BR112019010514A2 - unidade de tecido neural e uso dessa unidade para a implantação no sistema nervoso de um mamífero - Google Patents

Abstract

a presente invenção se refere a uma unidade de tecido neural para seu uso para uma implantação no sistema nervoso de um mamífero humano ou não humano, em que a dita unidade de tecido neural contém células neuronais pós-mitóticas diferenciadas, dentro de uma matriz extracelular, a dita unidade sendo obtida a partir de um microcompartimento celular que contém uma cápsula de hidrogel envolvendo a unidade de tecido neural, e a dita cápsula de hidrogel sendo eliminada ao menos parcialmente antes do uso da unidade de tecido neural. a invenção também se refere a um método de preparação dessa unidade de tecido neural.

Description

UNIDADE DE TECIDO NEURAL E USO DESSA UNIDADE PARA A

IMPLANTAÇÃO NO SISTEMA NERVOSO DE UM MAMÍFERO [0001] A invenção se refere a uma unidade de tecido neural, compreendendo uma pluralidade de células neuronals pós-mitóticas, e eventualmente células gliais, organizadas em rede de três dimensões (3D) em uma matriz extracelular, e ao seu uso como unidade a ser implantada no sistema nervoso de um mamífero. Em especial, essa unidade de tecido neural pode ser utilizada para enxertar células neuronals que apresentem um fenótipo de interesse no sistema nervoso de um indivíduo, visando tratar uma doença neurodegenerativa.

[0002] Há muitas décadas as doenças neurodegenerativas representam um grande desafio para a sociedade, tanto em termos da compreensão dos fenômenos biológicos envolvidos quanto em termos do tratamento. De fato, um número cada mais maior de pessoas são afligidas por essas doenças, que têm consequências dramáticas para o paciente e para as pessoas próximas.

[0003] 0 termo genérico doença neurodegenerativa engloba um número muito vasto de doenças, caracterizadas sobretudo por uma morte neuronal mais rápida que a do envelhecimento normal, dentre as quais o mal de Alzheimer, o mal de Parkinson, a coréia de Huntington, a esclerose lateral amiotrófica, etc. O sistema nervoso pode ser atingido de diversas formas, ocasionando uma série de sintomas, tais como transtornos de motricidade, equilíbrio, comportamento, e/ou de cognição.

[0004] No presente momento, de maneira geral, as causas

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2/39 e os mecanismos das doenças neurodegenerativas não são compreendidos, tornando o seu tratamento ainda mais complexo. Até agora não existem tratamentos comprovados com potencial de cura para essas doenças.

[0005] Há alguns anos, as linhas de desenvolvimento têm enfocado a terapia celular intracerebral e mais particularmente a enxertia de neurônios nas áreas cerebrais lesionadas de indivíduos portadores de doenças neurodegenerativas. A finalidade dessas enxertias é a substituição duradoura dos neurônios destruídos pela doença. Nesse sentido, enxertias localizadas de células ou tecidos embrionários foram praticadas com sucesso em diversos pacientes com o mal de Parkinson. No entanto, essa abordagem implica no uso de tecidos provenientes de fetos abortados, o que envolve questões éticas e logísticas. Além disso, inúmeros laboratórios se voltaram para as célulastronco induzidas pluripotentes humanas (hIPS) como uma fonte alternativa possivel de células humanas de qualidade. A diferenciação eficaz das hIPS em neurônios dotados do fenótipo necessário para substituir os neurônios perdidos pelos pacientes é um campo de pesquisa bastante ativo. Contudo, os neurônios são células extremamente frágeis. A injeção de uma suspensão de neurônios normalmente resulta na morte de mais de 98% dos ditos neurônios por perda de adesão (anoikis). Como alternativa, uma perspectiva considerada consistia em enxertar progenitores neuronals, conhecidos por serem menos frágeis que os neurônios. Essa solução também não foi satisfatória. Na realidade, a diferenciação celular dos progenitores neuronals depois da implantação não é controlada, e não há certeza de que as

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3/39 células implantadas se diferenciem convenientemente e/ou no tipo neuronal desejado.

[0006] Sendo assim, existe a necessidade de um sistema de implantação de células neuronals que permita prolongar a sobrevida das células implantadas, em especial para substituir os neurônios alterados de maneira duradoura em um paciente portador de uma doença neurodegenerativa.

