CN110730667B - 神经组织单元和这种单元用于植入哺乳动物的神经系统的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于植入人类或非人类哺乳动物的神经系统中的神经组织单元，其中所述神经组织单元含有在细胞外基质中的分化的有丝分裂后神经元细胞，所述单元是从包含围绕所述神经组织单元的水凝胶囊的细胞微室获得的，并且在使用所述神经组织单元之前至少部分去除所述水凝胶囊。本发明还涉及一种用于制备这种神经组织单元的方法。

Description

神经组织单元和这种单元用于植入哺乳动物的神经系统的 用途
本发明涉及一种神经组织单元，所述神经组织单元包含组织在细胞外基质中的三维(3D)网络中的多个有丝分裂后神经元细胞和任选的胶质细胞，并且涉及所述神经组织单元作为植入哺乳动物的神经系统中的单元的用途。这种神经组织单元可以尤其用于将具有目标表型的神经元细胞移植到受试者的神经系统中，以治疗神经变性疾病。
在过去的几十年内，神经变性疾病在理解所涉及的生物学现象方面和治疗方面都是一个重大的社会挑战。实际上，越来越多的人受到这些疾病的影响，对患者和患者的家人和朋友产生了严重的后果。
通用术语“神经变性疾病”涵盖特征主要为神经元死亡快于正常衰老的大量疾病，所述疾病包括阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)、帕金森氏病(Parkinson'sdisease)、亨廷顿氏病(Huntington's disease)、肌萎缩性侧索硬化等。神经系统可以以各种方式受到影响，从而引起各种症状，所述症状包括运动、平衡、行为和/或认知障碍。
目前，神经变性疾病的病因和机制往往知之甚少，从而使得其治疗更加复杂。目前还没有令人信服的治愈这些疾病的治疗。
近年来，优先性开发聚焦于脑内细胞疗法，并且更特别地聚焦于将神经元移植到患有神经变性疾病的人的脑中受损区域中。这些移植的目标是永久性地代替被疾病破坏的神经元。因此，已经在几位帕金森氏病患者中成功地进行了胚胎细胞或组织的局部移植。然而，这种方法涉及使用来自流产胎儿的组织，这引起了伦理和逻辑问题。此外，许多实验室已改为将人类诱导性多能干(hIPS)细胞作为合格人类细胞的可能替代来源。将hIPS有效分化为具有必要表型的神经元以代替患者损失的神经元是一个非常活跃的研究领域。然而，神经元是非常脆弱的细胞。注射神经元悬浮液通常导致所述神经元中超过98％因失巢凋亡而死亡。可替选地，考虑移植神经元祖细胞，已知神经元祖细胞比神经元更不脆弱。这种解决方案也不能令人满意。实际上，植入后神经元祖细胞的细胞分化不受控制，并且不能确定植入的细胞是否适当地分化和/或分化为所要的神经元类型。
因此需要一种神经元细胞植入系统来改善植入细胞的存活，特别是用于永久性地代替神经变性疾病患者中变化的神经元。
发明内容
在研究细胞的三维(3D)培养时，发明人发现当处理特别脆弱的细胞如神经元时，通过不以细胞悬浮液形式而是以三维细胞网络的形式对所述细胞进行培养和处理可以改善存活率。他们已经开发了包含具有目标表型的神经元细胞的神经组织单元，所述神经组织单元可以被注入患者的神经系统中，以便以比注射神经元细胞悬浮液时获得的存活率高得多的存活率在其中整合所述神经元细胞。所开发的神经细胞单元包含预组织在3D网络中并嵌入细胞外基质中的神经元细胞，所述神经细胞单元促进注射后细胞在神经系统中的整合和存活。实际上，将神经细胞转移到宿主神经系统中，同时保持了其局部环境的完整性，特别是细胞之间的相互作用和与神经组织单元内产生的细胞外基质的相互作用。此外，根据本发明的神经组织单元包含有丝分裂后神经元细胞，所述有丝分裂后神经元细胞的分化程度可以被完美控制，从而限制了引入不想要的细胞类型、特别是引起产生畸胎瘤和肿瘤生长的细胞类型的风险。有趣的是，观察到根据本发明的神经组织单元能够将轴突伸到宿主组织中，从而促进细胞良好地整合到所述宿主组织中，并产生明确的功能益处。
因此，本发明涉及一种用于植入人类或非人类哺乳动物的神经系统中的神经组织单元，其中所述神经组织单元含有在细胞外基质中的分化的有丝分裂后神经元细胞，所述单元是从包含围绕单个神经组织单元的水凝胶囊的细胞微室获得的，并且在植入所述神经组织单元之前至少部分去除所述水凝胶囊。
因此，本发明涉及一种用于治疗神经变性疾病的神经组织单元，所述治疗通过将至少一个神经组织单元植入患有神经变性疾病的人类或非人类哺乳动物的神经系统中来进行，所述神经组织单元含有在细胞外基质中的分化的有丝分裂后神经元细胞，所述单元是从包含围绕所述神经组织单元的水凝胶囊的细胞微室获得的，并且在植入所述神经组织单元之前至少部分去除所述水凝胶囊。
特别地，本发明涉及一种用于治疗帕金森氏病的神经组织单元，所述治疗通过将至少一个神经单元植入患有帕金森氏病的人类或非人类哺乳动物的神经系统中来进行，所述神经单元含有在细胞外基质中的分化为多巴胺能神经元的有丝分裂后神经元细胞，所述单元是从包含围绕所述神经组织单元的水凝胶囊的细胞微室获得的，并且在植入所述神经组织单元之前至少部分去除所述水凝胶囊。
本发明还涉及一种用于治疗帕金森氏病的方法，根据所述方法，将细胞外基质中的含有分化为多巴胺能神经元的有丝分裂后神经元细胞的至少一个神经组织单元植入患有帕金森氏病的患者的神经系统中，所述单元是从包含围绕所述神经组织单元的水凝胶囊的细胞微室获得的，并且在植入所述神经组织单元之前至少部分去除所述水凝胶囊。
类似地，本发明涉及一种用于治疗亨廷顿氏病的神经组织单元，所述治疗通过将至少一神经组织单元植入患有亨廷顿氏病的人类或非人类哺乳动物的神经系统中来进行，所述神经组织单元含有在细胞外基质中的分化为GABA能神经元的有丝分裂后神经元细胞，所述单元是从包含围绕所述神经组织单元的水凝胶囊的细胞微室获得的，并且在植入所述神经组织单元之前至少部分去除所述水凝胶囊。
