KR100558264B1

KR100558264B1 - 해양균류 페니실륨속으로부터 분리한 암세포독성작용 및항균작용을 가지는 신규화합물 및 그 용도

Info

Publication number: KR100558264B1
Application number: KR1020030097656A
Authority: KR
Inventors: 손병화
Original assignee: 부경대학교 산학협력단
Priority date: 2003-12-26
Filing date: 2003-12-26
Publication date: 2006-03-10
Also published as: KR20050066376A

Abstract

본 발명은 해양균류 페니실륨속(Penicillium sp.) 균주로부터 분리한 신규한 폴리옥시지네이티드 파르네실싸이클로헥세논(polyoxygenated farnesylcyclohexenones)구조 화합물 및 그 알코올 유도체에 관한 것으로, 해양균류 페니실륨속 균주로부터 분리 정제된 하기 구조식 (1)로 표시되는 7-디아세톡시야뉴손 A(7-deacetoxyyanuthone A) 및 하기 구조식 (2)로 표시되는 상기 화합물의 2,3-알코올 유도체는, in vitro에서 5종의 인간 고형암세포주 A549(Lung cancer), SK-OV-3(Ovarian cancer), SK-MEL-2(Skin cancer), XF498(CNS cancer), HCT15(Colon cancer)에 대해 우수한 암세포독성작용을 나타내고, 또한 메치실린-내성(methicillin-resistant) 및 다약제-내성(multidrug-resistant)의 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus)에 대해 온화한 항균활성을 나타내어 천연물 유래의 저독성 항암제 또는 항균제의 의약품 용도로 개발 가능하며, 상기 효능을 이용한 기능성 식품으로도 이용될 수 있어 의약산업 및 식품산업상 매우 유용한 발명이다.

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페니실륨속, 폴리옥시지네이티드 파르네실싸이클로헥세논, 디아세톡시야뉴손 A, 암세포독성작용, 항균작용

Description

해양균류 페니실륨속으로부터 분리한 암세포독성작용 및 항균작용을 가지는 신규화합물 및 그 용도{Novel compounds having cytotoxicity and antibacterial activity which were isolated from a Marine-Derived Fungus Penicillium sp. and A Usage thereof}

본 발명은 해양균류 페니실륨속(Penicillium sp.) 균주로부터 분리한 신규한 폴리옥시지네이티드 파르네실싸이클로헥세논(polyoxygenated farnesylcyclohexenones)구조 화합물 및 그 알코올 유도체에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 해양균류 페니실륨속 균주로부터 분리 정제된 신규화합물로서, in vitro 에서 5종의 인간 고형암세포주 A549(Lung cancer), SK-OV-3(Ovarian cancer), SK-MEL-2(Skin cancer), XF498(CNS cancer), HCT15(Colon cancer)에 대해 우수한 암세포독성작용을 나타내고, 메치실린-내성(methicillin-resistant) 및 다약제-내성(multidrug-resistant)의 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus)에 대해서도 온화한 항균활성을 나타내어 천연물 유래의 저독성 항암제 또는 항균제의 의약품 및 기능성 식품으로 개발가능한 하기 구조식 (1)로 표시되는 7-디아세톡시야뉴손 A(7-deacetoxyyanuthone A)와 하기 구조식 (2)로 표시되는 상기 화합물의 2,3-알코올 유도체에 관한 것이다.

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과학기술 발전에 따른 생활수준의 향상과 의료기술의 급진적인 발달에도 불구하고 암으로 인한 사망률은 계속 증가하고 있는 실정이다. 우리나라의 사망원인 통계자료를 보면, 85년의 15.1%였던 것이 1990년에는 20.1%, 1994년에는 21.3%로 계속 증가추세에 있으며, 미국이나 일본과 마찬가지로 사망원인의 제1위를 차지하고 있다. 현재, 암치료법에는 외과적 수술요법, 방사선 요법, 화학요법이 주종을 이루고 있는데, 그 중 특히 화학요법에서의 항암제는 암치료에 있어 많은 기여를 해오고 있다. 그러나 현재 쓰이고 있는 각종 항암제들은 대개가 강한 독성을 보이고 있고, 내성발현 및 임파구·골수세포의 파괴 등 임상적인 면에서 한계를 보이고 있어, 보다 부작용이 적으면서도 좋은 항암효과를 갖는 항암치료제를 개발하는 것이 절실히 요구되는 실정이다. 따라서 정상세포에는 독성을 나타내지 않고 면역체계를 활성화시킴으로써 암을 치료하려는 노력이 다각도에서 이루어지고 있으며, 이에 따라 최근에는 각종 천연자원으로부터 새로운 항암 성분을 탐색하고 이를 이용하여 항암제를 개발하려는 많은 노력이 진행되고 있다.

