夜培养。 从平板上挑出阳性单克隆， 抽提质粒， 重组质粒命名为 delm C, 该质粒中的 mcbC基因的部分片段被转移原点和阿泊 拉霉素抗性基因取代。 （4 ) 将构建好的重组突变质粒 ddmcbC转化到 E. coli ET12567/pUZ8002中，构建成 E. co/ ET12567/pUZ8002/ delmc6C，作为接合转移 的供体菌。
野生型放线菌 Marinactinospora thermotolerans SCSIO 00652菌株在 M-ISP4 培养基（可溶性淀粉 10 g，酵母提取物 0.5 g，蛋白胨 1 g， NaCl 1 g， MgS04-7H20 l g， （NH4) 2S04 2 g， K2HPO4 1 g, CaCOs 2 g, 海盐 30g， 微量元素适量， 加水 至 1 L， pH 7.2 )平板中划线培养 3-5 d， 长出的孢子用无菌棉签收集于的 TSB培 养基中， 涡旋振荡， 使孢子分散。 过滤分离菌丝体和孢子， 孢子悬浮于 5 mL的 TSB培养基中， 50 °C热激 lO min, 然后于 28 °C萌发 2-4 h， 作为接合转移的受 体菌。供体菌 K coli ET12567/pUZ8002/delmc¾C在 50 mL含 50 g/mL卡那霉素， 25 g/mL氯霉素和 50 g/mL阿泊拉霉素的 LB液体培养基中于 37 °C生长至 OD6QQ值约为 0.8时， 离心收集菌体（4000 r/min, 10 min) , 用 LB清洗菌体 3遍， 悬浮于 300 L LB培养基中， 作为接合转移的供体菌。 取上述受体菌 400 和 供体菌 100 μ 混合均匀，涂布于不含任何抗生素的 M-ISP4固体培养基上，吹干 后， 于 28 °C培养 18-20 h。 然后将平板取出， 用含有抗生素的水覆盖平板， 其终 浓度为 35 μ§/ηΛ阿泊拉霉素和 50 g/mL甲氧苄氨嘧啶， 吹干后， 置于 28 °〇培 养箱中， 培养 3-4 d后观察。
当接合转移平板上长出小菌落后， 用无菌牙签将其转接到含有 35 μΒ/ηΛ阿 泊拉霉素和 50 g/mL甲氧苄氨嘧啶的 M-ISP4平板上， 28 °C培养 2-3 d后，抽取 各个突变株的基因组 DNA， 利用检测引物 （引物序列见于表 2中的 mcbC的检 测引物序列） 通过 PCR检测获得阳性克隆， 即获得 m C-脱羧酶基因敲除双交 换突变菌株 （Amc6C)。
其他各个基因的灭活引物和检测引物参见表 3和表 2， 参照上述方法， 利用 PCR-targeting技术获得各个基因敲除的突变菌株。
敲除了 mcM-酰胺键合成酶基因， 获得的突变株 AmcM， 敲除了 m S- pictet-spengler 反应酶基因， 获得的突变株 Amc ^。
实施例 4
MCBs及其中间体的生物发酵与检测：
将放线菌 Marinactinospora thermotolerans SCSIO 00652野生菌或突变株 ( AmcbA , hmcbB mcbO 活化后， 按 5%的接种量分别接入到 250 mL三角 瓶的 50 mL M-ISP4液体发酵培养基（不添加微量元素）中，于 28 °C培养 6 d后， 加入等体积的丁酮， 超声 5 min破碎细胞， 然后静置分层。 将丁酮萃取液与水相 分离，用旋转蒸发仪将丁酮蒸干，残留物溶解于甲醇形成样品，进行 HPLC检测， 检测条件为： Alltima C18 ( 250x4.6 mm, 5 μηι) 反相柱， 流动相 Α相为 15%乙 腈， 含 0.1%乙酸， 流动相 B相为 85%乙腈， 含 0.1%乙酸； 流速为 1 mL/min， 检测波长为 285 nm和 375nm。 HPLC程序： 0 - 20 min， 20% - 100% B相； 20 - 25 min, 100% B相; 25 - 25.01 min, 100% - 20% B相， 25.01-30 min为 20% B 相。