本发明还涉及一种用于治疗亨廷顿氏病的方法，根据所述方法，将细胞外基质中的含有分化为GABA能神经元的有丝分裂后神经元细胞的至少一个神经组织单元植入患有亨廷顿氏病的患者的神经系统中，所述单元是从包含围绕所述神经组织单元的水凝胶囊的细胞微室获得的，并且在植入所述神经组织单元之前至少部分去除所述水凝胶囊。
类似地，本发明涉及一种用于植入人类或非人类哺乳动物的神经系统中的神经组织单元，其中所述神经组织单元含有遗传修饰的神经元。此类神经组织单元可以尤其用于帮助、改善或修复人类或非人类哺乳动物的认知和/或行为的功能。
本发明还涉及一种用于制备旨在植入人类或非人类哺乳动物的神经系统中的这种神经组织单元的方法，所述方法包含以下步骤：
(1)制备细胞微室，所述细胞微室包含在水凝胶囊内的细胞外基质和能够分化为神经细胞的人类或非人类哺乳动物细胞，所述人类或非人类哺乳动物细胞有利地与旨在接受所述神经组织单元的哺乳动物免疫相容；
(2)在细胞微室内诱导细胞分化，从而获得具有至少一种有丝分裂后目标表型的神经元细胞；
(3)至少部分去除水凝胶囊以回收神经元细胞作为神经组织单元。
本发明还涉及一种神经组织单元植入试剂盒，所述神经组织单元植入试剂盒包含至少一个细胞微室，所述细胞微室包含至少一个围绕根据本发明的神经组织单元的水凝胶囊，以及用于至少部分去除水凝胶囊的工具。
本发明还涉及一种神经组织单元植入试剂盒，所述神经组织单元植入试剂盒包含至少一个根据本发明的神经组织单元，优选10至100个并且最多1000个神经组织单元，所述神经组织单元被装载在能够将所述神经组织单元植入哺乳动物的神经系统中的手术植入装置中。
附图说明
图1为用于制备患上帕金森病，通过注射根据本发明的神经组织进行处理或未处理的不同大鼠的方案的示意图。Sham：对照大鼠：6-OHDA：患上帕金森病的大鼠(阴性对照)；6-OHDA包封的祖细胞(或Pro encap)：已接受根据本发明的神经组织单元的患上帕金森病的大鼠，所述神经组织单元来自商购神经元祖细胞已被包封其中的细胞微室；6-OHDA CNO(受控的神经类器官)；已接受根据本发明的神经组织单元(在该实施例中所述神经组织单元对应于CNO)的患上帕金森病的大鼠，所述神经组织单元来自细胞微室，在所述细胞微室中，多能细胞已被包封，接着分化为神经元，包括多巴胺能神经元；
图2A和2B描绘了施加以获得帕金森病大鼠和移植根据本发明的神经元组织的病变(2A)和移植(2B)方案。
图3是显示在将根据本发明的可植入神经单元(在该实施例中，CNO类型)移植到患上帕金森病的大鼠(6-OHDA CNO)的中枢神经系统中之后6天，人类神经元的多毫米轴突投影的显微照片。这是移植区域中经固定、冷冻并用低温恒温器切割的大鼠纹状体切片的共聚焦图像，所述图像通过组织化学使用针对人类细胞质(HCM)的抗体进行揭示；
图4A-E显示从对患上帕金森病的大鼠进行的行为测试获得的结果，所述大鼠已接受或未接受根据本发明的神经组织单元的移植。(4A)圆筒测试；(4B)踏步测试；(4C)旋转计量仪测试；(4D)焦虑测试。
具体实施方式
本发明公开了一种用于神经组织单元植入或移植到哺乳动物神经系统中的方法，在所述神经组织单元中将神经细胞组织在3D网络中。以致密球的形式移植神经细胞促进神经细胞植入和整合到宿主神经系统中。根据本发明的植入方法和更一般的根据本发明开发的神经组织单元旨在用于人类或非人类哺乳动物中，并且更优选用于人类受试者中。
神经组织单元
本发明提出使用神经组织单元代替神经元细胞悬浮液植入受试者的神经系统中，以治疗各种神经变性疾病和/或帮助、改善、修复所述受试者的认知或行为功能。
根据本发明，待植入的神经组织单元有利地在细胞外基质中包含分化的有丝分裂后神经元和胶质细胞，如星形胶质细胞和/或少突胶质细胞。
“有丝分裂后”神经元是丧失分裂能力的神经元细胞。微室中含有的神经元在其具有特定表型的意义上是分化的。
根据本发明，在植入受试者的神经系统中之前，至少部分去除围绕神经组织单元的水凝胶囊。
在本发明的上下文中，“水凝胶囊”是指从由液体、优选水溶胀的聚合物链的基质形成的三维结构。有利地，所使用的水凝胶在其对细胞无毒的意义上是生物相容的。此外，水凝胶囊必须允许氧和营养物质的扩散以供给微室中含有的细胞并且允许所述细胞存活。例如，水凝胶囊含有海藻酸盐。优选地，囊仅含有海藻酸盐。在本发明的上下文中，“海藻酸盐”是指由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸、其盐和衍生物形成的线性多糖。有利地，海藻酸盐是海藻酸钠，其由80％α-L-古洛糖醛酸和20％β-D-甘露糖醛酸组成，平均分子量为100-400KDa(例如PRONOVATM SLG100)，并且总浓度在0.5质量％至5质量％之间。
在制备神经组织单元时，水凝胶囊保护细胞免受外部环境影响，而使得其可以受控地分化为一种或多种目标神经元类型。根据本发明，水凝胶囊围绕单个神经组织单元。因此，每个神经组织单元独立地被水凝胶囊包围。一旦获得一种或多种所要细胞类型并且囊中神经组织的尺寸足够，就至少部分去除所述囊。“至少部分去除”是指水凝胶囊被至少部分水解、溶解、刺穿或破坏，以使得所述单元的至少一些神经细胞的至少轴突可以离开囊。可以使用任何生物相容性工具，即对细胞无毒的，使得水凝胶囊被水解、溶解、刺穿和/或至少部分破坏。例如，可以使用磷酸盐缓冲盐水、二价离子螯合剂、酶如海藻酸裂解酶、激光显微解剖、整合到水凝胶中的可溶性珠粒等。
有利地，将囊完全去除，因此旨在植入受试者神经系统中的神经组织单元不含水凝胶。
优选地，神经组织单元的细胞外基质层形成凝胶。细胞外基质层包含细胞培养并且更特别地神经细胞培养所必需的蛋白质和细胞外化合物的混合物。优选地，细胞外基质包含结构蛋白，如含有α1或α4或α5和β1或β2和γ1或γ3亚基的层粘连蛋白、巢蛋白、玻连蛋白、胶原蛋白，以及生长因子，如TGF-β和/或EGF。在一个实施方式中，细胞外基质层由和/或/>组成或含有/>和/或/>