한편, 박테리아 및 균류와 같은 해양 미생물은 바다의 여러 가지 환경에서 풍부하게 서식하고 있으며, 특히 화학적·생물학적으로 다양한 종류의 화합물을 대사생산함으로써 생물활성 해양천연물을 수득할 수 있는 풍부한 소재가 된다.

이에 본 발명자는 상기와 같은 점에 착안하여 해양미생물로부터 새로운 생물활성 해양천연물에 대한 연구를 한 결과, 해양균류 페니실륨속 균주로부터 우수한 in vitro 암세포독성작용 및 항균작용을 가진 2개의 신규화합물을 분리하게 되었다.

상기 신규화합물은, 본 발명자가 2002년 특허출원번호 제2002-22696호로 출원한 바 있는 하기 구조식 (3), (4)의 파르네실퀴논(farnesylquinones)을 분리한 균류로부터 극성이 큰 2차 대사성분에 대한 계속적인 연구끝에 새롭게 분리한 것으로, 폴리옥시지네이티드 파르네실싸이클로헥세논 구조의 신규화합물로서, 상기 파르네실퀴논의 산화유도체(oxidized derivatives)로 추정된다.

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ㆍㆍㆍ(4)

본 발명자는 해양균류 페니실륨속 균주로부터 암세포독성작용 및 항균작용을 가지는 신규 화합물 2종류를 분리정제하고, 상기 분리된 본 발명 화합물의 분자구조를 결정한 다음, 상기 신규물질이 in vitro 에서 5종의 인간 고형암세포주 A549(Lung cancer), SK-OV-3(Ovarian cancer), SK-MEL-2(Skin cancer), XF498(CNS cancer), HCT15(Colon cancer)에 대한 암세포독성작용 및 메치실린-내성 및 다약제-내성의 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus)에 대한 항균활성이 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 해양균류 페니실륨속 균주로부터 분리한 암세포독성작용 및 항균작용을 가지는 신규화합물, 즉 상기 구조식 (1)로 표시되는 7-디아세톡시야뉴손 A와 상기 구조식 (2)로 표시되는 7-디아세톡시야뉴손 A의 2,3-알코올 유도체를 제공함에 있다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 신규화합물 7-디아세톡시야뉴손 A 및 그것의 2,3-알코올 유도체의 항암제 및 항균제로서의 의약용도 또는 기능성식품용도를 제공함에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 경남 통영군 비진도에서 채집한 노끈의 표면으로부터 페니실륨속 균주를 분리·배양하고, 상기 배양한 균사체를 동결건조한 후 CH₂Cl₂-MeOH(1:1)을 이용하여 추출물을 얻은 다음, 이를 역상 컬럼 크로마토그래피(reversed-phase flash column chromatography)를 사용하여 4개의 분획물로 분획하고, 이들 분획물을 대상으로 1차 검색 결과 암세포독성작용과 항균작용이 관찰된 분획물 4를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography)와 HPLC로 정제하여 7-디아세톡시야뉴손 A와 그것의 2,3-알코올 유도체를 분리한 다음, 이들의 분자구조를 결정하고, in vitro 에서 상기 천연물의 암세포독성작용과 항균작용을 확인함으로써 완성하였다.

이하, 본 발명의 구성 및 작용을 설명한다.

본 발명에 의한 제조방법은 페니실륨속 균주를 배양하는 단계; 상기 배양된 균사체를 동결건조 한 후 CH₂Cl₂-MeOH(1:1)을 이용하여 추출하는 단계; 상기 추출물을 H₂O-MeOH(0-100% MeOH)를 용매로 한 역상 컬럼 크로마토그래피(reversed-phase flash column chromatography)(YMC ODS-A gel)을 사용하여 4개의 분획물로 분획하는 단계; 상기 분획물 중 1차 검색 결과 암세포독성작용 및 항균활성이 관찰된 분획물 4를 n-헥산-EtOAc(5:1-1:1)를 용매로 한 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography)로 분리하고, 이어 HPLC(YMC ODS-A, 10×250mm)(MeOH)로 정제하는 단계로 구성된다.