具体结果如图 3所示，敲除了 mcM-酰胺键合成酶基因，获得的突变株 Amc ^ 发酵不能生产 MCBs, 但是产生中间体 6 (1-酰基-3-羧基^-咔啉）； (2) 敲除了 mcbB- pictet-spengler 反应酶基因， 获得的突变株 Amc 发酵不能产生化合物 MCBs或其中间体； （3)敲除了 m C-脱羧酶基因， 获得的突变株 Am C发酵不 能生产 MCBs, 但是产生中间体 6 (1-酰基 -3-羧基 -β-咔啉） （图 3) 。
实施例 5
mcbABC SEQ ID N0.1所示 1-4222的序列）、 mcM (SEQ ID NO.l的 1-2516 的序列） mcbB (SEQ ID NO.l的 1572- 2516的序列) 在 E. coli B 21 (DE3) 中的表达和检测：
按照常规方法分别将 mcM C、 mcMS和 mc 分别克隆至 pET28a ( + )的 Ndel和 Hindm位点以得到 pET28a ( + )/mcbABC, pET28a( + ) /mcbAB禾卩 ET28a (+ ) I mcbB, 然后转化至 E. co/ BL21 (DE3) 以表达， 分别得到转化菌株 E.co/ BL21 (DE3) /pET28a ( + ) ImcbABC, E. coli B 2\ (DE3) /pET28a ( + ) / mcbAB 禾口 E.co/ BL21 (DE3) /pET28a ( + ) lmcbB。 将得到的转化菌株分别挑取单克隆 过夜培养后按 1%的接种量接入到 250 mL三角瓶的 50 mL LB培养液体，于 28。C 摇床 180 r/min培养至 OD6(X)约为 0.6时， 往培养液中加入终浓度为 O.lmM的异 丙基 -β-D-硫代吡喃半乳糖苷 （IPTG)。 于 28 °C继续培 12 h后， 往发酵物加入适 量 1 mol/L的 HC1以调节其 pH值至 5， 加入二倍体积的乙酸乙酯， 超声 5 min 破碎细胞， 然后静置分层。将乙酸乙酯萃取液与水相分离， 用旋转蒸发仪将乙酸 乙酯蒸干， 残留物溶解于甲醇形成样品， 进行高效液相色谱 （HPLC) 检测， 检 测条件为 Phenomenex (150x4.6mm, 5μηι) 反相柱， 流动相 Α相为 15%乙腈， 含 0.1%乙酸， 流动相 B相为 85%乙腈， 含 0.1%乙酸； 流速为 l mL/min， 检测 波长为 215nm和 285 nm。 HPLC程序： 0 - 20 min， 0%-70%B相； 20-21 min， 70%- 100% B相； 21 - 26 min, 100% B相； 26 - 26.01 min, 100% - 0% B相， 26.01-30 min为 0%B相。
以转有空载体 pET28a ( + )的 E.co/ BL21 (DE3)重组菌 E.co/ BL21 (DE3)
/pET28a ( + ) 作为对照。
结果如图 4所示，从图 4可以看出， E.co/ BL21 ( DE3 ) /pET28a ( + ) ImcbABC 禾口 E.co/ BL21 (DE3) /pET28a ( + ) / mcbAB的发酵产物可以检测到化合物 1 (其 NMR数据见表 4)， E.co/z BL21 (DE3) /pET28a ( + ) /mc 则可以产生中间体 5、 6和 7。采用正相硅胶柱层析、 反相中压液相色谱和高效液相色谱纯化后得到
6和 7， 并采用了核磁共振波谱法进行鉴定（图 6-11 )。对化合物 1的鉴定是采用 的高分辨质谱法， 对化合物 5的鉴定是采用的低分辨质谱法（图 12)， 化合物 1、
5、 6和 7的结构式如图 1中的式 1、 5、 6和 7所示， 其中化合物 1是 β-咔啉生物 5 碱类化合物， 属于海洋咔啉生物碱。
表 4 : 化合物 1-3的 NMR数据 （500/125 MHz, TMS 为内标， ppm)
化合物 3 化合物 2 化合o. Sc t¾ (Jin Hz) Sc t¾ (Jin Hz) Sc t¾ (Jin Hz)
133.5 133.9 133.5
138.8 138.8 139.2
118.3 9.00, s 117.8 9.08, , s 118.4 9.09, sa 132.6 131.8 132.7
b 120.9 120.2 121.1