根据本发明的神经组织单元具有含有组织在3D网络中的神经细胞的优点，在所述3D网络中细胞和细胞外基质之间的相互作用已经存在。
有利地，神经组织单元的神经细胞形成神经细胞簇，特别是卵形、管形或球形的神经细胞簇，最小尺寸优选在10μm至1000μm±10％之间，优选在150μm至400μm±10％之间，甚至更优选在200μm至300μm±10％之间。这些尺寸特别有利于神经组织单元内神经元的存活，并且优化植入后移植物的重组和血管形成。“最小尺寸”是指细胞簇任一侧上两点之间的最小距离。
优选地，根据本发明的神经组织单元含有100至100,000个神经细胞。
在神经组织内，神经元细胞有利地具有根据神经组织单元的旨在用途选择的一种或多种目标表型。根据本发明，植入的神经组织单元包含根据一种或多种经选择和控制的表型分化的神经元细胞。优选地，神经组织单元包含10至100％，优选50至100％，更优选超过90％的目标表型的有丝分裂后神经元细胞。存在于神经组织单元中的其它细胞可以特别是胶质细胞和/或表型不同于目标表型的有丝分裂后神经元细胞。有利地，神经组织单元基本上由具有相同表型的有丝分裂后神经元细胞组成。
有丝分裂后神经元细胞的目标表型取决于所述单元的目标。因此，在用于细胞疗法的情况下，神经元的表型有利地对应于待代替的失效细胞的表型。
实际上，根据本发明的神经组织单元可以有利地用于细胞疗法，用于治疗神经变性疾病，如帕金森氏病、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、阿尔茨海默氏病或神经元蜡样脂褐质沉积，如巴腾病(Batten disease)。
因此，对于帕金森氏病的治疗，神经组织单元有利地含有多巴胺能神经元。优选地，这种神经组织单元中含有的有丝分裂后神经元基本上为多巴胺能神经元。
在本发明的上下文中，“基本上”是指细胞的至少90％，优选至少95％，甚至更优选至少99％。
对于亨廷顿氏病的治疗，神经组织单元有利地含有GABA能神经元。优选地，这种神经组织单元中含有的有丝分裂后神经元基本上为GABA能神经元。
根据本发明的神经组织单元还可以含有遗传修饰的神经细胞。因此，可以将其中一种或多种基因的表达已被抑制或增加的神经细胞植入受试者的神经系统中。还可以植入已引入异源基因的神经细胞，从而将通常不存在的功能引入神经系统中。
这种含有遗传修饰细胞的神经组织单元特别有利于帮助、改善或修复认知和/或行为功能，例如所考虑的受试者的认知和/或行为功能失效或不足。
例如，在亨廷顿氏病的治疗中，已知遗传原因(编码亨廷顿蛋白的基因内CAG三联体重复序列的扩增)，可以从患者中去除细胞以制备根据本发明的神经组织单元，所述神经组织单元包含其中缺陷基因已经被校正的GABA能神经元，接着进行所述神经组织单元的自体移植。
对于患有帕金森氏病的患者，可以制备包含如下多巴胺能神经元的神经组织单元，所述多巴胺能神经元被修饰以表达光敏通道，如视紫红质通道，以通过简单的照射以类似于深部脑刺激但具有较小侵入性的方式控制被移植的神经组织的活动。通常，控制被移植的神经组织的活动，特别是通过表达光敏通道，可以有益于所有潜在的应用。
神经组织单元植入试剂盒
本发明还提出了一种神经组织单元植入试剂盒，所述神经组织单元植入试剂盒包含至少一个细胞微室，所述细胞微室包含围绕根据本发明的神经组织单元的水凝胶囊，以及用于至少部分去除所述水凝胶囊(水解、溶解、刺穿和/或破坏)的工具。
因此，必须使用根据本发明的神经组织单元的从业者可以在使用时并且根据需要至少部分去除水凝胶囊以获得准备好的待植入受试者的神经系统中的神经组织单元。
而且，根据本发明的植入试剂盒还可以含有能够将神经组织单元植入哺乳动物的神经系统中的手术植入装置。
本发明还提出一种神经组织单元植入试剂盒，所述神经组织单元植入试剂盒包含至少一个根据本发明的神经组织单元，优选1至10,000个，更优选10至1000个神经组织单元，所述神经组织单元被装载在能够将所述神经组织单元植入哺乳动物的神经系统中的手术植入装置中。有利地，植入的神经组织单位的数量取决于宿主脑的尺寸和应用。
可以任选地将神经组织单元在引入手术植入装置之前冷冻和/或与手术植入装置同时冷冻。当然，在将神经组织单元植入受试者的神经系统中之前，需要进行解冻步骤。
制备方法
本发明还涉及一种用于制备能够植入哺乳动物神经系统中的神经组织单元的方法。更具体地，本发明提出制备含有有丝分裂后神经元细胞的神经组织单元，所述有丝分裂后神经元细胞的表型取决于所述单元的预期用途。根据本发明，可以制备包含水凝胶囊的细胞微室，所述水凝胶囊围绕神经细胞，特别是来自分化的哺乳动物细胞的神经细胞，所述哺乳动物细胞在包封之前或之后被重编程，接着在水凝胶囊内分化为一种或多种神经类型。接着至少部分去除所述囊以使得所述神经细胞可以在移植之后植入宿主组织中。
通常，根据本发明，用于制备旨在植入人类或非人类哺乳动物的神经系统中的这种神经组织单元的方法包含以下步骤：
(1)制备细胞微室，所述细胞微室包含在水凝胶囊内的细胞外基质和能够分化为神经细胞的人类或非人类哺乳动物细胞，所述人类或非人类哺乳动物细胞有利地与旨在接受神经组织单元的哺乳动物免疫相容；
(2)在细胞微室内诱导细胞分化，从而获得具有至少一种目标表型的有丝分裂后神经元细胞；
(3)至少部分去除水凝胶囊以回收神经细胞作为神经组织单元。
可以使用用于制备细胞微室的任何方法，所述细胞微室含有在水凝胶囊内的细胞外基质和能够产生神经细胞的细胞。特别地，可以用Alessandri等人2016("用于产生用于培养和分化人类神经干细胞(hNSC)的功能化水凝胶微囊的3D印刷微流体装置(A 3Dprinted microfluidic device for production of functionalized hydrogelmicrocapsules for culture and differentiation of human Neuronal Stem Cells(hNSC))",Lab on a Chip,2016,第16卷,第9期,第1593-1604页)中描述的微流体装置来制备微室。