상기에서, 페니실륨속 균주는 2000년 경남 통영군 비진도에서 채집한 노끈의 표면으로부터 분리하고, 이를 지방산 메틸 에스테르의 분석법을 이용하여 동정한 결과 페니실륨 속임을 확인하였다〔(Korean Culture of Microorganisms, Seoul, Korea), 유사 인덱스 0.862〕. 본 발명자는 이를 Penicillium sp. MFA577로 명명하고, 2003년 11월 18일 한국농용미생물보존센터(KACC)에 기탁하여 수탁번호 KACC- 93011을 부여받았다.

상기 방법에 의하여 순수분리한 결과 2종의 화합물이 분리되었고, 그 분자구조를 결정한 결과, 하기 구조식 (1)로 표시되는 신규한 폴리옥시지네이티드 파르네실싸이클로헥세논 구조화합물 및 하기 구조식 (2)로 표시되는 상기 화합물의 알코올 유도체로 판명되었다.

ㆍㆍㆍ(1), (1a)

ㆍㆍㆍ(2)

상기 구조식 (1)의 화합물은 신규한 폴리옥시지네이티드 파르니셀싸이클로헥세논 구조화합물로, 상기 구조식 (1a)로 표시되는 야뉴손 A(yanuthone A)의 7-디아세톡시 유도체이다.

상기 화합물은 HRFABMS와 ¹³C NMR 분석결과 C₂₂H₃₂O₃(불포화도:7)의 원자조성이 판명되었으며, 황색 오일로 분리되었다. IR 흡수 스펙트럼은 하이드록실기(3431cm^-1)와 에논기(1680, 1029cm^-1)의 특징적인 밴드를 보였으며, DEPT를 포함한 ¹H 및 ¹³C NMR 스펙트럼은 5개의 올레핀 메틸 단일항(olefinic methyl singlets), 2개의 산화메틴(oxygenated methines), 1개의 산화4차탄소(oxygenated quaternary carbon), 4개의 올레핀 메틴(olefinic mehtines), 4개의 올레핀 4차탄소(olefinic quaternary carbon), 1개의 카르보닐탄소(carbonyl carbon), 1개의 부분입체 이성질체 메틸렌(diastereotopic methylene) 및 4개의 또다른 메틸렌의 존재를 보여주었다. 또한 전체적인 NMR 데이터는 상기 구조식 (1a)의 야뉴손 A 및 구조식 (3), (4)로 표시되는 파르네실퀴논과도 비슷했으며, 이로부터 파르네실 부분구조, 삼치환 에논 및 삼치환 에폭시 그룹의 존재가 추정되었다. 여기서, 에논 발색단 및 에폭시 그룹의 존재는 UV 스펙트럼 데이터〔203nm(log ε4.6), 238nm(log ε4.2)〕와 각각 상당히 업필드(upfield)에 위치한 산화탄소시그널(oxygenated carbon signals)〔δ61.6(s), C-2;59.2(d), C-3〕에 의해 더욱 뒷받침되었다. 상기 구조식 (1)로 표시되는 화합물에서 작용기의 연결은 2D NMR(COSY, HMQC, HMBC) 상관관계에 기초하여 확립되었는데, H₂-1과 C-1, C-2 및 C-3 그리고 H-2'와 C-2의 특징적인 HMBC 상관관계는 C-2와 C-1'의 연결을 보여주었다. 이상의 모든 결과를 기초로 하여 상기 구조식 (1)의 화합물은 상기 구조식 (1a)로 표시되는 야뉴손 A의 7-디아세톡시 유도체로 추정되었으며, 이에 상기 화합물을 7-디아세톡시야뉴손 A(7-deacetoxyyanuthone A)로 명명하였다.

