CN101294146A - 诱导神经干细胞分化的系统及诱导方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备神经干细胞的方法，包括用N2B27培养基诱导培养P19细胞，获得的细胞群中神经干细胞可占94％以上。本发明的方法在无血清环境中培养P19细胞且无需视黄酸的参与，既可排除成分复杂的血清的干扰，又可避免获得的神经干细胞被视黄酸后方化，并且，所述方法不导致选择性细胞凋亡，是一个直接从多潜能干细胞到神经干细胞的命运转变过程。本发明获得的神经干细胞具有前端神经板特性以及分化全能性，可很好地模拟体内的神经发生过程，因此可以作为研究模型，用于分析从上胚层细胞到神经外胚层的神经诱导和神经分化过程，为研究胚胎着床后的发育事件提供了理想途径。

Description

诱导神经干细胞分化的系统及诱导方法

技术领域

本发明属于生物技术和细胞生物学领域，更特别的，本发明涉及诱导神经干细胞分化的方法以及通过所述方法获得的神经干细胞。

背景技术

小鼠的早期胚胎发育是一个复杂的过程。在妊娠早期(E2.5-E4.5)，小鼠胚胎由滋养外胚层(Trophectoderm)和内细胞团(Inner cell mass，ICM)组成。伴随着发育的进行，ICM细胞经过重组，形成了另一群多潜能的上皮样细胞，即上胚层(Epiblast)(E4.5-E6.5)。上胚层的细胞经过原肠运动形成小鼠胚胎的三个胚层(E6.5-E7.5)，即外胚层(Ectoderm)，中胚层(Mesoderm)和内胚层(Endoderm)。随后胚胎发育进入器官形成期(organogenesis stage)(E7.5-E12.5)。这一时期中，最早开始发育的是神经系统，前方外胚层衍生出神经板(neural plate)结构，神经板再演化为神经管(neural tube)，最后形成中枢神经系统，包括脑和脊椎。神经系统的发育开始之后，整个胚胎的躯体规划已经成型，可以看出头尾。与此同时心脏和循环系统也开始发育，随之而来的是身体其他内脏器官的发育。原肠运动对整个生命是如此重要，但由于技术手段的局限性，人们却对它所知甚少。就发育时间而言，上胚层在原肠运动前形成，可以直接响应来自原肠运动的信号。因此要研究胚胎着床后的发育事件，上胚层会是非常合适的选择。

早期的小鼠胚胎非常难以获得，要利用早期胚胎进行分子机制的研究一直举步维艰。来源于小鼠早期胚胎发育不同阶段的多潜能干细胞可作为研究体内早期发育的细胞模型。这些体外培养的干细胞具有与体内相应发育阶段的细胞类似的特征，而且就形态和分子标记的表达顺序而言，干细胞形成的胚胎样小体的发育过程与早期胚胎的发育过程非常类似，因此常被用于研究早期胚胎发生中重要事件的分子机制。ES细胞来源于E3.5天左右的ICM，具有ICM特征性的FGF4⁺FGF5^-的表达模式，以及与ICM相同的分化潜能，可以分化成完整的小鼠胚胎。

人们较感兴趣的是多潜能细胞如何作为研究早期神经系统发育的模型。在中枢神经系统发育早期，形成神经外胚层的细胞大多形成柱状上皮形状(神经上皮)并迅速增殖。稍后，这些细胞停止分裂并分化成神经元、星型胶质细胞或少突胶质细胞。这些神经上皮前体细胞的增殖及分化可以用神经上皮组织的原代培养进行有效的研究，但是想研究早期神经外胚层的发育就无计可施了。因此，用早期多潜能细胞建立体外分化成神经外胚层细胞的系统来研究胚胎发育早期的分子事件就成为极其有效的手段。

经过过去数十年的努力，现在已有几套比较成熟的方法从ES细胞来诱导体外神经外胚层，包括：1)用RA诱导经血清刺激的胚胎样小体(EBs)；2)在添加特定化学分子的无血清培液中培养胚胎样小体；3)ES在基质细胞表面无血清培养分化；4)条件性培养液培养分化；5)无血清培液中ES细胞贴壁分化。不过，这些方法各有不足之处。比如，有些方法需要在体外培养很长时间，在如此长的诱导时间里研究机制是比较困难的；有的需要与一些成分不确定的条件性培养液或者活性不明的基质细胞共培养，这样不利于明确分析神经诱导活性成分。在多数培养条件下，并不能得到高比例的神经干细胞，除非用特定的神经营养性培液来进行筛选。并且，这些方法得到的神经干细胞多数不具有特定的位置信息，这一点与体内情况是不一致的，因为体内神经外胚层细胞在形成初期是带有前端特性的(anterior character)。此外，ES细胞的神经诱导并不能很好的模拟体内诱导的过程。在体内，内细胞团必须重排组合形成上胚层后才会起始原肠运动，而神经诱导通常认为在原肠运动早期发生。ES的神经诱导包含了从内细胞团到上胚层再到神经外胚层这样两个转换过程，那些对上胚层形成起作用的信号可能会干扰对神经诱导过程的研究。因此，建立一套从上胚层类似的细胞快速诱导高比例的，具有前端特性的神经干细胞的系统，来研究从上胚层到神经外胚层的神经诱导过程还是很有必要的。

小鼠胚胎性癌细胞P19在发育时期上类似于上胚层细胞，它们的细胞表面抗原表达模式和蛋白合成模式也和上胚层细胞同源，因此被广泛应用于研究胚胎发育原肠期的事件。现代发育生物学以P19细胞作为体外研究模型，在研究早期神经分化和肌肉分化的机制方面得到了长足的进展。在10^-6M视磺酸(RA)的诱导下，P19细胞经过成团过程(aggregation)可以分化为神经元和神经胶质细胞。此方法被广泛应用于研究早期神经诱导分化过程中的分子机制。不过，这个方法有几个缺点。首先，RA诱导的P19胚胎样小体是一个比较杂的群体，其中只有较低比例的神经干细胞，其它都是杂细胞，这会严重干扰对神经分化机制的研究；其次，在胚胎发育早期抑制体内RA信号通路并不影响神经板/神经管的形成，这就提示在体内RA信号并不参与神经诱导过程，因此，用RA诱导P19神经分化的系统来研究分子机制并不能很好的模拟体内的神经发生过程；再次，RA在体内的作用主要在于中枢神经系统前后轴模式的形成。它能把前端的神经组织后方化，并且阻碍前端神经组织的形成。在体外用RA处理ES细胞形成的胚胎样小体同样会影响诱导的神经干细胞的位置特性。并且经RA诱导形成的神经干细胞在发育潜能上有限制，只能形成有限的神经细胞类型。

因此，本领域还有必要进一步开发制备神经干细胞的方法，从而有利于分析从上胚层细胞到神经外胚层的神经诱导和神经分化过程，为研究胚胎着床后的发育事件提供更理想的途径。

发明内容

本发明的目的在于提供一种促进P19胚胎性癌细胞生成神经干细胞的方法。

本发明的另一目的在于提供一种通过所述的方法制备获得的细胞群，所述细胞培养物中神经干细胞占所有细胞的80-100％。

在本发明的第一方面，提供一种促进P19胚胎性癌细胞生成神经干细胞的方法，所述方法包括：用N2B27培养基诱导培养P19胚胎性癌细胞，从而使P19胚胎性癌细胞形成神经干细胞。

在另一优选例中，所述的培养基中基本上不含有视黄酸(RA)和血清。优选的，所述的培养基中视黄酸的含量低于0.01μM；更优选的，所述的培养基中视黄酸的含量低于0.005μM；最优选的，所述的培养基中视黄酸的含量低于0.001μM。

在另一优选例中，所述的N2B27培养基中血清的含量低于1％(v/v)。更优选的，所述的N2B27培养基中血清的含量低于0.5％(v/v)；最优选的，所述的N2B27培养基中血清的含量低于0.1％(v/v)。

在另一优选例中，所述的N2B27培养基含有：

(a)加入了Ins、TF、Pro、Put、Sel和BSA的DMEM/F12培养基；和

(b)加入了B27的Neurobasal培养基；

其中，(a)与(b)以(1-2)∶(1-2)的比例混合。更优选的，(a)与(b)以1∶1混合。

在另一优选例中，在(a)中，Ins的终浓度为15-35μg/ml；TF的终浓度为80-120μg/ml、Pro的终浓度为4-8nM、Put的终浓度为12-20μM、Sel的终浓度为20-40nM；或BSA的终浓度为35-75μg/ml。更优选的，Ins的终浓度为20-30μg/ml；TF的终浓度为90-110μg/ml、Pro的终浓度为5-7nM、Put的终浓度为14-18μM、Sel的终浓度为25-35nM；或BSA的终浓度为40-70μg/ml。