在一个具体实施方式中，包封的细胞是多能干细胞，如诱导性多能干(IPS)细胞或胚胎干(ES)细胞。在本发明的上下文中，将“诱导性多能干细胞”(IPS细胞)定义为如下多能干细胞，所述多能干细胞通过分化的体细胞的遗传重编程获得，并且具有用于与胚胎干细胞部分类似的自我更新和多能性的形态和潜力。这些细胞特别是对多能性标志物如碱性磷酸酶染色以及蛋白质NANOG、SOX2、OCT4和SSEA3/4的表达呈阳性。用于获得诱导性多能干细胞的方法是本领域技术人员所公知的，并且特别描述在Yu等人(Science,2007,318(5858):1917-1920)、Takahashi等人(Cell,2007,131(5):861-872)和Nakagawa等人(NatBiotechnol,2008,26(1):101-106)的文章中。在胚胎干细胞的情况下，所述多能干细胞是源自囊胚内部细胞团并且能够导致生物体的所有组织的形成的细胞。胚胎干细胞的多能性可以通过标记物如转录因子OCT4和NANOG以及表面标志物如SSEA3/4、Tra-1-60和Tra-1-81的存在来评估。可以例如通过使用Chung等人(Cell Stem Cell,2008,2(2):113-117)描述的技术在不破坏胚胎干细胞所源自的胚胎的情况下获得所述胚胎干细胞。在一个具体实施方式中，并且出于法律或伦理原因，将干细胞定义为排除人类胚胎干细胞。
或者，可以包封神经祖细胞，即已经参与向神经细胞进行细胞分化的干细胞。在另一个实施方式中，可以包封分化的细胞，所述细胞将通过转分化而被迫分化为神经细胞。还可以包封能够形成胶质细胞的细胞，如体细胞。
在另一个实施方式中，可以使用分化的细胞，所述细胞将在包封之前或之后被重编程为多能干细胞。由于神经组织单元必须能够在患者神经系统中长时间植入，因此优选以与所述受试者免疫相容的细胞开始，以避免任何排斥风险。在一个具体实施方式中，预先从待植入神经组织单元的人类或非人类哺乳动物中收集用于制备所述神经组织单元的细胞。
在所有情况下，一旦获得细胞微室，其含有的细胞必须进行细胞分化以使其分化为符合一种或多种所需表型的神经元细胞。
可以使用常规用于2D培养(皮氏培养皿等)以迫使细胞分化的任何方法，如Chambers等人("通过双重抑制SMAD信号传导进行的人类ES和iPS细胞的高效神经转化(Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dualinhibition of SMAD signaling)",Nature Biotechnology 27,275-280(2009))或Lippmann等人("指定的人类多能干细胞培养能够在没有小分子抑制剂的情况下进行高效神经上皮细胞衍生(Defined human pluripotent stem cell culture enables highlyefficient neuroepithelium derivation without small molecule inhibitors)",StemCells 2014)描述的方法。在一个具体实施方式中，分化培养基含有24(S),25-环氧胆固醇，以改善多巴胺能分化。
优选地，将细胞微室在分化培养基中并且在水凝胶囊的任何去除之前培养至少三周。
通常，可以将多能细胞微室在使用前冷冻并且根据需要解冻。
在一个示例性实施方式中，可以诱导细胞分化从而迫使细胞微室内的细胞分化为多巴胺能细胞("从多能性产生区域化神经元细胞，一种分步方案(Generatingregionalized neuronal cells from pluripotency,a step-by-step protocol)",Kirkeby等人,Frontiers in Cellular Neuroscience 2012)。接着可以将源自这种细胞微室的神经组织单元植入患有帕金森氏病的受试者的神经系统中，以至少部分代替所述受试者的失效多巴胺能神经元。
在另一个示例性实施方式中，可以诱导细胞分化以迫使细胞微室内的细胞分化为GABA能细胞("从人类干细胞衍生纹状体神经元(Derivation of striatal neurons fromhuman stem cells)",Viegas等人,Prog Brain Res 2012)。接着可以将源自这种细胞微室的神经组织单元植入患有亨廷顿氏舞蹈病(Huntington's chorea)的受试者的神经系统中以至少部分代替所述受试者的失效GABA能神经元。
用于制备根据本发明的神经组织单元的方法还可以包含以下附加步骤：
-用至少一个神经组织单元，优选10至1000个，更优选10至100个神经组织单元装载手术植入装置。
因此，所述植入装置是准备好的以用于将神经细胞移植到受试者的神经系统中。
根据本发明，可以在至少部分去除水凝胶囊之前或之后将作为神经组织单元的神经细胞冷冻。当然，所述神经组织单元可以在制备过程之后被直接使用，而不必首先被冷冻。
有利地，根据本发明的制备方法包含以下中间步骤：
-在细胞分化步骤之后，证实水凝胶囊中含有的神经细胞的表型。
例如，在一个或多个含有多巴胺能神经元的神经组织单元的情况下，可以通过从培养基取出上清液，并且通过进行与HPLC耦合的微透析分析，在移植之前非侵入性地测量可植入神经单元的活性。
更一般地，可以有利地通过所谓的“膜片钳”技术基于通过细胞膜的离子电流的记录来表征代表样品的神经元的电活动。