상기 7-디아세톡시야뉴손 A의 입체화학은 NOE 실험과 CD 스펙트럼 데이터로부터 구조식 (1)과 구조식 (1a)의 두 화합물은 모든 키랄 중심에서 동일한 상대 입체화학을 가지고 있음이 입증되었다. 주요 NOE 상관관계는 H-3과 H-4, 그리고 H-3과 H-2'로서, 7-디아세톡시야뉴손 A의 상대구조가 확립되었다. 에폭사이드(epoxide)와 C-4 하이드록실기(hydroxyl)간의 시스(cis) 관계는, 상기 화합물의 H-3과 H-4의 결합상수(coupling constant)(J=2.5Hz)를 이미 보고된 에폭시싸이클로헥세논(epoxycyclohexenones) 구조의 야뉴손 A(J=2.5Hz), 매크로포린(macrophorins)(J=2.5Hz) 그리고 (+)-이소판에폭시돈(isopanepoxydon)(J=3.0Hz)의 수치와 비교함으로써 더욱 뒷받침되었다.

상기 7-디아세톡시야뉴손 A의 절대 입체화학은 CD를 이용하여 조사되었는데, 상기 CD 스펙트럼에서 340nm에서 (+) 부호의 제1 코톤효과(Cotton effect) (Δε,+2.8)가 관찰되었으며, 이는 매크로포린의 R-입체화학의 것과 동일한 결과였다. 따라서, 상기 구조식 (1)의 화합물에 대한 키랄 중심의 절대배치를 2R, 3R 그리고 4R로 결정하였으며, 이는 α-에폭시케톤의 옥탄터 법칙에 의해 더욱 뒷받침되었다.

한편, 상기 구조식 (2)의 화합물은 구조식 (1)로 표시되는 7-디아세톡시야뉴손 A의 2,3-알코올 유도체이다. 상기 화합물은 HRFABMS와 ¹³C NMR 분석결과 C₂₂H₃₄O₄의 원자조성이 판명되었으며, 불안정한 황색 오일로 분리되었다. UV, IR 그리고 NMR 스펙트럼 데이터는 그 전체적인 특징이 상기 구조식 (1)의 7-디아세톡시야뉴손 A와 거의 흡사하였으나, 에폭시 그룹으로 추정되는 NMR 시그널이 7-디아세톡시야뉴 손 A에 대해서는 δ_H3.69(H-3), δ_C 59.2(C-3) 및 δ_C61.6(C-2)였던 것이 본 화합물에 대해서는 δ_H4.28(H-3), δ_C74.5(C-3) 및 δ_C 68.4(C-2)로 다운필드(downfield) 이동한 점만 달랐다(표 3 참조).

또한, DEPT, COSY, HMQC, HMBC 및 NOESY 실험으로부터 얻은 결과를 포함하는 구조식 (2)의 ¹H 및 ¹³C NMR 스펙트럼 데이터에 대한 상세한 분석결과, 구조식 (2)의 대사물질은 상기 구조식 (1)의 화합물의 에폭사이드 고리 열림(epoxide ring opening)으로 생성된 2,3-알코올 유도체(2,3-hydro derivative)로 추정되었다.

상기 구조식 (2)로 표시되는 대사물질의 상대 입체화학은 결합상수(coupling constant)와 NOESY 데이터에 의해 결정되었다. 즉, H-3과 H-4의 결합상수가 3.5 Hz로 관찰되어, 트랜스(trans) 배향(J_H3-H4= 8.0-9.0 Hz)이 아니고, 시스(cis) 배향임이 판명되었다. 또한, NOE 상관관계가 H-3과 H-4 사이에서 관찰된 반면, 이들이 H₂-1' 또는 H-2'와는 관측되지 않았다. 따라서, 상기의 사실로부터 3-OH와 4-OH는 같은 방향으로 배향하고 있으나, 2-OH와 3-OH는 트랜스(trans) 배향을 하고 있음이 추론되었다. 한편, 상기 화합물에서의 비대칭 탄소 중심의 절대 입체화학은 미정으로 남아있다.

상기 구조식 (1)과 (2)로 표시되는 각각의 화합물에 대해 in vitro 에서 5종의 인간 고형암세포주 A549(Lung cancer), SK-OV-3(Ovarian cancer), SK-MEL-2(Skin cancer), XF498(CNS cancer), HCT15(Colon cancer)에 대한 암세포독성작용이 있음을 확인하였으며, 또한 메치실린-내성 및 다약제-내성의 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus)에 대해 항균작용이 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명 해양균류 페니실륨속 균주로부터 분리한 신규 화합물, 즉 상기 구조식 (1)로 표시되는 7-디아세톡시야뉴손 A와 상기 구조식 (2)로 표시되는 상기 화합물의 2,3-알코올 유도체는 천연물 유래의 저독성 항암제 또는 항균제의 의약품 용도로 개발가능하며, 상기 효능을 이용한 기능성 식품으로도 사용가능하다.

