CN102181396B - 一种体外诱导神经干细胞定向分化为感觉神经元的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明请求保护一种通过物理因素和化学因子的联合作用，在体外诱导神经干细胞定向分化为感觉神经元的诱导方法。方法包括神经干细胞的分离和培养，然后将所获神经干细胞种植在细胞牵张应力装置的硅胶膜上，给予一定强度和时间的牵张刺激，并加入含NB+2%B27和维持浓度（500nM)维甲酸的培养基，最后通过对感觉神经元的特殊抗体免疫荧光染色和功能检测进行鉴定。本发明首次通过物理刺激和化学分子联合应用的方法将神经干细胞定向诱导为感觉神经元，该方法操作简单、成本低、重复性好，且神经干细胞向感觉神经元分化的比率约占分化神经元的15％,占神经干细胞分化细胞总数的5％，是一种将神经干细胞定向诱导为感觉神经元的新技术和新方法。
Description
技术领域
本发明涉及发育生物学和生物医学工程领域，具体涉及神经干细胞的定向分化研究，更具体的涉及体外诱导神经干细胞分化为感觉神经元的方法。
背景技术
神经干细胞(neural stem cell，NSC)的发现为脊髓损伤的修复与治疗带来了新的希望。由于NSC自我复制和多分化潜能，作为修复神经系统损伤的供体不但能满足移植时所需的细胞量，而且NSC在一定条件下能诱导分化为包括神经元在内的三种不同的神经细胞系。因此，将外源性的NSC通过移植治疗脊髓损伤并恢复机体功能，就具有重要的理论意义和良好的临床治疗前景。
通过大量的研究发现将神经干细胞移植到损伤脊髓组织后，99％以上的细胞均分化为星形胶质细胞，几乎没有神经元的存在。而神经元对脊髓损伤后功能的恢复起着决定性的作用。因此，能否首先在体外将NSC定向诱导分化为各种特定的神经元就成为制约其临床应用前景的至关重要的问题之一。
众多的研究表明,睫状神经营养因子(CNTF)可特异性地促进NSC分化成为星形胶质细胞; 脑源性神经营养因子（BDNF）、神经生长因子（NGF）、神经营养素－3（NT-3）、胶质源性神经营养因子（GDNF）、视黄酸等均可促进NSC向神经元方向分化。GDNF、甲状腺素3（T3）与维甲酸（RA） 通过Nurr1核转录因子诱导NSC分化为成熟的多巴胺能神经元。RA和软猬因子（Shh）联合应用可将NSC诱导分化为运动神经元。总之，目前对NSC定向分化的研究主要侧重于化学因素的影响，其诱导分化的神经元主要为运动神经元和多巴胺能神经元。而利用化学因子将NSC定向分化为感觉神经元的研究还未见明确的报道。由于感觉神经元是脊髓组织中不可或缺的重要组成部分，因此随着研究的深入，将NSC定向分化为感觉神经元无论对神经科学的基础研究还是临床治疗都具有重要的理论和实际应用价值。
在NSC分阶段分化过程中RA可将NSC诱导分化为脊髓的神经元前体细胞，而Wnt3a虽然在脊髓背侧神经元的发育中起着重要的作用，但却未能将RA诱导产生的神经元前体细胞进一步诱导为成熟的感觉神经元。发育学的研究表明：无论是低等还是高等的动物，其感觉系统的发育和可塑性变化均需要相应的物理刺激，例如视觉的发育与成熟需要光和色的刺激，听觉的发育需要声音的刺激。因此认为脊髓感觉神经元的发育与成熟除了化学因素的影响外，同样离不开有效的物理刺激条件。由此可见，将存在于化学环境作用下的NSC定向诱导分化为成熟的感觉神经元，物理因素也是不可缺少的重要诱导条件。