将神经组织单元有利地在相同条件下分批培养，还可以对所考虑的神经组织单元群的代表性样品进行更详细的分析，特别是通过免疫细胞化学、RNA和/或蛋白质组测序，以确保分化的准确质量。例如，在含有多巴胺能神经元的神经组织单元的情况下，可以进行靶向酪氨酸羟化酶、FOXA2和/或NURR1的免疫细胞化学分析("源自人类ES细胞的多巴胺神经元在帕金森氏病动物模型中的有效植入(Dopamine neurons derived from human EScells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease)",Kriks等人,2012)。
因此，可以在植入受试者的神经系统中的步骤之前检验有丝分裂后神经元和/或神经细胞实际上具有所需表型。
将神经组织单元移植到人类或非人类哺乳动物的神经系统中
本发明还提出了一种将神经组织单元植入或移植到有需要的受试者，并且特别是人类的神经系统中的方法。实际上，根据本发明的神经组织单元可以有利地用于治疗神经变性疾病。在本发明的上下文中，术语“治疗”是指治愈性、症状性(symptomatic)或预防性治疗。如本文所用，术语疾病的“治疗”涉及旨在扩展患者的质量和/或生命的任何行为。治疗可以被设计来根除疾病，停止或延迟疾病的进展和/或促进疾病的消退。术语疾病的“治疗”还涉及旨在减少与疾病相关的症状的任何行为。待治疗的患者为任何哺乳动物，优选人类。
通常，可以使用任何神经细胞移植方法来将神经组织单元植入受试者的神经系统中。特别地，可以使用已将神经组织单元预先装载到其中的套管，如玻璃套管。
在一个具体实施方式中，实施方案包含以下步骤：
-麻醉和/或固定受试者以接受神经组织单元；
-打开受试者的颅骨；
-将含有神经组织单元的植入装置定位在移植区域上方，例如使用所谓的“立体定向”装置；
-将植入装置插入移植区域中；
-注射神经组织单元，同时从移植区域逐渐移除植入装置。
有利地，通过微流体泵和机动化系统来控制注射步骤，以控制植入装置插入受试者神经系统中的深度，从而为神经组织单元在所述神经系统中提供必要的空间，因此所述神经组织单元沉积在植入装置的退出轨迹中。
在一个具体实施方式中，植入装置由玻璃套管组成，所述玻璃套管的内径在0.3至2mm之间，优选为0.4mm，并且外径在0.4和3mm之间，优选为0.55mm。套管有利地具有圆形或倒角的尖端，并且将其表面用氟化化合物进行硅烷化，以在插入套管时降低组织损伤的风险并且降低由血凝块堵塞的风险。将神经组织单元例如从前部装载到套管中。将套管插入受试者颅骨的适当位置中。
有利地，在同一次移植期间，植入10至40个神经组织单元，每个神经组织单元优选地包含1000至10,000个神经细胞。当然，根据受试者和待治疗的疾病和/或待调节的认知或行为功能来调整待植入的神经组织单元的数量。还可以考虑或多或少间隔一段时间的几个移植物。类似地，可以在受试者的神经系统的不同区域中同时或在短期时间内进行移植。
实施例
1.用于治疗帕金森氏病的可植入神经组织单元的制备：
根据Kriks等人("源自人类ES细胞的多巴胺神经元在帕金森氏病动物模型中的有效植入(Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft inanimal models of Parkinson's disease)",Kriks等人,2012)发表的方法，在源自人类诱导性多能干细胞的培养物中使用24(S),25-环氧胆固醇(浓度1至10μM)以优化向多巴胺能神经元的分化，从而获得祖细胞。
将因此获得的祖细胞根据Alessandri等人,2016("用于产生用于培养和分化人类神经干细胞(hNSC)的功能化水凝胶微囊的3D印刷微流体装置(A 3D printedmicrofluidic device for production of functionalized hydrogel microcapsulesfor culture and differentiation of human Neuronal Stem Cells(hNSC))",Lab on aChip,2016)发表的方法进行包封。
一旦获得含有祖细胞的细胞微室，就根据Kriks等人("源自人类ES细胞的多巴胺神经元在帕金森氏病动物模型中的有效植入(Dopamine neurons derived from human EScells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease)",Kriks等人,2012)发表的方法，再次使用24(S),25-环氧胆固醇(浓度1至10μM)进行向多巴胺能神经元的所谓“终末”分化。
应特别注意要更换培养基，因为细胞微室中细胞的增殖增加了可植入神经单元在其制备期间消耗培养基的速率。
所有分化都发生在细胞微室中，但只要细胞支持单个细胞的悬浮液离解(或添加γ分泌酶抑制剂和/或Notch信号如DAPT、化合物E或其它促进终末分化的分子之后最多一周)，就可以解封和重包封所述细胞。
将分化三周之后因此获得的细胞微室通过在PBS溶液中连续冲洗来处理以溶解水凝胶壳并且在注射之前回收神经组织单元。
注射套管的制备：
用陶瓷刀片切5cm部分的硼硅酸盐毛细管(内径：0.4mm，外径0.55mm)。
将毛细管的正面用氧化铝砂纸打磨以依次获得12μm和1μm光学纤维。
通过等离子体处理5分钟将玻璃活化，接着通过在位于密封的玻璃皮氏培养皿中的尖端的附近沉积20μl 1H,1H,2H,2H-全氟辛基三氯硅烷在气相中进行硅烷化。
反应30分钟之后，注射套管准备就绪并将其安装在连接到10μl注射器(Hamilton)的标准立体定向装置上，所述注射器由注射泵(Harvard Apparatus)提供动力。所述立体定向装置的注射臂也是机动的(PI)。
手术：
接着对大鼠进行标准的神经移植手术。这种外科方法包含根据以下的步骤：