122.2 8.17, d (8.0) 122.2 8.45, , d (8.0) 122.3 8.22, d (7.5)
121.5 7.33, dt (8.0, 3.0) 120.7 7.34, , t (8.0) 121.5 7.38, t (7.5)
129.7 7.57, m 129.2 7.62, , t (8.0) 129.7 7.63, t (7.5)
112.2 7.57, m 113.2 7.83, , d (8.0) 112.2 7.59, d (7.5)a 141.6 142.3 141.6
a 136.0 134.7 136.3
0 202.2 202.2 202.3
1 25.6 2.71, s 25.9 2.87, , s 25.7 2.75, s2 164.9 163.7 164.6
3 8.08, t (5.5) 8.3 L , br s 8.07, t (5.5)4 40.7 3.76, q (7.0) 40.7 3.57, , t (7.0) 40.7 3.76, q (7.0)5 34.8 2.91, t (7.0) 34.5 2.80, , t (7.0) 34.8 2.91, t (7.0)6 130.9 129.4 130.9
7 129.9 6.86, d (8.5) 129.5 6.71， , d (8.0) 129.0 7.34, m8 114.2 7.21, d (8.5) 115.2 7.11, d (8.0) 128.8 7.34, m9 158.7 155.6 126.7 7.28, t (7.0)0 114.2 7.21, d (8.5) 115.2 7.11, d (8.0) 128.8 7.34, m1 129.9 6.86, d (8.5) 129.5 6.71， , d (8.0) 129.0 7.34, m9-OMe 55.3 3.76, s
9-OH 9.2L , s
10 表 5 : 化合物 4 的 NMR数据 （500/125 MHz, TMS 为内标， ppm)
化合物 4
No. Jc t¾ (Jin Hz)
1 133.4
3 138.7
4 118.6 8.98, s
4a 132.6
4b 120.8
5 122.0 8.16, d, (8.0)
6 121.3 7.31, dt (8.0, 2.5)
7 129.6 7.56, m
8 112.2 7.56, m
8a 141.6
9a 136.5
10 202.3
11 25.4 2.75, s
12 164.9
13 8.18, t(5.5)
14 39.7 3.84, q (6.5)
15 25.2 3.11, t (6.5)
16 112.2
17 122.0 7.11, s
18a 136.2
19 111.3 7.35, d (8.5)
20 121.8 7.11, t (8.5)
21 119.1 7.01, t (8.0)
22 118.1 7.60, d (8.0)
22a 127.2
实施例 6
E.coli B 2\ ( DE3 ) /pET28a ( + ) /mc^g的扩大发酵和部分产物的分离和鉴 定：
Pictet-Spengler反应酶 编码基因 mc ^在 E.co/ BL21 ( DE3 ) 的表达和扩大 发酵见实施例 5。 最后经乙酸乙酯萃取得到粗提物。 粗提物首先通过正相硅胶柱 层析方法， 经氯仿 -甲醇体系梯度洗脱 （氯仿： 甲醇 =100: 0， 98： 2， 96： 4， 94： 6 ， 92： 8， 9： 1 , 8： 2 )后， 顺序得到 AFr. l-AFr.7共 7个馏分， 通过 TLC 结合 HPLC追踪分析得到含有目标化合物的馏分。
AFrl主要含有化合物 5， AFr2-AFr7再分别通过反相 HPLC制备得 BFrl、 BFr2 、 BFr3三个馏分。 反向制备用 HPLC为 KNAUER LC3000型高效液相色 谱仪，制备柱为 YMC C18 250x20 mm 5μηι， Α流动相为 100% ddH2O+0.1%乙酸， B流动相为 100%乙腈 +0.1%乙酸，制备条件： 30%-80%流动相 B， 20 min; 80-100% 流动相 B， 2 min; 100%流动相 B， 5 min; 0%流动相 B， 3 min; 流速 8 mL/min， 由此分别得到 BFrl (保留时间 5-15 min)、 BFr2 (保留时间 18-22 min)、 BFr3 (保 留时间 23-30 min) 三个馏分。