申请人通过离体的细胞学实验发现牵张刺激参与并诱导了感觉神经元的发育、成熟和对刺激的应答过程。由于感觉神经元在机体信息的传入、保持反射弧的完整以及全身肌张力的维持等方面均具有重要的作用，而其损伤后很难通过其它方式进行替代。因此，SCI后恢复感觉神经元的数目和功能不仅有助于减缓截瘫病人病情的恶化，促进患者感觉功能的恢复，而且也必将明显地促进损伤脊髓结构和功能的重建，对整个中枢神经系统损伤的再生修复以及神经组织工程学的研究也会产生积极的推动作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种体外诱导神经干细胞定向分化为感觉神经元的方法。
本发明首先将胚胎脊髓组织来源的NSC接种于含特定化学因子（RA）的无血清培养环境中，然后通过牵张应力对NSC进行物理刺激，通过物理的牵张应力和化学因子共同作用，将NSC定向诱导分化为感觉神经元。该发明不仅对SCI的救治与功能康复有重要的理论和实际意义，而且对整个神经系统组织工程中种子细胞的研究也有积极的推动作用。
本发明的方法包括以下步骤：
（1）神经干细胞的分离、培养与鉴定；
（2）神经干细胞的诱导分化：将神经干细胞接种到细胞牵张应力装置的硅胶膜上，进行牵张刺激，并加入由NB+2%B27和维持浓度的维甲酸（500nM）组成的培养基，于37℃,5％CO2,饱和湿度下，诱导神经干细胞定向分化为感觉神经元。
（3）感觉神经元的鉴定。
本发明中神经干细胞来源于分离的胚胎脊髓组织。
所述神经干细胞的培养方法：将分离的胚胎脊髓组织消化为单细胞后，加入含NB+2%B27＋20ng/ml bFGF＋100ng/ml胰岛素的培养基，于37℃,5％CO2,饱和湿度下进行培养。
在获得神经干细胞后，将其接种于牵张培养装置的弹性硅胶膜上，并将培养基更换为NB+2%B27+500nM维持浓度的维甲酸，同时对细胞进行牵张刺激，诱导10天后进行鉴定。
所述神经干细胞和感觉神经元采用形态学和功能相结合的办法进行鉴定。
本发明从胚胎脊髓组织中分离培养神经干细胞，并以该细胞为研究对象，通过机械牵张刺激和特定化学因子的联合作用，从物理和化学方法联合作用的角度提供了一种获得感觉神经元的新途径，为神经干细胞的定向分化提供了一种重要的研究思路，同时为神经组织工程的研究提供了一种新的种子细胞，也为探讨神经干细胞的定向分化、调控机制提供了新的研究线索，并为神经干细胞移植治疗脊髓损伤奠定了理论和实验基础。
本发明的方法操作简单，重复性好，分化的感觉神经元数量占分化神经元的比率约为15％,占神经干细胞分化细胞总数的5％左右。参见图1，图为脊髓神经干细胞牵张应力10天后，分化细胞的免疫荧光染色，其中
A. 分化细胞SP免疫荧光染色；B.分化细胞β-tublin免疫荧光染色；C:A\B两图的重叠，显示SP和β-tublin双阳性细胞。
D. 分化细胞SP免疫荧光染色;E.分化细胞DAPI染色，显示所有分化数量；F. D\E两图的重叠，显示SP阳性细胞与所有分化细胞。
附图说明
图1. 牵张应力作用下，脊髓神经干细胞的分化情况；
图2. 脊髓神经干细胞牵张应力10天后，分化细胞的免疫荧光染色；
图3. 感觉神经元的刺激物P物质作用下，分化神经元细胞内钙离子变化情况。
具体实施方式
1．神经干细胞的分离培养：采用原代培养的方法，将大鼠12-14天胚胎的脊髓组织放入D-Hanks液中，用眼科剪剪碎组织并用吸管轻轻吹打，然后依次用100、200目的筛网过滤制备单细胞悬液，记数后以5×106个/cm2接种,加入NB+2％N2+20ng/ml bFGF+100ng/ml胰岛素的无血清培养基进行原代及传代培养。待克隆形成后，收集悬浮生长的神经干细胞团，进行传代培养。
2．神经干细胞的鉴定: 通过Brd-U标记，Nestin抗体免疫组化双标染色鉴定神经干细胞。