在另一优选例中，在(b)中，B27在Neurobasal培养基中的终浓度为1-3％(v/v)；更优选的，为1.5-2.5％(v/v)。

在另一优选例中，将P19胚胎性癌细胞在N2B27培养基中悬浮培养(即采用成团诱导的方式)。

在另一优选例中，诱导培养P19胚胎性癌细胞的时间是96±10小时。

优选的，诱导培养P19胚胎性癌细胞的时间是96±6小时；更优选的，诱导培养P19胚胎性癌细胞的时间是96±3小时；最优选的，诱导培养P19胚胎性癌细胞的时间是96±1小时。

在另一优选例中，培养条件是37±3℃，5±1％CO₂。更优选的，培养条件是37±1℃，5±0.5％CO₂。

在本发明的第二方面，提供一种制备富含神经干细胞的细胞群的方法，所述细胞群中神经干细胞占所有细胞的80-100％，所述方法包括：用N2B27培养基诱导培养P19胚胎性癌细胞，从而获得所述的细胞群。

优选的，所述细胞培养物中神经干细胞占所有细胞的85-100％；更优选的，所述细胞群中神经干细胞占所有细胞的90-100％。

在另一优选例中，诱导培养P19胚胎性癌细胞的时间是96±10小时。

在另一优选例中，将P19胚胎性癌细胞在N2B27培养基中悬浮培养。

在另一优选例中，所述的N2B27培养基中基本上不含有视黄酸(RA)和血清。

在另一优选例中，还包括：从富含神经干细胞的细胞群中分离所述的神经干细胞。

在本发明的第三方面，提供一种通过所述的方法制备获得的富含神经干细胞的细胞群，所述细胞群中神经干细胞占所有细胞的80-100％。

在另一优选例中，所述的神经干细胞是通过诱导P19胚胎性癌细胞直接从多潜能干细胞转变到神经干细胞而获得，不是通过选择性筛选(即：通过选择性筛选使非神经细胞凋亡)而获得。

在另一优选例中，所述的神经干细胞表达神经干细胞特异的分子标记Sox，不表达干细胞特异的分子标记Oct。

在另一优选例中，所述的神经干细胞是具有前端神经外胚层特性的细胞。

在另一优选例中，所述的神经干细胞可用于作为神经诱导模型，模拟体内从上胚层细胞到神经外胚层的分化过程，从而用于研究该分化过程的分化机制。

在另一优选例中，所述的神经干细胞表达放射状胶质细胞的分子标记Nestin、RC2、3CB2、Vimentin、Pax6。

在另一优选例中，所述的神经干细胞高表达神经外胚层的分子标记Sox1、Sox2、Sox3，低表达中胚层的分子标记Brachyury、Goosecoid，低表达内胚层的分子标记HNF3、GATA6。

在另一优选例中，所述的神经干细胞表达前端神经外胚层分子标记Otx2、Hesx1、Six3，不表达后方神经外胚层分子标记Gbx2，后脑和脊髓分子标记Hoxb4，脊髓分子标记Hoxb9。

在另一优选例中，所述的神经干细胞具有分化的全能性，可分化成神经元和神经胶质细胞。

在另一优选例中，所述的神经干细胞分化的神经元可表达胆碱能神经元的分子标记ChAT，GABA能神经元分子标记GAD67，谷氨酸能神经元分子标记VGLUT1，多巴胺能神经元分子标记TH，5-羟色氨能神经元分子标记TPH1，TPH2。

在本发明的第四方面，提供一种N2B27培养基的用途，用于诱导培养P19胚胎性癌细胞使之形成神经干细胞。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1A显示了RT-PCR检测内细胞团和上胚层的分子标记在ES细胞和P19细胞的表达情况的结果。以β-actin(RT⁺)(即模板为经过反转录的RNA)作为内标；β-actin(RT^-)(即模板为未经转录的RNA)用来证明RNA没有被基因组DNA污染。

图1B显示了免疫染色检测内细胞团和上胚层的分子标记FGF4和FGF5在ES细胞和P19细胞的表达情况的结果(a-d)；以及分子标记Gbx2的原位杂交结果(e，f)。

图2A显示了N2B27诱导的P19细胞的体外分化的基本步骤。

图2B显示了免疫染色检测P19细胞(P19EC)、诱导4天的P19细胞(P19Agg4d)、诱导4天且用RA处理的P19细胞(P19RA/Agg4d)、用N2B27无血清培液诱导4天的P19细胞(P19NB/Agg4d)表达Oct4、Sox的情况。

图2C显示了P19细胞(P19EC)、诱导4天的P19细胞(P19Agg4d)、诱导4天且用RA处理的P19细胞(P19RA/Agg4d)、用N2B27无血清培液诱导4天的P19细胞(P19NB/Agg4d)表达Oct4^-Sox⁺的情况的免疫染色计数。

图2D显示了对N2B27诱导1到4天的细胞进行染色分析并计数，确定Oct4⁺Sox⁺和Oct4^-Sox⁺的细胞比例。

图3A显示了免疫染色检测N2B27诱导的细胞放射状胶质细胞的分子标记(即Nestin，RC2，3CB2，Vimentin，Pax6)的表达情况。

图3B显示了对N2B27诱导的细胞进行染色分析并计数，确定表达Nestin，RC2，3CB2，Vimentin，Pax6的细胞比例。

图3C显示了RT-PCR检测RA诱导1-4天和N2B27诱导1-4天的P19细胞表达神经外胚层(Sox1，2，3)、中胚层(Brachyury，Goosecoid)、内胚层(HNF3β，GATA6)分子标记的情况。以β-actin(RT⁺)作为内标。

图3D显示了FACS检测未处理的P19细胞、RA诱导1-4天和N2B27诱导1-4天过程中细胞凋亡情况。

图3E显示了TUNEL染色检测未处理的(Agg4d)、RA处理的(RA/Agg4d)和N2B27处理的(NB/Agg4d)P19细胞的凋亡情况。

图4A显示了RT-PCR检测P19EC细胞、RA处理4天(RA4d)、N2B27处理4天(NB4d)、N2B27处理6天(NB6d)、N2B27处理8天(NB8d)、N2B27处理2天且RA处理2天(NB2dRA2d)、N2B27处理4天且RA处理2天(NB4dRA2d)、N2B27处理4天且RA处理4天(NB4dRA4d)的P19细胞表达前端神经外胚层的分子标记Otx2和Hesx1，前脑特异表达的同源盒基因Six3，中后脑界限处的分子标记Gbx2，后脑和脊髓的分子标记Hoxb4，脊髓的分子标记Hoxb9的情况。以β-actin(RT⁺)作为内标。

图4B显示了免疫染色检测N2B27处理4天(NB4d)，N2B27处理8天(NB8d)，N2B27处理4天且RA处理4天(NB4dRA4d)的P19细胞表达Hoxb4情况。

图4C显示了对N2B27处理4天(NB4d)，N2B27处理8天(NB8d)，N2B27处理4天且RA处理4天(NB4dRA4d)的P19细胞进行染色分析并计数，确定表达Hoxb4的细胞比例。

图5A显示了免疫染色检测N2B27诱导的细胞团在细胞分化后表达分子标记Tuj1、MAP2、GFAP、O4的情况。R1d表示重铺板(replating)第1天，R10d表示重铺板(replating)第10天。

图5B显示了对N2B27处理后重铺板0-7天(R0-R7)的细胞进行免疫染色计数分析，确定各个时间段表达Tuj1和MAP2的细胞比例。

图5C显示了RT-PCR检测未经处理的P19细胞、N2B27处理后重铺板5、9、11天(R5d、R9d、R11d)，RA处理后重铺板11天(RA/R11)的P19细胞表达胆碱能神经元的分子标记ChAT、GABA，谷氨酸能神经元分子标记VGLUT1，多巴胺能神经元分子标记TH，5-羟色氨能神经元分子标记TPH1，TPH2的情况。以β-actin(RT⁺)作为内标。