1)在动物中诱导药物(氯胺酮)睡眠和麻醉
2)使用立体定向设备将动物精确定位。
3)剃除动物颅骨的毛，接着用必妥碘(betadine)处理，然后用解剖刀打开以去除颅骨上的皮肤，接着使用微钻在颅骨中形成窗口，从而使得套管可以穿过。将脑膜小心铺展，不要损伤正下方露出的皮层。
4)使用立体定向装置将连接到注射器的套管定位在移植区域上方。
5)将神经组织单元从前部装入套管中(约80个囊或10,000至800,000个细胞)。移植物在套管中呈现出总共4μl，或4cm高度。在大鼠中单侧注射两个位点，以约1mm的距离进入纹状体。
6)将套管插入动物颅骨中腹侧纹状体内的第一位点中。在2μl注射期间，在使用微流体泵系统注射和机动控制套管深度的同时取出套管，以释放移植物所需的空间，因此使移植物在退出轨迹中沉积约2mm。
7)将套管留在原位一分钟，接着轻轻取出。
8)接着使用相同程序植入第二位点。
9)用必妥碘冲洗伤口之后缝合大鼠的皮肤(三至五针)。
移植结果：
在展示在成熟人类神经元移植过程的存活的情况下，在手术之后一周牺牲动物以通过对在移植轨迹中用振动切片机切割的脑切片进行免疫细胞化学来研究移植物的存活和植入。
基于移植物尺寸(移植前已知)估计的存活率大于84％±33％，与用于移植悬浮液形式的成熟多巴胺能神经元的方法获得的2％存活率(D.M.Marchionini等人,"对失巢凋亡诱导的多巴胺神经元细胞的死亡的干扰：在帕金森氏病大鼠模型中增强胚胎移植物存活的意义(Interference with anoikis-induced cell death of dopamine neurons:implications for augmenting embryonic graft survival in a rat model ofParkinson's disease)".J Comp Neurol 464,172-179(2003))形成对比。保留了神经元的表型(酪氨酸羟化酶阳性)。此外，可见几毫米的轴突过程，从而指示神经元立即开始整合到大鼠的脑中。
2.包含神经元细胞的神经组织单元的移植以用于治疗帕金森氏病
2.1-手术方案
将大鼠(7/8周龄)饲养在具有12小时光照/黑暗循环的温度受控房间中，并使其随意获取食物和水。
图1总结了对这些大鼠进行的不同程序，以获得帕金森病大鼠，接着将向所述大鼠施加根据本发明的神经组织的移植物。
帕金森病大鼠的制备
手术之前使动物禁食。保留了食物，包括膳食补充剂，和水。
将每只动物置于用空气(0.3L/min)+氧气(0.3L/min)和2％异氟烷的连续流馈送的麻醉室中。注射利多卡因(Xylocaine)(7mg/kg，皮下)、博克(borgal)(7.5％，肌肉内)和丁丙诺啡(buprenorphine)(0.1mg/kg，皮下)。接着用基于异氟烷的麻醉剂使动物保持麻醉，所述麻醉剂通过体积控制的呼吸器施用。在手术期间记录直肠中心温度。必要时，使用加热垫来保持体温。向每只眼睛施用眼用软膏(硫辛酸眼用凝胶)。将毛皮从颅骨切割到颈部。在失去意识后，将动物置于立体定向框(Kopf)中并且使用耳棒将其头部固定在适当位置。
使用与Legato 101自动注射器(KD scientific)耦合的Hamilton 1702N注射器(Ga22s/51mm/PST3)，通过根据Paxinos和Watson脑图谱(Paxinos and Watson brainatlas)，在内侧前脑束(MFB)中，在坐标-前后2.8mm、侧面2mm和背腹8.4mm处，以1μl/min的速率单侧立体定向注射2.5μl含有0.1％抗坏血酸的6-羟基多巴胺(6-OHDA)(Sigma，5mg/ml的无菌NaCl溶液，0.9％)使大鼠呈假性帕金森病(图2A)。
注射之后，将针留在原位5分钟，接着从脑中缓慢取出。在手术之前30分钟，动物接受溶解在0.9％NaCl中的地昔帕明(desipramine)(25mg/kg，5ml/kg)的腹膜内(i.p.)注射，以保护去甲肾上腺素能系统。
当注射完成时，用缝合线闭合皮肤。接着使动物从麻醉中恢复。
移植物
在整个移植程序中保持成熟神经元的微环境使得可以存活并与宿主脑连接。
一组大鼠(6-OHDA包封的祖细胞)接受根据本发明的神经组织单元的移植物，所述移植物包含商购神经元祖细胞(Cellular Dynamics iCell DopaNeurons)，将所述神经元祖细胞在使用前在体外包封并且成熟两周。
第二组大鼠(6-OHDA CNO)接受根据本发明的神经组织单元的移植物，所述移植物包含在实验室中制备并分选的受控的神经类器官(CNO)。
通过将多能细胞或原初多能细胞包封在海藻酸盐中并根据以下方案使其分化为神经元祖细胞来获得包含CNO细胞的神经组织单元：
在37℃、5％CO2和高于95％的湿度饱和度下进行整个培养。
D0-D3(第0天至第3天)：N2B27(对于500mL培养基：250mL神经基础培养基(Neurobasal medium)+250mL Dmem F12培养基外加glutamax+1N2补充剂+1B27补充剂+0.5μM LDN-193189+10μM SB431542+100ng/mL Shh(音猬因子(Sonic Hedgehog))+100ng/mLFGF-8(成纤维细胞生长因子8)+2μM嘌吗啡胺(purmorphamine)+10μM 24(S),25-环氧胆固醇
D3-D9：N2B27+LDN+SB+Shh+FGF-8+嘌吗啡胺+CHIR+24(S),25-环氧胆固醇
D9-D10：N2B27+LDN+CHIR+24(S),25-环氧胆固醇
D10-D15或更多：N2B27+cAMP+AA+GDNF+BDNF+FGF-20+TGFbeta+曲古霉素(trichostatin)+CpE+24(S),25-环氧胆固醇
表1：缩写和简称列表