AFrl、 BFrl、 BFr2 、 BFr3最后再分别通过反向半制备 HPLC制备得到化合 物 5和 6。反向制备高效液相色谱仪为日立半制备型，制备柱为 YMC C18 250x 10 mm 5μηι， Α流动相为 100% ddH2O+0.1%乙酸， B流动相为 100%乙腈 +0.1%乙酸， 制备条件： 30%-80%流动相 B， 20 min; 80-100%流动相 B， 2 min; 100%流动相 B， 5 min; 0%流动相 B， 3 min; 流速 2 mL/min， 由此分别得到化合物 5馏分（保 留时间 21-22 min) 和化合物 6馏分 （保留时间 18-19 min)。 制备出来的馏分经 旋转蒸发仪减压加热蒸馏后得到化合物 5和 6， 用氯仿-甲醇转移至小的玻璃瓶 中， 干燥后称重并转移至核磁管中， 备用。 AFr2主要含有化合物 7， 通过反相 中压液相色谱得到目标物，再经日立半制备高效液相色谱仪制备，制备柱为 YMC C18 250x 10 mm 5μηι， Α流动相为 100% ddH2O+0.1%乙酸， B流动相为 100%乙 腈 +0.1%乙酸，制备条件： 30%-80%流动相 B， 20 min; 80-100%流动相 B， 2 min; 100%流动相 B， 5 min; 0%流动相 B， 3 min; 流速 2 mL/min， 由此分别得到化 合物 7馏分（保留时间 13-15 min), 制备出来的化合物 7馏分经旋转蒸发仪减压 加热蒸馏后得到纯品化合物 7。
化合物 5、 6和 7的结构鉴定参见图 6-11和图 12， 化合物 5、 6和 7的结构 如图 1的式 5、 6、 7所示。
实施例 7
酰胺键合成酶 McbA的表达、 亲和层析纯化、 SDS-PAGE电泳、 Bradford法 含量测定、 体外生化反应及产物鉴定：
按照常规方法将基因 mcbA ( SEQ ID N0.1的第 1-1488个碱基处） 克隆至 pET28a ( + )的 ΜΛ和 H wdIII位点以得到 pET28a ( + ) /mcbA ,然后转化至 E. coli BL21 (DE3 ) 以表达， 得至 IJ转化菌株 £.co/ BL21 (DE3 ) /pET28a ( + ) /mcbA。
将 E. co/z BL21/pET28a ( + ) /mcbA过夜培养后， 按 1%的接种量接入到 1 L 三角瓶（共计 15个）的 300 mL LB培养液体，于 28 °C摇床 200 r/min培养至 OD600 约为 0.6时， 往培养物中加入终浓度为 0.1 mmol/L的异丙基 -β-D-硫代吡喃半乳 糖苷 （IPTG)。 再于 28 °C 150 r/min继续培 6-8 h， 4000 r/min离心 10 min收集 菌体， 用 50 mmol/L Tris-HCl洗涤菌体两次， 最后重悬于 15-20 mL的 Binding Buffer中（20 mmol/L Tris-HCl， 500 mmol/L NaCl, 5 mmol/L imidazole, pH 8.0) , 0 超声裂解菌体。 待菌体裂解后， 4 、 10000 r/min离心 40 min。 然后按照以 下过程纯化蛋白： （1 )装柱： 上清加入 Ni-NTA亲和柱中， 收集滤液； （2)洗涤： 加入 5-15 mL Binding BufferC大约 5-15 柱体积），收集滤液加入 10-20 mL Washing Buffer (大约 15-20柱体积， 20 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0， 500 mmol/L NaCl, 50 mmol/L imidazole)洗去与 Ni-NTA柱相结合的杂蛋白； （3 )洗脱：加入 3.5 mL 的 Elution Buffer 1 (20 mmol/L Tris-HCl， pH 8.0， 