이하, 본 발명의 구체적인 구성 및 작용을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1: 해양균류 페니실륨속 균주로부터 본 발명 암세포독성작용 및 항균작용을 가진 신규화합물의 분리>

제 1단계: 균주의 분리 및 배양

경남 통영군 비진도(2000년 2월)에서 채집한 노끈의 표면으로부터 균류(분리 번호 MFA 577)를 분리하고, 이를 지방산 메틸 에스테르의 분석법을 이용하여 동정한 결과 페니실륨 속임을 확인하였다〔(Korean Culture of Microorganisms, Seoul, Korea), 유사 인덱스 0.862〕.

상기 분리된 균주를 SWS 배지(소이톤(soytone) 0.1%, 가용성 전분 1.0%, 해수 100%)를 이용하여 29℃에서 30일 동안 정치(static) 배양 방식으로 20L를 배양하였다.

한편, 상기 균주는 Penicillium sp. MFA577로 명명하고 2003년 11월 18일 한국농용미생물보존센터(KACC)에 기탁하여 수탁번호 KACC-93011을 부여받았다.

제 2단계: 신규화합물 추출 및 분리

상기 실험에서 배양한 균사체와 배양액을 여과하여 분리하였다. 균사체(mycelial mat)를 동결건조한 후, CH₂Cl₂-MeOH(1:1)를 이용하여 추출하였다. 그 결과 얻어진 추출물(4.8g)을 H₂O-MeOH(0-100% MeOH)를 용매로 한 역상 컬럼 크로마토그래피(reversed-phase flash column chromatography)(YMC ODS-A gel)을 사용하여 4개의 분획물로 분획하였다. 그 중 라디칼 소거능이 관찰된 분획물 3(410mg)을 n-헥산-EtOAc(15:1 - 5:1)를 용매로 한 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography)로 분리하고, 이어 HPLC(YMC ODS-A, 10×250mm)(MeOH)로 정제하여 구조식 (3)의 파르네실하이드로퀴논 61mg과 구조식 (4)의 세스퀴터펜 퀴논 12.0mg을 얻었다. 한편, 암세포독성작용과 항균작용을 1차 검색한 결과 적절한 활성이 관찰된 분획물 4(84mg)를 n-헥산-EtOAc(5:1 - 1:1)를 용매로 한 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography)로 분리하고, 이어 HPLC(YMC ODS-A, 10×250mm)(MeOH)로 정제하여 18.0mg의 신규화합물 1과 3.0mg의 신규화합물 2를 분리하였다.

<실시예 2: 신규화합물의 구조결정>

상기 실시예 1에서 분리된 2개의 신규화합물의 구조를 결정하기 위하여 2D NMR과 α-에폭시케톤의 코톤효과를 관찰하기 위한 CD를 포함한 분광학적 분석방법을 실시하였다.

본 발명에서 비선광도는 퍼킨 앨머 모델 341 편광계(Perkin Elmer model 341 polarimeter)를 사용하여 측정하였고, IR 스펙트럼은 브루커 FT-IR 모델 IFS-88 분광계(Bruker FT-IR model IFS-88 spectrometer)를 사용하여 기록하였다. NMR 스펙트럼은 일본 전자 모델 JEOL JNM-ECP 400 NMR〔¹H (400 MHz) 및 ¹³C (100 MHz) NMR〕을 이용하여 측정하였으며, 내부표준물질은 TMS 또는 용매 피크를 이용하였다. 그리고, 자외선-가시광선 분광계는 히타치 모델 U-2001(Hitachi U-2001 UV/Vis spectrometer)를 사용하여 측정하였다.

상기와 같이 측정한 결과, 본 발명의 신규화합물 1의 물리화학적 성질은 다음과 같다.