图5D显示了FACS检测未处理的P19细胞、RA诱导后重铺板1-4天和N2B27诱导后重铺板1-4天过程中细胞凋亡情况。

图5E显示了免疫染色检测N2B27诱导分化的细胞表达GAD65和VGLUT1的情况。

图5F显示了对N2B27诱导分化的细胞进行免疫染色计数分析，确定表达GAD65和VGLUT1的细胞比例。

图6A显示了免疫染色检测P19EC细胞、未经处理且成团培养4天(P19Agg4d)，RA处理4天(P19RA/Agg4d)、N2B27处理4天(R19NB/Agg4d)、N2B27和RA共处理4天(P19NBRA/Agg4d)的P19细胞表达Tuj1的情况。

图6B显示了对P19EC细胞、未经处理且成团培养4天(Agg4d)，RA处理4天(RA/Agg4d)、N2B27处理4天(NB/Agg4d)、N2B27和RA共处理4天(NBRA/Agg4d)的P19细胞进行免疫染色计数分析，确定Tuj1⁺和Oct4^-Sox⁺的细胞比例。

图6C显示了RT-PCR检测N2B27处理4天(NB4d)，RA处理4天(RA4d)，N2B27和RA共处理4天(NBRA4d)的P19细胞的中胚层和内胚层分子标记(Brachyury、Goosecold、HNF3β和GATA6)的表达情况。以β-actin(RT⁺)作为内标。

图6D显示了RT-PCR检测N2B27处理4天(NB4d)，N2B27和RA共处理4天(NBRA4d)的P19细胞的Otx2、Hesx1、Six3、Gbx2、Hoxb4、Hoxb9的表达情况。以β-actin(RT⁺)作为内标。

图7A显示了RT-PCR检测RA处理(RA/Agg)1-4天和N2B27处理(NB/Agg)1-4天的P19细胞表达BMP2、BMP4、BMP7、Noggin、Chordin、Follistatin的情况。以β-actin(RT⁺)作为内标。

图7B显示了荧光素酶法检测P19细胞成团培养1-4天，RA处理1-4天(RA/Agg)，N2B27处理1-4天(NB/Agg)，N2B27和RA共处理1-4天(NBRA/Agg)的P19细胞的荧光素酶报告基因活性。

图7C显示了未处理的P19细胞，N2B27诱导且加入BMP或者同时加入BMP和Noggin后P19细胞的荧光素酶报告基因活性。

图7D显示了对N2B27处理4天且不加入BMP和Noggin、加入BMP或同时加入BMP和Noggin的P19细胞进行免疫染色计数分析，确定Oct4⁺Sox⁺和Oct4^-Sox⁺的细胞比例。

图8A显示了RT-PCR检测未处理的P19细胞，RA处理1-4天(RA/Agg)，N2B27处理1-4天(NB/Agg)的P19细胞表达FGF1、FGF2、FGF4、FGF5、FGF8的情况。以β-actin(RT⁺)作为内标。

图8B显示了对N2B27处理4天且不加入SU5402和Noggin、加入SU5402、同时加入SU5402和Noggin的P19细胞进行免疫染色计数分析，确定Oct4⁺Sox⁺和Oct4^-Sox⁺的细胞比例。

图8C显示了未处理的P19细胞，N2B27诱导且加入SU5402或者同时加入SU5402和Noggin后P19细胞的荧光素酶报告基因活性。

图8D显示了对N2B27处理4天(NB4d)，N2B27和SU5402共处理4天(NB SU54024d)，N2B27和U0126共处理4天(NB U0126 4d)，N2B27和Wortmannin共处理4天(NB Wortmannin 4d)，N2B27和U73122共处理4天(NB U731224d)的P19细胞进行免疫染色计数分析，确定Oct4⁺Sox⁺和Oct4^-Sox⁺的细胞比例。

图8E-G显示了Western Blot检测未经处理的P19细胞(P19N)，N2B27处理30分钟(P19NB30’)，N2B27处理1小时(P19NB1hr)，N2B27和U0126共处理30分钟(P19NB U012630’)，N2B27和FGF共处理10分钟(P19NB FGF 10’)，N2B27和U0126和FGF共处理10分钟(P19NB FGF U012610’)的P19细胞，MAPK/ERK(E)，PI3K/Akt(F)，和PLC-γ(G)信号途径的活化情况。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，意外地发现，采用N2B27诱导培养P19胚胎性癌细胞，可获得含有高比例神经干细胞的细胞群，所述的神经干细胞具有前端神经外胚层特性及分化全能性。并且，N2B27的神经诱导并不伴随着中胚层和内胚层的诱导，不是通过非神经细胞的选择性凋亡来实现的。在此基础上完成了本发明。

P19胚胎性癌细胞

如本文所用，所述的P19胚胎性癌细胞简称为P19细胞，或P19EC细胞，其来源于上胚层细胞形成的畸胎瘤。

所述的P19胚胎性癌细胞是将上胚层来源的细胞植入成年小鼠的睾丸形成畸胎瘤，进而分离出的细胞系，是具有发育全能性的干细胞，在特定诱导剂作用下可以分化出三个胚层来源的所有细胞，只是不能整合至生殖嵴并发育为有功能的生殖细胞。双向电泳实验也表明，P19EC细胞的表面抗原表达模式和蛋白合成模式与E5.5天的上胚层同源，因此P19细胞在发育阶段上与上胚层类似。

在本发明中，可采用本领域技术人员已知的P19细胞的培养方法和培养基来培养P19细胞，并使之传代。

促进P19胚胎性癌细胞生成神经干细胞的方法

本发明提供了一种促进P19胚胎性癌细胞生成神经干细胞的方法，所述方法包括：用N2B27培养基诱导培养P19胚胎性癌细胞，从而诱导P19胚胎性癌细胞形成神经干细胞。

在诱导培养时，采用的诱导培养的培养基中基本上不含有视黄酸(RA)和血清。如本文所用，所述的“基本上不含有视黄酸”是指：所述的培养基中视黄酸的含量低于0.01μM；更优选的，视黄酸的含量低于0.005μM；最优选的，视黄酸的含量低于0.001μM。所述的“基本上不含有血清”是指：所述的N2B27培养基中血清的含量低于1％(v/v)；更优选的，血清的含量低于0.5％(v/v)；最优选的，血清的含量低于0.1％(v/v)。

由于(1)RA只能诱导低比例的神经干细胞，并且在诱导同时就将其后方化，与体内的神经诱导过程不一致，(2)RA在体内并不行使神经诱导的功能，因此，RA诱导的神经分化不是很好的研究早期胚胎神经分化的模型。本发明人在对P19细胞的培养中不加入RA，不加入血清，利用N2B27诱导出高比例的具备前端特性的神经干细胞群体。这些神经干细胞具有分化多潜能性，在体外能分化出高比例的神经元，同时也能分化出星形胶质细胞和少突胶质细胞；并且，它们能被后方化因子RA有效后方化。

通常，本领域人员采用贴壁培养或悬浮培养等方法来诱导培养神经干细胞。本发明人在研究中发现，采用悬浮培养的方式来培养P19细胞，有利于P19细胞在N2B27培养液中良好地形成胚胎样细胞团。因此，作为本发明的优选方式，将P19胚胎性癌细胞在N2B27培养基中悬浮培养。

由于在培养P19细胞的过程中，P19细胞处于不断的生长和分化中，因此，在诱导培养过程中，需要控制时间以获得最高比例的神经干细胞。本发明人在研究中发现，利用N2B27诱导培养96±10小时，可获得较高比例的神经干细胞；而当诱导培养时间为48小时以内时，细胞培养物中神经干细胞的比例很低(低于20％)，当诱导培养时间超过106小时后，N2B27诱导的神经干细胞开始分化出神经元，不再是神经干细胞了。因此，作为本发明的优选方式，利用N2B27培养基诱导培养P19胚胎性癌细胞的时间是96±10小时；更优选的，诱导培养P19胚胎性癌细胞的时间是96±6小时；进一步优选的，诱导培养P19胚胎性癌细胞的时间是96±3小时；最优选的，诱导培养P19胚胎性癌细胞的时间是96±1小时。

作为本发明的优选方式，细胞培养的条件是37±3℃，5±1％CO₂。更优选的，培养条件是37±1℃，5±0.5％CO₂。

培养基

1.N2B27诱导培养基

以往，N2B27培养基通常被用于培养原代神经细胞以及诱导ES细胞向神经方向分化。然而，在ES细胞培养中采用贴壁诱导且方法复杂。通常人们认为N2B27适合于培养已经分化的神经细胞，然而还没有将之用于培养P19细胞来诱导神经干细胞产生的报道。