3．从神经干细胞诱导分化为感觉神经元：取第2～4代的纯化的神经干细胞,以1×105 /ml 密度接种，接种于硅胶膜培养板上，加入含500nM RA的NB+2%B27的无血清培养基，细胞贴壁6小时 后, 通过细胞牵张应力装置加载力学干预, 参数: 非等轴牵张、力大小(12%的形变率) 、每天2次（上午10点、下午3点）加载，每次持续1小时，干预10天，其中每三天更换一次培养基。所采用的细胞牵张应力装置可以采用申请人已获授权的新型实用专利(专利号：ZL 2009 2 0126151.6)或专利号分别为：ZL200720123317.X 和 ZL200520079070.7的新型实用专利。
4．感觉神经元的鉴定：
（1）形态学鉴定：取分化的培养细胞，用4%多聚甲醛固定20分钟，0.01M的PBS洗3次后，0.3%H2O2/甲醇封闭内源性过氧化物酶和正常血清封闭后，分别加入一定比例稀释后的小鼠抗大鼠β-tublin（sigma,1:800）,兔抗大鼠SP（chemicon,1:1000），孵育24小时，并加入相应的荧光二抗进行免疫荧光双标染色，检测NSC分化为感觉神经元的比例。
（2）功能鉴定：将分化后的细胞用D-Hanks液洗2-3次，放入含2umol/l Fluo-4/AM与2ml Pluonic F-127(200g/L)的D-Hanks液中于37℃负载45分钟，然后给予感觉神经元的刺激物P物质进行实时刺激，通过激光共聚焦扫描显微镜检测观察细胞内钙离子浓度的变化情况。其中荧光探针Fluo-4/AM激发波长494纳米，发射波长516纳米，扫描间隔时间12秒，细胞内Ca2+浓度=Kd(F-Fmin)/(Fmax-F),其中F：检测到的荧光强度；Fmax为加入5mmol/L CaCl2缓冲液和Ca2+载体A23187后细胞内饱和时的荧光强度，Fluo-4的值为345mmol/L。
5．结果
神经干细胞在NB+B27+RA的培养基中培养一天后，细胞就发生贴壁。在无血清培养条件下，牵张应力作用3天后，在干细胞球周围可见分化细胞胞体较小，并有较长突起，形态上类似神经元细胞。7天后分化细胞数量增多，突起明显曾长，在牵张应力作10天后，分化细胞互相连成网状（结果见图1，图中A.牵张应力3天后脊髓神经干细胞的分化；B. 牵张应力7天后脊髓神经干细胞的分化；C. 牵张应力10天后脊髓神经干细胞的分化），经β-tublin（sigma,1:800）和SP（chemicon,1:1000）免疫双标染色后发现，在β-tublin阳性表达的细胞中约有15％的细胞同时表达SP蛋白，说明该类型的分化细胞为感觉神经元（结果见图2）。同时通过Fura-4标记的感觉神经元细胞，在给予感觉神经元的刺激物P物质进行刺激后，可观察到细胞内钙离子浓度明显增高，表明分化的感觉神经元具有基本的电生理活动，（结果见图1）说明通过物理牵张刺激和特定化学分子RA联合作用可将神经干细胞诱导分化为具有功能的感觉神经元细胞。
Claims (2)
1.体外诱导神经干细胞定向分化为感觉神经元的方法，包括以下步骤：
在含有NB+2%B27和维持浓度维甲酸500 nM的培养基中培养神经干细胞，然后接种到细胞牵张应力装置的硅胶膜上，进行物理牵张刺激，诱导神经干细胞定向分化为感觉神经元；
其中对细胞进行物理牵张刺激的参数为：非等轴牵张，12%形变大小的持续牵张，每天两次，每次1小时，连续牵张10天，其中每三天更换一次培养基。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述神经干细胞来源于大鼠胚胎脊髓组织。
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