500 mmol/L NaCl, 250 mmol/L imidazole ) 把目的蛋白从 Ni-NTA柱上洗脱下来， 为防止目的蛋白与 Ni-NTA柱 过度结合， 继续用 1 mL Elution Buffer 2 ( 20 mmol/L Tris-HCl， pH 8.0， 500 mmol/L NaCl, 1 mol/L imidazole ) 洗涤； （4 ) 浓縮： 将 Elution Buffer I洗脱下 来的 3.5mL滤液转入 15 mL 10 kD超滤管中， 2500 r/min、 4 °C离心 20min， 浓縮 至小于 2.5 mL; ( 5 ) 脱盐： 将浓縮后的蛋白转入 PD-10 脱盐柱脱盐， 用 2.5 mL 的 Storage Buffer洗脱 （ 30% glycerol, 50 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0 ) 把目的蛋 白冲洗下来， 再用 10 kD超滤管浓縮， 浓縮后的目的蛋白于 -80 °C或 -20 °C保存 备用， 由此得到基因 mcM编码的蛋白 McbA。
纯化后的蛋白 McbA取出 2-20 L， 补水至 20 L， 加入 5 5xSDS PAGE Loading Buffer, 充分混匀后沸水煮 10-15 min, 取 3-8 μ 上样 SDS PAGE电泳 ( Tris-Glycin缓冲液系统）， 同时， 纯化后的蛋白分别稀释 1倍、 2倍、 10倍， 补水至 20 μL,加入 1 mL 1 xBio-Rad Protein Assay试齐 U，反应 5-60 min,测定 595 nm下的吸光度， 通过和 Bradford标准蛋白含量曲线比较， 计算酰胺键合成酶 McbA的浓度。
蛋白 McbA的 SDS-PAGE如图 13所示， 纯化后得到的 McbA蛋白的浓度约 为 25 μΜ。
酰胺键合成酶 McbA的体外反应如下：
0.2 mmol/L化合物 7 + 1 mmol/L底物 （见图 5附图说明） +3 mmol/L ATP +0.15 μηιοΙ/L 酶 McbA+50 mmol/L pH7.5 磷酸盐缓冲液， 37 °C反应 lh， 用 2倍 体积 0 °C的甲醇终止反应后，用 Vrian ProStar Workstation V6.41 HPLC分析产物， 通过高分辨质谱确定产物。 HPLC检测条件为 Phenomenex ( 150x4.6 mm, 5 μηι) 反相柱，流动相 Α相为 15%乙腈，含 0.1%乙酸，流动相 B相为 85%乙腈，含 0.1% 乙酸；流速为 1 mL/min，检测波长为 215 nm和 285 nm。 HPLC程序： 0 - 20 min, 2% - 80% B相； 20 - 21 min, 80%- 100% B相； 21 - 26 min, 100% B相； 26 - 26.01 min, 100% - 0% B相， 26.01-30 min为 0% B相。
结果如图 5所示， 图 5中， I： 对照； Π: β-咔啉母核 6和 β-苯乙胺反应得到 的产物 1 ; III： β-咔啉母核 6和酪胺反应得到的产物 2; IV： β-咔啉母核 6和 4- 甲氧基苯乙胺反应得到的产物 3 ; V： β-咔啉母核 6和色胺反应得到的产物 4; VI： β-咔啉母核 6和 4-溴苯乙胺反应得到的产物 8; VII： β-咔啉母核 6和 4-甲基 苯乙胺反应得到的产物 9; VIII： β-咔啉母核 6和 3-溴苯乙胺反应得到的产物 10; IX： β-咔啉母核 6和 3-三氟甲基苯乙胺反应得到的产物 11 ; X： β-咔啉母核 6和 2-甲基苯乙胺反应得到的产物 12; XI： β-咔啉母核 6和 2-甲氧基苯乙胺反应得到 的产物 13; XII： β-咔啉母核 6和 2-溴苯乙胺反应得到的产物 14， 图中阿拉伯数 字表示 MCBs或其中间体， 其中 1、 2、 3、 4、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14分别代表图 1中的式 1、 式 2、 式 3、 式 4、 式 5、 式 6、 式 7、 式 8、 式 9、 式 10、 式 11、 式 12、 式 13和式 14表示的化合物， 式 1-14的分离可以从 HPLC制 备得到， 然后进行高分辨质谱鉴定， 化合物 6和 7的1 H， 13C 和 HMBC 的核磁 共振谱的结果如图 6-11所示， 化合物 1-4， 8-14的高分辨质谱及化合物 5的低分 辨质谱结果如图 12所示， 化合物 1-4的 NMR数据如表 4和表 5所示， 化合物 8-14核磁共振波谱如图 14-27所示。