如本发明所用，所述的N2B27培养基含有：(a)加入了牛胰岛素(Ins)、转铁蛋白(TF)、孕酮(Pro)、尸胺(Put)、硒酸钠(Sel)和牛血清白蛋白(BSA)的DMEM/F12培养基；和(b)加入了B27(基本上不含维生素A)的Neurobasal培养基；其中，(a)与(b)以(1-2)∶(1-2)的比例混合(更优选的，(a)与(b)以1∶1混合)。

作为优选的方式，在(a)中，Ins的终浓度为15-35μg/ml；TF的终浓度为80-120μg/ml、Pro的终浓度为4-8nM、Put的终浓度为12-20μM、Sel的终浓度为20-40nM；或BSA的终浓度为35-75μg/ml。更优选的，Ins的终浓度为20-30μg/ml；TF的终浓度为90-110μg/ml、Pro的终浓度为5-7nM、Put的终浓度为14-18μM、Sel的终浓度为25-35nM；或BSA的终浓度为40-70μg/ml。

作为优选的方式，在(b)中，B27在Neurobasal培养基中的终浓度为1-3％(v/v)；更优选的，为1.5-2.5％(v/v)。

2.分化培养基

在本发明中，对用于培养神经干细胞使之分化的培养基没有特别的限制，通常根据所需获得的神经细胞的种类的不同而不同。例如，可在分化培养基中加入血清来使神经干细胞尽可能多地分化为胶质细胞；或者，利用无血清的分化培养基来使神经干细胞尽可能多地分化为神经元。

作为本发明的一种方式，采用N2培养基作为神经干细胞的分化培养基，所述的培养基质中不含有血清。作为本发明的实例，所述的N2培养基含有：加入了Ins、TF、Pro、Put和Sel的DMEM/F12培养基。

优选的，在N2培养基中，Ins的终浓度为3-7μg/ml；TF的终浓度为30-70μg/ml、Pro的终浓度为15-25nM、Put的终浓度为45-75μM、Sel的终浓度为20-40nM。更优选的，在含有N2的培养基质中，Ins的终浓度为4-6μg/ml；TF的终浓度为40-60μg/ml、Pro的终浓度为18-22nM、Put的终浓度为55-65μM、Sel的终浓度为25-35nM。

富含神经干细胞的细胞群

本发明还提供了一种制备富含神经干细胞的细胞群的方法，所述细胞群中神经干细胞占所有细胞的80-100％(优选的，所述细胞培养物中神经干细胞占所有细胞的85-100％；更优选的，所述细胞培养物中神经干细胞占所有细胞的90-100％)，所述方法包括：用N2B27培养基诱导培养P19胚胎性癌细胞，从而获得所述的细胞群。

所述的N2B27培养基中基本上不含有视黄酸(RA)和血清。

本发明还提供了通过所述的方法制备获得的富含神经干细胞的细胞群，所述细胞群中神经干细胞占所有细胞的80-100％。

经过本发明人的验证，在N2B27诱导培养4天左右后，所获得的神经干细胞表达神经干细胞特异的分子标记Sox，不表达干细胞特异的分子标记Oct。

并且，本发明的方法获得的神经干细胞表达放射状胶质细胞的分子标记Nestin、RC2、3CB2、Vimentin、Pax6。

并且，本发明的方法获得的神经干细胞表达前端神经外胚层分子标记Otx2、Hesx1、Six3，不表达后方神经外胚层分子标记Gbx2，后脑和脊髓分子标记Hoxb4，脊髓分子标记Hoxb9。因此，所述的神经干细胞是具有前端神经外胚层特性的细胞。

并且，本发明的方法获得的神经干细胞具有分化的全能性，可分化成神经元和神经胶质细胞。

并且，本发明的方法获得的神经干细胞高表达神经外胚层的分子标记Sox1、Sox2、Sox3，低表达中胚层的分子标记Brachyury、Goosecoid，低表达内胚层的分子标记HNF3、GATA6。

并且，本发明的方法获得的神经干细胞分化的神经元可表达胆碱能神经元的分子标记ChAT，GABA能神经元分子标记GAD67，谷氨酸能神经元分子标记VGLUT1，多巴胺能神经元分子标记TH，5-羟色氨能神经元分子标记TPH1，TPH2。

作为本发明的一种方式，还可以从富含神经干细胞的细胞群中分离所述的神经干细胞。本发明对分离神经干细胞的方法没有特别的限制，可采用本领域常规使用的方法。

所述的富含神经干细胞的细胞群或分离的神经干细胞可用于作为神经诱导模型，模拟体内从上胚层细胞到神经外胚层的分化过程，从而用于研究该分化过程的分化机制。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明首次揭示了采用N2B27诱导培养P19胚胎性癌细胞，可获得含有高比例神经干细胞的细胞培养物，所述的神经干细胞具有前端神经外胚层特性以及分化全能性。本发明的培养神经干细胞的方法比之传统的RA诱导方法的优势在于：(a)在无血清的环境中培养，排除了成分复杂的血清的干扰；(b)不需要RA的参与，避免获得的神经干细胞被RA后方化；(c)能够得到高比例(94％以上)的神经干细胞。

(2)采用本发明的方法获得的神经干细胞具有前端神经板特性，可很好地模拟体内的神经发生过程，因此其可以作为研究模型，用于分析从上胚层细胞到神经外胚层的神经诱导和神经分化过程，为研究胚胎着床后的发育事件提供了更理想的途径。

(3)本发明方法条件易于控制、操作简单、成本低廉。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

I.材料与方法

细胞：P19C6细胞(购自日本理化学研究所细胞库)。

细胞培养DMEM/F12细胞培养基，多聚赖氨酸(PLL)，牛胰岛素(Ins)，转铁蛋白(TF)，尸胺(Put)，孕酮(Pro)，硒酸钠(Sel)，全反式视磺酸(RA)，多聚甲醛，DMSO。以上试剂为Sigma公司产品。

MEM细胞培养基(Minimal Essential Medium Alpha Medium)，NeuralBasal细胞培养基，B27(不含维生素A)，胰蛋白酶-EDTA，纤粘蛋白，牛血清白蛋白(BSA)。以上试剂为Gibco公司产品。

胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS，Hyclone)。

分子标记及其检测抗体见表1；用于检测分子标记的引物见表2。

表1

分子标记	一抗来源	二抗
			FGF5	Abcam	CY3-偶联的羊抗小鼠IgG
FGF4	Abcam	FITC-偶联的羊抗小鼠IgG
			Sox	Abcam	FITC-偶联的羊抗兔IgG
Nestin	Abcam	FITC-偶联的羊抗兔IgG
			RC2	Developmental Studies Hybridoma Bank(DSHB)	CY3-偶联的羊抗小鼠IgG
3CB2	DSHB	CY3-偶联的羊抗小鼠IgG
			Vimentin	DSHB	CY3-偶联的羊抗小鼠IgG
Pax6	DSHB	FITC-偶联的羊抗小鼠IgG
			Hoxb4	DSHB	CY3-偶联的羊抗小鼠IgG
Tuj1	COVANCE	FITC-偶联的羊抗小鼠IgG
			MAP2	Sigma	CY3-偶联的羊抗小鼠IgG
GFAP	Sigma	FITC-偶联的羊抗小鼠IgG
			O4	Chemicon	CY3-偶联的羊抗小鼠IgG
GAD65	Sigma	CY3-偶联的羊抗小鼠IgG

*所有的二抗均购自Jackson ImmunoResearch Laboratories。

表2

分子标记	正向引物	SEQ ID NO：	反向引物	SEQ ID NO：
					FGF5	aaagtcaatggctcccacgaa	1	cttcagtctgtacttcactgg	2
FGF4	gaggcgtggtgagcatctt	3	acactcggttccccttcttg	4
					Gbx2	cggcaacttcgacaaagc	5	agagagaagctctcctccttgc	6
Crtrl	cctgctcccatcagcctcta	7	gcctcacattcctgcctttg	8
					Rex1	gtgtaacatacaccatccg	9	aaatcctcttccagaatgg	10
Oct4	cagaagaggatcaccttggg	11	gtgagtgatctgctgtaggg	12
					Sox1	gcacacagcgttttctcgg	13	acatccgactcctcttccc	14

