WO2002083884A2 - Verfahren zur immobilisierung und damit hergestellte anordnungen von verbindungen auf einer planaren oberfläche - Google Patents

Verfahren zur immobilisierung und damit hergestellte anordnungen von verbindungen auf einer planaren oberfläche Download PDF

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WO2002083884A2
WO2002083884A2 PCT/EP2002/004266 EP0204266W WO02083884A2 WO 2002083884 A2 WO2002083884 A2 WO 2002083884A2 EP 0204266 W EP0204266 W EP 0204266W WO 02083884 A2 WO02083884 A2 WO 02083884A2
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immobilized
planar surface
reaction
ring system
heterocyclic ring
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Mike Schutkowski
Dirk Scharn
Frank Osterkamp
Gerd Hummel
Laurence Jobron
Antje Burian
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Jerini Ag
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Publication date
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Publication of WO2002083884A3 publication Critical patent/WO2002083884A3/de

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/06—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier attached to the carrier via a bridging agent

Definitions

  • proteins that have been produced can be significantly influenced in their enzymatic activity (and thus in their biological function) by slight chemical modifications in the cell (post-translational modifications). It is therefore necessary to carry out a parallel analysis of the enzymatic activity of as many proteins as possible, in particular enzymes.
  • Such an approach allows, among other things, the very rapid determination of the substrate specificity of a defined enzyme, which in turn is an important prerequisite for the design of knowledge-based inhibitors, or the selective testing of pharmaceuticals or drug candidates, especially in the context of the prediction of side effects.
  • immobilization has a number of advantages. This includes the increased stability of the immobilized compounds. If, for example, nucleic acids or proteins are immobilized, it is regularly observed that their half-life increases significantly when exposed to various media, including media that have a nuclease or protease activity. One reason for the observed increased half-life may certainly be the reduced accessibility of the nucleic acids or protein for the corresponding degradative enzyme activities.
  • immobilization is the reusability of the immobilized compounds. For example, by immobilizing compounds on support materials that are used in the context of chromatographic processes, it is possible to use them again after passing through a medium that is to be cleaned up or modified under the influence of the immobilized compounds, and, if appropriate, regeneration.
  • pro Processes include affinity chromatography or bioconversion and biotransformation.
  • immobilized compounds or arrangements of nucleic acids or proteins is the field of application of the so-called biochips mentioned at the beginning. These require a precisely defined correlation between the type of immobilized molecule and its positioning or arrangement on a surface.
  • biomolecules such as oligoeptides or nucleic acids
  • a surface planar support or resin beads
  • a biopolymer protein surface and thus biocoat formation
  • prefabricated biomolecules (and purified) biomolecules can be used for the immobilization reaction, which can be directional or non-directional, and on the other hand these biomolecules can be synthesized step by step directly on a corresponding surface.
  • peptides on cellulose R. Frank, 1992, Spot synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support, Tetrahedron, 48, 9217-9232; A. Kramer and J.
  • immobilization technology for example in the field of biochips, and in particular the use of biochips to determine the substrate specificity of enzymes such as, for example, kinases, phosphatases, acetyltransferases, glycosyltransferases, farnesyltransferases, sulfatases, sulfotransferases or proteases, which depend on defined arrangements of their own Peptides that distinguish amino acid sequences will be present due to these limitations in addition to the desired amino acid sequence in a large number of other amino acid sequences, which are characterized by the lack of one or more amino acid units.
  • enzymes such as, for example, kinases, phosphatases, acetyltransferases, glycosyltransferases, farnesyltransferases, sulfatases, sulfotransferases or proteases, which depend on defined arrangements of their own Peptides that distinguish amino acid sequences will be present due to these limitations in addition to the desired
  • immobilized compounds such as amino acid sequences in the form of biochips makes it necessary that both the compounds and the link between the surface and the immobilized compound withstand the respective test or investigation conditions. Furthermore, there is an increasing need in the art for a quantification of the interaction between the immobilized compound and an agent which is contained in a sample which is to be examined and, if appropriate, quantified by means of the immobilized compound. This in turn presupposes that the actual loading density of the surface with the immobilized compound is known or can be determined non-destructively.
  • the present invention was therefore based on the object of providing a method for immobilizing compounds which meets the needs described above.
  • the object is achieved by a method for immobilizing compounds on a surface comprising the steps
  • the heterocyclic ring system is formed between the first and the second reaction partner.
  • the heterocyclic ring system is formed from parts of the first reactive group of the first reaction partner and the first reactive group of the second reaction partner.
  • the heterocyclic ring system is formed without loss of atoms (addition) or with the escape of at least one molecule (condensation and / or substitution).
  • the heterocyclic ring system consists of 3-12 atoms, where 1-7 atoms are either nitrogen, sulfur or oxygen. It is further preferred that the heterocyclic ring system consisting of 3 to 12 atoms consists of 1 to 7 heteroatoms, the heteroatoms being selected from the group comprising nitrogen, sulfur and oxygen. In a still further embodiment it is provided that the heterocyclic ring system is selected from the group comprising thiazoles, aminothiazoles, imidazoles, benzimidazoles, indoles, tetrahydroisoqumolines, tetrahydro- ⁇ -carbolines, dihydroquinazoline, oxidation products from ortho-amino-benzoic acid derivatives and pyrazoles.
  • the heterocyclic ring system comprises one of the following structural elements 1, 2, 3, 4 or 5, preferably 2, 3, 4 or 5:
  • X is O, S or NH, preferably NH
  • Y is S or O, preferably O;
  • R ! -R 3 alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, aryl, heteroatoms, heterocycles or biomolecule
  • R 4 -R 9 is alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, aryl, heteroatoms, heterocycles, biomolecule or H, D, T.
  • Alkyl branched and unbranched C ⁇ - 0 alkyl, C 3 -cycloalkyl, preferably: branched and unbranched C ⁇ _ ⁇ alkyl, C 3- ⁇ 2 cycloalkyl, and more preferably: branched and unbranched C ⁇ -6 alkyl, C 3rd 6- cycloalkyl;
  • Alkenyl branched and unbranched C 2 -2 0 alkenyl, branched and unbranched C ⁇ . 20 - Alkyl-OC 2 -2Q-alkenyl, C ⁇ -2 o (-O / SC 2.
  • Alkynyl branched and unbranched C 2-2 -alkynyl, branched and unbranched -20 (-O / SC 2 - 2 ⁇ ) 2 - 20 alkynyl, preferably: branched and unbranched C 2- i2-alkynyl, branched and unbranched C ⁇ -12 (-O / SC 2 -i2) 2-i2alkynyl, and more preferably: branched and unbranched C2- 6 alkynyl, branched and unbranched C ⁇ -6 (-O / S-C2- 8 ) 2- 8 alkynyl;
  • Cycloalkyl bridged and non-bridged C 3-4 o-cycloalkyl, preferably: bridged and non-bridged C 3-26 cycloalkyl, and more preferably: bridged and non-bridged C -1 s-cycloalkyl;
  • Heteroatoms N, S, O, Se, P, B, preferably: N, S, O, Se, and more preferably: N, S, O;
  • Heterocycles unsaturated and saturated 3-15-membered mono-, bi- and tricyclic rings with 1-7 heteroatoms, preferably: 3-10-membered mono-, bi- and tricyclic rings with 1-5 heteroatoms, and more preferably: 5-, 6- and 10-membered mono-, bi- and tricyclic rings with 1-3 heteroatoms;
  • Biomolecule nucleic acids, genes, chromosomal nucleic acids, cDNA, oligonucleotides, polynucleotides, primers, probes, PNA, peptides, polypeptides, protein domains, proteins, sugars, poly sugars, lipids, polylipids, natural products or combinations of two or more of these compounds.
  • alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, aryl, heteroatoms, heterocycles biomolecules or natural substances have substituents, more specifically 0 to 30, preferably 0 to 10 and preferably 0 to 5 of the following substituent, which can occur either individually or in any combination: fluorine , Chlorine, bromine, iodine, hydroxyl, amide, ester, acid, amine, acetal, ketal, thiol, ether, phosphate, sulfate, sulfoxide, peroxide, sulfonic acid, thioether, nitrile, urea and carbamate.
  • substituents more specifically 0 to 30, preferably 0 to 10 and preferably 0 to 5 of the following substituent, which can occur either individually or in any combination: fluorine , Chlorine, bromine, iodine, hydroxyl, amide, ester, acid, amine, acetal, ketal,
  • Preferred substituents are: fluorine, chlorine, bromine, hydroxyl, amide, ester, acid, amine, ether, phosphate, sulfate, sulfoxide, thioether, nitrile, urea, carbamate.
  • substituents are: chlorine, hydroxyl, amide, ester, acid, ether, nitrile.
  • the reactive group is selected from the group consisting of thioamines, thiocarbonyls, thioureas, hydroxylamino, alpha-isothiocyanatoketones, anthranilic acid amides, anilines, aldehydes, ketones, 1,2-diketones, amines, aminooxy derivatives, arylhydrazines , Arylamines, heteroarylamines, ortho-amino-benzoic acid, hydrazines, 2-cyano-aldehydes, imines and acid halides.
  • the first reactive group of the compound to be immobilized is a reactive group which is selected from the group consisting of thioamide, ani- contains lin, thiourea, thiocarbonyl, anthranilic acid, anthranilic acid amide and hydroxylamino.
  • the first reactive group of the surface is a reactive group which is selected from the group comprising carbonyl, keto and aldehyde.
  • the conversion is a chemoselective reaction.
  • the immobilization is a directed immobilization.
  • the compound to be immobilized is selected from the group consisting of nucleic acids, genes, chromosomal nucleic acids, cDNA, oligonucleotides, polynucleotides, primers, probes, PNA, peptides, polypeptides, protein domains, proteins, sugars, poly sugars, Includes lipids, polylipids, natural products and low molecular weight compounds.
  • the surface is a planar surface.
  • the planar surface is a chip.
  • the surface comprises a material which is selected from the group comprising silicates, ceramics, glass, metals, organic carrier materials, cellulose, nitrocellulose, PTFE membranes, polypropylene, gold, titanium dioxide and silicon oxide ,
  • the planar surface is a non-porous surface.
  • the object is achieved by a method for producing an arrangement comprising at least two different connections at at least two different locations on a planar surface, the first connection at a first location on the planar surface and the second connection at a second location the planar surface is immobilized by one of the methods according to the invention.
  • the object is achieved by a planar surface which can be produced by one of the methods according to the invention.
  • the object is achieved by a planar surface comprising a compound covalently immobilized thereon, a heterocyclic ring system being arranged between the immobilized compound and the surface, which is only formed by the immobilization process.
  • the heterocyclic ring system consists of 3-12 atoms, where 1-7 atoms are either nitrogen, sulfur or oxygen.
  • heterocyclic ring systems are selected from the group comprising thiazoles, aminothiazoles, imidazoles, benzimidazoles, indoles, tetrahydroisoquinolines, tetrahydro-ß-carbolines, dihydroquinazoline, oxidation products from ortho-amino-benzoic acid derivatives and pyrazoles.
  • R -R alkyl alkenyl, alkmyl, cycloalkyl, aryl, heteroatoms, heterocycles or biomolecule
  • R 4 -R 9 is alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, aryl, heteroatoms, heterocycles, biomolecule or H, D, T.
  • the object is achieved by an arrangement which can be produced by the method according to the invention for producing an arrangement.
  • the object is achieved by an arrangement which comprises a planar surface according to the invention.
  • the arrangement is an arrangement that can be produced by the method according to the invention for producing an arrangement.
  • the object is achieved by using an arrangement according to the invention or a planar surface according to the invention in a method for Determination of the substrate specificity of an enzymatic activity comprising the following steps:
  • planar surface is a planar surface according to the invention or a planar surface of an arrangement according to the invention.
  • the molecular weight of at least one of the amino acid sequences is changed.
  • the change in molecular weight takes place by the formation or cleavage of a covalent bond on one of the amino acid sequences, preferably on the amino acid sequence which reacts with the enzymatic activity. It is particularly preferred if the reaction is detected on or using the amino acid sequence immobilized on the surface of the support material.
  • reaction is detected by detecting the change in molecular weight.
  • the detection is carried out by a detection method which is selected from the group comprising autoradiography, plasmon resonance spectroscopy and fluorescence spectroscopy.
  • the enzymatic activity is selected from the group comprising kinases, sulfotransferases, glycosyltransferases, acetyltransferases, farnesyltransferases, palmityltransferases, phosphatases, sulfatases, esterases, lipases, acretylases and proteases.
  • natural substances are to be understood as meaning, in particular, a compound which can be isolated from animal or vegetable organisms, or the fully synthetic analogues with a molecular weight below 1000 kDa.
  • the present invention is based on the surprising finding that the method according to the invention can be used to immobilize compounds, in particular amino acid sequences, and that the amino acid sequences immobilized in this way are particularly stable with regard to the heterocyclic ring system formed during the reaction of the compound to be immobilized and the surface Dissolution of the immobilization (acid and base stability of the immobilization). Furthermore, the inventors have surprisingly found that using the immobilization method according to the invention, the immobilization efficiency, which can be calculated from the loading or immobilization density when the concentration of the starting concentrations used is known, can be controlled. The immobilization density in turn is a prerequisite for carrying out quantitative studies, as described at the beginning.
  • the determination of the immobilization density seems to be based essentially on the fact that a heterocyclic ring system forms between the compound to be immobilized and the surface to which the compound is to be immobilized.
  • the amount of the compound immobilized at one location on the surface can be inferred directly.
  • the reactive group of the compound to be immobilized and the reactive group of the surface, and optionally a further group to be added, that of a third reactant or a second reactive group of the compound to be immobilized or a second reactive group of the surface, (where all or all of the above-mentioned reactive groups lead to the formation of the heterocyclic ring system) is derivatized in such a way that the result of the immobilization heterocyclic ring system forming or contains a chromophore that allows specific detection.
  • the detection is typically carried out using UV-Vis, fluorescence or infrared spectroscopy
  • the immobilization of several different amino acid sequences is provided with a terminal structure that is uniform to all amino acid sequences and that this terminal structure is made available for the specific reaction with the surface, in particular an activated surface, and is used in the immobilization.
  • the amino or carboxyl groups contained in the amino acid sequence are typically not impaired in the chemoselective reactions. Examples of suitable reactions are the formation of amide bonds from thioesters and 1,2-aminothiols (Fig.
  • Imidazoles from 1,2-diketones and amines benzimidazoles from phenylenediamine derivatives and aldehydes, indoles from arylhydrazines and aldehydes, tetrahydroisoquinolines from arylamines and aldehydes, tetrahydro-ß-carbolines and corresponding tetrahydroimidazopyridines from heteroazoamylines from heteroazoamylines from heteroazoamylines from heteroazoamylines from heteroazo aryamines from heteroazo aryamines from heteroazo aryamines from their heteroazo pyridine Amino-benzoic acid derivatives and aldehydes, pyrazoles from hydrazines and 2-cyano-aldeydes, cycloaddition of two olefins, cycloaddition of olefins and imines, cycloaddition of imines and acid halides.
  • the compound to be immobilized or conjugated contains an aniline function which is arranged in such a way that it can form a heterocycle with a corresponding reaction partner (surface or other biomolecule).
  • the compound to be immobilized or conjugated contains a thioamide function which is arranged in such a way that it can form a heterocycle with a corresponding reaction partner (surface or other biomolecule).
  • Directed immobilization should be understood to mean, in addition to what has already been said at the outset, that in the case of immobilization a Amino acid sequence each amino acid sequence is bound to the surface via a defined reactive group or group of reactive groups. As a result of this binding specificity it is achieved that the individual amino acid sequences will be in an energetically preferred state within the framework of the usual entropies, so that the amino acid sequences immobilized in this way are present in largely similar secondary and tertiary structures.
  • the immobilization method according to the invention can also be referred to or carried out as a conjugation method.
  • Conjugation should be understood to mean in particular the directional linkage of different biomolecules, these molecules differing sufficiently in size so that one of these biomolecules can be viewed as a surface and the other biomolecule (s) on the surface of the first biomolecule to be immobilized compound (s).
  • conjugation methods can be used for the regioselective labeling of biomolecules with mostly small compounds, which are suitable as probes in subsequent experiments. Examples of such probes are fluorescent labels, electron spin resonance labels, radioactive labels and biotinylations.
  • Fig. 6 shows the result of the incubation of a modified glass surface with a
  • the alpha-bromoketone is converted to an alpha-isothiocyanatoketone (X) and this is reacted with the amino-oxypeptide or biomolecule (XI) to form a hydroxylaminothiazole (XII) with the intermediate formation of a thiourea.
  • the radicals R 4 and R 5 represent alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl or aryl radicals, or heterocycles or surfaces or H, D, or T, alkyl being for branched and unbranched C ⁇ -2 o -Alkyl, C 3-20 cycloalkyl, preferably for branched and unbranched C ⁇ - ⁇ 2 alkyl, C 3- i 2 cycloalkyl and particularly preferably for branched and unbranched C ⁇ -6- alkyl, C 3-6 cycloalkyl radicals stands.
  • Heterocycles can be unsaturated and saturated 3-15-membered mono-bi and tricyclic rings with 1-7 heteroatoms, preferably 3-10-membered mono-bi and tricyclic rings with 1-5 heteroatoms and particularly preferably: 5.6 and 10- link mono-bi and tricyclic rings with 1-3 heteroatoms.