表2：最终浓度
小分子或生长因子 细胞水平的最终浓度
cAMP 0.5mM
抗坏血酸AA 200μM
BDNF 10ng/ml
Chir99021 3μM
化合物E 1μM
FGF-20 5ng/ml
FGF-8 100ng/ml
GDNF 10ng/ml
LDN-193189 0.5μM
嘌吗啡胺 2μM
rock抑制剂 10μM
SB431542 10μM
Shh 100ng/ml
TGFβ3 1ng/ml
曲古霉素A 10nM
24(S),25-环氧胆固醇 10μM
在注射神经组织单元(6-OHDA包封的祖细胞和6-OHDA CNO)之前，通过将培养基换成PBS而简单地溶解细胞微室的海藻酸盐囊。
注射装置是安装在立体定向设备上的注射器或套管。通过将注射的体积(25个CNO，约1μL)吸入套管体中，将神经组织单元装载到注射套管中。
为了在2个轨迹上注射4个注射位点(图2B)：在以下坐标处将4μl祖细胞(组3)、包封的祖细胞(6-OHDA祖细胞)或CNO(6-OHDA CNO)注入纹状体中：A/P+1.2；M/L-2.6；D/V-5.0(3μl)和-4.0(3μl)；和A/P+0.5；M/L-3.0；D/V-5.0(3μl)和-4.0(3μl)；齿棒-2.4(Grealish等人,2014)。
手术后程序
从免疫受损的大鼠(NR或裸鼠)形成四组大鼠：
-“Sham”：无病变大鼠
-“6-OHDA”：右半球中的多巴胺能神经元已被化学杀死并且没有移植的大鼠(对照实验)
-“CNO”或“6-OHDA CNO”：右半球的多巴胺能神经元已被化学杀死，并且在右侧纹状体中移植包含约250,000个细胞的根据本发明的神经组织单元的大鼠。
-“Pro encap”或“6-OHDA包封的祖细胞”：右半球的多巴胺能神经元已被化学杀死，并且在右侧纹状体中移植在囊中包含约250,000个成熟2周的Cellular DynamicsiDopaneurons细胞的根据本发明的神经组织单元的大鼠。
密切观察每只动物并保持温暖，直至其恢复其翻正和吞咽反射。动物由有经验的技术人员照顾，所述技术人员能容易地获得有经验的兽医的支持。
必要时，使用用于动物临床控制的其它药物。每种药物、剂量、途径和施用位点都记录在手术记录中。
每天至少一次监视手术切口的感染迹象、发炎和一般完整性(直到切口愈合)。所有观察现象和结果都记录在手术记录中。告知研究协调员任何异常情况。应尽快通知研究监视员任何异常情况。
每天两次(从11am到10pm)检查动物的状况。
根据公平和人道的处理标准评价动物。必要时提供适当的兽医支持。显示可能持续存在剧烈疼痛或痛苦迹象的任何动物都会很快被安乐死。接着对其进行粗略尸检。除尸检之外，取出脑以进行组织学检查，并按照安乐死部分所指示进行处理。尽一切合理的努力来应用公平且人道的处理标准，以防止动物被发现死亡。
2.2-行为研究
安非他明(Amphetamine)诱导的旋转(修改自Grealish等人,2014)
在将6-羟基多巴胺(6-OHDA)注射到中端脑束之后，只有超过5转/分的动物才被认为成功患上病变。使用自动系统(Omnitech Electronics)记录全身注射安非他明(2.5mg/kg，腹膜内，Apoteksbolaget)之后的旋转偏差。记录动物旋转90分钟，仅计数完整的身体转动，接着以每分钟的净转数表示，将向病变侧旋转(顺时针)计数为阳性。
踏步测试
将每只大鼠放置在平坦的表面上；通过轻轻握住尾巴使其后爪抬起，使得仅允许一条腿接触桌子。实验者将老鼠以规则速率拉回一米。在对应路径上独立地计数对侧和同侧前的前爪的调整运动。通过计算对侧/(对侧+同侧)比率，将数据呈现为使用爪进行调整运动的百分比。
圆筒测试
通过将每只动物放置在玻璃圆筒中并且计数同侧和对侧爪在圆筒壁上的触摸次数5分钟来进行圆筒试验，通过计算对侧/(对侧+同侧)比率来表示结果，基于最多20次触摸。
“旷场”活动监测仪
使用光电活动监测仪(Actitrack,Panlab,S.L.,Barcelona,Spain)测量自发运动活动。该装置由与光电管连接的透明笼组成。在两个连续的10分钟训练期中每天记录每只大鼠的光束检测运动和水平运动检测的总数。所有活动监测仪测试都在8:00am至1:00pm之间在隔离房间内进行。前三天阶段使得可以适应。第四天被认为是测试之日。前10分钟训练期被认为是每天适应期。仅将在第二个10分钟训练期记录的运动活动用于数据分析。
2.3-死后研究评价-组织学分析
实验结束之后，通过心内输注4％多聚甲醛牺牲大鼠，收集脑，在-45℃下在异戊烷中冷冻并且储存在-80℃下。将输注的脑用低温恒温器切成50μm冠状切片。
多巴胺能(DA)病变的验证
如上所述(Bouali-Benazzouz等人,2009)，通过酪氨酸羟化酶(TH)的免疫组织化学检验中枢神经系统中DA细胞的损失和纹状体中DA纤维的损失。通过施加光学分级分离法使用具有Mercator Pro软件(ExploraNova，版本7.9.8)的Leica DM6000B显微镜获得酪氨酸羟化酶(TH)免疫活性细胞的数量。
移植物的验证
使用抗体对大鼠脑切片和CNO进行免疫组织化学测定以分析移植物的细胞存活、可能的增殖和表型成熟(使用人类细胞质标志物(HCM)鉴别)，并且通过常规的DA标志物(TH、DAT、FOXA2)、泛神经元标志物(MAP2，NeuN)、血清素(FOXG1)、增殖标志物Ki-67/PCNA和胶质标志物(人类特异性GFAP)表征。
神经元存活测试
在移植后6天牺牲6只CNO大鼠以评价移植之后的神经元存活
结果
行为研究的结果
行为研究显示，根据本发明的移植物在移植大鼠(6Pro-encap和CNO)中具有非常积极的效果，因为对于踏步测试(图4B)和圆筒测试(图4A)，在4至6周内获得行为校正，并且对于旋转计量仪测试，在2周内获得行为校正(图4C)，而文献中用祖细胞移植物证明的极少效果在约20周之后显示行为改善(Kriks等人2011，Grealish等人2014，Kirkeby等人2017，Doi等人2014)。