본 발명 신규화합물 1(7-디아세톡시야뉴손 A)의 물리화학적 특성

구분	물리화학적 특성
외관	황색 오일
광학활성	[α]_D+3.1°(c 0.5, CHCl₃)
IR 스펙트럼(KBr, cm^-1)	3431, 1680, 1440, 1381, 1274, 1108, 1029, 999, 871
UV 스펙트럼(MeOH, nm)	203 (log ε4.6), 238 (4.2)
LRFABMS(m/z)	367 [M+Na]⁺ (5), 345 [M+H]⁺ (15)
HRFABMS(m/z)	345.2432 (calcd for C₂₂H₃₂O₃, 345.2430)
CD(MeOH)	340 (Δε+2.8), 256 (-1.2)

본 발명의 신규화합물 2의 물리화학적 특성은 다음과 같다.

본 발명 신규화합물 2(7-디아세톡시야뉴손 A의 2,3-알코올 유도체)의 물리화학적 특성

구분	물리화학적 특성
외관	불안정한 황색 오일
광학활성	[α]_D-2.1°(c 0.3, CHCl₃)
IR 스펙트럼(KBr, cm^-1)	3436, 1670, 1439, 1379, 1229, 1098, 998, 882, 832
UV 스펙트럼(MeOH, nm)	203 (log ε4.2), 238 (4.0)
LRFABMS(m/z)	385 [M+Na]⁺ , 363 [M+H]⁺
HRFABMS(m/z)	363.2538 (calcd for C₂₂H₃₅O₄, 363.2535)
CD(MeOH)	352 (Δε+0.2), 257 (-2.2)

또한 신규화합물 1과 2의 ¹H 및 ¹³C NMR 데이터는 하기 표 3과 같다.

7-디아세톡시야뉴손 A(1)와 그것의 2,3-알코올 유도체(2)^a의¹H 및¹³C NMR 데이터

탄소수	1		2
탄소수	δ_H	δ_C	δ_H	δ_C
1		193.3 (s)		190.5 (s)
2		61.6 (s)		68.4 (s)
3	3.69 (d, 3.0)	59.2 (d)	4.28 (d, 3.5)	74.5 (d)
4	4.41 (br, s)	67.6 (d)	4.73 (br, s)	68.8 (d)
5		155.8 (s)		158.2 (s)
6	5.77 (s)	123.6 (d)	5.95 (s)	123.9 (d)
7	2.00 (s)	20.1 (q)	2.07 (s)	20.2 (q)
1'	2.49 (dd, 15.5, 7.0)	26.0 (t)	2.85 (br, d, 8.0)	32.3 (t)
	2.80 (dd, 15.5, 7.0)
2'	5.01 (t, 7.0)	116.1 (d)	5.33 (dd, 7.0, 3.0)	117.1 (d)
3'		139.8 (s)		140.5 (s)
4'	1.97 (m)^b	39.6 (t)	2.13 (m)^c	39.9 (t)
5'	2.07 (m)^b	26.4 (t)	2.17 (m)^c	26.3 (t)
6'	5.07 (t, 7.0)	123.8 (d)	5.08 (m)^d	123.7 (d)
7'		135.2 (s)		135.5 (s)
8'	1.99 (m)^b	39.7 (t)	1.98 (m)^c	39.7 (t)
9'	2.03 (m)^b	26.7 (t)	2.11 (m)^c	26.7 (t)
10'	5.09 (t, 7.0)	124.3 (d)	5.10 (m)^d	124.3 (d)
11'		131.3 (s)		131.5 (s)
12'	1.68 (s)	25.7 (q)	1.69 (s)	25.7 (q)
13'	1.60 (s)	17.7 (q)	1.61 (s)	17.7 (q)
14'	1.59 (s)	16.0 (q)	1.61 (s)	16.1 (q)
15'	1.63 (s)	16.3 (q)	1.70 (s)	16.5 (q)

a : 400 MHz(¹H) 및 100 MHz(¹³H)의 CDCl₃ 용매에서 측정하여 기록한 것

b, c, d : 오버랩된 것.

신규화합물 1과 2의 구조식은 다음과 같다.

ㆍㆍㆍ(1)

ㆍㆍㆍ(2)

<실시예 3: 본 발명에 의한 신규화합물의 암세포독성작용 확인>

상기 구조식 (1)과 (2)로 표시되는 실시예 2의 신규화합물의 암세포독성작용을 확인하기 위하여, in vitro 에서 5종의 인간 고형암세포주 A549(Lung cancer), SK-OV-3(Ovarian cancer), SK-MEL-2(Skin cancer), XF498(CNS cancer), HCT15(Colon cancer)에 대한 암세포독성작용을 측정하였다.