Sumário da Invenção [0007] Trabalhando com a cultura de células em três dimensões (3D) , os inventores descobriram que é possível aumentar a taxa da sobrevida à manipulação de células particularmente frágeis como os neurônios, cultivando e manipulando essas células não sob a forma de suspensões celulares, e sim sob a forma de redes celulares tridimensionais. Os inventores desenvolveram uma unidade de tecido neural com células neuronals que apresentam um fenótipo de interesse suscetível de ser injetado no sistema nervoso de um paciente, para integrar as ditas células neuronals com uma taxa de sobrevida bastante superior à obtida pela injeção de uma suspensão de células neuronals. A unidade de células neurais desenvolvida contém células neurais pré-organizadas em uma rede 3D e submersas em uma matriz extracelular, favorecendo a integração e a sobrevida das células no sistema nervoso posteriormente à injeção. Com efeito, as células neurais são transferidas dentro do sistema nervoso hospedeiro mantendo a integridade do seu ambiente local, especialmente as interações entre células e com a matriz extracelular desenvolvidas dentro da unidade do tecido neural. Adicionalmente, a unidade de tecido neural de acordo com a invenção contém células neuronals

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4/39 pós-mitóticas com um grau de diferenciação que pode ser manejado perfeitamente, limitando os riscos de introdução de tipos celulares não desejados, responsáveis especialmente pelo desenvolvimento de teratomas e por crescimentos tumorais. Uma constatação interessante foi que a unidade de tecido neural de acordo com a invenção é capaz de projetar axônios no interior do tecido hospedeiro, favorecendo uma boa integração das células no dito tecido hospedeiro, e produzindo um beneficio funcional certo.

[0008] A invenção tem por objeto, portanto, uma unidade de tecido neural para seu uso para uma implantação no sistema nervoso de um mamífero humano ou não humano, em que a dita unidade de tecido neural contém células neuronals pós-mitóticas diferenciadas, em uma matriz extracelular, a dita unidade sendo obtida a partir de um microcompartimento celular compreendendo uma cápsula de hidrogel que envolve uma única unidade de tecido neural, e a dita cápsula de hidrogel sendo eliminada ao menos parcialmente antes da implantação da dita unidade de tecido neural.

[0009] Assim, a invenção tem por objeto uma unidade de tecido neural para seu uso no tratamento de uma doença neurodegenerativa pela implantação no sistema nervoso de um mamífero humano ou não humano que apresenta uma doença neurodegenerativa de pelo menos uma unidade de tecido neural contendo células neuronals pós-mitóticas diferenciadas dentro de uma matriz extracelular, a dita unidade sendo obtida a partir de um microcompartimento celular compreendendo uma cápsula de hidrogel que envolve a dita unidade de tecido neural, e a dita cápsula de hidrogel sendo eliminada ao menos parcialmente antes da implantação

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5/39 da unidade de tecido neural.

[0010] Especialmente, a invenção tem por objeto uma unidade de tecido neural para seu uso no tratamento do mal de Parkinson, pela implantação no sistema nervoso de um mamífero humano ou não humano apresentando o mal de Parkinson, de pelo menos uma unidade neural contendo células neuronals pós-mitóticas diferenciadas em neurônios dopaminérgicos dentro de uma matriz extracelular, a dita unidade sendo obtida a partir de um microcompartimento celular compreendendo uma cápsula de hidrogel que envolve a dita unidade de tecido neural, e a dita cápsula de hidrogel sendo eliminada ao menos parcialmente antes da implantação da unidade de tecido neural.

[0011] A invenção também tem por objeto uma metodologia de tratamento do mal de Parkinson, segundo a qual implantamos no sistema nervoso de um paciente que apresenta o mal de Parkinson pelo menos uma unidade de tecido neural contendo células neuronals pós-mitóticas diferenciadas em neurônios dopaminérgicos dentro de uma matriz extracelular, a dita unidade sendo obtida a partir de um microcompartimento celular compreendendo uma cápsula de hidrogel que envolve a dita unidade de tecido neural, e a dita cápsula de hidrogel sendo eliminada ao menos parcialmente antes da implantação da unidade de tecido neural.