  • substituents can occur on the alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, aryl, heteroatoms, heterocycles, biomolecule or natural product 0 to 30 (preferably 0 to 10, particularly preferably 0 to 5) individually or in combination with one another; Fluorine, chlorine, bromine, iodine, hydroxyl, amide, ester, acid, amine, acetal, ketal, thiol, ether, phosphate, sulfate, sulfoxide, peroxide, sulfonic acid, thioether, nitrile, urea, carbamate, the following being preferred: fluorine , Chlorine, bromine, hydroxyl, amide, ester, acid, amine, ether, phosphate, sulfate, sulfoxide, thioether, nitrile, urea, carbamate, and particularly preferably: chlorine, hydroxyl, amide, ester, acid
  • FIG. 3 shows a representation of various combinations of thioamides as the first reactive group in the compound to be immobilized and various first reactive groups of the surface, which lead to the immobilization of biomolecules with the formation of heterocyclic ring systems.
  • a biomolecule in particular a peptide, is used as the compound to be immobilized.
  • 3D shows that using a thioamide function of the peptide (XXVI) together with a hydrazide function (XXVII), oxadiazoles can be formed on the surface.
  • the radicals R 4 -R 9 represent alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl or aryl radicals, or heterocycles or surfaces or H, D, or T, alkyl being for branched and unbranched C 1.
  • Alkynyl stands for branched and unbranched C2-20 alkynyl, branched and unbranched C1-20 (-O / SC 2 - 2 o) 2- 20 alkynyl, preferably for branched and unbranched C 2 -i 2 alkynyl, branched and unbranched C 1st 12 (-O / SC 2 -i 2) 2-i2alkinyl, particularly preferably branched and unbranched C2- 6 - alkynyl, branched and unbranched C ⁇ - 6 (-O / SC 2 - 8) 2 - 8 alkynyl radicals; Cycloalkyl stands for bridged and unbridged C 3 .
  • aryl stands for substituted and unsubstituted mono- or multi-linked phenyl, pentalenyl, azulenyl, anthracenyl, indacenyl, acenaphthyl, fluorenyl , Phenalenyl, phenanthrenyl, preferably for substituted and unsubstituted mono- or multi-linked phenyl, pentalenyl, azulenyl, anthracenyl, indenyl, indacenyl, acenaphtyl, fluorenyl, particularly preferably for substituted and unsubstituted mono- or multi-linked Phenyl, pentalenyl, anthracenyl residues, and their partially hydrogen
  • Heterocycles can be unsaturated and saturated 3-15-membered mono-bi and tricyclic rings with 1-7 heteroatoms, preferably 3-10-membered mono-bi and tricyclic rings with 1-5 heteroatoms and particularly preferably: 5.6 and 10- link mono-bi and tricyclic rings with 1-3 heteroatoms.
  • substituents can occur on the alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, aryl, heteroatoms, heterocycles, biomolecule or natural product 0 to 30 (preferably 0 to 10, particularly preferably 0 to 5) individually or in combination with one another; Fluorine, chlorine, bromine, iodine, hydroxyl, amide, ester, acid, amine, acetal, ketal, thiol, ether, phosphate, sulfate, sulfoxide, peroxide, sulfonic acid, thioether, nitrile, urea, carbamate, the following being preferred: fluorine , Chlorine, bromine, hydroxyl, amide, ester, acid, amine, ether, phosphate, sulfate, sulfoxide, thioether, nitrile, urea, carbamate, and particularly preferably: chlorine, hydroxyl, amide, ester, acid
  • Fig. 4 shows the immobilization of a biomolecule to form a substituted 2,3,4a, 8a-tetrahydro-1H-quinazolin-4-one (XIII).
  • a building block is added to form a covalent bond.
  • the latter is added by adding isatoic acid (XIV) to form an ortho-amino-benzoyl biomolecule (XV), which is subsequently separated from the solid phase by the action of acid as an ortho-amino-benzoyl biomolecule.
  • Amide (XVI) is split off.
  • the ortho-amino-benzoyl biomolecule amide (XVI) obtained is brought into contact with a glass support whose surface has an aldehyde function, and a substituted 2,3,4a, 8a-tetrahydro-lH- quinazolin-4-ones (XIII).
  • the radicals R 4 and R 5 represent alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl or aryl radicals, or heterocycles or surfaces or H, D or T, where alkyl for branched and unbranched Cj. 20 - alkyl, C -2 o- cycloalkyl, preferably branched and unbranched C M 2 - alkyl, C 3- i 2 cycloalkyl, and particularly preferably represents branched and unbranched C 1 - 6 - alkyl, C 3-6 cycloalkyl Leftovers.
  • Alkenyl stands for branched and unbranched C2-2 0 - alkenyl, branched and unbranched C ⁇ -20 - alkyl-OC 2 -2 0 -alkenyl, C ⁇ -2o (-O / SC 2 - 20 ) 2 - 2 oalkenyl, aryl-C 2nd 2 Q-alkenyl, branched and unbranched heterocyclyl-C2-20-alkenyl, C 3-2 o-cycloalkenyl, preferably for branched and unbranched C 2 -i2-alkenyl, branched and unbranched C M2 (-O / SC 2 -i 2 ) 2 -i 2 alkenyl, particularly preferably branched and unbranched C 2 - 6 alkenyl, branched and unbranched C ⁇ -6 (-O / S C 2 - 8) 2 - 8 alkenyl radicals; Alkynyl represents branched and unbranched C 2-20 al
  • aryl stands for substituted and unsubstituted mono- or multi-linked phenyl -, pentalenyl, azulenyl, anthracenyl, indacenyl, acenaphthyl, fluorenyl, phenalenyl, phenanthrenyl, preferably for substituted and unsubstituted mono- or multi-linked phenyl, pentalenyl, azulenyl, anthracenyl, indenyl, indacenyl, Acenaphtyl, fluorenyl, particularly preferred for substituted and unsubstituted mono- or multi-linked phenyl, pentalenyl, anthracenyl residues, and their partially hydrogenated
  • Heterocycles can be unsaturated and saturated 3-15-membered mono-bi and tricyclic rings with 1-7 heteroatoms, preferably 3-10-membered mono-bi and tricyclic rings with 1-5 heteroatoms and particularly preferably: 5.6 and 10- membered mono-, bi- and tricyclic rings with 1-3 heteroatoms.
  • substituents can occur on the alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, aryl, heteroatoms, heterocycles, biomolecule or natural product 0 to 30 (preferably 0 to 10, particularly preferably 0 to 5) individually or in combination with one another; Fluorine, chlorine, bromine, iodine, hydroxyl, amide, ester, acid, amine, acetal, ketal, thiol, ether, phosphate, sulfate, sulfoxide, peroxide, sulfonic acid, thioether, nitrile, urea, carbamate, the following being preferred: fluorine , Chlorine, bromine, hydroxyl, amide, ester, acid, amine, ether, phosphate, sulfate, sulfoxide, thioether, nitrile, urea, carbamate, and particularly preferably: chlorine, hydroxyl, amide, ester, acid
  • Example 12 which was initially pre-incubated with 10 ml 100 ⁇ M ATP solution in 50 mM sodium phosphate buffer pH 7.5 for 10 minutes.
  • the modified glass surface was then covered with a second glass surface and introduced into the resulting interspace protein kinase A (lOU / mL) together with ATP / ⁇ 32 P-ATP mixture (100 ⁇ M / mL; 100 ⁇ Ci / mL) using capillary force.
  • the phosphorylation of the corresponding peptides was detected using a phosphor image from FUJIFILM (cf. Example 13).
  • Oxalyl chloride, sodium thiocyanate, trifluoroacetic acid, dimethyl sulfoxide, thioacetamide, Lawesson's reagent, formic acid, and thiourea were purchased from Fluka (Deisenhofen, Germany).
  • Adenosine 5'-triphosphate, 2-amino-2-hydroxymethyl-l, 3-propanediol hydrochloride, sodium chloride, magnesium chloride, 1,4-dithio-DL-threitol, sodium lauryl sulfate, polyoxyethylene sorbitant monolaurate, and ethylene glycol bis- (2-aminoethyl) -N, N, N ', N'-tetraacetic acid are from Sigma (Taufkirchen, Germany).
  • the Rink-Amid-MBHA resin, (benzotriazol-l-yl) -N, N, N ', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate, and all Fmoc-amino acid pentafluorophenyl esters were obtained from Novabiochem (Bad Soden, Germany). Cellulose membranes "Whatman 50" (Whatman Maidstone, UK) were used for the SPOT synthesis. Chromatography and physical data:
  • RP-18 HPLC-MS analyzes were performed by chromatography using a Hewlett Packard Series 1100 system (degasser G1322A, quaternary pump G1311A, automatic sampler G1313A, thermostatted column compartment G 1316A, variable UV detector G1314A) and coupled ESI-MS ( Finnigan LCQ ion trap mass spectrometer).
  • Preparative HPLC was carried out using a system from Merck / Hitachi (quaternary pump L-6250, variable UV detector L- / 400, interface D-7000, software: HPLC system manager D-7000 for NT 4.0) using a column from Merck Eurolab (LiChrospher 100, RP18, 10x250 mm) with a solvent flow of 6.0 mL / min.
  • the solvent system used was composed of components A (H 2 O / OI vol% TFA) and B (CH 3 CN / 0.1 vol% TFA).
  • the peptides used for immobilization were synthesized as C-terminal peptide amides using a parallel “Syro” automatic synthesizer (MultiSynTech, Witten, Germany) according to the standard Fmoc protocol on Rink amide MBHA resin. All peptides obtained were analyzed by HPLC-MS after cleavage from the resin and cleavage of all protective groups and showed the desired molecular ion signals. After subsequent HPLC purification, the peptides were lyophilized and stored at -20 ° C.
  • the peptides used for the mobilization were automatically prepared using the Autospot AMS 222 device (Abimed, Langenfeld, Germany) using the control software Autospot XL Ver. 2.02 carried out. The washing steps took place in stainless steel bowls (Merck Eurolab) that were moved on a rocking table.
  • Example 1 Aldehyde functionalization of aminopropylsilylated glass surfaces
  • Levulinic acid (Fluka, 61380) was dissolved 0.3 M in DMF. The resulting mixture was activated by the addition of half an equivalent of DIC for 15 min at RT. Aminopropylsilylated glass surfaces (2.5 ⁇ 7.5 cm; Sigma, Silane-Prep TM, S4651) cleaned with compressed air were overlaid with the levulinic anhydride solution thus obtained and incubated for three hours at RT. The glass surfaces treated in this way were then washed five times with 30 mL DMF each for 3 minutes at RT. After washing three times for three minutes each with 30 mL DCM at RT, the glass surfaces were dried and stored at 4 ° C. until further use.
  • 1,4-dibromo-2,3-diketobutane (Aldrich, D3,916-9) (Fig. 5, XXX) was 0.2 M dissolved in DMF 0.1% triethylamine.
  • Aminopropylsilylated glass surfaces (2.5 ⁇ 7.5 cm; Sigma, Silane-Prep TM, S4651) cleaned with compressed air were covered with a solution and incubated for seven hours at RT. The glass surfaces treated in this way were then washed five times with 30 mL DMF each for 3 minutes at RT. After washing three times for three minutes each with 30 mL DCM at RT, the glass surfaces were dried and stored at 4 ° C. until further use.
  • Example 5 Bromoketone functionalization of thioamide-modified glass surfaces (see FIG. 5)
  • Example 6 Bromoketone functionalization of phenylthiourea-modified glass surfaces (cf. FIG. 5)
  • This surface modification shows that it is possible to use even very small structures to convert an amino-functionalized to a bromoketone-functionalized glass surface.
  • the bromopyruvic acid is the smallest possible compound which contains both the carboxyl function necessary for the amide bond formation and the alpha-bromo-keto function necessary for the subsequent immobilization of the biomolecule.
  • the pyruvic acid-modified glass surfaces thus obtained were converted into the bromopyruvic acid-modified glass surfaces by treatment for one hour with a solution of 0.1 ml of bromine in 10 ml of glacial acetic acid. After washing three times each for three minutes each with 30 mL methanol and DCM at RT, the glass surfaces were dried and stored at 4 ° C. until further use.
  • Example 8 Bromacetophenone functionalization of aminopropylsilylated glass surfaces (cf. FIGS. 2A, IX)
  • the glass surfaces modified in this way were converted into the bromoacetophenone-modified glass surfaces (FIG. 2, IV) by treatment with a solution of 0.1 ml of bromine in 10 ml of glacial acetic acid for one hour. After washing three times each for three minutes each with 30 mL methanol and DCM at RT, the glass surfaces were dried and stored at 4 ° C. until further use.
  • Example 9 Thiocyanato-acetophenone functionalization of aminopropylsilylated glass surfaces (cf. FIG. 2C)
  • Example 10 Immobilization of anthraniloyl peptides on aldehyde-functionalized glass surfaces (cf. FIG. 4)
  • Fmoc-A pentafluorophenyl esters were dissolved in DMF and 1 ⁇ L each was spotted on. The coupling reaction was carried out twice at RT for 25 min each. The Fmoc protecting group was cleaved using 20% piperidine in DMF for 20 min at RT. After the last Fmoc split the N-termini of the cellulose-bound peptides were converted into the corresponding ortho-aminobenzoylated derivatives by incubation with a saturated solution of isatoic acid in DMF at 50 ° C. for five hours.
  • the permanent protective groups (tBu for serine, threonine, tyrosine, glutamic acid and aspartic acid; Boc for lysine; trityl for asparagine, glutamine, cysteine, histidine and Pbf for arginine) were removed by treatment with 97% trifluoroacetic acid at RT for two hours.
  • the cellulose-bound peptides were then washed with DCM, MeOH and diethyl ether and dried in vacuo.
  • the peptides were cleaved from the cellulose using ammonia gas at RT for 24 hours.
  • the spots with the physically adsorbed peptides were punched out and transferred to 96-well microtiter plates. After detaching the peptides with 200 ⁇ L of 20% methanol under ultrasonic conditions, the samples were filtered, transferred to 384well microtiter plates, lyophilized and stored at -20 ° C until further use.
  • Example 11 Immobilization of peptides containing thioxocitrulline on bromacetophenone-functionalized glass surfaces (cf. FIG. 2B)
  • the permanent protective groups (tBu for serine and Pbf for arginine) were split off and the polymer was simultaneously detached by treatment with 97% trifluoroacetic acid at RT for two hours. The resulting mixture was filtered and the filtrate was precipitated by adding tert-butyl methyl ether. The precipitate was separated off and purified by means of HPLC on RP18 material with acetonitrile / water mixtures (0.1% trifluoroacetic acid). The fractions containing the desired product were lyophilized and stored at -20 ° C. until further use.
  • Example 12 Immobilization of thioamide-containing peptides on bromketone-functionalized glass surfaces (see FIG. 5)
  • the precipitate was separated off and purified by means of HPLC on RP18 material with acetonitrile / water mixtures (0.1% trifluoroacetic acid). The fractions containing the desired product were lyophilized and stored at -20 ° C. until further use.
  • the modified glass surfaces (FIG. 5, XXXIIc) were incubated with 30 mL of a 3% aqueous solution of thioacetamide for 30 minutes at RT in order to deactivate the remaining alpha-bromoketone functions.
  • the glass surfaces were then washed five times for 3 minutes each with 50 mL water at RT and then twice each for 3 minutes each with 50 mL methanol at RT.
  • the glass surfaces treated in this way were dried and stored at 4 ° C. until further use.
  • a glass surface modified with the peptide Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly-thioamide (cf. Example 12 and Fig. 5, XXXIIc) was treated with 10 ml 100 ⁇ M ATP in kinase buffer (50 mm Tris-HCl, 150 mm NaCl, 30 mm) MgCl 2 , 4mM DTT, 2mM EGTA, pH 7.5) incubated at RT for 10 minutes. The glass surface was dried and then a second, unmodified glass surface of the same dimensions was placed on the peptide-modified glass surface.
  • washing buffer 1% SDS and 1% Tween20 in 50mM TRIS buffer, pH 7.5, 200mM NaCl
  • the amount of radioactive phosphate incorporated in the glass surface-bound peptides was determined using a phosphorus lean system (FLA-3000, FUJIFILM) (cf. FIG. 6).
  • kinase buffer 50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 30mM MgCl 2 , 4mM DTT, 2mM EGTA, pH 7.5
  • washing buffer 1% SDS and 1% Tween20 in 50mM TRIS buffer, pH 7.5, 200mM NaCl
  • the amount of radioactive phosphate incorporated in the glass surface-bound peptides was determined using a phosphorus lean system (FLA-3000, FUJIFILM) (cf. FIG. 7).

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung von Verbindungen auf einer Oberfläche, umfassend die Schritte: - Bereitstellen einer zu immobilisierenden Verbindung als ersten Reaktionspartner und einer Oberfläche als zweiten Reaktionspartner, wobei der erste Reaktionspartner eine erste reaktive Gruppe und der zweite Reaktionspartner eine erste reaktive Gruppe umfasst, und - Umsetzen der beiden Reaktionspartner, wobei vorgesehen ist, dass beim Umsetzen der beiden Reaktionspartner ein heterocyclisches Ringsystem ausgebildet wird.

Description

Verfahren zur Immobilisierung und damit hergestellte Anordnungen von Verbindungen auf einer planaren Oberfläche
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung von Verbindungen insbesondere von Biomolekülen, dadurch herstellbare planare Oberflächen und Anordnungen sowie Verwendung der planaren Oberfläche und der Anordnung in einem Verfahren zur Bestimmung der Substratspezifität einer enzymatischen Aktivität.