如所预期的，另一方面，根据本发明的移植物对焦虑结果没有效果(图4D)。
组织学结果
在两个CNO和Pro-encap组中进行的移植物的组织学分析显示移植物中存在10至15％TH神经元。为了比较，先前发表的研究描述了祖细胞移植之后TH神经元水平约为5％(Kirkeby等人2017)或6％(Kriks等人2011)。
神经元存活的分析显示，在移植6天之后，在CNO大鼠的脑中观察到多毫米的轴突投影(图3)，这证实了神经元在根据本发明的移植之后的显著存活。

Claims (30)

1.神经组织单元在制备用于植入人类或非人类哺乳动物的神经系统中的药物中的用途，其中所述神经组织单元含有具有与待代替的失效细胞的表型相对应的目标表型的分化的有丝分裂后神经元细胞并含有胶质细胞，所述细胞被组织在细胞外基质中的三维网络中，所述单元是从包含围绕单个神经组织单元的水凝胶囊的细胞微室获得的，所述分化的有丝分裂后神经元细胞是从所述水凝胶囊内分化成有丝分裂后神经元细胞的人类或非人类哺乳动物获得的，并且在使用所述神经组织单元之前至少部分去除所述水凝胶囊。
2.权利要求1的用途，其中所述神经组织单元不含水凝胶。
3.权利要求1的用途，其中所述神经细胞形成神经细胞簇。
4.权利要求3的用途，其中所述神经细胞簇的最小尺寸在50μm至500μm之间。
5.权利要求3的用途，其中所述神经细胞簇的最小尺寸在150μm至400μm之间。
6.权利要求3的用途，其中所述神经细胞簇的最小尺寸在200μm至300μm之间。
7.权利要求1至6任一项的用途，其中所述单元包含10％至100％的具有所述目标表型的有丝分裂后神经元细胞。
8.权利要求1至6任一项的用途，其中所述单元包含50％至100％的具有所述目标表型的有丝分裂后神经元细胞。
9.权利要求1至6任一项的用途，其中所述单元包含超过90％的具有所述目标表型的有丝分裂后神经元细胞。
10.权利要求1至6任一项的用途，其中所述单元含有100至100,000个神经细胞。
11.权利要求1至6任一项的用途，其中所述神经组织单元用于治疗神经变性疾病或神经元蜡样脂褐质沉积。
12.权利要求11的用途，其中所述神经变性疾病选自帕金森氏病、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)和阿尔茨海默氏病。
13.权利要求11的用途，其中所述神经元蜡样脂褐质沉积是巴腾病。
14.权利要求12的用途，其中所述神经组织单元含有多巴胺能神经元以用于治疗帕金森氏病。
15.权利要求12的用途，其中所述神经组织单元含有GABA能神经元以用于治疗亨廷顿氏病。
16.权利要求1至6任一项的用途，其中所述神经组织单元含有经遗传修饰的神经细胞。
17.权利要求16的用途，其中所述神经组织单元用于帮助、改善或修复认知和/或行为功能。
18.一种用于制备旨在植入受试者的神经系统中的如权利要求1至17任一项中限定的神经组织单元的方法，所述方法包含以下步骤：
(1)制备细胞微室，所述细胞微室包含在水凝胶囊内的细胞外基质和能够分化成神经细胞的人类或非人类哺乳动物细胞，所述人类或非人类哺乳动物细胞与旨在接受所述神经组织单元的哺乳动物免疫相容；
(2)在所述细胞微室内诱导细胞分化，从而获得具有与待代替的失效细胞的表型相对应的至少一种目标表型的有丝分裂后神经元细胞；
(3)至少部分去除所述水凝胶囊以回收所述神经元细胞作为神经组织单元，
其中所述神经组织单元还含有胶质细胞。
19.权利要求18的用于制备神经组织单元的方法，所述方法包含以下附加步骤：
(4)用至少一个神经组织单元装载手术植入装置。
20.权利要求18的用于制备神经组织单元的方法，所述方法包含以下附加步骤：
(4)用至少10至1000个神经组织单元装载手术植入装置。
21.权利要求18的用于制备神经组织单元的方法，所述方法包含以下附加步骤：
(4)用10至100个神经组织单元装载手术植入装置。
22.权利要求18至21任一项的用于制备神经组织单元的方法，所述方法包含以下附加步骤：
-在至少部分去除所述水凝胶囊之前或之后将作为组织单元的所述神经细胞冷冻。
23.权利要求18至21任一项的用于制备神经组织单元的方法，其中预先从待植入所述神经组织单元的人类或非人类哺乳动物中收集步骤(1)中使用的细胞。
24.权利要求18至21任一项的用于制备神经组织单元的方法，所述方法包含以下中间步骤：
-在步骤(2)的细胞分化之后，证实所述水凝胶囊中含有的神经细胞的表型。
25.权利要求18至21任一项的用于制备神经组织单元的方法，其中将所述细胞分化为多巴胺能细胞或GABA能细胞。
26.一种神经组织单元植入试剂盒，所述神经组织单元植入试剂盒包含至少一个细胞微室，所述细胞微室包含至少一个包封如权利要求1至17任一项中限定的神经组织单元的水凝胶囊，以及用于至少部分去除所述水凝胶囊的工具。
27.权利要求26的神经组织单元植入试剂盒，所述神经组织单元植入试剂盒还包含能够将神经组织单元植入哺乳动物的神经系统中的手术植入装置。
28.一种神经组织单元植入试剂盒，所述神经组织单元植入试剂盒包含在手术植入装置中的至少一个如权利要求1至17任一项中限定的神经组织单元，所述手术植入装置适用于将所述神经组织单元植入哺乳动物的神经系统中。
29.权利要求28的神经组织单元植入试剂盒，所述神经组织单元植入试剂盒包含在所述手术植入装置中的1至10,000个神经组织单元。
30.权利要求28的神经组织单元植入试剂盒，所述神经组织单元植入试剂盒包含在所述手术植入装置中的10至1,000个神经组织单元。
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