Sox2	acctacagcatgtcctactcg	15	gggcagtgtgccgttaatgg	16
					Sox3	tctccgccgcccgccatccgttcg	17	ccgttccattgaccgcagtc	18
Brachyury	aagaaacgaccacaaagatg	19	tggtaccattgctcacagac	20
					Goosecoid	agcatgttcagcatcgacaa	21	cgtagaagtagctgttgtag	22
HNF3	actggagcagctactacg	23	cccacataggatgacatg	24
					GATA6	agacataacattccttcgatgcg	25	ttccaagtgacctcagatcagc	26
Otx2	cacttcgggtatggactt	27	tgattgagatggctggtaa	28
					Hesx1	gggaaggtgctcagctc	29	cgtcctcggtaccaactc	30
Six3	ggtttaagaaccggcgacag	31	taccgagaggatcgaagtgc	32
					Gbx2	cggcaacttcgacaaagc	33	agagagaagctctcctccttgc	34
Hoxb4	cctggatgcgcaaagttc	35	gtgttgggcaacttgtggtc	36
					Hoxb9	ggaagcgaggacaaagagag	37	ttgaggagtctggccacttc	38
GAD67	tacggggttcgcacaggtc	39	ccccaagcagcatccacat	40
					ChAT	ggccattgtgaagcggtttg	41	tgacatgctcgggctcaggc	42
VGLUT1	gagcgcaaatacattgaggatgc	43	caaaagttcgcaacgatgatgg	44
					TH	agggatgggaatgctgttctca	45	accaggtggtgacacttgtccaa	46
TPH1	aacaaactctacccgaccca	47	gcacagcccaaactccac	48
					TPH2	ctccaaactctacccgactc	49	taaccctgctccatacgc	50
BMP2	ccaggttagtgattcagaacac	51	tcatcttggtgcaaagacctgc	52
					BMP4	ccagtctcgtgtccagtagtcg	53	tagcaagagtgccgtcattcc	54
BMP7	tgggcttctgaggagggctggttg	55	tggcgtggttggtggcgttcat	56
					Noggin	cgaacatccagaccctatcttt	57	tcaggcgctgtttcttgccttg	58
Chordin	ggacactgcaccttctcaca	59	gcatctgccagagacgaaca	60
					Follistatin	ctggcgtatgtggcattgtc	61	agagcagccggaactagaag	62
FGF1	tatcacgtcactgtgtgcttgg	63	ttcatttgaacagcattctctgg	64
					FGF2	caagcggctctactgcaaga	65	cagctcttagcagacattgg	66
FGF4	gaggcgtggtgagcatctt	67	acactcggttccccttcttg	68
					FGF5	aaagtcaatggctcccacgaa	69	cttcagtctgtacttcactgg	70
FGF8	caggtgagggagcagagcct	71	agttgttctccagcacgatc	72

P19细胞的传代培养

P19细胞贴壁生长于25cm²培养瓶中，培液为5ml含10％FBS的DMEM/F12。隔天传代。传代时，吸去原有培液，用5ml PBS洗一遍，再加入0.5mlTrypsin-EDTA(1×)于37℃消化5分钟，取出轻轻拍打，使细胞脱壁。加入2.5ml含10％FBS的培养液终止胰酶作用，吹打成单细胞，并将所有细胞悬液转移到15ml离心管中。1,000rpm离心3min，弃上清。加入3ml含10％FBS的新鲜培养液将细胞充分悬浮，以3×10⁵细胞/瓶接种。细胞培养在37℃、5％CO₂的培养箱中。

N2B27诱导的P19细胞的体外分化

N2B27诱导的P19细胞的体外分化的基本步骤如图2A所示。

1.N2B27的配制和诱导

A.每50ml DMEM/F12(每1000ml配制的DMEM/F12中加入了31mg青霉素，50mg链霉素，2.2g碳酸氢钠；购自Invitrogen)中加入以下6种因子，使其终浓度分别为：25μg/mlIns，100μg/ml TF，6nM Pro，16μM Put，30nMSel，50μg/ml BSA；B.每50ml Neural Basal培养基中加入1ml B27(不含维生素A)(购自GIBCO)；A和B二者以1∶1混合。

P19细胞以1×10⁵细胞/ml的密度接种于底部不经处理的细菌培养皿(petri di sh)中，培养液为5ml N2B27，不加RA。P19细胞在此培液中形成胚胎样细胞团。成团诱导4天，中间换液一次，并将培液体积加倍。换液时用巴斯德吸管将细胞团小心地转移到15ml离心管中，1,000rpm离心3min。弃去上清，加入N2B27新鲜培液中，小心吹打均匀后分装至新的petri dish中，继续在37℃、5％CO₂培养。

2.N2培液的配制和体外分化

每100ml DMEM/F12中加入以下五种因子，使其终浓度分别为：5μg/mlIns，50μg/ml TF，20nM Pro，60μM Put，30nM Sel。

六孔板用1×PLL 37℃包被过夜(1-1.5ml/孔)。次日，回收1×PLL(4℃保存，可重复用一次)。d₂H₂O洗六孔板两次，超净台内晾干。收集诱导了四天的P19细胞团，1×Trypsin-EDTA消化为单细胞，按1.0×10⁶-1.5×10⁶细胞/孔的接种密度接种于六孔培养板中。培液为N2无血清培液。隔天换液。

RA诱导时采用的培养基的配制

采用的培养基为：α-MEM+10％FBS(v/v)。

α-MEM培养基配方为：每1000ml α-MEM培养基中加入：青霉素31mg，链霉素50mg，碳酸氢钠2.2g。当需要进行RA诱导时，在该培养基中加入RA至所需浓度(1μM)。

细胞免疫荧光染色

1.培养细胞的固定

用PBS分3次取代原有的培液，之后在预冷的4％PFA中4℃固定30min。而后在-20℃预冷30min的CMA(氯仿∶甲醇∶丙酮＝1∶2∶1)中低温固定30min，移至100％甲醇中，-20℃密闭保存。

使用前，梯度甲醇复水(95％，80％，70％，50％，30％甲醇，ddH₂O，各5min)后，于PBS中平衡2×5min，进行免疫化学染色。

2.免疫染色

将细胞置于盖玻片上，有细胞面朝上，平放于干净的载玻片上，滤纸擦边，蜡笔(immunoedge pen)画框。以含0.5％NGS(正常羊血清)，1％BSA的PBS中室温封闭1小时。而后用对应于各种待检测分子的第一抗体(一抗)室温孵育1～1.5小时或4℃过夜，PBS洗3次，每次10min。而后用第二抗体(二抗)室温孵育1～1.5小时，PBS洗3次，每次10min。DAPI染色，室温3-5min，PBS洗1次。最后免疫荧光封固剂封片，封片后在室温下避光晾干。采用荧光显微镜观察染色情况。

RT-PCR

采用常规方法从所述的细胞中抽提mRNA，利用对应于各待测基因(如各种分子标记)的引物，通过RT-PCR分别扩增待检测的基因，将获得的扩增产物进行琼脂糖电泳检测。

原位杂交

细胞培养在种有玻片的35mm皿或六孔板中。实验时从培箱中取出。在4％的多聚甲醛中室温固定20min。然后与制备好的线性DNA模板探针进行预杂交和杂交，详见分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)。

FACS检测

每天收集RA/P19和N2B27/P19的细胞团，PBS洗一次，用胰酶消化成单细胞，再用PBS洗一次。然后用0.2ml PBS重悬细胞，用预冷的70％乙醇在4℃固定30min。PBS洗一次，以0.5ml PBS重悬。加入Rnase(购自Invitrogen，终浓度20μg/ml)于37℃作用30min。PBS洗一次去除RNase，加入PI(购自Sigma，终浓度50μg/ml)，室温避光作用30min，上机进行FACS检测。G0/G1峰的位置以未经处理的对照细胞而定，每次实验均需重新设定。

Vent2-Luc/P19稳定细胞株的构建和荧光素酶检测法

1.Vent2/P19稳定细胞株的筛选

1)质粒Vent2-luc(购自Promega)和pRL-TK(购自Promega)以4∶1共转染P19细胞，转染后细胞生长至70-80％满时，传代并将细胞稀释，均分至4个60mm皿中。

2)12小时后，在培液中添加G418，终浓度为500μg/ml。添加选择压力后，细胞开始死亡。视细胞死亡程度，隔天换液。

3)2-3周后，基本再无死亡的细胞。传代并按比例稀释细胞，在10cm培养皿中接种300-400个细胞；剩余的细胞悬液冻存，保存于液氮中。

4)3-4天后10cm培养皿中单个细胞将长成较大的单克隆，在显微镜下观察并选择形态较好的单克隆细胞，在培养皿的底部划圈标记。

5)吸去培养液，以1×PBS洗。吸去PBS，勿吸太干，以免细胞过度暴露于空气中。小心将灭过菌的克隆环粘在标记好的圈上，对克隆环中的细胞分别进行传代操作，将细胞悬液尽数转移至十二孔板中。