由此鉴定化合物 1-14的结构如图 1中的式 1、 式 2、 式 3、 式 4、 式 5、 式 6、 式 7、 式 8、 式 9、 式 10、 式 11、 式 12、 式 13 和式 14所示。
由图 5可以看出，酶 McbA负责左半部分 β-咔啉母核 6和右半部分芳香胺类 化合物之间酰胺键的形成。
实施例 8化合物 9-14的放大制备、 分离以及 NMR鉴定：
称取实施例 7中的 E.co/ BL21 (DE3 ) /pET28a ( + ) /mcM菌体 3 g， 加入 50 mM pH7.5磷酸盐缓冲液， 超声破碎， 加入 7.5-15 mg化合物 6 (根据转化率 不同， 加入的量不同， 最大转化率 80%的加入约 7.5 mg， 最低转化率 35%的加 入 15 mg) ， 足量的 ATP， X (分别加 4-甲基苯乙胺、 3-溴苯乙胺、 3-三氟甲基 苯乙胺、 2-甲基苯乙胺、 2-甲氧基苯乙胺、 2-溴苯乙胺， 分别对应相应的产物化 合物 9、 10、 11、 12、 13和 14) ， 37 °C反应 2小时， 加入 30 mL乙酸乙酯萃取 三次： 浸膏溶于 2-3 mL DMSO， HPLC制备， 色谱仪为日立半制备型， 制备柱 为 YMC C18 250x 10 mm 5μηι， Α流动相为 100% ddH2O+0.1%乙酸， B流动相为 100%乙腈 +0.1%乙酸。方法为： 30%-80%流动相 B， 20 min; 80-100%流动相 B， 3 min; 100%流动相 B， 10 min; 0%流动相 B， 5 min; 流速为 2 mL/min。
由此分别得到化合物 9(保留时间 21.6 min)，化合物 10(保留时间 22.4 min)， 化合物 11 (保留时间 22.1 min), 化合物 12 (保留时间 21.4 min)， 化合物 13 (保 留时间 19.9 min) 和化合物 14 (保留时间 22.3 min)。

Claims

权利要求书
1、 一种海洋咔啉生物碱的生物合成基因簇， 其特征在于， 该生物合成基因簇的核苷酸序 列如 SEQ ID N0.1的第 1-4222位的碱基序列所示。
2、权利要求 1所述的海洋咔啉生物碱的生物合成基因簇在制备海洋咔啉生物碱及其类似 物中的应用。
3、一种酰胺键合成酶基因 mcbA,其特征在于，其核苷酸序列如 SEQ ID N0.1的第 1-1488 位碱基所示。
4、 权利要求 3所述的酰胺键合成酶基因 mcbA编码的酰胺键合成酶 McbA。
5、 权利要求 4所述的酰胺键合成酶 McbA在催化如式 （ I )所示的 β-咔啉母核和芳香胺 类化合物之间酰胺键的形成而产生 β-咔啉生物碱类似物中的应用
Figure imgf000021_0001
6
式 （ I )。
6、 一种 Pictet-Spengler反应酶基因 mcb£， 其特征在与， 其核苷酸序列如 SEQ ID N0.1 的第 1572- 2516位碱基所示。
7、 权利要求 6所述的 Pictet-Spengler反应酶基因 mcbB编码的 Pictet-Spengler反应酶 McbB。
8、 权利要求 7所述的 Pictet-Spengler反应酶 McbB在制备 β-咔啉母核或 β-咔啉衍生物中 的应用。
9、 根据权利要求 8所述的应用， 其特征在于， 所述的 β-咔啉母核为如式 （Π )所示的化 合物 6， β-咔啉衍生物为如式 （Π ) 所示的化合物 5或 7。
Figure imgf000021_0002
式 （Π )
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