[0012] Da mesma forma, a invenção tem por objeto uma unidade de tecido neural para seu uso no tratamento da doença de Huntington pela implantação no sistema nervoso de um mamífero humano ou não humano, que apresenta a doença de Huntington, de pelo menos uma unidade de tecido neural

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6/39 contendo células neuronals pós-mitóticas diferenciadas em neurônios GABAérgicos dentro de uma matriz extracelular, a dita unidade sendo obtida a partir de um microcompartimento celular compreendendo uma cápsula de hidrogel que envolve a dita unidade de tecido neural, e a dita cápsula de hidrogel sendo eliminada ao menos parcialmente antes da implantação da unidade de tecido neural.

[0013] A invenção também tem por objeto uma metodologia de tratamento da doença de Huntington, segundo a qual implantamos no sistema nervoso de um paciente que apresenta a doença de Huntington pelo menos uma unidade de tecido neural contendo células neuronals pós-mitóticas diferenciadas em neurônios GABAérgicos dentro de uma matriz extracelular, a dita unidade sendo obtida a partir de um microcompartimento celular compreendendo uma cápsula de hidrogel que envolve a dita unidade de tecido neural, e a dita cápsula de hidrogel sendo eliminada ao menos parcialmente antes da implantação da unidade de tecido neural.

[0014] De maneira similar, a invenção tem por objeto uma unidade de tecido neural para seu uso para uma implantação no sistema nervoso de um mamífero humano ou não humano, sendo que a dita unidade de tecido neural contém neurônios modificados geneticamente. Essas unidades de tecido neural podem ser utilizadas sobretudo para auxiliar, melhorar ou reparar uma função de cognição e/ou ação em um mamífero humano ou não humano.

[0015] A invenção também tem por objeto um método de preparação dessa unidade de tecido neural, destinada a ser implantada no sistema nervoso de um mamífero humano ou não

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7/39 humano, o dito método compreendendo as etapas de:

(1) produzir microcompartimentos celulares compreendendo, no interior de uma cápsula de hidrogel, uma matriz extracelular e células de mamífero humano ou não humano, capazes de se diferenciarem em células neurais, vantajosamente imunocompativeis com o mamífero destinado a receber a unidade de tecido neural;

(2) induzir a diferenciação celular no interior do microcompartimento celular, de maneira a obter células neuronals que apresentem pelo menos um fenótipo pósmitótico de interesse;

(3) eliminar pelo menos parcialmente a cápsula de hidrogel para recuperar as células neuronals sob a forma de unidade de tecido neural.

[0016] A invenção também se refere a um kit de implantação de unidades de tecido neural compreendendo pelo menos um microcompartimento celular que compreende pelo menos uma cápsula de hidrogel envelopando uma unidade de tecido neural de acordo com a invenção, e meios para a eliminação ao menos parcial da cápsula de hidrogel.

[0017] A invenção também se refere a um kit de implantação de unidades de tecido neural compreendendo pelo menos uma unidade de tecido neural de acordo com a invenção, preferencialmente entre 10 e 100 e até 1000, as ditas unidades de tecido neural sendo carregadas em um

dispositivo	de implantação cirúrgica capaz	de implantar	as
unidades	de	tecido	neural no sistema	nervoso de	um
mamífero.
Descrição	das Figuras
[0018]	A	Figura 1	é uma representação	esquemática	do

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8/39 protocolo de preparação de diferentes ratos tornados parkinsonianos, tratados ou não com uma injeção de tecido neural de acordo com a invenção. Placebo: ratos de controle; 6-OHDA: ratos tornados parkinsonianos (testemunha negativa); 6-OHDA progenitor encapsulados (ou Pro encaps): ratos tornados parkinsonianos que tenham recebido unidades de tecido neural de acordo com a invenção, provenientes de microcompartimentos celulares nos quais células progenitoras de neurônios comerciais foram encapsuladas; 6OHDA CNOs (Controlled Neural Organoids): ratos tornados parkinsonianos que tenham recebido unidades de tecido neural (que nesse exemplo correspondem aos CNOs) de acordo com a invenção, provenientes de microcompartimentos celulares nos quais células pluripotentes foram encapsuladas antes de serem diferenciadas em neurônios, entre as quais os neurônios dopaminérgicos;

[0019] As Figuras 2A e 2B descrevem o protocolo de lesão (2A) e de enxertia (2B) aplicado para obtenção de ratos parkinsonianos e para enxertar os tecidos neuronals de acordo com a invenção;

[0020] A Figura 3 é uma micrografia mostrando as projeções axonais plurimilimétricas de neurônios humanos 6 dias após a enxertia de uma unidade neural implantável de acordo com a invenção (nesse exemplo, do tipo CNO) no sistema nervoso central de um rato tornado parkinsoniano (6-OHDA CNOs). A representação é uma imagem confocal de um corte do corpo esfriado do rato na zona da enxertia, fixado, congelado e seccionado em criostato, revelada por histoquimica com um anticorpo contra o citoplasma humano (HCM);

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9/39 [0021] As Figuras 4A-E mostram os resultados obtidos para os testes comportamentais conduzidos em ratos tornados parkinsonianos que receberam ou não uma enxertia da unidade de tecido neural de acordo com a invenção. (4A) teste do cilindro; (4B) Prova de marcha; (4C) teste do rotômetro; (4D) Teste de ansiedade.