상기 실시예 1에서 추출·분리한 신규화합물, 즉 구조식 (1)로 표시되는 7-디아세톡시야뉴손 A와 구조식 (2)로 표시되는 상기 화합물의 2,3-알코올 유도체의 추출물을 소량의 DMSO에 용해시키고, 실험용 배지로 원하는 농도만큼 희석하여 시료로 사용하였다. 이 때, 최종 DMSO의 농도는 0.5%이하가 되도록 하였으며, 이 농도에서는 5종의 세포주에 부작용을 나타내지 않았다.

암세포주는 인체 고형암 세포주인 A549(Lung cancer), SK-OV-3(Ovarian cancer), SK-MEL-2(Skin cancer), XF498(CNS cancer), HCT15(Colon cancer)의 5종을 한국 화학연구소에서 분양받아 실험에 사용하였으며, 상기 세포주들은 10%의 송아지 혈청(fetal bovine serum)이 포함된 RPMI 1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 존재 하에서 1주일에 1-2회 계대배양하였다.

항암활성검정은 SRB 분석법(Rubinstein 등, 1990; Skenhan 등, 1990)에 따라 검정하였는데, 96 well plate의 각 well에 5-20×10⁴ 개의 세포밀도로 접종하여 37℃, 5% CO₂ 존재 하에서 24시간 배양한 후, 다양한 농도의 시료를 첨가하고, 다시 48시간 반응시킨 후에 SRB 분석법에 의한 세포의 성장을 조사하여 ED₅₀값으로 나타내었다.

한편, 암세포독성활성 비교를 위하여 항암제의 일종인 독소루비신(doxorubicin) 및 구조식 (4)의 세스퀴터펜 퀴논에 대해서도 같은 실험을 실시하였다. 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

인간 고형암세포에 대한 본 발명 신규화합물(구조식 (1), 구조식 (2))의 세포독성(ED₅₀, ㎍/mL)

화합물	A549	SK-OV-3	SK-MEL-2	XF498	HCT15
7-디아세톡시야뉴손 A	7.74	6.35	3.86	10.04	10.07
2,3-알코올 유도체	7.96	6.78	4.12	10.53	10.35
세스퀴터펜 퀴논	25.44	37.29	18.41	38.07	42.56
독소루비신(doxorubicin)	0.02	0.09	0.04	0.02	0.79

상기 표 4에서 알 수 있듯이, 본 발명의 신규화합물 구조식 (1)의 7-디아세톡시야뉴손 A와 구조식 (2)의 2,3-알코올 유도체는 대략 3.86 ~ 10.53의 ED₅₀값을 나타내었다. 이는 세스퀴터펜 퀴논에 비하면 현저히 높은 활성이다. 다만 독소루비신에 비해서는 비교적 낮은 활성이라 하겠으나, 이제까지 개발된 항암제를 임상적으로 사용할 때 나타나는 치명적인 부작용, 내성발현, 임파구 및 골수세포의 파괴 등 문제점을 고려해 본다면, 본 발명 신규화합물이 나타내는 암세포독성활성은 정상적인 세포에는 독성을 일으키지 않으면서 각종 암세포에 대해서는 선택적인 독성을 나타낼 수 있는 적절한 수치라 할 것이다.

<실시예 4: 본 발명 신규화합물의 항균활성 확인>

구조식 (1)과 구조식 (2)로 표시되는 본 발명 신규화합물의 항균작용을 확인하기 위하여 메치실린-내성 및 다약제-내성인 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus)에 대한 항균활성을 측정하였다.

먼저, BHIA(Brain Heart Infusion Agar) 52g을 3차 증류수 1L에 충분히 혼합 한 후 천천히 가열하여 충분히 용해시키고 120℃에서 15분간 멸균한 후 4개(그 중 하나는 Blank)의 멸균한 시험관에 3mL씩 옮겨 담아 4℃ 냉장고에 응고될 때까지 사면으로 방치하였다. 시험균주 SA(Staphylococcus aureus), MRSA(Methicillin resistant S. aureus) 및 MDRSA(Multi-Drug resistant S. aureus)를 상기에서 만든 사면 배지에 각각 도말하여 37℃에서 17시간 배양하였다.