Mit der zunehmenden Verfügbarkeit von Sequenzinformationen aus den verschiedenen Genomprojekten gewann die Anordnung von Nukleinsäurefragmenten mit hoher Dichte auf einem Trägermaterial, sogenannten Chips oder Biochips, eine große Bedeutung, deren volles Potential jedoch erst mit der Verfügbarkeit neuerer Synthesetechniken sowie der Miniaturisierung ausgeschöpft werden konnte und zu einer Vielzahl von Anwendungen führte. Neben Nukleinsäuren wurden Naturstoffe bzw. Bibliotheken davon, aber auch Anordnungen von Oligopeptiden und Proteinen auf derartige Chips aufgebracht. Als Trägermaterialien für diese Anordnungen wurden dabei Zellulose (D.R. Englebretsen, D.R.K. Harding; 1994, High yield, directed immobilization of a peptide-ligand onto a beaded cellulose support, Pept. Res., 7, 322-326, R.Frank, 1992, Spot synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support, Tetrahedron, 48, 9217-9232; A.Kramer und J. Schneider-Mergener, Methods in Molecular Biology, vol 87: Combinatorial Peptide Library Protocols, S. 25-39, edited by: S. Cabilly; Humana Press Inc., Totowa, NJ), Glas (S.P.A. Fodor, J.L.Read, M.C.Pirrung, L.Stryer, A.T.Lu, D.Solas; 1991, Light-directed, spatially addressable parallel chemical synthesis, Science, 251, 767-773 J. Robles, M. Beitran, V. Marchan, Y. Perez, I. Travesset, E. Pedroso, A. Grandas; 1999, Towards nucleopeptides containing any trifunctional amino acid, Tetrahedron, 55, 13251- 13264), Nitrozellulose (SJ. Hawthome, M. Pagano, P. Harriott, D.W. Haiton, B. Walker; 1998, The synthesis and utilization of 2,4-dinitrophenyl-labeled irreversible peptidyl diazomethyl ke- tone inhibitors, Anal. Biochem., 261, 131-138), PTFE-Membranen, Gold (B.T. Houseman, M. Meksich; 1998, Efficient solid-phase synthesis of peptide-substituted alkanethiols for the prepa- ration of Substrates that support the adhesion of cells, J. Org. Chem., 63, 7552-7555), Titanoxid (SJ. Xiao, M. Textor, ND. Spencer, M. Wieland, B. Keller, H. Sigrist; 1997, Immobilization of the cell-adhesive peptide ARG-GLY-ASP-CYS (RGDC) on titanium surfaces by covalent chemical attachment, J. Materials Science-Materials in Medicine, 8, 867-872), Siliziumoxid und modifizierte Polypropylenoberflächen verwendet. Mit der zunehmenden Bedeutung von Proteomics und deren biotechnologische Anwendung rücken Peptide und Proteine in den Vordergrund des Interesses. Generell sind es Proteine und meistens deren enzymatische Aktivitäten, die nahezu alle biochemischen Reaktionen innerhalb und außerhalb der Zelle ermöglichen. Die Verwendung von Anordnungen von Nukleinsäuren, mit denen entweder die Messenger-RNA (mRNA), die durch in der Zelle gerade aktive Gene generiert wurden, oder aber DNA-Kopien dieser mRNA nachgewiesen werden, sind zwar von großer Bedeutung, jedoch ist die damit erhältliche Information aus einer Reihe von Gründen nicht ausreichend, um die Vorgänge sowohl intrazellulärer wie auch extrazellulärer Prozesse zu verstehen und hiervon im Rahmen verschiedener biotechnologischer Anwendungen Gebrauch zu machen. Ein Grund besteht darin, dass die Menge an mRNA in einer Zelle oft nicht mit der entsprechenden, in der Zelle produzierten Proteinmenge korreliert. Außerdem können einmal hergestellte Proteine durch geringfügige chemische Modifikationen in der Zelle (post-translationale Modifikationen) erheblich in ihrer enzymatischen Aktivität (und damit in ihrer biologischen Funktion) beeinflußt werden. Somit besteht die Notwendigkeit, eine parallele Analyse der enzymatischen Aktivität möglichst vieler Proteine, insbesondere Enzyme, durchzuführen. Ein derartiger Ansatz erlaubt u. a. die sehr schnelle Bestimmung der Substratspezifϊtät eines definierten Enzyms, welche wiederum eine wichtige Voraussetzung für das Design von Wissens-basierten Inhibitoren ist, oder die selektive Prüfung von Pharmaka bzw. Pharmaka-Kandidaten, insbesondere im Rahmen der Voraussage von Nebenwirkungen.
Grundsätzlich weist die Immobilisierung eine Reihe von Vorteilen auf. Dazu gehört unter anderem die erhöhte Stabilität der immobilisierten Verbindungen. Werden beispielsweise Nukleinsäuren oder Proteine immobilisiert, beobachtet man regelmäßig, dass sich deren Halbwertszeit bei Exposition gegenüber verschiedenen Medien deutlich erhöht, so auch bei solchen Medien, die eine Nuklease- oder Protease-Aktivität aufweisen. Ein Grund für die beobachtete erhöhte Halbwertszeit mag sicherlich in der verringerten Zugänglichkeit der Nukleinsäuren bzw. Protein für die entsprechenden degradativen Enzymaktivitäten sein.
Ein weiterer Vorteil der Immobilsierung ist die Wiederverwendbarkeit der immobilisierten Verbindungen. Beispielsweise ist es möglich, durch Immobilisierung von Verbindungen an Trägermaterialien, die im Rahmen von chromatographischen Prozessen verwendet werden, nach Passage eines Mediums, das es aufzureinigen oder unter dem Einfiuss der immobilisierten Verbindungen zu modifizieren gilt, und gegebenenfalls Regeneration, wieder zu verwenden. Derartige Pro- zesse sind beispielsweise die Affinitätschromatographie oder die Biokonversion und Biotransformation.
Eine weitere Anwendung von immobilisierten Verbindungen bzw. Anordnungen von Nukleinsäuren oder Proteinen ist das eingangs erwähnte Anwendungsgebiet der sogenannten Biochips. Bei diesen ist eine genau definierte Korrelation zwischen der Art des immobilisierten Moleküls und seiner Positionierung oder Anordnung auf einer Oberfläche erforderlich.
Grundsätzlich gibt es zwei Methoden, Biomoleküle, wie zum Beispiel Oligoeptide oder Nukleinsäuren, mit einer Oberfläche (planarer Träger oder Harzkügelchen) bzw. einem Biopolymer (Proteinoberfläche und damit Bioko jugatbildung) zu verbinden. Einerseits können vorgefertigte Biomoleküle (und gereinigte) Biomoleküle zur Immobilisierungsreaktion, die gerichtet oder un- gerichtet sein kann, verwendet werden und andererseits können diese Biomoleküle direkt auf einer entsprechenden Oberfläche schrittweise synthetisiert werden. Im Stand der Technik wurden zum Beispiel Peptide auf Zellulose (R.Frank, 1992, Spot synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support, Tetrahedron, 48, 9217-9232; A.Kramer und J. Schneider-Mergener, Methods in Molecular Biology, vol 87: Com- binatorial Peptide Library Protocols, S. 25-39, edited by: S. Cabilly; Humana Press Inc., Totowa, NJ; Töpert, F., Oires, C, Landgraf, C, Oschkinat, H. and Schneider-Mergener, J., 2001, Synthesis of an array comprising 837 variants of the hYAP WW protein domain) oder auf Polypropylen (WO 92/04366) oder auf Glas (S.P.A. Fodor, J.L.Read, M.C.Pirrung, L.Stryer, A.T.Lu, D.Solas; 1991, Light-directed, spatially addressable parallel chemical synthesis, Science, 251, 767-773, J.P. Pellois, W. Wang, X.L. Gao; 2000, Peptide synthesis based on t-Boc chemistry and solution photogenerated acids, J. Comb. Chem., 2, 355-360) oder auf Chitin (W. Neugebauer, R.E. Williams, J.R. Barbier, R. Brzezinski, G. Willick; 1996, Peptide synthesis on chitin, Int. J. Pept. Prot. Res., 47, 269-275) oder an Separose (R. Gast, J. Glokler, M. Hoxter, M. Kiess, R. Frank, W. Tegge; 1999, Method for determining protein kinase Substrate specificities by the phosphoryla- tion of peptide libraries on beads, phosphate-specific staining, automated sorting, and sequenc- ing, Anal. Biochem., 276, 227-241) synthetisiert.
Auch Nukleinsäuren konnten so durch direkte Synthese auf geeigneten Oberflächen, wie zum Beispiel Glas (S.P.A. Fodor, J.L.Read, M.C.Pirrung, L.Stryer, A.T.Lu, D.Solas; 1991, Light- directed, spatially addressable parallel chemical synthesis, Science, 251, 767-773, J. Robles, M. Beitran, V. Marchan, Y. Perez, I. Travesset, E. Pedroso, A. Grandas; 1999, Towards nucleopep- tides containing any trifunctional amino acid, Tetrahedron, 55, 13251-13264), direkt synthetisiert werden. Dabei ist für den Fachmann verständlich, dass infolge der nicht immer vollständigen Ausbeuten der einzelnen Syntheseschritte bzw. Kopplungsschritte gewisse Heterogenitäten in den verschiedenen Aminosäuresequenzen im vorstehend beschriebenen Sinne entstehen können. Insbesondere bei Synthesen, die viele Reaktionsschritte erfordern, wie dies bei der Synthese von Amiosäuresequenzen der Fall ist (pro Aminosäurebaustein eine Kupplungsreaktion und eine Schutzgruppen-Abspaltung und am Ende der Synthese im allgemeinen eine Reaktion für die simultane Abspaltung aller Schutzgruppen der Seitenkettenfunktionen) kann das ein Problem darstellen. So ist zum Beispiel bei der Synthese einer Aminosäuresequenz, die aus 20 Aminosäurebausteinen oder 40 Aminosäurebausteinen besteht, und einer angenommenen durchschnittlichen Ausbeute von 95% für die nötigen 41 bzw. 81 Reaktionsschritte die zu erwartente theoretische Ausbeute nur noch 0.9541 = 0.122 (12.2 %) bzw. 0.9581 = 0.0157 (1.57 %). Selbst bei einer angenommen durchschnittlichen Ausbeute von 99 % ergeben sich für die oben aufgeführten Beispiele nur 66.2 % bzw. 44.3 %.
Die Anwendung der Immobilisierungstechnologie beispielweise im Bereich der Biochips und insbesondere die Verwendung von Biochips zur Bestimmung der Substratspezifität von Enzymen wie zum Beispiel Kinasen, Phosphatasen, Acetyltransferasen, Glycosyltransferasen, Farne- syltransferasen, Sulfatasen, Sulfotransferasen oder Proteasen, die auf definierte Anordnungen von sich in ihrer Aminosäuresequenz unterscheidenden Peptide zurückgreifen, werden infolge dieser Limitierungen neben der gewünschten Aminosäuresequenz in großer Vielzahl weitere Aminosäuresequenzen vorhanden sein, die sich durch das Fehlen einer oder mehrerer Aminosäurebausteine auszeichnen. Genau diese, dem Fachmann als Fehl- bzw. Abbruchsequenzen bekannten Nebenprodukte, können unter Umständen das Ergebnis der Inkubation mit einer, die auf der Oberfläche angeordneten Aminosäuresequenzen modifizierenden, enzymatischen Aktivität stark verfälschen bzw. die Interpretation der Ergebnisse erschweren. Um diese Nachteile zu vermeiden, kann die Immobilisierung von möglichst gereinigten, Biomolekülen hilfreich sein. Im Stand der Technik wurden Biomoleküle, wie zum Beispiel Peptide oder Nukleinsäuren, auf verschiedenen Oberflächen wie Glas (S.P.A. Fodor, J.L.Read, M.C.Pirrung, L.Stryer, A.T.Lu, D.Solas; 1991, Light-directed, spatially addressable parallel chemical synthesis, Science, 251, 767-773, J.P. Pellois, W. Wang, X.L. Gao; 2000, Peptide synthesis based on t-Boc chemistry and solution photogenerated acids, J. Comb. Chem., 2, 355-360, J. Robles, M. Beitran, V. Marchan, Y. Perez, I. Travesset, E. Pedroso, A. Grandas; 1999, Towards nucleopeptides containing any trifunctional amino acid, Tetrahedron, 55, 13251-13264), trifunctional amino acid, Tetrahedron, 55, 13251-13264), Zellulose (D.R. Englebretsen, D.R.K. Harding; 1994, High yield, directed immobilization of a peptide-ligand onto a beaded cellulose support, Pept. Res., 1, 322-326, R.Frank, 1992, Spot synthesis: an easy technique for the posi- tionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support, Tetrahedron, 48, 9217- 9232; A.Kramer und J. Schneider-Mergener, Methods in Molecular Biology, vol 87: Combinato- rial Peptide Library Protocols, S. 25-39, edited by: S. Cabilly; Humana Press Inc., Totowa, NJ), Nitrozellulose (SJ. Hawthorne, M. Pagano, P. Harriott, D.W. Haiton, B. Walker; 1998, The synthesis and utilization of 2,4-dinitrophenyl-labeled irreversible peptidyl diazomethyl ketone Inhibitors, Anal. Biochem., 261, 131-138), Titanoxid (SJ. Xiao, M. Textor, ND. Spencer, M. Wieland, B. Keller, H. Sigrist; 1997, Immobilization of the cell-adhesive peptide ARG-GLY-ASP- CYS (RGDC) on titanium surfaces by covalent chemical attachment, J. Materials Science- Materials in Medicine, 8, 867-872) oder Gold (B.T. Houseman, M. Meksich; 1998, Efficient solid-phase synthesis of peptide-substituted alkanefhiols for the preparation of Substrates that support the adhesion of cells, J. Org. Chem., 63, 7552-7555) immobilisiert.
Eine weitere Unterscheidung der Immobilisierung kann auf der Grundlage der Orientierung oder Bindung der einzelnen immobilisierten Verbindung relativ zur Oberfläche vorgenommen werden. Hier kann zwischen spezifischer und unspezifischer Immobilisierung unterschieden werden. Bei unspezifischer Immobilisierung erfolgt in einem Immobilisierungsereignis der Kontakt zwischen der zu immobilisierenden Verbindung und der Oberfläche, auf bzw. an der die Verbindung immobilisiert wird, in unterschiedlicher Weise. Mit anderen Worten, es reagieren entweder verschiedene in der zu immobilisierenden Verbindung enthaltene reaktive Gruppen mit der Oberfläche oder aber es reagieren verschiedene, auf der Oberfläche vorhandene reaktive Gruppierungen mit einer reaktiven Gruppe der zu immobilisierenden Verbindung (Quervernetzung). Infolgedessen kommt es zur Ausbildung einer Population von immobilisierten Verbindungen, die hinsichtlich ihrer Bindung an die Oberfläche heterogen sind. Diese unterschiedlich Art der Immobilisierung kann zu einem oftmals unerwünschten unterschiedlichen Verhalten der immobilisierten Verbindung führen. Zum Beispiel können bei der Immobilisierung eines Substrates für eine Ki- nase auf oder an einer Oberfläche unter Nutzung der innerhalb dieses Substrates enthaltenen A- minogruppen mehrere (abhängig von der Anzahl der in der zu immobilisierenden Verbindung vorhandenen Aminogruppen) Möglichkeiten der Reaktion und damit der endgültigen Orientie¬ rung der Verbindung auf der Oberfläche bestehen. Werden dabei bei der nachgeschalteten Inku¬ bation dieser immobilisierten Verbindung (Kinasesubstrat) mit einer, mindestens eine Kinaseak- tivität enthaltenden, biologischen Flüssigkeit eben eine oder mehrere dieser Aminogruppen für die effektive Ausbildung eines Emzym/Substrat/Komplexes benötigt, kann eine solche unspezifische Immobilisierung dazu führen, das nur eine geringe Population der immobilisierten Substrate in der richtigen Art und Weise verankert sind und damit das Meßsignal unterhalb der Nachweisgrenze liegt. Damit ist eine spezifische oder auch gerichtete Immobilisierung von großem Vorteil. Hier erfolgt in einem Immobilsierungsereignis der Kontakt zwischen der zu immobilisierenden Verbindung und der Oberfläche, auf bzw. an der die Verbindnung immobilisiert wird, jeweils in der gleichen Art und Weise und alle Verbindungen sind in einer definierten und vorhersagbaren Orientierung auf oder an der Oberfläche gebunden.
Bei dieser Form der Immobilisierung handelt es sich in der Regel um eine kovalente Immobilisierung, wobei hier eine chemoselektive Reaktion zwischen der zu immobilisierenden Verbindung und der Oberfläche (des Trägermaterials) erfolgt. Hierzu können eine Reihe von Reaktionen verwendet werden, die dem Fachmann auf diesem Gebiet als solche bekannt (G. A. Lemieux und C.R. Bertozzi, 1998, chemoselective ligation reactions with proteins, oligosaccharides and cells, TIBTECH, 16, 506-513) und in Fig. 1 dargestellt sind. Die chemoselektive Reaktion kann grundsätzlich durch zwei Mechanismen bedingt werden. Bei einem Mechanismus weist die zu immobilisierende Verbindung eine reaktive Gruppe auf, die mit der Oberfläche spezifisch reagiert: Dies kann dadurch bewerkstelligt werden, dass die besagte reaktive Gruppe nur einmal an der zu immobilisierenden Verbindung vorhanden ist. Bei dem zweiten Mechanismus ist die reaktive Gruppe möglicherweise mehrfach vorhanden, jedoch unterscheiden sich die Gruppen in ihrer Reaktivität, so dass lediglich das Vorliegen bestimmter Reaktionsbedingungen wie pH Wert oder dergleichen zu einer Umsetzung mit der Oberfläche führt.
Die Verwendung von immobilisierten Verbindungen wie Aminosäuresequenzen in Form von Biochips macht es erforderlich, dass sowohl die Verbindungen als auch die Verknüpfung zwischen der Oberfläche und der immobilisierten Verbindung den jeweiligen Test- oder Untersuchungsbedingungen standhalten. Weiterhin besteht in der Technik zunehmend das Bedürfnis nach einer Quantifizierung der Wechselwirkung zwischen der immobilisierten Verbindung und einem Agens, das in einer Probe enthalten ist, die mittels der immobilisierten Verbindung untersucht und gegebenenfalls quantifiziert werden soll. Dies wiederum setzt voraus, dass die tatsächliche Beladungsdichte der Oberfläche mit der immobilisierten Verbindung bekannt ist bzw. zerstörungsfrei bestimmt werden kann. Der vorliegenden Erfindung lag somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Immobilsierung von Verbindungen bereitzustellen, das den vorstehend beschriebenen Bedürfhissen gerecht wird.
Erfmdungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur Immobilisierung von Verbindungen auf einer Oberfläche umfassend die Schritte
Bereitstellen einer zu immobilisierenden Verbindung als ersten Reaktionspartner und einer Oberfläche als zweiten Reaktionspartner, wobei der erste Reaktionspartner eine erste reaktive Gruppe und der zweite Reaktionspartner eine erste reaktive Gruppe umfasst, und
Umsetzen der beiden Reaktionspartner
dadurch gekennzeichnet, dass beim Umsetzen der beiden Reaktionspartner ein heterocyc- lisches Ringsystem ausgebildet wird.
In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass das heterocyclische Ringsystem zwischen dem ersten und dem zweiten Reaktionspartner ausgebildet wird.
In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass das heterocyclische Ringsystem aus Teilen der ersten reaktiven Gruppe des ersten Reaktionspartners und der ersten reaktiven Gruppe des zweiten Reaktionspartners gebildet wird.
Grundsätzlich besteht bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Möglichkeit, dass das heterocyclische Ringsystem ohne Verlust von Atomen (Addition) oder unter Austritt von mindestens einem Molekül (Kondensation und/oder Substitution) entsteht.
In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass das heterocyclische Ringsystem aus 3-12 Atomen besteht, wobei 1-7 Atome entweder Stickstoff, Schwefel oder Sauerstoff sind. Weiter bevorzugt ist, dass das aus 3 bis 12 Atomen bestehende heterocyclische Ringsystem aus 1 bis 7 Heteroato- men besteht, wobei die Heteroatome ausgewählt sind aus der Gruppe, die Stickstoff, Schwefel und Sauerstoff umfasst. In einer noch weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass das heterocyclische Ringsystem ausgewählt ist aus der Gruppe, die Thiazole, Aminothiazole, Imidazole, Benzimidazole, Indole, Tetrahydroisoqumoline, Tetrahydro-ß-carboline, Dihydroquinazolin, Oxidationsprodukte aus ortho-Amino-Benzoesäurederivate und Pyrazole umfasst.
In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass das heterocyclische Ringsystem eine der folgenden Strukturelemente 1, 2, 3, 4 oder 5, bevorzugterweise 2, 3, 4, oder 5, umfasst:
Figure imgf000009_0001
3
wobei die Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt sind und worin
X O, S oder NH, bevorzugterweise NH ist;
A ein Ringsystem aus 4 bis 8 Atomen ist, bevorzugterweise Aryl ist;
Y S oder O, bevorzugterweise O ist;
R!-R3 Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Aryl, Heteroatome, Heterocyclen oder Biomolekül
R4-R9 Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Aryl, Heteroatome, Heterocyclen, Biomolekül oder H, D, T ist
Hierin sollen, sofern nichts gegenteiliges angegeben ist, die folgenden Begrifflichkeiten bedeuten:
Alkyl: verzweigte und unverzweigte Cι- 0-Alkyl, C3- o-Cycloalkyl, bevorzugterweise: verzweigte und unverzweigte Cι_ι -Alkyl, C3-ι2-Cycloalkyl, und bevorzugtererweise: verzweigte und unverzweigte Cι-6-Alkyl, C3.6-CycloalkyI; Alkenyl: verzweigte und unverzweigte C2-20-Alkenyl, verzweigte und unverzweigte Cι.20- Alkyl-O-C2-2Q-alkenyl, Cι-2o(-O/S-C2.2o)2-2oalkenyl, Aryl-C -2o-alkenyl, verzweigte und unverzweigte Heterocyclyl- C2.20-alkenyl, C3-2o-Cycloalkenyl, bevorzugterweise: verzweigte und unverzweigte C2-i2-Alkenyl, verzweigte und unverzweigte C1.12 (-O/S-C2-ι 2)2-12alkenyl, und bevorzugtererweise: verzweigte und unverzweigte C2-6- Alkenyl, verzweigte und unverzweigte Cι-6 (-O/S-C2-8)2-8alkenyl;
Alkinyl: verzweigte und unverzweigte C2-2o-Alkinyl, verzweigte und unverzweigte -20 (-O/S-C2-2θ)2-20alkinyl, bevorzugterweise: verzweigte und unverzweigte C2-i2-Alkinyl, verzweigte und unverzweigte Cι-12 (-O/S-C2-i2)2-i2alkinyl, und bevorzugtererweise: verzweigte und unverzweigte C2-6-Alkinyl, verzweigte und unverzweigte Cι-6 (-O/S-C2-8)2-8alkinyl;
Cycloalkyl: überbrückte und nicht-überbrückte C3-4o-Cycloalkyl, bevorzugterweise: überbrückte und nicht-überbrückte C3-26-Cycloalkyl, und bevorzugtererweise: überbrückte und nicht-überbrückte C -1s-Cycloalkyl;
Aryl: substituierte und unsubstituierte mono- oder multi-verknüpfte Phenyl-, Pentalen-, Azulen-, Anthracenyl-, Indacen-, Acenaphtylen, Fluoren, Phenalen, Phenanthren, Bevorzugt: substituierte und unsubstituierte mono- oder multi-verknüpfte Phenyl-, Pentalen-, Azulen-, Anthracenyl-, Inden-, Indacen-, Acenaphtylen-, Fluorensysteme; bevorzugterweise: substituierte und unsubstituierte mono- oder multi-verknüpfte Phenyl-, Pentalen-, Anthracenylsysteme sowie deren teilhydrierte Derivate;
Heteroatome: N, S, O, Se, P, B, bevorzugterweise: N, S, O, Se, und bevorzugtererweise: N, S, O;
Heterocyclen: ungesättigte und gesättigte 3-15-gliedrige mono-, bi- und tricyclische Ringe mit 1-7 Heteroatomen, bevorzugterweise: 3-10-gliedrige mono-, bi- und tricyclische Ringe mit 1-5 Heteroatomen, und bevorzugtererweise: 5-, 6- und 10-gliedrige mono-, bi- und tricyclische Ringe mit 1-3 Heteroatomen;
Biomolekül: Nukleinsäuren, Gene, chromosomale Nukleinsäuren, cDNA, Oligonukleotide, Polynukleotide, Primer, Sonden, PNA, Peptide, Polypeptide, Proteindomänen, Proteine, Zucker, Polyzucker, Lipide, Polylipide, Naturstoffe bzw. Kombinationen aus zwei oder mehreren dieser Verbindungen.
Zusätzlich können zu die vorstehend genannten Gruppen oder Moleküle, d.h. Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Aryl, Heteroatome, Heterocyclen, Biomolekül oder Naturstoff Substituenten aufweisen, genauer 0 bis 30, bevorzugterweise 0 bis 10 und bevorzugtererweise 0 bis 5 der folgenden Substituent, wobei diese entweder einzeln oder in beliebiger Kombination auftreten können: Fluor, Chlor, Brom, Iod, Hydroxyl, Amid, Ester, Säure, Amin, Acetal, Ketal, Thiol, Ether, Phosphat, Sulfat, Sulfoxyd, Peroxyd, Sulfonsäure, Thi- oether, Nitril, Harnstoffe und Carbamat.
• Bevorzugte Substituenten sind: Fluor, Chlor, Brom, Hydroxyl, Amid, Ester, Säure, Amin, Ether, Phosphat, Sulfat, Sulfoxyd, Thioether, Nitril, Harnstoffe, Carbamat.
Besonders bevorzugte Substituenten sind: Chlor, Hydroxyl, Amid, Ester, Säure, Ether, Nitril.
In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass die reaktive Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe, die Thioamine, Thiocarbonyle, Thiohamstoffe, Hydroxylamino, alpha-Isothiocyanatoketone, Anthranilsäureamide, Aniline, Aldehyde, Ketone, 1,2-Diketone, Amine, Aminooxyderivate, A- rylhydrazine, Arylamine, Heteroarylamine, ortho-Amino-Benzoesäure, Hydrazine, 2-Cyan- Aldehyde, Imine und Säurehalogenide umfasst.
In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass die erste reaktive Gruppe der zu immobilisierenden Verbindung eine reaktive Gruppe ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die Thioamid, Ani- lin, Thioharnstoff, Thiocarbonyl, Anthranilsäure, Anthranilsäureamid und Hydroxylamino enthält.
In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass die erste reaktive Gruppe der Oberfläche eine reaktive Gruppe ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die Carbonyl, Keto und Aldehyd umfasst.
In einer noch weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Umsetzen eine chemoselektive Reaktion ist.
Schließlich ist in einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Immobilisierung eine gerichtete Immobilisierung ist.
In einer Ausfuhrungsform ist vorgesehen, dass der entstehende heterocyclische Ring sich in seinem Absorptions-/Emmisionsverhalten von den Edukten unterscheidet.
In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass die zu immobilisierende Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe, die Nukleinsäuren, Gene, chromosomale Nukleinsäuren, cDNA, Oligonukleotide, Polynukleotide, Primer, Sonden, PNA, Peptide, Polypeptide, Proteindomänen, Proteine, Zucker, Polyzucker, Lipide, Polylipide, Naturstoffe und niedermolekulare Verbindungen umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Oberfläche eine planare Oberfläche ist.
In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass es sich bei der planaren Oberfläche um einen Chip handelt.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Oberfläche ein Material umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die Silikate, Keramik, Glas, Metalle, organische Trägermaterialien, Cellulose, Nitrocellulose, PTFE-Membranen, Polypropylen, Gold, Titandioxid und Siliziumoxid umfasst. In einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass die planare Oberfläche eine nicht-poröse Oberfläche ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Umsetzung der zu immobilisierenden Verbindung mit der Oberfläche unter Mirkowellenbestrahlung erfolgt.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung einer Anordnung umfassend mindestens zwei verschiedene Verbindungen an mindestens zwei verschiedenen Stellen einer planaren Oberfläche, wobei die erste Verbindung an einer ersten Stelle der planaren Oberfläche und die zweite Verbindnung an einer zweiten Stelle der planaren Oberfläche nach einem der erfindungsgemäßen Verfahren immobilisiert wird.
In einem noch weiteren Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch eine planare Oberfläche herstellbar nach einem der erfindungsgemäßen Verfahren.
Schließlich wird die Aufgabe in einem weiteren Aspekt durch eine planare Oberfläche umfassend eine daran kovalent immobilisierte Verbindung, wobei zwischen der immobilisierten Verbindung und der Oberfläche ein heterocyclisches Ringsystem angeordnet ist, das erst durch den Immobilisierungsvorgang ausgebildet wird.
In einer Ausführungsform der planaren Oberfläche ist vorgesehen, dass das heterocyclische Ringsystem aus 3-12 Atome besteht, wobei 1-7 Atome entweder Stickstoff, Schwefel oder Sauerstoff sind.
In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass die heterocyclischen Ringsysteme ausgewählt sind aus der Gruppe, die Thiazole, Aminothiazole, Imidazole, Benzimidazole, Indole, Tetrahydroisoquinoline, Tetrahydro-ß-carboline, Dihydroquinazolin, Oxidationsprodukte aus ortho-Amino-Benzoesäurederive und Pyrazole umfassen.
In einer noch weiteren Ausführungsform ist vorgesehen das heterocyclische Ringsystem eines der folgenden Strukturelemente 1, 2, 3, 4, oder 5 umfasst:
Figure imgf000014_0001
wobei die Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt sind und worin
X O, S oder NH, bevorzugterweise NH ist;
A ein fusioniertes Ringsystem aus 4 bis 8 Atomen ist, bevorzugterweise Aryl ist;
Y S oder O, bevorzugterweise O ist;
1 "
R -R Alkyl, Alkenyl, Alkmyl, Cycloalkyl, Aryl, Heteroatome, Heterocyclen oder Biomolekül;
R4-R9 Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Aryl, Heteroatome, Heterocyclen, Biomolekül oder H, D,T ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass das heterocycylische Ringsystem das Strukturelement 2 oder 3 umfasst. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass das heterocycylische Ringsystem das Strukturelement 4 oder 5 umfasst.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Aufgabe gelöst durch eine durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung einer Anordnung herstellbaren Anordnung.
In einem noch weiteren Aspekt der Erfindung wird die Aufgabe durch eine Anordnung gelöst, die eine erfindungsgemäße planare Oberfläche umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Anordnung um eine durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung einer Anordnung herstellbaren Anordnung.
In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch eine Verwendung einer erfindungsgemäßen Anordnung oder einer erfindungsgemäßen planaren Oberfläche in einem Verfahren zur Bestimmung der Substratspezifität einer enzymatischen Aktivität umfassend die folgenden Schritte:
Bereitstellen eines Satzes von Aminosäuresequenzen auf der planaren Oberfläche eines Trägermaterials, wobei die Aminosäuresequenzen gerichtet immobilisiert sind,
Kontaktieren und/oder Inkubieren einer enzymatischen Aktivität mit der mit dem Satz von Aminosäuresequenzen, und
Nachweis einer Reaktion zwischen einer der immobilisierten Aminosäuresequenzen und der enzymatischen Aktivität,
wobei
die planare Oberfläche eine erfindungsgemäße planare Oberfläche oder eine planare O- berfläche einer erfindungsgemäßen Anordnung ist, und
bei der Umsetzung der enzymatischen Aktivität mit dem Satz von Aminosäuren eine Änderung des Molekulargewichts mindestens einer der Aminosäuresequenzen erfolgt.
In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Änderung des Molekulargewichts durch Ausbildung oder Spaltung einer kovalenten Bindung an einer der Aminosäuresequenzen erfolgt, bevorzugterweise an derjenigen Aminosäuresequenz, die mit der enzymatischen Aktivität reagiert. Dabei ist besonders bevorzugt, wenn der Nachweis der Reaktion an der oder unter Verwendung der auf der Oberfläche des Trägermaterials immobilisierten Aminosäuresequenz erfolgt.
In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Nachweis der Reaktion durch Detektion der Änderung des Molekulargewichts erfolgt.
In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis durch ein Nachweisverfahren erfolgt, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die Autoradiographie, Plasmonresonanzspektroskopie und Fluoreszenzspektroskopie umfasst. In einer noch weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass die enzymatische Aktivität ausgewählt ist aus der Gruppe, die Kinasen, Sulfotransferasen, Glycosyltransferasen, Acetyltransfera- sen, Farnesyltransferasen Palmityltransferasen, Phosphatasen, Sulfatasen, Esterasen, Lipasen, Acretylasen und Proteasen umfasst.
Unter Naturstoffen sollen, soweit hierin keine gegenteiligen Angaben gemacht werden insbesondere eine aus tierischen oder pflanzlichen Organismen isolierbare Verbindung, bzw. das vollsynthetisch erhaltende Analoga mit einem Molekulargewicht unter 1000 kDa verstanden werden.
Der vorliegenden Erfindung liegt die überraschende Erkenntnis zugrunde, dass mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Immobilisierung von Verbindungen, insbesondere von Aminosäuresequenzen, erfolgen kann und die solchermaßen immobilisierten Aminosäuresequenzen infolge des bei der Umsetzung der zu immobilisierenden Verbindung und der Oberfläche entstehenden heterocyclischen Ringsystems besonders stabil ist hinsichtlich der Auflösung der Immobilisierung (Säure- und Basenstabilität der Immobilisierung). Weiterhin haben die Erfinder überraschend festgestellt, dass unter Verwendung des erfindungsgemäßen Immobilisierungsverfahrens die Immobilisierungseffizienz, die sich bei Kenntnis der Konzentration der verwendeten Ausgangskonzentrationen aus der Beladungs- oder Immobilisierungsdichte berechnen lässt, kontrolliert werden kann. Die Immobilisierungsdichte wiederum ist Voraussetzung für die Durchführung quantitativer Untersuchungen, wie eingangs geschildert.
Ohne im folgenden darauf festgelegt sein zu wollen, scheint die Bestimmung der Immobilsie- rungsdichte im wesentlichen darauf zu beruhen, dass sich bei der Immobilisierung zwischen der zu immobilisierenden Verbindung und der Oberfläche, an die die Verbindung immobilisiert werden soll, ein heterocyclisches Ringsystem ausbildet. Infolge der Absorptionseigenschaften des neugebildeten heterocyclischen Ringsystems kann direkt auf die an einem Ort der Oberfläche immobilisierte Menge der Verbindung gefolgert werden. Es ist im Rahmen der Kenntnisse des Fachmanns auf dem Gebiet, dass die reaktive Gruppe der zu immobilisierenden Verbindung und die reaktive Gruppe der Oberfläche, und gegebenenfalls eine weitere hinzutretende Gruppe, die von einem dritten Reaktionspartner oder einer zweiten reaktiven Gruppe der zu immobilisierenden Verbindung oder einer zweiten reaktiven Gruppe der Oberfläche stammen kann, (wobei die Gesamtheit der vorstehend genannten reaktiven Gruppen oder Teilen davon) zur Ausbildung des heterocyclischen Ringsystems führt) so derivatisiert ist, das das sich in Folge der Immobili- sierung ausbildende heterocyclische Ringsystem einen Chromophor enthält bzw. darstellt, der einen spezifischen Nachweis erlaubt. Der Nachweis erfolgt typischerweise mittels UV-Vis-, Fluoreszenz- oder Infrarot-Spektroskopie
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Immobilisierungsverfahrens handelt es sich um eine gerichtete Immobilisierung. Bei der gerichteten Immobilisierung soll sichergestellt werden, dass unter den jeweiligen Reaktionsbedingungen im wesentlichen nur eine spezielle Verknüpfung zwischen der zu immobilisierenden Verbindung, bei der es sich bevorzugterweise um eine Aminosäuresequenz handelt, und der Oberfläche hergestellt wird. Im Falle der Immobilisierung von Aminosäuresequenzen hängt die Auswahl der reaktiven Gruppe auf Seiten der Aminosäuresequenzen im wesentlichen von der Einzelsequenz ab.
Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass der Immobilisierung von mehreren verschiedenen Aminosäuresequenzen eine allen Aminosäuresequenzen einheitliche terminale Struktur vorgesehen ist und diese terminale Struktur für die spezifische Reaktion mit der Oberfläche, insbesondere einer aktivierten Oberfläche, zur Verfügung gestellt und bei der Immobilisierung verwendet wird. Typischerweise werden bei den chemoselektiven Reaktionen in der Aminosäuresequenz enthaltene Amino- bzw. Carboxylgruppen nicht beeinträchtigt. Beispiele für geeignete Reaktionen sind die Bildung von Amidbindungen aus Thioestern und 1,2-Aminothiolen (Fig.lE), die Bildung von Thioamidbindungen aus Dithioestern und 1,2-Aminothiolen, die Bildung von Oximen aus Amino-oxy- Verbindungen und Aldehyden (Fig.lA, R4=H), die Bildung von Oximen aus Amino-oxy- Verbindungen und Ketonen (Fig.lA, R4 nicht H), die Bildung von Hydrazonen aus Hydrazinen und Aldehyden (Fig. IC, R4=H), die Bildung von Hydrazonen aus Hydraziden und Ketonen, (Fig. IC, R4 nicht H), die Bildung von Thiosemicarbazonen aus Thio- semicarbaziden und Aldehyden (Fig.lB, R4=H), die Bildung von Thiosemicarbazonen aus Thio- semicarbaziden und Ketonen (Fig.lB, R4 nicht H), die Bildung von Thioestern aus Thiocarboxy- laten und alpha-Halocarbonylen (Fig. 1D) und Succinimiden aus Mercaptanen und Maleinimiden (Fig. 1F).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind die folgenden heterocyclischen Ringsysteme und die sie aufbauenden reaktiven Gruppen besonders bevorzugt. Die reaktiven Gruppen sind erste und zweite reaktive Gruppen der beiden Reaktionspartner. Grundsätzlich ist es möglich, dass eine jede der hierin beschriebenen ersten oder zweiten reaktiven Gruppe diejenige der zu immo- bilisierenden Verbindung oder diejenige der Oberfläche ist. Die Auswahl, welche reaktive Gruppe an der zu immobilisierenden Verbindung vorliegt und welche an der Oberfläche vorliegt, hängt von der Art der zu immobilisierenden Verbindung bzw. der für die Immobilisierung zur Verfügung stehenden Oberfläche ab. Entscheiden bei der Auswahl der entsprechenden Gruppen ist die Fähigkeit der Ausbildung eines heterocyclischen Ringsystems. Die nachfolgenden heterocyclischen Ringsysteme sind besonders bevorzugt:
Imidazole aus 1,2-Diketonen und Aminen, Benzimidazole aus Phenylendiaminderivaten und Aldehyden, Indole aus Arylhydrazinen und Aldehyden, Tetrahydroisoquinoline aus Arylaminen und Aldehyden, Tetrahydro-ß-carboline und entsprechende Tetrahydroimidazopyridine aus He- teroarylaminen und Aldehyden, Dihydroquinazoline sowie deren Oxidationsprodukte aus ortho- Amino-Benzoesäurederivaten und Aldehyden, Pyrazole aus Hydrazinen und 2-Cyan-Aldeyden, Cycloaddition zweier Olefine, Cycloaddition von Olefinen und Iminen, Cycloaddition von Imi- nen und Säurehalogeniden.
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Immobilisierung ist vorgesehen, dass in der zu immobilisierenden oder zu konjugierenden Verbindung eine Anilinfunktion enthalten, die so angeordnet ist, das sie einen Heterocyclus mit einem entsprechenden Reaktionspartner (Oberfläche oder anderes Biomolekül) bilden kann.
In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass in der zu immobilisierenden oder zu konjugierenden Verbindung eine Thioamid-Funktion enthalten ist, die so angeordnet ist, daß sie einen Heterocyclus mit einem entsprechenden Reaktionspartner (Oberfläche oder anderes Biomolekül) bilden kann.
In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass in der zu immobilisierenden oder zu konjugierenden Verbindung eine Thioharnstofffunktion enthalten ist, die so angeordnet ist, daß sie einen Heterocyclus mit einem entsprechenden Reaktionspartner (Oberfläche oder anderes Biomolekül) bilden kann.
Unter gerichteter Immobilisierung soll hierin unter Ergänzung dessen, was bereits eingangs hierzu ausgeführt wurde, insbesondere verstanden werden, dass im Falle der Immobilisierung einer Aminosäuresequenz jede Aminosäuresequenz über eine definierte reaktive Gruppe oder Ansammlung reaktiver Gruppen an die Oberfläche gebunden wird. Infolge dieser Bindungsspezifi- tät wird erreicht, dass sich im Rahmen der üblichen Entropien die einzelnen Aminosäuresequenzen in einem energetisch bevorzugten Zustand befinden werden, so dass die solchermaßen immobilisierten Aminosäuresequenzen in weitgehend ähnlichen Sekundär- und Tertiärstrukturen vorliegen.
Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die Aminosäuresequenzen in situ auf der Oberfläche der Anordnung synthetisiert werden, wobei hier alle möglichen Formen denkbar sind, d. h. sequentielles Anfügen der die Aminosäuresequenz aufbauenden einzelnen Aminosäuren, ebenso wie die Verwendung von Block-Synthesetechniken, bei denen Gruppierungen von Aminosäuren zusammengefügt werden und dann die einzelnen Blöcke sequentiell aneinandergereiht werden und die Blöcke oder Aneinanderreihungen davon sodann immobilisiert werden bzw. an bereits immobilisierte Aminosäuresequenzen angefügt werden. Entscheiden ist dabei in einem jeden Fall die Ausbildung eines heterocyclischen Ringsystems infolge der Immobilisierung.
Die Tatsache, dass verschiedene Aspekte des hierin offenbarten Immobilisierungsverfahrens anhand der Immobilisierung von Aminosäuresequenzen erläutert wurden, beschränkt den Offenbarungsgehalt nicht, da die dabei aufgezeigten Richtlinien und Vorgehensweisen sinngemäß auch bei allen anderen zu immobilisierenden oder immobilisierbaren Verbindungen gelten bzw. Anwendung finden.
Das erfindungsgemäße Immobilisierungsverfahren kann auch als Konjugationsverfahren bezeichnet bzw. ausgeführt werden. Unter Konjugation soll dabei insbesondere verstanden werden die gerichtete Verknüpfung von verschiedenen Biomolekülen, wobei sich diese Moleküle in ihrer Größe hinreichend unterscheiden, sodass eines dieser Biomoleküle als Oberfläche betrachtet werden kann und das (die) andere(n) Biomolekül(e) die auf der Oberfläche des ersten Biomoleküls zu immobilisierende(n) Verbindung(en) darstellt/darstellen. Solche Konjugationsverfahren können zur regioselektiven Markierung von Biomolekülen mit meist kleinen Verbindungen, die in nachgeschalteten Experimenten als Sonden geeignet sind, dienen. Beispiele für solche Sonden sind Fluoreszenzmarkierungen, Elektronen-Spin-Resonanz-Markierungen, radioaktive Markierungen und Biotinylierungen. Weiterhin ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die reaktive Gruppe der Oberfläche des Trägermaterials auf einer wiederum selbst immobilisiert vorliegenden Verbindung angeordnet oder enthalten ist. Diese Verbindung wird hierin auch als primär immobilisierte Verbindung bezeichnet. Bevorzugterweise ist diese primär immobilisierte Verbindung ebenfalls unter Ausbildung eines heterocyclischen Ringsystems an die Oberfläche eines Trägermaterials gebunden.
Die Erfindung wird im folgenden anhand der Beispiele und Figuren erläutert, aus denen sich weitere Merkmale, Ausführungsformen und Vorteile ergeben. Dabei zeigt
Fig. 1 eine Übersicht verschiedener chemo selektiver Reaktionen;
Fig. 2 eine Übersicht verschiedener erfindungsgemäßer Immobilisierungsreaktionen, die zur Ausbildung eines Thiazol-Ringes führen;
Fig. 3 eine Darstellung verschiedener Kombinationen von Thioamiden als erster reaktiver Gruppe der zu immobilisierenden Verbindung und erster reaktiven Gruppe der Oberfläche, die zur Ausbildung von heterocyclischen Ringsystemen führen;
Fig. 4 die Synthese und Immobilisierung eines ortho-Amino-Benzoyl-Peptids an einer Aldehyd-funktionalisierten Oberfläche unter Ausbildung eines substituierten 2, 3,4a,8a-tetrahydro-lH-quinazolin-4-ons;
Fig. 5 Immobilisierung eines Biomoleküls auf einer Oberfläche, die durch eine ebenfalls unter Bildung eines heterocyclischen Ringsystems verlaufende primäre Immobilisierungsreaktion modifiziert wurde;
Fig. 6 das Resultat der Inkubation einer modifizierten Glasoberfläche mit einer
Kinase; und
Fig. 7 das Resultat der Inkubation einer modifizierten Glasoberfläche mit einer
Kinase.
Im folgenden werden die einzelnen Figuren näher erläutert.
Fig. 1 zeigt eine Übersicht verschiedener chemoselektiver Reaktionen nach dem Stand der Technik: A) Aldehyde (R4=Η) oder Ketone (R4 nicht H) und Amino-oxy- Verbindungen reagieren zu Oximen, B) Aldehyde (R4=H) oder Ketone (R4 nicht H) und Thiosemicarbazide reagieren zu Thiosemicarbazonen, C) Aldehyde (R4=H) oder Ketone (R4 nicht H) und Hydrazide reagieren zu Hydrazonen D) Thiocarboxylate und -Halocarbonyle reagieren zu Thioestern, E) Thioester und ß-Aminothiole reagieren zu ß-Mercaptoamiden, F) Mercaptane und Maleinimide reagieren zu Succinimiden
Fig. 2 zeigt eine Übersicht verschiedener erfindungsgemäßer Immobilisierungsreaktionen, die zur Ausbildung eines Thiazol-Ringes führen. In Fig. 2A wird ausgegangen von einem alpha- Keton (IX), das an der Festphase zu einem alpha-Bromketon (IV) bromiert wird. Ein entweder geschütztes oder ungeschütztes Peptid bzw. Biomolekül, das entweder C-terminal oder N- terminal oder aber an einer definierten Position innerhalb des Biomoleküls eine Thioamidfünkti- on (Va) trägt, unter Ausbildung eines Thiazols (VI) immobilisert. In Fig. 2B wird die Lnmobil- sierung eines Thioharnstoff-Derivates (Vb) eines entweder geschützt oder ungeschützt vorliegenden Peptids bzw. Biomoleküls mit einem an der Festphase immobilisiert vorliegenden alpha- Bromketon (IV) unter Ausbildung eines Aminothiazols (VIII) dargestellt. In Fig. 2C wird schließlich, ausgehend von einem alpha-Bromketon (IV), die Immobilisierung eines Amino-oxy- Peptids bzw. Biomoleküls beschrieben. Diese Immobilisierung stellt ein Beispiel für die chemoselektive Immobilisierung dar, bei der durch Anlegen spezifischer Reaktionsbedingungen, hier pH 5, eine chemoselektive Reaktion erst ermöglicht wird. Das alpha-Bromketon wird wie in der in Beispiel 9 beschriebenen ersten Alternative zu einem alpha-Isothiocyanatoketon (X) umgesetzt und dieses mit dem Amino-oxypeptid bzw. Biomolekül (XI) unter intermediärer Ausbildung eines Thioharnstoffs zu einem Hydroxylaminothiazol (XII) umgesetzt. Die Reste R4 und R5 stellen dabei Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Cycloalkyl- oder Aryl-Reste, bzw. Heterocyclen oder Oberflächen oder H, D, bzw. T dar, wobei Alkyl für verzweigte und unverzweigte Cι-2o-Alkyl, C3-20-Cycloalkyl, bevorzugt für verzweigte und unverzweigte Cι-ι2-Alkyl, C3-i2-Cycloalkyl und besonders bevorzugt für verzweigte und unverzweigte Cι-6-Alkyl, C3-6-Cycloalkyl-Reste steht. Alkenyl steht für verzweigte und unverzweigte C2-20-Alkenyl, verzweigte und unverzweigte Ci- 2o-Alkyl-O-C2-2θ-alkenyl, C1-2o(-O/S-C2-2θ)2-2oalkenyl, Aryl-C2-2o-alkenyl, verzweigte und unverzweigte Heterocyclyl- C2.2o-alkenyl, C3-20-Cycloalkenyl, bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C2-i2-Alkenyl, verzweigte und unverzweigte Cι-ι2 (-O/S-C2-!2)2-]2alkenyl, besonders bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C2-6- Alkenyl, verzweigte und unverzweigte Cι-6 (-O/S- C2-8)2-8alkenyl-Reste; Alkinyl steht für verzweigte und unverzweigte C2-2Q-Alkinyl, verzweigte und unverzweigte Cι_2o (-O/S-C2-20) -2oalkinyl, bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C2- 12-Alkinyl, verzweigte und unverzweigte Cι-12 (-O/S-C2-ι2)2-i2alkinyl, besonders bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C2-6- Alkinyl, verzweigte und unverzweigte Cι-6 (-O/S-C2-8)2- salkinyl-Reste; Cycloalkyl steht für überbrückte und nicht-überbrückte C3-4o-Cycloalkyl, bevorzugt für überbrückte und nicht-überbrückte C3-26-Cycloalkyl, besonders bevorzugt für überbrückte und nicht-überbrückte C3-ι5-CycIoalkyl-Reste, Aryl steht für substituierte und unsubstituierte mono-oder multi-verknüpfte Phenyl-, Pentalenyl-, Azulenyl-, Anthracenyl-, Indacenyl-, Ace- naphtyl, Fluorenyl, Phenalenyl, Phenanthrenyl, bevorzugtfür substituierte und unsubstituierte mono-oder multi-verknüpfte Phenyl-, Pentalenyl-, Azulenyl-, Anthracenyl-, Indenyl-, Indacenyl- , Acenaphtyl-, Fluorenyl, besonders bevorzugt für substituierte und unsubstituierte mono-oder multi-verknüpfte Phenyl-, Pentalenyl-, Anthracenyl-Reste, sowie deren teilhydrierte Derivate. Heterocyclen können sein ungesättigte und gesättigte 3-15-gliedrige mono-bi und tricyclische Ringe mit 1-7 Heteroatomen, bevorzugt 3-10-gliedrige mono-bi und tricyclische Ringe mit 1-5 Heteroatomen und besonders bevorzugt: 5,6 und 10-gliedrige mono-bi und tricyclische Ringe mit 1-3 Heteroatomen.
Zusätzlich können am Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Aryl, Heteroatome, Heterocyclen, Biomolekül oder Naturstoff 0 bis 30 (bervorzugt 0 bis 10, besonders bevorzugt 0 bis 5) der folgende Substituenten einzeln oder in Kombination untereinander auftreten; Fluor, Chlor, Brom, Iod, Hydroxyl, Amid, Ester, Säure, Amin, Acetal, Ketal, Thiol, Ether, Phosphat, Sulfat, Sulfoxyd, Peroxyd, Sulfonsäure, Thioether, Nitril, Harnstoffe, Carbamat, wobei folgende bevorzugt sind: Fluor, Chlor, Brom, Hydroxyl, Amid, Ester, Säure, Amin, Ether, Phosphat, Sulfat, Sulfoxyd, Thioether, Nitril, Harnstoffe, Carbamat, und besonders bevorzugt: Chlor, Hydroxyl, Amid, Ester, Säure, Ether, Nitril.