6)待十二孔板中的细胞长至70-80％满时，将其传代，转移至六孔板中。待六孔板中的细胞长至70-80％满时，将其分别转移至60mm皿中。将60mm皿中的细胞冻存。另留一份以裂解缓冲液裂解，测荧光素酶报告基因活性。

2.报告基因表达的检测

用Vent2/P19稳定株进行RA诱导，N2B27诱导，诱导过程中分别加入BMP4，Noggin或SU5402等因子。收取每天的细胞团离心去培液，用1×PBS洗一次后冻在-80℃，收齐一批样品后以1×PLB(Passive lysis buffer)，室温裂解30min，收集裂解细胞。按照Promega提供的操作方法，分别加入底物1和底物2，测报告基因的表达。

Western Blot

将待测细胞用SDS裂解液裂解，进行SDS-PAGE电泳，经转膜后分别用相应的抗体(Erk兔源多抗(购自Santa Cruz)，p-ERK鼠源单抗(购自Santa Cruz)，Akt鼠源单抗(购自Santa Cruz)，p-Akt兔源多抗(购自Santa Cruz)，PLC-γ兔源多抗(购自Cell Signaling)，p-PLC-γ兔源多抗(购自Cell Signaling))进行杂交，用化学发光法使X光胶片感光，扫描照片进行分析。

II.具体实施例

实施例1P19细胞相当于早期胚胎中的上胚层细胞

已有的报道都认为P19细胞在发育时期上类似于早期胚胎中的上胚层细胞。为了进一步确认这种说法，本发明人用RT-PCR，免疫染色和原位杂交实验来检测内细胞团和上胚层的分子标记在ES细胞和P19细胞的表达情况。

RT-PCR结果见图1A。结果表明，P19细胞表达上胚层(epiblast)的分子标记FGF5，但是不表达内细胞团(Inner cell mass)的分子标记FGF4，Gbx2，Rex1，CRTR-1；而ES恰恰相反，它表达内细胞团的分子标记FGF4，Gbx2，Rex1和CRTR-1，却不表达上胚层的分子标记FGF5。

FGF4和FGF5的免疫染色、Gbx2的原位杂交结果与RT-PCR的结果是一致的，见图1B。

虽然P19和ES都表达多潜能的分子标记Oct4，它们代表了不同的多潜能细胞群体。ES相当于体内的内细胞团细胞，而P19对应了上胚层的细胞。因此，P19细胞可以用来研究从上胚层到神经外胚层的过程。

实施例2N2B27能够诱导P19细胞分化成为高比例的神经干细胞

P19细胞在N2B27无血清培液中成团悬浮培养4天(P19NB/Agg4d)，4天后肉眼即可见培养液中悬浮有大量细胞团。通过自然沉降小心收集细胞团，将细胞团固定，冰冻切片后通过免疫双荧光染色的方法考察干细胞特异的分子标记Oct4和神经干细胞特异的分子标记Sox在N2B27诱导4天的P19细胞团中的表达。

结果发现，未诱导的P19细胞具有多潜能性，所有细胞为Oct4⁺Sox⁺，即具有干细胞性质的细胞。在含血清培液里悬浮培养4天，不用RA处理的细胞团(P19Agg4d)不再表达Sox，但继续表达多潜能细胞的分子标记Oct4；RA(P19RA/Agg4d)或N2B27(P19NB/Agg4d)诱导4天的细胞团不再表达Oct4，但继续表达Sox，见图2B。这些Oct4^-Sox⁺细胞都是神经干细胞。

计数结果表明，N2B27能够诱导高比例(～94％)的神经干细胞，而RA只能诱导大约30％的神经干细胞，见图2C。

为了更详细地分析N2B27的诱导过程，本发明人收取了诱导1到4天的细胞团，进行染色分析。结果表明，多潜能细胞Oct4⁺Sox⁺的比例随着诱导的进行逐渐下降，神经干细胞Oct4^-Sox⁺在诱导第3天开始出现，并在第4天达到94％，见图2D。

已知放射状胶质细胞(radial glia)是体内早期神经发育过程中广泛存在的一类神经干细胞，是绝大多数神经元细胞和神经胶质细胞的前体。为了进一步确认N2B27诱导的神经干细胞的性质，本发明人采用如前所述的免疫染色方法检测了细胞团中放射状胶质细胞的分子标记(即Nestin，RC2，3CB2，Vimentin，Pax6)的表达情况，发现多于95％的细胞都表达Nestin，RC2，3CB2和Vimentin。本发明人还发现只有约80％左右的细胞为Pax6阳性，这可能因为在发育的大脑皮层中，有些放射状胶质细胞并不表达Pax6，见图3A和图3B。

上述结果都表明，N2B27能够把P19细胞诱导成高比例的神经干细胞。

实施例3N2B27的神经诱导并不伴随着中胚层和内胚层的诱导

在含血清的培液中进行神经诱导常常伴随着中胚层、内胚层细胞的出现。为了检测在N2B27培液中的神经诱导是否也是这种情况，本发明人用RT-PCR检测了三个胚层的分子标记的表达。

结果发现，神经外胚层的分子标记Sox1，2，3在N2B27诱导(NB/Agg)之后表达上调，尤其值得注意的是Sox1的表达在诱导第3天大幅度上调，这与神经干细胞在N2B27诱导的第3天开始出现的结果一致。中胚层的分子标记Brachyury和Goosecoid在N2B27诱导过程中只有低水平的表达，而内胚层的分子标记HNF3和GATA6几乎检测不到；这些分子标记在RA诱导的P19细胞中都有高水平的表达，见图3C。

上述结果说明，N2B27的神经诱导并不伴随着中胚层和内胚层的诱导。

实施例4N2B27的神经诱导不是通过非神经细胞的选择性调亡实现的

现有的一些神经干细胞诱导方法往往通过神经特异的营养性培液来筛选神经干细胞，引导非神经细胞的凋亡，从而得到高比例的神经干细胞群体。为了检测N2B27的神经诱导是通过非神经细胞选择性的凋亡来实现的，还是直接的从干细胞到神经细胞命运的转变，本发明人用FACS检测了在N2B27诱导过程中的细胞凋亡。

FACS检测结果表明，N2B27诱导过程中的凋亡和正常P19差不多，而RA诱导的P19细胞有比较高比例的凋亡，见图3D。

为了更进一步的证实这个结果，本发明人用TUNEL染色(采用TUNEL检测试剂盒(购自invitrogen))来检测N2B27诱导第4天的团的凋亡情况。结果显示，N2B27诱导的团(NB)和正常的有血清培液里培养4天的团都没有什么凋亡，而RA诱导4天的团里有很多TUNEL阳性的细胞，见图3E。

上述结果表明，N2B27诱导高比例的神经干细胞不是通过非神经细胞的选择性调亡来实现的，而是一个直接的从多潜能干细胞到神经干细胞命运的转变过程。

实施例5N2B27诱导的神经干细胞具有前端特性(Anterior Character)

早期胚胎的神经板具有前后轴和背腹轴的位置信息，赋予它们特定的分化命运。为了检测N2B27诱导的神经干细胞是否具有特定的位置信息，本发明人用RT-PCR检测前后轴的位置分子标记的表达。

结果如图4A所示，前端神经外胚层的分子标记Otx2和Hesx1在正常P19细胞(P19EC)和N2B27(NB)诱导的神经干细胞中表达。在前脑特异表达的同源盒基因Six3在N2B27诱导的神经干细胞中被极大诱导。而后方神经外胚层的分子标记，比如中后脑界限处的分子标记Gbx2，后脑和脊髓的分子标记Hoxb4，脊髓的分子标记Hoxb9，在正常P19细胞和N2B27诱导的神经干细胞中不表达。RA诱导的P19细胞团，只表达后方分子标记，不表达前方分子标记。上述结果提示，N2B27诱导的神经干细胞具有前端神经外胚层的特性，而RA诱导的神经干细胞具有后方的特性。