그 다음 BHI(Brain Heart Infusion) 37g을 3차 증류수 1L에 충분히 용해시키고 120℃에서 15분간 멸균한 후 이를 8개(그 중 2개는 Blank)의 멸균한 시험관에 1mL씩 옮겨담았다. 그 후, 상기 사면 배지에서 자란 균을 상기 BHI 배지 중 4개(그 중 하나는 Blank)에 각각 백금이로 접종하여 37℃에서 17시간 배양하였다.

상기 BHI 배지에서 자란 균을 다시 나머지 4개(그 중 하나는 Blank)의 BHI 배지에 백금이로 각각 접종하여 37℃에서 17시간 배양한 후 사용하였다.

한편, 시료제작을 위해 상기 실시예 1에서 추출·분리한 구조식 (1)과 구조식 (2)로 표시되는 신규화합물의 추출물을 각각 1mg씩 20% DMSO 용액 4mL에 용해시킨 다음 1mL를 취하여 2배식 희석하여 그 농도를 250㎍/mL, 125㎍/mL, 62.50㎍/mL, 15.63㎍/mL, 7.81㎍/mL로 조정하였다. 이 때, 표준시료는 옥사실리(Oxacilli)를 20% DMSO 용액에 용해시켜 제작하였다(16㎍/mL).

상기에서 제조한 각 농도의 시료 1mL를 멸균한 BHI 액체배지가 담겨있는 시험관에 각각 첨가한 다음, 37℃에서 5시간 배양한 시험균주 SA(Staphylococcus aureus), MRSA(Methicillin resistant S. aureus) 및 MDRSA(Multi-Drug resistant S. aureus)를 백금이로 접종하고 다시 37℃에서 20시간 배양 후 육안으로 관찰하여 배양이 억제된 항균물질의 농도를 최소 생장저해농도(MIC)로 결정하였다.

상기 실험결과를 나타내기 위하여 구조식 (1)과 구조식 (2)의 화합물에 따른 각 시험균주에 대한 농도별 MIC 수치를 평균하여 하기 표 5에 기재하였다.

본 발명 신규화합물(구조식 (1), 구조식 (2))의 항균활성(MIC,㎍/mL)

	SA	MRSA	MDRSA
7-디아세톡시야뉴손 A	50	50	50
2,3-알코올유도체	51	51	51
표준시료(Oxacilli)	63	65	65

상기 표 5에 따르면, 시험균주 SA, MRSA 및 MDRSA에 대한 구조식 (1)과 구조식 (2)로 표시되는 본 발명 신규화합물의 MIC 평균치는 50~51㎍/mL로서 항균제의 일종인 옥사실리(63~65㎍/mL)에 비해 뛰어난 in vitro 항균활성을 가짐을 알 수 있다.

이상 실시예 및 실험예를 통하여 설명한 바와 같이, 본 발명 해양균류 페니실륨속 균주(KACC 93011)로부터 분리한 구조식 (1)로 표시되는 7-디아세톡시야뉴손 A 및 구조식 (2)로 표시되는 상기 화합물의 2,3-알코올 유도체는, 5종의 인간 고형암세포주 A549(Lung cancer), SK-OV-3(Ovarian cancer), SK-MEL-2(Skin cancer), XF498(CNS cancer), HCT15(Colon cancer)에 대한 우수한 in vitro 암세포독성작용과 메치실린-내성 및 다약제-내성의 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus)에 대한 온화한 in vitro 항균활성을 가짐으로써 천연물 유래의 저독성 항암제 또는 항균제로 개발 가능하고, 상기 효능을 이용한 기능성 식품으로도 이용될 수 있어 의약산업 및 식품산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

해양균류 페니실륨속(Penicillium sp.) 균주(KACC-93011)로부터 분리되고 암세포독성작용 및 항균활성을 나타냄을 특징으로 하는 하기 구조식 (1)의 7-디아세톡시야뉴손 A(7-deacetoxyyanuthone A).

ㆍㆍㆍ(1)
해양균류 페니실륨속 균주(KACC-93011)로부터 분리되고 암세포독성작용 및 항균활성을 나타내는 하기 구조식 (2)로 표시됨을 특징으로 하는 상기 청구항 1의 화합물의 2,3-알코올 유도체.

ㆍㆍㆍ(2)
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