Fig. 3 zeigt eine Darstellung verschiedener Kombinationen von Thioamiden als erster reaktiver Gruppe in der zu immobilisierenden Verbindung und verschiedener erster reaktiver Gruppen der Oberfläche, die zur Immobilisierung von Biomolekülen unter Ausbildung von heterocyclischen Ringsystemen führen. Dabei wird beispielhaft als die zu immobilisierende Verbindung ein Biomolekül, insbesondere ein Peptid, verwendet. Gemäß Fig. 3A kommt es unter Verwendung einer Thioamid-Funktion des Peptids (XVII) zusammen mit einer 1 ,2-Aminothiol-Funktion der Oberfläche (X=S, XVIIIa) zur Ausbildung eines Thiazolins (XlXa) bzw. zusammen mit einer 1,2- Aminoalkohol-Funktion der Oberfläche (X=O, XVIIIb) zur Ausbildung eines Oxazolins (XlXb) bzw. zusammen mit einer 1,2-Diamino-Funktion der Oberfläche (X=NH, XVIIIc) zur Ausbil- düng eines Imidazolins (XIXc). In Fig. 3B wird ersichtlich, das die Umsetzung unter Verwendung einer Thioamid-Funktion des Peptids (XX) zusammen mit einer ortho-Phenylendiamin- Funktion (XXI) auf der Oberfläche zur Ausbildung eines Benzimidazols (XXII) führt. In Fig. 3C wird deutlich, das unter Verwendung einer Thioamid-Funktion des Peptids (XXIII) zusammen mit einer alpha-Halo-Keto-Funktion (XXIV, Y=C1, Br, J; bevorzugt Br, Cl; besonders bevorzugt Br) auf der Oberfläche Biomoleküle unter Bildung von Thiazolen (XXV) immobilisiert werden können. Schließlich wird in Fig. 3D dargestellt, das unter Verwendung einer Thioamid-Funktion des Peptids (XXVI) zusammen mit einer Hydrazid-Funktion (XXVII) auf der Oberfläche Oxadi- azole gebildet werden können. Die Reste R4-R9 stellen dabei Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Cycloalkyl- oder Aryl-Reste, bzw. Heterocyclen oder Oberflächen oder H, D, bzw. T dar, wobei Alkyl für verzweigte und unverzweigte Cι.20- Alkyl, C3-2o-Cycloalkyl, bevorzugt für verzweigte und unverzweigte Cι-j -Alkyl, C3-j2-Cycloalkyl und besonders bevorzugt für verzweigte und unverzweigte Cι-6-Alkyl, C3-6-Cycloalkyl-Reste steht. Alkenyl steht für verzweigte und unverzweigte C2-20-Alkenyl, verzweigte und unverzweigte Cι.2o-Alkyl-O-C2-2θ-alkenyl, Cι-2o(-O/S-C2-2θ)2- 20alkenyl, Aryl-C2-2o-alkenyl, verzweigte und unverzweigte Heterocyclyl- C2-20-alkenyl, C3-20- Cycloalkenyϊ, bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C2-i2-Alkenyl, verzweigte und unverzweigte Cι-12 (-O/S-C2-12)2-12alkenyl, besonders bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C2.6- Alkenyl, verzweigte und unverzweigte Cι-6 (-O/S-C2-8)2-8alkenyl-Reste; Alkinyl steht für verzweigte und unverzweigte C2-20- Alkinyl, verzweigte und unverzweigte C1-20 (-O/S-C2-2o)2- 20alkinyl, bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C2-i2-Alkinyl, verzweigte und unverzweigte C1.12 (-O/S-C2-i2)2-i2alkinyl, besonders bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C2-6- Alkinyl, verzweigte und unverzweigte Cι-6 (-O/S-C2-8)2-8alkinyl-Reste; Cycloalkyl steht für überbrückte und nicht-überbrückte C3.4o-Cycloalkyl, bevorzugt für überbrückte und nicht- überbrückte C3.26-Cycloalkyl, besonders bevorzugt für überbrückte und nicht-überbrückte CM 5- Cycloalkyl-Reste, Aryl steht für substituierte und unsubstituierte mono-oder multi-verknüpfte Phenyl-, Pentalenyl-, Azulenyl-, Anthracenyl-, Indacenyl-, Acenaphtyl, Fluorenyl, Phenalenyl, Phenanthrenyl, bevorzugtfür substituierte und unsubstituierte mono-oder multi-verknüpfte Phenyl-, Pentalenyl-, Azulenyl-, Anthracenyl-, Indenyl-, Indacenyl-, Acenaphtyl-, Fluorenyl, besonders bevorzugt für substituierte und unsubstituierte mono-oder multi-verknüpfte Phenyl-, Pentalenyl-, Anthracenyl-Reste, sowie deren teilhydrierte Derivate. Heterocyclen können sein ungesättigte und gesättigte 3-15-gliedrige mono-bi und tricyclische Ringe mit 1-7 Heteroatomen, bevorzugt 3-10-gliedrige mono-bi und tricyclische Ringe mit 1-5 Heteroatomen und besonders bevorzugt: 5,6 und 10-gliedrige mono-bi und tricyclische Ringe mit 1-3 Heteroatomen. Zusätzlich können am Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Aryl, Heteroatome, Heterocyclen, Biomolekül oder Naturstoff 0 bis 30 (bervorzugt 0 bis 10, besonders bevorzugt 0 bis 5) der folgende Substituenten einzeln oder in Kombination untereinander auftreten; Fluor, Chlor, Brom, Iod, Hydroxyl, Amid, Ester, Säure, Amin, Acetal, Ketal, Thiol, Ether, Phosphat, Sulfat, Sulfoxyd, Peroxyd, Sulfonsäure, Thioether, Nitril, Harnstoffe, Carbamat, wobei folgende bevorzugt sind: Fluor, Chlor, Brom, Hydroxyl, Amid, Ester, Säure, Amin, Ether, Phosphat, Sulfat, Sulfoxyd, Thioether, Nitril, Harnstoffe, Carbamat, und besonders bevorzugt: Chlor, Hydroxyl, Amid, Ester, Säure, Ether, Nitril.
Fig. 4 zeigt die Immobilisierung eines Biomoleküls unter Ausbildung eines substituierten 2,3,4a,8a-tetrahydro-lH-quinazolin-4-ons (XIII). Ausgehend von einer amino-modifizierten Festphase erfolgt die Addition eines Bausteins unter Ausbildung einer kovalenten Bindung. Nach der schrittweisen Synthese des Biomoleküls an der festen Phase wird dieses durch die Zugabe von Isatosäure (XIV) unter Ausbildung eines ortho-Amino-Benzoyl-Biomoleküls (XV), das nachfolgend von der Festphase mittels Säureeinwirkung als ortho-Amino-Benzoyl-Biomolekül- Amid (XVI) abgespalten wird. Das erhaltene ortho-Amino-Benzoyl-Biomolekül-Amid (XVI) wird mit einem Glasträger in Kontakt gebracht, dessen Oberfläche eine Aldehyd-Funktion aufweist, und es kommt zur Ausbildung eines eines substituierten 2,3,4a,8a-tetrahydro-lH- quinazolin-4-ons (XIII).
Fig. 5 zeigt eine spezielle Ausführung der Immobilisierung eines Biomoleküls, bei der die Oberfläche durch eine ebenfalls unter Ausbildung eines heterocyclische Ringsystems verlaufenden Reaktion modifiziert wird.Ausgehend von einer mit einem Thioamid (Z1=CR4R5, XXIXa) bzw. einem Thioharnstoff (ZI=NR4, XXIXb) modifizierten Oberfläche erhält man nach Behandlung mit l,4-Dibrom-2,3-diketobutan (XXX) immobilisierte bromacetylierte Thiazole (Z1=CR R5, XXXIa) bzw. bromacetylierte Aminothiazole (Z1=NR4, XXXIb). Diese Funktionen können für eine Immobilisierungsreaktion eines mit einer Thioamid-Funktion (Z =CR R5, Va) bzw. Thio- harnstoff-Funktion (Z2=NR4, Vb) versehenen Biomoleküls verwendet werden. Je nach Kombination des derivatisierten Biomoleküls und der in einer primären hnmobilisierungsreaktion modifizierten Oberfläche erhält man XXXIIa (Z!=NR4, Z2=NR4), XXXIIb (Z'=CR4R5, Z2=NR4), XXXIIc (Z!=CR4R5, Z2=CR4R5) bzw. XXXIId (Z]=NR4, Z2=CR4R5). Die Reste R4 und R5 stellen dabei Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Cycloalkyl- oder Aryl-Reste, bzw. Heterocyclen oder Ober- flächen oder H, D, bzw. T dar, wobei Alkyl für verzweigte und unverzweigte Cj.20- Alkyl, C -2o- Cycloalkyl, bevorzugt für verzweigte und unverzweigte CM 2- Alkyl, C3-i2-Cycloalkyl und besonders bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C 1-6- Alkyl, C3-6-Cycloalkyl-Reste steht. Alkenyl steht für verzweigte und unverzweigte C2-20- Alkenyl, verzweigte und unverzweigte Cι-20- Alkyl-O-C2-20-alkenyl, Cι-2o(-O/S-C2-20)2-2oalkenyl, Aryl-C2.2Q-alkenyl, verzweigte und unverzweigte Heterocyclyl- C2-20-alkenyl, C3-2o-Cycloalkenyl, bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C2-i2-Alkenyl, verzweigte und unverzweigte CM2 (-O/S-C2-i2)2-i2alkenyl, besonders bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C2-6-Alkenyl, verzweigte und unverzweigte Cι-6 (-O/S- C2-8)2-8alkenyl-Reste; Alkinyl steht für verzweigte und unverzweigte C2-20-Alkinyl, verzweigte und unverzweigte C]-2o (-O/S-C2-2ö)2-2oalkinyl, bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C2- 12-Alkinyl, verzweigte und unverzweigte Cι-12 (-O/S-C2-i2)2-i2alkinyl, besonders bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C2-0- Alkinyl, verzweigte und unverzweigte C1-6 (-O/S-C2-8)2- 8alkinyl-Reste; Cycloalkyl steht für überbrückte und nicht-überbrückte C3.4o-Cycloalkyl, bevorzugt für überbrückte und nicht-überbrückte C3-26-Cycloalkyl, besonders bevorzugt für überbrückte und nicht-überbrückte C3-i5-Cycloalkyl-Reste, Aryl steht für substituierte und unsubstituierte mono-oder multi-verknüpfte Phenyl-, Pentalenyl-, Azulenyl-, Anthracenyl-, Indacenyl-, Acenaphtyl, Fluorenyl, Phenalenyl, Phenanthrenyl, bevorzugtfür substituierte und unsubstituierte mono-oder multi-verknüpfte Phenyl-, Pentalenyl-, Azulenyl-, Anthracenyl-, Indenyl-, Indacenyl- , Acenaphtyl-, Fluorenyl, besonders bevorzugt für substituierte und unsubstituierte mono-oder multi-verknüpfte Phenyl-, Pentalenyl-, Anthracenyl-Reste, sowie deren teilhydrierte Derivate. Heterocyclen können sein ungesättigte und gesättigte 3-15-gliedrige mono-bi und tricyclische Ringe mit 1-7 Heteroatomen, bevorzugt 3-10-gliedrige mono-bi und tricyclische Ringe mit 1-5 Heteroatomen und besonders bevorzugt: 5,6 und 10-gliedrige mono-, bi- und tricyclische Ringe mit 1-3 Heteroatomen.
Zusätzlich können am Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Aryl, Heteroatome, Heterocyclen, Biomolekül oder Naturstoff 0 bis 30 (bervorzugt 0 bis 10, besonders bevorzugt 0 bis 5) der folgende Substituenten einzeln oder in Kombination untereinander auftreten; Fluor, Chlor, Brom, Iod, Hydroxyl, Amid, Ester, Säure, Amin, Acetal, Ketal, Thiol, Ether, Phosphat, Sulfat, Sulfoxyd, Peroxyd, Sulfonsäure, Thioether, Nitril, Harnstoffe, Carbamat, wobei folgende bevorzugt sind: Fluor, Chlor, Brom, Hydroxyl, Amid, Ester, Säure, Amin, Ether, Phosphat, Sulfat, Sulfoxyd, Thioether, Nitril, Harnstoffe, Carbamat, und besonders bevorzugt: Chlor, Hydroxyl, Amid, Ester, Säure, Ether, Nitril. Fig. 6 Eine mit Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly-thioamid modifizierte Glasoberfläche (vgl. Beispiel 5 und Fig. 5, XXXIIc) (Aminosäuresequenz wurde in 200 mM Natrium-Phosphatpuffer pH 5.5 gelöst und bei RT wurde jeweils 1 nL dieser Lösung in einer Anordnung von 70 Reihen und 168 Spalten (gesamt 11760 Spots) auf die bromketo-funktionalisierten Glasoberflächen (Fig. 5, XXXIa) mittels eines NanoPlotters der Firma Gesim aufgebracht. Dabei betrug der Spot-zuSpot- Abstand 0.3 mm. Anschließend wurden die so behandelten Glasoberflächen 2 min mit einer Mikrowelle behandelt und dann 3 Stunden bei RT inkubiert (vgl. Beispiel 12)) wurde zunächst mit 10ml lOOμM ATP-Lösung in 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 7.5 für 10 Minuten vorin- kubiert. Anschließend wurde die modifizierte Glas-Oberfläche mit einer zweiten Glasoberfläche abgedeckt und in den entstandenen Zwischenraum Proteinkinase A (lOU/mL) zusammen mit ATP/γ32P-ATP-Mischung (100 μM/mL; lOOμCi/mL) mittels Kapillarkraft eingebracht. Nach 30 minütiger Inkubation bei 25°C wurde die Phosphorylierung der entsprechenden Peptide mittels eines Phosphorimages von FUJIFILM detektiert (vgl. Beispiel 13). Es wird deutlich, das einerseits die Verknüpfung des immobilisierten Kinasesubstrates von der Proteinkinase A toleriert wird und das andererseits die Modifikation der Glasoberflächen gleichmäßig und ohne größere Schwankungen in der Immobilisierungsdichte verläuft. Weiterhin ist klar, das die Auflösung des hier verwendeten Phosphorimages ausreichend ist, um selbst mehr als 11000 Meßpunkte pro Biochip zu analysieren.
Fig. 7 Eine mit dem Peptid thioxoCit-ßAla-Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly-NH2 (Fig. 2B, Vb, R4=H) modifizierte Glasoberfläche (vgl. Beispiel 11 und Fig. 2B, VIII, R4=H) wurde zunächst mit 10ml lOOμM ATP-Lösung in 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 7.5 für 10 Minuten vorin- kubiert. Anschließend wurde die modifizierte Glas-Oberfläche mit einer zweiten Glasoberfläche abgedeckt und in den entstandenen Zwischenraum Proteinkinase A (lOU/mL) zusammen mit ATP/γ32P-ATP-Mischung (100 μM/mL; lOOμCi/mL) mittels Kapillarkraft eingebracht. Nach 30 minütiger Inkubation bei 25°C wurde die Phosphorylierung der entsprechenden Peptide mittels eines Phosphorimages von FUJIFILM detektiert (vgl. Beispiel 14). Es wird deutlich, das einerseits die Verknüpfung des immobilisierten Kinasesubstrates von der Proteinkinase A toleriert wird und das andererseits die Modifikation der Glasoberflächen gleichmäßig und ohne größere Schwankungen in der Immobilisierungsdichte verläuft. Weiterhin ist klar, das die Auflösung des hier verwendeten Phosphorimages ausreichend ist, um mehr als 950 Meßpunkte pro Biochip zu analysieren. Die nachfolgenden Beispiele betreffen die Funktionalisierung von Glas, dessen Oberfläche als Oberfläche für eine Immobilisierung erforderlich ist (Beispiele 1 bis 9), die Immobilisierung von verschiedenen mit einer reaktiven Gruppe versehenen Peptide an eine Oberfläche (Beispiele 10 bis 12) und die Analyse von Kinase vermittelter Peptidmodifikation unter Verwendung der erfindungsgemäß immobilisierten Peptide. Dabei wurden die nachfolgend aufgelisteten Abkürzungen verwendet:
Ala L-Alanin
Arg L-Arginin
ATP Adenosin-5'-triphosphat
Ala Alanin, 3-Aminopropionsäure
Boc tertiär-Butoxycarbonyl cDNA complementary DNA
Cit L-Citrullin
DCM Dichlormethan
DIC N,N-Diisopropylcarbodiimid
DMF N,N-Dimethylformamid
DNA deoxyribonucleic acid
DTT 1,4-dithio-DL-threitol
EGTA Ethylenglycol-bis-(2-aminoethyl)-NNN,N-tetraessigsäure
Fmoc 9-Fluorenylmethoxycarbonyl
Gly Glycin
HBTU O-(Benzotriazol-l-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat
HPLC high-performance liquid chromatography
L Liter
Leu L-Leucin
M molar
MBHA Methylbenzhydrylamin
MBP myelin basic protein
MeOH Methanol mL Milliliter mM millimolar mRNA messenger RNA
Pbf 2,2,4,6,7-Pentamethyl-dihydrobenzofuran-5-sulfonyl
PNA peptide nucleic acid
PTFE Polytetrafluorethylen
RNA ribonucleic acid
RP reversed-phase
RT Raumtemperatur
SDS Natriumlaurylsulfat
Ser L-Serin tBu tertiär-Butyl
TFA Trifluoressigsäure
THF Tetrahydrofuran
Tris 2-Amino-2-hydroxymethyl- 1 ,3-propandiol
Tween20 Polyoxyethylen-Sorbitant-Monolaurat (Wz. der Fa. Atlas Chemie)
Dabei wurden die folgenden Reagenzien und Lösungsmittel benutzt:
Brom, tert.-Butyl-Methyl-Ether, 1,3-Diisopropylcarbodiimid, N,N-Diisopropylethylamin Eisessig, Glycerol, Harnstoff, 40%ige Hydroxylaminlösung, Piperidin, Triethylamin, Dichlormethan, Diethylether, N,N-Dimethylformamid, Ethanol, Methanol, und Tetrahydrofuran stammen von Merck Eurolab (Darmstadt, Deutschland). Oxalylchlorid, Natriumthiocyanat, Trifluoressigsäure, Dimethylsulfoxid, Thioacetamid, Lawessons Reagenz, Ameisensäure, und Thiohamstoff wurden von Fluka (Deisenhofen, Deutschland) bezogen. Adenosin-5'-triphosphat, 2-Amino-2- hydroxymethyl-l,3-propandiol-hydrochlorid, Natriumchlorid, Magnesiumchlorid, 1,4-dithio- DL-threitol, Natriumlaurylsulfat, Polyoxyethylen-Sorbitant-Monolaurat, und Ethylenglycol-bis- (2-aminoethyl)-N,N,N',N'-tetraessigsäure stammen von Sigma (Taufkirchen, Deutschland). Das Rink-Amid-MBHA-Harz, (Benzotriazol-l-yl)-N,N,N',N'- tetramethyluroniumhexafluorophosphat, sowie alle Fmoc-Aminosäure-pentafluorphenylester wurde bei der Firma Novabiochem (Bad Soden, Deutschland) bezogen. Zur SPOT-Synthese wurden Zellulose Membranen "Whatman 50" (Whatman Maidstone, UK) verwendet. Chromatographie und physikalische Daten:
RP-18-HPLC-MS-Analysen wurden durch Chromatographie unter Verwendung eines Hewlett Packard Serie 1100-Systems (Entgaser G1322A, Quaternäre Pumpe G1311A, Automatischer Probengeber G1313A, Thermostatisiertes Säulenfach G 1316A, Variabler UV-Detektor G1314A) und gekoppelter ESI-MS (Finnigan LCQ Ion-Trap-Massenspektrometer) durchgeführt. Die Trennung erfolgte an RP-18-Säulenmaterial (Vydac 218 TP5215, 2.1x150 mm, 5 μm, C18, 300 A mit Vorsäule) bei 30°C und einem Fluß von 0.3 mL/min unter Anwendung eines linearen Gradienten für alle Chromatogramme (5-95% B innerhalb von 25 min, wobei A: 0.05% TFA in Wasser und B: 0.05% TFA in CH3CN). Die UV-Detektion erfolgte bei λ=220 nm.