为了验证这些前端的神经外胚层细胞能否被后方化因子如RA后方化，本发明人用RA处理N2B27诱导的细胞团，并检测前后方分子标记的变化。在RA的处理下，后方化的分子标记Gbx2，Hoxb4和Hoxb9能被有效的诱导。有趣的是，这些后方的分子标记被最有效诱导的时间不一样。Gbx2最佳的诱导时间2天N2B27诱导加上2天RA处理(NB2dRA2d)，Hoxb9最佳的诱导时间是4天N2B27诱导加上4天RA处理(NB4dRA4d)，Hoxb4在任何时间都能得到有效的诱导。前端的分子标记，Otx2和Six3，只有在2天N2B27诱导加上2天RA处理时能得到最有效的抑制。N2B27诱导4天以后，P19细胞已经完全前方化了，即使再用RA处理4天，也只能部分抑制Otx2和Six3的表达。RA只能在一定的时间范围内对前方基因进行有效的抑制。作为对照的细胞在N2B27培液中继续培养到总共8天(NB8d)也不会发生位置信息的改变。

本发明人还用免疫染色来进一步证实RA的后方化作用。Hoxb4染色结果显示N2B27诱导的神经干细胞在N2B27里培养到第8天(NB8d)也不会表达Hoxb4。而4天的N2B27诱导加上4天的RA处理能够使多于95％的细胞开始表达Hoxb4(NB4dRA4d)，见图4B和图4C。

上述结果都表明，N2B27诱导的神经干细胞具有前端神经外胚层特性，并且能够被RA有效的后方化。

实施例6N2B27诱导的神经干细胞具有分化全能性

为了检测N2B27诱导的神经干细胞是否能够分化成神经元和神经胶质细胞，本发明人把N2B27诱导培养后的细胞团打散成单细胞，种到事先用PLL包被好的细胞培养皿中，在无血清N2培液中培养，并且通过免疫染色检测分子标记来确定这些细胞的分化情况。

在重铺板(Replating)的第1天，就有神经上皮样细胞出现，而后渐渐形成细胞簇，从中延伸出许多神经突触。免疫染色显示，随着分化的进行，这些细胞能分化出Tuj1和MAP2阳性的神经元细胞，GFAP阳性的星型胶质细胞，O4阳性的少突胶质细胞。Tuj1和MAP2阳性的细胞在replating第1天就出现，在第4-5天达到高峰(多于90％)，随后下降。星型胶质细胞和少突胶质细胞分别在第10天和第14天开始出现，见图5A，B。

为了确定在N2B27诱导分化的神经元中有哪些神经元亚型，本发明人用RT-PCR来检测各种神经元亚型的分子标记。

结果如图5C，RA诱导的P19细胞表达很强的GABA能神经元分子标记，GAD67和EAAC1，这与前人的工作一致(已报导RA诱导的P19神经元绝大多数是GABA能的神经元)。而N2B27诱导的神经元表达胆碱能神经元的分子标记ChAT，GABA能神经元分子标记GAD67，谷氨酸能神经元分子标记VGLUT1，多巴胺能神经元分子标记TH，5-羟色氨能神经元分子标记TPH1，TPH2。

为了进一步证实上述结果，本发明人用免疫染色观察到了约10％的GAD65和5％的VGLUT1阳性细胞，见图5E和图5F。

为了检测这样高比例的神经元是直接的神经干细胞分化的结果还是非神经干细胞选择性调亡的结果，本发明人用FACS来检测replating后4天内细胞的凋亡情况。

结果见图5D，RA诱导的P19细胞在replating第1天会有大量的死亡，随后凋亡细胞减少。而N2B27诱导的P19细胞在replating后4天内都没有明显的凋亡。

综上可见，N2B27诱导的神经干细胞具有分化的全能性，可以分化成神经元和神经胶质细胞，并且它能分化出高比例的神经元不是通过N2培养基的筛选来实现的，是直接的从神经干细胞到神经细胞的分化结果。

实施例7RA在P19细胞神经诱导的过程中会加速神经元分化，并促进内胚层分子标记表达

RA诱导多潜能细胞的神经分化长期以来作为研究体内神经诱导的体外模型。但是，RA对神经诱导和神经分化的不同作用至今所知甚少。前人在爪蟾胚胎里的工作表明，RA能够加速神经板中神经干细胞的神经分化，本实施例验证了是否因为这个原因，RA诱导的细胞团里神经干细胞比例比较低。

本发明人对各种诱导方法得到的细胞团进行Tuj 1染色，发现在N2B27诱导的细胞团(P19NB/Agg4d)中Tuj1的阳性比例很低(＜5％)，而在RA诱导的细胞团(P19RA/Agg4d)中有～16％的Tuj1阳性细胞。如果在N2B27诱导的同时加入了RA，4天后的细胞团里就能检测到～25％的Tuj1阳性细胞(P19NBRA/Agg4d)。上述结果表明，RA能够加速P19细胞形成的神经干细胞向神经元分化的过程，从而导致在RA处理的细胞团中只能得到相对低比例的神经干细胞，见图6A和图6B。

值得注意的是，N2B27本来能够诱导约94％的神经干细胞，加入RA以后只剩55％左右，这很难用25％的神经分化比例来解释。为了寻求其它的可能性，本发明人检测了在RA处理的N2B27细胞团中中胚层和内胚层分子标记(Brachyury、Goosecold、HNF3β和GATA6)的表达情况，发现RA能够极大促进内胚层分子标记的表达，见图6C。这就意味着除了加速神经分化以外，RA也促进了P19细胞向内胚层分化。并且还发现，RA能够在N2B27诱导的细胞团中引起后方化(图6D)。

综上所述，RA对干细胞的命运决定有多重作用，包括诱导后方化神经命运，加速诱导的神经干细胞分化成神经元，以及促进干细胞向内胚层方向分化。

实施例8BMP信号通路在N2B27诱导过程中完全被阻断

N2B27的神经诱导是一个很高效的诱导系统，本实施例验证在这个过程中有哪些信号通路在起作用。

已知BMP信号通路的抑制对于神经诱导是必需的。本发明人先用RT-PCR检测了BMP家族成员和BMP的拮抗剂在N2B27神经诱导过程中的表达。结果显示，BMP2和BMP4的表达在N2B27诱导的第3天下调，而它们的拮抗剂Noggin、Chordin、Follistatin都在N2B27诱导的第1天就显著上调。相反的，在RA诱导的P19神经分化中，BMP2和BMP4是持续表达的，它们的拮抗剂的表达也处于比较低的水平，见图7A。上述结果提示，BMP信号在N2B27过程诱导中被削弱。

为了检测N2B27诱导过程中BMP信号途径的活性，本发明人建立了Vent2-Luc/P19稳定细胞株。Vent2是BMP下游的靶基因，对BMP信号有很灵敏的响应性。Vent2-Luc是由Vent2的启动子来指导荧光素酶报告基因的表达，由此可以反映出BMP信号的强弱。本发明人用Vent2/P19细胞株来做P19诱导，收取每天的细胞团，裂解以后采用常规方法检测荧光素酶报告基因的活性。RA和N2B27诱导条件的区别之处在于，前者在有血清环境，并且有RA存在；而后者是无血清环境，没有RA。为了分清血清和RA对BMP信号通路的影响，本发明人设计了4组实验，把Vent2/P19在以下4种环境中培养4天：有血清培液(Agg)，有血清培液加RA(RA/Agg)，N2B27无血清培液(NB/Agg)，N2B27加RA(NBRA/Agg)。

结果见图7B，在有血清培液中成团第1天，BMP信号被极大激活；有血清培液中加入RA可部分抑制BMP信号。在N2B27诱导过程中BMP信号完全被抑制，在其中加入RA也不能激活BMP信号。由此看来，血清会激活P19细胞中的BMP信号，而RA可以部分抑制这种活性。在N2B27的无血清诱导环境中，BMP信号是完全被抑制的。

已有报道，血清中痕量的BMP会抑制ES和P19细胞的神经分化。为了证实这一点，本发明人在N2B274天诱导过程中加入BMP4(10ng/ml)，荧光素酶活性测定显示BMP活性在第1天也是较高的。然而这种BMP活性能够被BMP的抑制剂Noggin有效抑制。

为了进一步确认这个BMP活性情况与神经诱导相关，本发明人检测了在N2B27中加入BMP或者同时加入BMP和Noggin时对神经干细胞诱导的影响。结果发现，加入BMP能够极大程度的抑制神经干细胞的诱导，而同时加入Noggin可以逆转(rescue)这种情况，见图7C和图7D。