Präparative HPLC wurde mit einem System der Firma Merck/Hitachi (Quaternäre Pumpe L- 6250, Variabler UV-Detektor L-/400, Interface D-7000, Software: HPLC Systemmanager D- 7000 für NT 4.0) unter Verwendung einer Säule der Firma Merck Eurolab (LiChrospher 100, RP18, 10x250 mm) bei einem Lösungsmittelfluß von 6.0 mL/min durchgeführt. Das verwendete Lösungsmittelsystem setzte sich aus den Komponenten A (H2O/O.I Vol-% TFA) und B (CH3CN/0.1 Vol-% TFA) zusammen.
Geräte zur Herstellung der löslichen Peptide:
Die zur Immobilisierung verwendeten Peptide wurden als C-terminale Peptidamide mit Hilfe eines parallelen Syntheseautomaten "Syro" (MultiSynTech, Witten, Deutschland) nach dem Standard Fmoc-Protokoll an Rink-Amid-MBHA-Harz synthetisiert. Alle erhaltenen Peptide wurden, nach Spaltung vom Harz und Abspaltung aller Schutzgruppen, mittels HPLC-MS analysiert und zeigten die gewünschten Molekülionensignale. Nach anschließender HPLC-Reinigung wurden die Peptide lyophilisiert und bei -20°C gelagert.
Die zur hnobilisierung verwendeten Peptide (13mere Peptide der Proteine MBP, Casein, Histon Hl) wurden nach der Standard-SPOT-Synthesemethode automatisch mit dem Gerät Autospot AMS 222 (Abimed, Langenfeld, Deutschland) unter Anwendung der Steuersoftware Autospot XL Ver. 2.02 durchgeführt. Die Waschschritte erfogten in Edelstahlschalen (Merck Eurolab), die auf einem Wipptisch bewegt wurden. Beispiel 1 : Aldehyd-Funktionalisierung aminopropylsilylierter Glasoberflächen
4-Carboxybenzaldehyd (Fluka, 21873) wurde 0.3 M in DMF gelöst. Die resultierende Mischung wurde durch die Zugabe von einem halben Äquivalent DIC 15 min bei RT aktiviert. Mit Druckluft gereinigte aminopropylsilylierte Glasoberflächen (2.5 x 7.5 cm; Sigma, Silane-Prep™, S4651) wurden mit der so erhaltenen aktivierten Carboxybenzaldehyd-Lösung überschichtet und drei Stunden bei RT inkubiert. Anschließend wurden die so behandelten Glasoberflächen fünfmal mit jeweils 30 mL DMF je 3 Minuten bei RT gewaschen. Nach dreimaligem Waschen je drei Minuten mit jeweils 30 mL DCM bei RT wurden die Glasoberflächen getrocknet und bis zur weiteren Verwendung bei 4°C gelagert.
Beispiel 2: Keton-Funktionalisierung aminopropylsilylierter Glasoberflächen
Lävulinsäure (Fluka, 61380) wurde 0.3 M in DMF gelöst. Die resultierende Mischung wurde durch die Zugabe von einem halben Äquivalent DIC 15 min bei RT aktiviert. Mit Druckluft gereinigte aminopropylsilylierte Glasoberflächen (2.5 x 7.5 cm; Sigma, Silane-Prep™, S4651) wurden mit der so erhaltenen Lävulinsäureanhydrid-Lösung überschichtet und drei Stunden bei RT inkubiert. Anschließend wurden die so behandelten Glasoberflächen fünfmal mit jeweils 30 mL DMF je 3 Minuten bei RT gewaschen. Nach dreimaligem Waschen je drei Minuten mit jeweils 30 mL DCM bei RT wurden die Glasoberflächen getrocknet und bis zur weiteren Verwendung bei 4°C gelagert.
Beispiel 3: Thioamid-Funktionalisierung aminopropylsilylierter Glasoberflächen (Fig. 5, XXIXa)
Bernsteinsäure- ono-thioamid wurde 0.2 M in DMF gelöst. Die resultierende Mischung wurde durch die Zugabe von einem halben Äquivalent DIC 15 min bei RT aktiviert. Mit Druckluft gereinigte aminopropylsilylierte Glasoberflächen (2.5 x 7.5 cm; Sigma, Silane-Prep , S4651) wurden mit der so erhaltenen modifizierten Bernsteinsäureanhydrid-Lösung überschichtet und drei Stunden bei RT inkubiert. Anschließend wurden die so behandelten Glasoberflächen (Fig. 5, XXIXa) fünfmal mit jeweils 30 mL DMF je 3 Minuten bei RT gewaschen. Nach dreimaligem Waschen je drei Minuten mit jeweils 30 mL DCM bei RT wurden die Glasoberflächen getrocknet und bis zur weiteren Verwendung bei 4°C gelagert. Beispiel 4: Bromoketon-Funktionalisierung aminopropylsilylierter Glasoberflächen (
l,4-Dibrom-2,3-Diketobutan (Aldrich, D3,916-9) (Fig. 5, XXX) wurde 0.2 M in DMF 0.1% Triethylamin gelöst. Mit Druckluft gereinigte aminopropylsilylierte Glasoberflächen (2.5 x 7.5 cm; Sigma, Silane-Prep™, S4651) wurden mit Lösung überschichtet und sieben Stunden bei RT inkubiert. Anschließend wurden die so behandelten Glasoberflächen fünfmal mit jeweils 30 mL DMF je 3 Minuten bei RT gewaschen. Nach dreimaligem Waschen je drei Minuten mit jeweils 30 mL DCM bei RT wurden die Glasoberflächen getrocknet und bis zur weiteren Verwendung bei 4°C gelagert.
Beispiel 5: Bromoketon-Funktionalisierung thioamidmodifizierter Glasoberflächen (vgl. Fig. 5)
Die in diesem Beispiel gezeigten Strukturen (XXXIa) ermöglichen eine einfache und mit guten Ausbeuten verlaufende Oberflächenmodifikation)
Mit Bernsteinsäure-mono-thioamid umgesetzte aminopropylsilylierte Glasoberflächen (2.5 x 7.5 cm; Sigma, Silane-Prep™, S4651, vgl. Beispiel 3) wurden mit einer 0.1 M l,4-Dibrom-2,3- Diketobutan-Lösung (Fig. 5, XXX) in Ethanol überschichtet und drei Stunden bei RT inkubiert. Anschließend wurden die so behandelten Glasoberflächen (Fig. 5, XXXIa) fünfmal mit jeweils 30 mL Ethanol je 3 Minuten bei RT gewaschen. Nach dreimaligem Waschen je drei Minuten mit jeweils 30 mL DCM bei RT wurden die Glasoberflächen getrocknet und bis zur weiteren Verwendung bei 4°C gelagert.
Beispiel 6: Bromoketon-Funktionalisierung phenylthioharstoffmodifizierter Glasoberflächen (vgl. Fig. 5)
Die in diesem Beispiel gezeigten Strukturen (XXXIb) ermöglichen eine einfache und mit guten Ausbeuten verlaufende Oberflächenmodifikation)
Mit 4-Carboxyphenylthioharstoff (Fig. 5, XXIXb) umgesetzte aminopropylsilylierte Glasoberflächen (2.5 x 7.5 cm; Sigma, Silane-Prep™, S4651) wurden mit einer 0.1 M l,4-Dibrom-2,3- Diketobutan-Lösung (Fig. 5, XXX) in Ethanol überschichtet und drei Stunden bei RT inkubiert. Anschließend wurden die so behandelten Glasoberflächen (Fig. 5, XXXIb) fünfmal mit jeweils 30 mL Ethanol je 3 Minuten bei RT gewaschen. Nach dreimaligem Waschen je drei Minuten mit jeweils 30 mL DCM bei RT wurden die Glasoberflächen getrocknet und bis zur weiteren Verwendung bei 4°C gelagert.
Beispiel 7: Brombrenztraubensäure-Funktionalisierung aminopropylsilylierter Glasoberflächen
Diese Oberflächenmodifikation zeigt, daß es möglich, auch sehr kleine Strukturen zur Umwandlung einer aminofunktionalisierten in eine bromketonfunktionalisierte Glasoberfläche zu benutzten. Dabei stellt die Brombrenztraubensäure die kleinste mögliche Verbindung dar, die sowohl die für die Amidbindungsknüpfung notwendige Carboxyl-Funktion als auch die für die nachfolgende Immobilisierung des Biomoleküls notwendige alpha-Brom-Keto-Funktion enthält.
Natriumpyruvat wurde mit Oxalylchlorid in in das entsprechende Säurechlorid überführt. Mit Druckluft gereinigte aminopropylsilylierte Glasoberflächen (2.5 x 7.5 cm; Sigma, Silane-Prep™, S4651) wurden mit der so erhaltenen Lösung überschichtet und 5 Stunden bei RT inkubiert. Anschließend wurden die so behandelten Glasoberflächen fünfmal mit jeweils 30 mL DMF je 3 Minuten bei RT gewaschen. Nach jeweils dreimaligem Waschen je drei Minuten mit jeweils 30 mL Methanol und DCM bei RT wurden die Glasoberflächen getrocknet. Die so erhaltenen Brenztraubensäure-modifizierten Glasoberflächen wurden durch einstündige Behandlung mit einer Lösung von 0.1 mL Brom in 10 mL Eisessig in die Brombrenztraubensäure-modifizierten Glasoberflächen überführt. Nach jeweils dreimaligem Waschen je drei Minuten mit jeweils 30 mL Methanol und DCM bei RT wurden die Glasoberflächen getrocknet und bis zur weiteren Verwendung bei 4°C gelagert.
Beispiel 8: Bromacetophenon-Funktionalisierung aminopropylsilylierter Glasoberflächen (vgl. Fig. 2A, IX)
4-Acetylbenzoesäure (Fluka, 00932) wurde 0.3 M in DMF gelöst. Die resultierende Mischung wurde durch die Zugabe von einem halben Äquivalent DIC 15 min bei RT aktiviert. Mit Druckluft gereinigte aminopropylsilylierte Glasoberflächen (2.5 x 7.5 cm; Sigma, Silane-Prep , S4651) wurden mit der so erhaltenen 4-Acetylbenzoesäureanhydrid-Lösung überschichtet und 3 Stunden bei RT inkubiert. Anschließend wurden die so behandelten Glasoberflächen (Fig.2, IX) fünfmal mit jeweils 30 mL DMF je 3 Minuten bei RT gewaschen. Nach jeweils dreimaligem Waschen je drei Minuten mit jeweils 30 mL Methanol und DCM bei RT wurden die Glasoberflächen getrocknet. Die so modifizierten Glasoberflächen wurden durch einstündige Behandlung mit einer Lösung von 0.1 mL Brom in 10 mL Eisessig in die Bromacetophenon-modifizierten Glasoberflächen (Fig. 2, IV) überführt. Nach jeweils dreimaligem Waschen je drei Minuten mit jeweils 30 mL Methanol und DCM bei RT wurden die Glasoberflächen getrocknet und bis zur weiteren Verwendung bei 4°C gelagert.
Beispiel 9: Thiocyanato-acetophenon-Funktionalisierung aminopropylsilylierter Glasoberflächen (vgl. Fig. 2C)
Bromacetophenon-modifizierte (Fig. 2, IV, vgl. Beispiel 8), aminopropylsilylierte Glasoberflächen (2.5 x 7.5 cm; Sigma, Silane-Prep™, S4651) wurden mit einer 0.1 M Lösung von Natrium- thiocyanat in Ethanol überschichtet und fünf Stunden bei 50°C inkubiert. Anschließend wurden die so behandelten Glasoberflächen (Fig. 2, X) fünfmal mit jeweils 30 mL Ethanol je 3 Minuten bei RT gewaschen. Nach dreimaligem Waschen je drei Minuten mit jeweils 30 mL DCM bei RT wurden die Glasoberflächen getrocknet und bis zur weiteren Verwendung bei 4°C gelagert.
Beispiel 10: Immobilisierung von Anthraniloyl-peptiden an aldehyd-funktionalisierten Glasoberflächen (vgl. Fig. 4)
a) Die zur Immobilisierung verwendeten Peptide (jeweils 13mere Peptide, die die gesamte Primärstruktur der Proteine MBP, Casein und Histon Hl repräsentieren) wurden nach Standard- SPOT-Synthesemethoden (R.Frank, Tetrahedron, 48, 1992, S.9217-9232; A.Kramer und J. Schneider-Mergener, Methods in Molecular Biology, vol 87: Combinatorial Peptide Library Pro- tocols, S. 25-39, edited by: S. Cabilly; Humana Press Inc., Totowa, NJ) an Cellulose als C- terminale Peptidamide synthetisiert. Dabei wurden entsprechend geschützte Fmoc-A inosäure- pentafluorphenylester in DMF gelöst und jeweils lμL aufgespottet. Die Kupplungsreaktion erfolgte doppelt jeweils 25 min bei RT. Die Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe erfolgte unter Verwendung von 20% Piperidin in DMF 20 min bei RT. Nach der letzten Fmoc-Abspaltung wurden die N-Termini der cellulose-gebundenen Peptide durch eine fünfstündige Inkubation mit einer gesättigten Lösung von Isatosäure in DMF bei 50°C in die entsprechenden ortho- aminobenzoylierten Derivate überführt. Die Abspaltung der permanenten Schutzgruppen (tBu für Serin, Threonin, Tyrosin, Glutaminsäure und Asparaginsäure; Boc für Lysin; Trityl für Aspa- ragin, Glutamin, Cystein, Histidin und Pbf für Arginin) erfolgte durch zweistündige Behandlung mit 97% Trifluoressigsäure bei RT. Anschließend wurden die cellulose-gebundenen Peptide mit DCM, MeOH und Diethylether gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Abspaltung der Peptide von der Cellulose erfolgte unter Verwendung von Ammoniakgas 24 Stunden bei RT. Die Spots mit den physikalisch adsorbierten Peptiden wurden ausgestanzt und in 96-well Mikroti- terplatten überführt. Nach Ablösen der Peptide mit je 200 μL 20% Methanol unter Ultraschall- bedingungen wurden die Proben filtriert, in 384well Mikro titerplatten überführt, lyophilisiert und bis zur weiteren Verwendung bei -20°C gelagert.
b) Die in Mikrotiterplatten vorliegenden ortho-Aminobenzoyl-Peptide wurden in 200 mM Natrium-Phosphatpuffer pH 6.0 gelöst (finale Konzentation der Peptide 0.5 mM), der 15 Vol% DMSO enthielt. Anschließend wurde bei RT jeweils 0.01 μL dieser Lösung auf die aldehydmodifizierten Glasoberflächen (vgl. Beispiel 1 und Fig. 4) mittels eines NanoPlotters der Firma Gesim aufgebracht und diese vier Stunden bei RT inkubiert. Nach dreimaligem Waschen bei RT mit jeweils 100 mL destilliertem Wasser wurden die modifizierten Glasoberflächen (Fig. 4, XIII) mit 30 mL einer 40%igen wässrigen Lösung Hydroxylamin 30 Minuten bei RT inkubiert, um die restlichen Aldehydfunktionen zu deaktivieren. Danach wurden die Glasoberflächen jeweils fünfmal je 3 Minuten mit je 50 mL Wasser bei RT und anschließend jeweils zweimal je 3 Minuten mit je 50 mL Methanol bei RT gewaschen. Die so behandelten Glasoberflächen wurden getrocknet und bis zur weiteren Verwendung bei 4°C gelagert.
Beispiel 11: Immobilisierung thioxocitrullinhaltiger Peptide an bromacetophenon- funktionalisierte Glasoberflächen (vgl. Fig. 2B)
a) Das zur Immobilisierung verwendete Peptid thioxoCit-ßAla-Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly- NH2 (Fig. 2B, Vb, R4=H) wurde nach Standardmethoden der Fmoc-basierenden Chemie an der festen Phase als C-terminales Peptidamid synthetisiert. Dabei wurden entsprechend geschützte Fmoc-Aminosäuren mit einem Äquivalent HBTU und drei Äquivalenten Diisopropylamin in DMF aktiviert und an Rink-Amind-MBHA-Harz in DMF gekoppelt. Die Abspaltung der Fmoc- Schutzgruppe erfolgte unter Verwendung von 20% Piperidin in DMF 30 min bei RT. Die Abspaltung der permanenten Schutzgruppen (tBu für Serin und Pbf für Arginin) und die gleichzeitige Ablösung vom Polymer erfolgte durch zweistündige Behandlung mit 97% Trifluoressigsäure bei RT. Die resultierende Mischung wurde filtriert und das Filtrat durch Zugabe von tert.Butyl-Methyl-Ether gefällt. Der Niederschlag wurde abgetrennt und mittels HPLC an RP18- Material mit Acetonitril/Wasser Mischungen (0.1% Trifluoressigsäure) gereinigt. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen wurden lyophilisiert und bis zur weiteren Verwendung bei -20°C gelagert.
b) Das Peptid thioxoCit-ßAla-Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly-NH2 (Fig. 2B, Vb, R4=H) wurde in 200 mM Natrium-Phosphatpuffer pH 5.5 gelöst (finale Konzentation 1 mM) der 30 Vol% Glyce- rol enthielt. Anschließend wurden bei RT jeweils 1 nL dieser Lösung in einer Anordnung von 70 Reihen und 168 Spalten (gesamt 11760 Spots) auf die bromacetophenon-funktionalisierten Glas- oberflächen (Fig. 2B, IV, vgl. Beispiel 8) mittels eines NanoPlotters der Firma Gesim aufgebracht. Dabei betrug der Spot-zu-Spot-Abstand 0.3 mm. Anschließend wurden die so behandelten Glasoberflächen (Fig. 2B, VIII, R4=H) 3 Stunden bei RT inkubiert. Nach dreimaligem Waschen bei RT mit jeweils 100 mL destilliertem Wasser wurden die modifizierten Glasoberflächen mit 30 mL einer 3%igen wässrigen Lösung von Thioacetamid 30 Minuten bei RT inkubiert, um die restlichen Bromacetophenon-fünktionen zu deaktivieren. Danach wurden die Glasoberflächen jeweils fünfmal je 3 Minuten mit je 50 mL Wasser bei RT und anschließend jeweils zweimal je 3 Minuten mit je 50 mL Methanol bei RT gewaschen. Die so behandelten Glasoberflächen wurden getrocknet und bis zur weiteren Verwendung bei 4°C gelagert.
Beispiel 12: Immobilisierung thioamidhaltiger Peptide an bromketon-funktionalisierte Glasoberflächen (vgl. Fig.5)
a) Das zur Immobilisierung verwendete Peptid Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly-thioamid (Kemp- tide-thioamid) (Fig. 5, Va) wurde nach Standardmethoden der Fmoc-basierenden Chemie an der festen Phase als C-terminales Peptidthioxoamid synthetisiert. An Rink-Amid-MBHA-Harz gebundenes Fmoc-Gly-OH wurde 3 Stunden mit Lawessons Reagenz in THF am Rückfluß gekocht. Anschließend wurde das Harz mit THF und DCM gewaschen, 1 Stunde mit DMF geschüttelt und dann mit DMF, DCM und Methanol gewaschen. Nach Entfernen der Fmoc- Schutzgruppe mit 50% Morpholin in DMF (40 min) wurden die entsprechend geschützten Fmoc- Aminosäuren mit einem Äquivalent HBTU und drei Äquivalenten Diisopropylamin in DMF aktiviert gekoppelt. Die Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe erfolgte unter Verwendung von 20% Piperidin in DMF 30 min bei RT. Die Abspaltung der permanenten Schutzgruppen (tBu für Serin und Pbf für Arginin) und die gleichzeitige Ablösung vom Polymer erfolgte durch zweistündige Behandlung mit 97% Trifluoressigsäure bei RT. Die resultierende Mischung wurde filtriert und das Filtrat durch Zugabe von tert.Butyl-Methyl-Ether gefällt. Der Niederschlag wurde abgetrennt und mittels HPLC an RP18-Material mit Acetonitril/Wasser Mischungen (0.1% Trifluoressigsäure) gereinigt. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen wurden ly- ophilisiert und bis zur weiteren Verwendung bei -20°C gelagert.
b) Das Peptid Leu-Arg- Arg-Ala-Ser-Leu-Gly-thioamid (Fig. 5, Va) wurde in 200 mM Natrium- Phosphatpuffer pH 5.5 gelöst (finale Konzentation 1 mM) der 50 Vol% Glycerol enthielt. Anschließend wurden bei RT jeweils 1 nL dieser Lösung in einer Anordnung von 70 Reihen und 168 Spalten (gesamt 11760 Spots) auf die bromketon-fünktionalisierten Glasoberflächen (vgl. Beispiel 5 und Fig. 5, XXXIa) mittels eines NanoPlotters der Firma Gesim aufgebracht. Dabei betrug der Spot-zu-Spot-Abstand 0.3 mm. Anschließend wurden die so behandelten Glasoberflächen 2 min mit einer Mikrowelle behandelt und dann 3 Stunden bei RT inkubiert. Nach dreimaligem Waschen bei RT mit jeweils 100 mL destilliertem Wasser wurden die modifizierten Glasoberflächen (Fig. 5, XXXIIc) mit 30 mL einer 3%igen wässrigen Lösung von Thioacetamid 30 Minuten bei RT inkubiert, um die restlichen alpha-Bromketonfünktionen zu deaktivieren. Danach wurden die Glasoberflächen jeweils fünfmal je 3 Minuten mit je 50 mL Wasser bei RT und anschließend jeweils zweimal je 3 Minuten mit je 50 mL Methanol bei RT gewaschen. Die so behandelten Glasoberflächen wurden getrocknet und bis zur weiteren Verwendung bei 4°C gelagert.
Beispiel 13: Analyse Kinase-vermittelter Peptidmodifikationen an modifizierten Glasoberflächen (Fig. 5, XXXII)
Eine mit dem Peptid Leu- Arg- Arg-Ala-Ser-Leu-Gly-thioamid modifizierte Glasoberfläche (vgl. Beispiel 12 und Fig. 5, XXXIIc) wurde mit 10ml lOOμM ATP in Kinasepuffer (50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 30mM MgCl2, 4mM DTT, 2mM EGTA, pH 7,5) 10 Minuten bei RT inkubiert. Die Glasoberfläche wurde getrocknet und anschließend wurde auf die Peptid-modifizierte Glasoberfläche eine zweite, nichtmodifizierte Glasoberfläche gleicher Abmessungen gelegt. Dann wurden 50 μL einer Mischung aus Proteinkinase A (Sigma, P26452, 10 U/mL), lOOμM/mL ATP und lOOμCi/mL γ-32P-ATP (Amersham, 9,25mBq/250μCi/25μL, Aktivität >5000Ci/mmol) in Kinasepuffer (50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 30mM MgCl2, 4mM DTT, 2mM EGTA, pH 7,5) durch Kapillarkräfte in den Spalt, der durch die auf der modifizierten Glasoberfläche aufliegende zweite Glasoberfläche gebildet wird, aufgegeben. Anschließend wurde 30 min bei RT in einer nahezu wassergesättigten Atmosphäre inkubiert. Um den durch unspezifische Bindung von ATP- bzw. Kinase-Molekülen an die Glasoberflächen verursachten Hintergrund zu verringern, wurde die modifizierte Glasoberfläche wie folgt gewaschen:
- 3mal 3 Minuten bei RT mit Waschpuffer (1% SDS und 1% Tween20 in 50mM TRIS-Puffer, pH 7.5, 200 mM NaCl)
- 2mal 3 Minuten bei RT mit IM NaCl-Lösung
- 2mal 3 Minuten bei RT mit destilliertem Wasser
- 2mal 3 Minuten bei RT mit 80%iger Ameisensäure in Ethanol
- 2mal 3 Minuten bei RT mit destilliertem Wasser
- 2mal 5 Minuten bei 50°C mit einer Lösung, die 6M Harnstoff, 2M Thiohamstoff und 1% SDS enthielt
- 3mal 3 Minuten bei RT mit destilliertem Wasser
- 3mal 3 Minuten bei RT mit Methanol
Nach dem Trocknen der Glasoberfläche wurde die in den glasoberflächen-gebundenen Peptiden eingebaute Menge an radioaktivem Phosphat mittels eines Phosphorlmager-Systems (FLA-3000, FUJIFILM) bestimmt (vgl. Fig. 6).
Beispiel 14: Analyse Kinase-vermittelter Peptidmodifikationen an modifizierten Glasoberflächen (Fig. 2B, VIII, R4=H)
Eine mit dem Peptid thioxoCit-ßAla-Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly-NH2 (Fig. 2B, Vb, R4=H) modifizierte Glasoberfläche (vgl. Beispiel 11 und Fig. 2B, VIII, R4=H) wurde mit 10ml lOOμM ATP in Kinasepuffer (50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 30mM MgCl2, 4mM DTT, 2mM EGTA, pH 7,5) 10 Minuten bei RT inkubiert. Die Glasoberfläche wurde getrocknet und anschließend wurde auf die Peptid-modifizierte Glasoberfläche eine zweite, nichtmodifizierte Glasoberfläche gleicher Abmessungen gelegt. Dann wurden 50 μL einer Mischung aus Proteinkinase A (Sigma, P26452, 10 U/mL), lOOμM/mL ATP und lOOμCi/mL γ-32P-ATP (Amersham, 9,25mBq/250μCi/25μL, Aktivität >5000Ci/mmol) in Kinasepuffer (50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 30mM MgCl2, 4mM DTT, 2mM EGTA, pH 7,5) durch Kapillarkräfte in den Spalt, der durch die auf der modifizierten Glasoberfläche aufliegende zweite Glasoberfläche gebildet wird, aufgegeben. Anschließend wurde 30 min bei RT in einer nahezu wassergesättigten Atmosphäre inkubiert. Um den durch unspezifische Bindung von ATP- bzw. Kinase-Molekülen an die Glasoberflächen verursachten Hintergrund zu verringern, wurde die modifizierte Glasoberfläche wie folgt gewaschen:
- 3mal 3 Minuten bei RT mit Waschpuffer (1% SDS und 1% Tween20 in 50mM TRIS-Puffer, pH 7.5, 200 mM NaCl)
- 2mal 3 Minuten bei RT mit IM NaCl-Lösung
- 2mal 3 Minuten bei RT mit destilliertem Wasser
- 2mal 3 Minuten bei RT mit 80%iger Ameisensäure in Ethanol
- 2mal 3 Minuten bei RT mit destilliertem Wasser
- 2mal 5 Minuten bei 50°C mit einer Lösung, die 6M Harnstoff, 2M Thiohamstoff und 1% SDS enthielt
- 3mal 3 Minuten bei RT mit destilliertem Wasser
- 3mal 3 Minuten bei RT mit Methanol
Nach dem Trocknen der Glasoberfläche wurde die in den glasoberflächen-gebundenen Peptiden eingebaute Menge an radioaktivem Phosphat mittels eines Phosphorlmager-Systems (FLA-3000, FUJIFILM) bestimmt (vgl. Fig. 7).
Die in der vorstehenden Beschreibung, den Ansprüchen sowie den Zeichnungen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen wesentlich sein.

Claims

ANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Immobilisierung von Verbindungen auf einer Oberfläche umfassend die Schritte
Bereitstellen einer zu immobilisierenden Verbindung als ersten Reaktionspartner und einer Oberfläche als zweiten Reaktionspartner, wobei der erste Reaktionspartner eine erste reaktive Gruppe und der zweite Reaktionspartner eine erste reaktive Gruppe umfasst, und
Umsetzen der beiden Reaktionspartner
dadurch gekennzeichnet, dass beim Umsetzen der beiden Reaktionspartner ein heterocyclisches Ringsystem ausgebildet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das heterocyclische Ringsystem zwischen dem ersten und dem zweiten Reaktionspartner ausgebildet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das heterocyclische Ringsystem aus Teilen der ersten reaktiven Gruppe des ersten Reaktionspartners und der ersten reaktiven Gruppe des zweiten Reaktionspartners gebildet wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass das heterocyclische Ringsystem aus der Gruppe, die Thiazole, Aminothiazole, Imidazole, Benzimidazole, Indole, Tetrahydroisoquinoline, Tetrahydro-ß-carboline, Dihydroquinazolin, Oxidationsprodukte aus ortho-Amino-Benzoesäurederive und Pyrazole.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das heterocyclische Ringsystem folgende Strukturelemente umfasst:
Figure imgf000040_0001
3 4 5
wobei die Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt sind und worin
X O, S oder NH, bevorzugterweise NH ist;
A ein Ringsystem aus 4 bis 8 Atomen ist, bevorzugterweise Aryl ist;
Y S oder O, bevorzugterweise O ist;
R'-R3 Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Aryl, Heteroatome, Heterocyclen oder Biomolekül
R4-R9 Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Aryl, Heteroatome, Heterocyclen, Biomolekül oder H, D,T ist
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die reaktive Gmppe ausgewählt ist aus der Gmppe, die Thioamine, Thiocarbonyle, Thiohamstoffe, Hydroxylamino, alpha-Isothiocyanatoketone, Anthranilsäureamide, Aniline, Aldehyde, Ketone, 1,2- Diketone, Amine, Aminooxyderivate, Arylhydrazine, Arylamine, Heteroarylamine, ortho- Amino-Benzoesäure, Hydrazine, 2-Cyan-Aldehyde, hnine und Säurehalogenide umfasst.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die erste reaktive Gmppe der zu immobilisierenden Verbindung eine reaktive Gmppe ist, die ausgewählt ist aus der Gmppe, die Thioamid, Anilin, Thiohamstoff, Thiocarbonyl, Anthranilsäure, Anthranil- säureamid und Hydroxylamino enthält.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die erste reaktive Gmppe der Oberfläche eine reaktive Gmppe ist, die ausgewählt ist aus der Gmppe, die Carbonyl, Keto und Aldehyd umfasst.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Umsetzen eine chemoselektive Reaktion ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Immobilisierung eine gerichtete Immobilisiemng ist.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der entstehende heterocyclische Ring sich in seinem Absoφtions-/Emmisionsverhalten von den Edukten unterscheidet.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die zu immobilisierende Verbindung ausgewählt ist aus der Gmppe, die Nukleinsäuren, Gene, chromoso- male Nukleinsäuren, cDNA, Oligonukleotide, Polynukleotide, Primer, Sonden, PNA, Peptide, Polypeptide, Proteindomänen, Proteine, Zucker, Polyzucker, Lipide, Polylipide, Naturstoffe und niedermolekulare Verbindungen umfasst.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche eine planare Oberfläche ist.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der planaren O- berfläche um einen Chip handelt.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche ein Material umfasst, das ausgewählt ist aus der Gmppe, die Silikate, Keramik, Glas, Metalle, organische Trägermaterialien, Cellulose, Nitrocellulose, PTFE-Membranen, Polypropy- len,Gold, Titandioxid und Siliziumoxid umfasst.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die planare Oberfläche eine nicht-poröse Oberfläche ist.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung der zu immobilisierenden Verbindung mit der Oberfläche unter Mirkowellenbestrahlung erfolgt.
18. Verfahren zur Herstellung einer Anordnung umfassend mindestens zwei verschiedene Verbindungen an mindestens zwei verschiedenen Stellen einer planaren Oberfläche, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Verbindung an einer ersten Stelle der planaren Oberfläche und die zweite Verbidnung an einer zweiten Stelle der planaren Oberfläche nach einem der Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche immobilisiert wird.
19. Planare Oberfläche herstellbar nach einem Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche.
20. Planare Oberfläche umfassend eine daran kovalent immobilisierte Verbindung, wobei zwischen der immobilisierten Verbindung und der Oberfläche ein heterocyclisches Ringsystem angeordnet ist, das erst durch den Immobilisierangsvorgang ausgebildet wird.
21. Planare Oberfläche nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass das heterocyclische Ringsystem ausgewählt ist aus der Gmppe, die Thiazole, Aminothiazole, Imidazole, Benzimidazole, Indole, Tetrahydroisoquinoline, Tetrahydro-ß-carboline, Dihydroquinazolin, Oxidationsprodukte aus ortho-Amino-Benzoesäurederive und Pyrazole.
22. Planare Oberfläche nach einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass das heterocyclische Ringsystem folgende Strukturelemente umfasst:
Figure imgf000042_0001
wobei die Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt sind und worin X O, S oder NH, bevorzugterweise NH ist;
A ein fusioniertes Ringsystem aus 4 bis 8 Atomen ist, bevorzugterweise Aryl ist;
Y S oder O, bevorzugterweise O ist;
R'-R3 Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Aryl, Heteroatome, Heterocyclen oder Biomolekül
R -R9 Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Aryl, Heteroatome, Heterocyclen, Biomolekül oder H, D,T ist
23. Anordnung herstellbar nach Anspmch 18.
24. Anordnung, . insbesondere nach Anspmch 23, umfassend eine planare Oberfläche nach einem der vorangehenden Ansprüche.
25. Verwendung einer Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche oder einer planaren Oberfläche nach einem der vorangehenden Ansprüche in einem Verfahren zur Bestimmung der Substratspezifität einer enzymatischen Aktivität umfassend die folgenden Schritte:
Bereitstellen eines Satzes von Aminosäuresequenzen auf der planaren Oberfläche eines Trägermaterials, wobei die Aminosäuresequenzen gerichtet immobilisiert sind,
Kontaktieren und/oder Inkubieren einer enzymatischen Aktivität mit der mit dem Satz von Aminosäuresequenzen, und
Nachweis einer Reaktion zwischen einer der immobilisierten Aminosäuresequenzen und der enzymatischen Aktivität,
dadurch gekennzeichnet, dass
die planare Oberfläche eine planare Oberfläche nach einem der Ansprüche 1 bis 17 oder eine planare Oberfläche einer Anordnung nach einem der Ansprüche 23 bis 24 ist, und bei der Umsetzung der enzymatischen Aktivität mit dem Satz von Aminosäuren eine Änderung des Molekulargewichts mindestens einer der Aminosäuresequenzen erfolgt.
26. Verfahren nach Anspmch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Änderung des Molekulargewichts durch Ausbildung oder Spaltung einer kovalenten Bindung an einer der Aminosäuresequenzen erfolgt, bevorzugterweise an derjenigen Aminosäuresequenz, die mit der enzymatischen Aktivität reagiert.
27. Verfahren nach Anspruch 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis der Reaktion durch Detektion der Änderung des Molekulargewichts erfolgt.
28. Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis durch ein Nachweisverfahren erfolgt, das ausgewählt ist aus der Gmppe, die Autoradiogra- phie, Plasmonresonanzspektroskopie und Fluoreszenzspektroskopie umfasst.
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass die enzy- matische Aktivität ausgewählt ist aus der Gmppe, die Kinasen, Sulfotransferasen, Glycosyltrans- ferasen, Acetyltransferasen, Farnesyltransferasen Palmityltransferasen, Phosphatasen, Sulfat- asen, Esterasen, Lipasen, Acretylasen und Proteasen umfasst.
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