总之，上述结果显示BMP信号活性的完全抑制在N2B27神经诱导过程中发挥了较为重要的作用。

实施例9FGF信号参与N2B27的神经诱导

已有报道，FGF信号在鸡胚的神经诱导中起着很重要的作用，在ES细胞的神经诱导中也是必不可少的。本实施例验证FGF信号是否在RA或N2B27诱导过程中起作用。

本发明人先用RT-PCR检测了RA或N2B27诱导过程中FGF家族成员的表达情况。结果显示，FGF1，FGF2，FGF4和FGF8在N2B27神经诱导的不同阶段被诱导表达，见图8A。

为了检测FGF信号对于N2B27神经诱导是否是必需的，本发明人在N2B27培液中加入FGF受体的抑制剂SU502来阻断FGF信号通路，通过免疫染色以及检测荧光素酶活性来确定其影响情况。结果发现SU5402(5μM)可以极大程度抑制神经干细胞的诱导，见图8B。这些结果显示FGF信号参与了N2B27诱导的神经诱导。

根据以往的报道，FGF的神经诱导功能可能是通过两种途径来实现的。一种是依赖于对BMP信号的抑制：FGF信号通过抑制BMP成员的表达，和/或刺激BMP拮抗剂的表达，或者通过激活Erk，进而阻止Smad1的入核来实现对BMP信号途径的抑制。另一种是不依赖于BMP抑制的，FGF信号通过磷酸化Erk直接参与了P19细胞的神经分化。本发明人还验证了在N2B27诱导中FGF是通过那种方式来作用的。如果FGF是仅仅通过抑制BMP来实现的，那么用试剂来完全抑制BMP活性应该可以逆转阻断FGF通路的效果，重新实现神经干细胞的诱导。

在N2B27诱导过程中，本发明人通过加入过量的Noggin来实现对BMP信号的完全抑制，发现并不能逆转SU5402对神经干细胞的抑制。为了进一步证实，本发明人用Vent2/P19来检测这些过程中BMP信号通路的活性，发现加入SU5402能够很低程度的释放一些内源的BMP活性，而这些活性能够被Noggin完全抑制，见图8C。该结果表明，FGF信号直接参与了N2B27神经诱导，并且主要是通过不依赖于BMP的抑制来实现的。

FGF信号通常会激活MAPK/ERK，PI3K/Akt，和/或PLC-γ信号途径。为了检测哪种信号途径参与了N2B27的神经诱导，本发明人用Western B1ot检测了各个通路的活化情况。结果见图8E-G，发现MAPK/ERK在此系统中并未被激活，这与体内的报道是一致的，即在早期小鼠胚胎神经诱导发生的区域内不能检测到明显的ERK磷酸化形式。

本发明人分别用各种途径的抑制剂，U0126(5μM)来抑制MEK途径，Wortmannin(100nM)来抑制PI3K途径，U73122(100nM)(前述抑制剂购自Calbiochem)来抑制PLC-γ途径，发现它们都不能抑制N2B27的神经诱导。而在同等情况下，它们的确能够抑制自己的目的蛋白的磷酸化，见图8D。

总而言之，这些结果显示，FGF信号通过不依赖于BMP抑制的途径参与了N2B27的神经诱导，并且已知的途径都不参与这个过程，提示很可能有新的途径在其中起作用。

讨论

内细胞团(Inner Cell Mass，ICM)来源的上胚层(epiblast)是小鼠发育过程中最后的多潜能细胞群，能够派生出所有的胚层体系，包括神经外胚层。从上胚层样细胞中诱导神经干细胞的系统可以很好的用来研究胚胎发育原肠运动时期的神经命运决定事件。小鼠P19胚胎性癌细胞在发育时期上正对应于体内的上胚层阶段。P19细胞在成团条件下经RA诱导，可分化为神经元和神经胶质细胞，这是广泛应用于研究哺乳动物胚胎早期神经发育机制的体外模型。然而，这一系统有其不足之处。首先，它只能诱导低比例的神经干细胞，并且在诱导同时就将其后方化，与体内的神经诱导过程不一致；另外在体内，RA并不行使神经诱导的功能。因此，RA诱导的神经分化不是很好的研究早期胚胎神经分化的模型。为了解决这个问题，本发明人建立了新的无血清诱导系统，该系统能够诱导出高比例的具备前端特性的神经干细胞群体(～94％)，并能被后方化因子RA有效后方化。这些神经干细胞具有分化多潜能性，在体外能分化出高比例的神经元(＞90％)，同时也能分化出星形胶质细胞和少突胶质细胞。为探讨是何种机制在其中起作用，本发明人考察了神经诱导过程中的核心角色BMP通路在其中的活化情况。本发明人建立了稳定表达Vent2/Luc的P19细胞株，用来监测各种诱导过程中BMP信号的活性。在N2B27诱导过程中BMP信号通路是完全被抑制的。而在其他不能进行神经诱导，或者只能进行不完全的神经诱导条件下，BMP信号都有不同程度的激活，提示BMP信号通路的完全抑制是N2B27进行高比例神经诱导的主要原因。本发明人还考察了FGF通路在其中的作用。用FGF信号通路的广谱性抑制剂SU5402能够有效抑制N2B27的神经诱导，并且此抑制不能被BMP的拮抗剂Noggin回复，提示FGF信号也在其中扮演了不可或缺的角色，并且其功能是通过不依赖于BMP抑制的方式，直接促进P19细胞的神经命运决定。

本发明人主要运用P19细胞来进行体外神经分化研究，使用P19细胞模型的优越性在于：它省略了由ICM向上胚层发育分化的阶段，进而直接反映了由上胚层向神经外胚层发育分化的过程，因此提供的信息可能更为准确。传统的RA诱导P19神经分化的方法不能很好地反应体内的情况，在本发明中，本发明人建立了新的P19神经诱导模型，该方法能够快捷迅速的诱导高比例的神经干细胞，这些神经干细胞具有发育的多潜能性，在特定条件下能够分化出不同亚型的神经元，星型神经胶质细胞和少突胶质细胞。同时这些神经干细胞表达前端神经外胚层的分子标记，能够被后方化信号RA有效的后方化，这与体内中枢神经系统形成的two-step模型是一致的。现有的一些神经干细胞诱导方法很多需要运用特定的神经营养性培液来选择性筛选，使得非神经细胞选择性调亡，从而得到高比例的神经干细胞。本发明人的方法不需要非神经细胞的选择性调亡，是直接的从多潜能干细胞到神经干细胞的命运转变。与传统的RA诱导模型相比，本发明的模型不需要血清，从而排除了血清里复杂成分的干扰；不需要RA，不需要特定培养基的筛选，直接诱导就可以得到更高比例的具有前端特性(anterior character)的神经干细胞群体，能够更好的模拟体内神经发生的过程。本发明的模型的建立为更好的研究胚胎早期神经发生的分子机制提供了很好的体外模型，同时也为从小鼠胚胎癌细胞定向诱导特定亚型的神经元，从而应用于神经退行性疾病的干细胞移植治疗提供了可能。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种促进P19胚胎性癌细胞生成神经干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：

用N2B27培养基诱导培养P19胚胎性癌细胞，从而使P19胚胎性癌细胞形成神经干细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的N2B27培养基含有：

(a)加入了Ins、TF、Pro、Put、Sel和BSA的DMEM/F12培养基；和

(b)加入了B27的Neurobasal培养基；

其中，(a)与(b)以(1-2)∶(1-2)的比例混合。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将P19胚胎性癌细胞在N2B27培养基中悬浮培养。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，诱导培养P19胚胎性癌细胞的时间是96±10小时。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，培养条件是37±3℃，5±1％CO₂。

6.一种制备富含神经干细胞的细胞群的方法，所述细胞群中神经干细胞占所有细胞的80-100％，其特征在于，所述方法包括：

用N2B27培养基诱导培养P19胚胎性癌细胞，从而获得所述的细胞群。

7.一种通过权利要求6所述的方法制备获得的富含神经干细胞的细胞群，所述细胞群中神经干细胞占所有细胞的80-100％。

8.如权利要求7所述的细胞群，其特征在于，所述的神经干细胞表达神经干细胞特异的分子标记Sox，不表达干细胞特异的分子标记Oct。

9.如权利要求7所述的细胞群，其特征在于，所述的神经干细胞是具有前端神经外胚层特性的细胞。

10.一种N2B27培养基的用途，其特征在于，用于诱导培养P19胚胎性癌细胞使之形成神经干细胞。

Images