Descrição detalhada [0022] A presente invenção revela uma metodologia de implantação, ou enxertia, no sistema nervoso de um mamífero, de uma unidade de tecido neural na qual as células neurais são organizadas em rede 3D. A enxertia de células neurais sob a forma de esferas densas favorece a sua implantação e integração no sistema nervoso hospedeiro. A metodologia de implantação de acordo com a invenção, e de forma mais geral a unidade de tecido neural desenvolvida de acordo com a invenção, é planejada para ser utilizada em um mamífero humano ou não humano, e mais preferencialmente em um indivíduo humano.

Unidade de tecido neural [0023] A invenção propõe utilizar, invés e em substituição a uma suspensão de células neuronals, uma unidade de tecido neural, para sua implantação no sistema nervoso de um indivíduo, a fim de tratar alguns tipos de doenças neurodegenerativas e/ou auxiliar, melhorar, reparar uma função de cognição ou ação no dito indivíduo.

[0024] De acordo com a invenção, a unidade de tecido neural planejada para ser implantada contém beneficamente neurônios pós-mitóticos diferenciados e células gliais, tais como astrócitos e/ou oligondendrócitos dentro de uma matriz extracelular.

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10/39 [0025] Por neurônios pós-mitóticos, entendemos células neuronals que perderam a capacidade de se dividirem. Os neurônios contidos no microcompartimento são diferenciados pelo fato de apresentarem um fenótipo particular.

[0026] De acordo com a invenção, a cápsula de hidrogel que envolve a unidade de tecido neural é eliminada ao menos parcialmente antes de ser implantada no sistema nervoso do indivíduo.

[0027] No contexto da invenção, a cápsula de hidrogel designa uma estrutura tridimensional formada a partir de uma matriz de cadeias de polímeros expandida por um liquido, de preferência a água. Em um aspecto vantajoso, o hidrogel utilizado é biocompativel, por não ser tóxico às células. Além disso, a cápsula de hidrogel deve permitir a difusão de oxigênio e de nutrientes para alimentar as células contidas no microcompartimento e permitir a sua sobrevida. Por exemplo, a cápsula de hidrogel contém alginato. De preferência, a cápsula contém apenas alginato. No contexto da invenção, entendemos por alginato os polissacarideos lineares formados a partir do β-Dmanuronato e do a-L-guluronato, sais e derivados dessas substâncias. Em um aspecto vantajoso, o alginato é um alginato de sódio, composto com 80% de α-L-guluronato e 20% de β-D-manuronato, com uma massa molecular média de 100 a 400 KDa (por exemplo: PRONOVA™ SLG100) e uma na concentração total compreendida entre 0,5% e 5% em massa.

[0028] A cápsula de hidrogel permite, no momento da preparação da unidade de tecido neural, proteger as células do meio externo e permitir a sua diferenciação controlada em um ou vários tipos neuronals de interesse. De acordo com

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11/39 a invenção, uma cápsula de hidrogel envolve uma única unidade de tecido neural. Assim, cada unidade de tecido neural é envolvida individualmente por uma cápsula de hidrogel. Uma vez que o ou os tipos celulares desejados obtidos e o tamanho do tecido neural na cápsula sejam suficientes, a dita cápsula é eliminada ao menos parcialmente. Por eliminada ao menos parcialmente, entendemos que a cápsula de hidrogel é hidrolisada, dissolvida, perfurada, ou rompida ao menos parcialmente para permitir que pelo menos os axônios de pelo menos certas células neurais da dita unidade saiam da cápsula. Qualquer meio biocompativel, ou seja, não tóxico às células, que possibilite a hidrólise, a dissolução, a perfuração e/ou a ruptura pelo menos parcial da cápsula de hidrogel pode ser utilizado. Por exemplo, podemos usar um tampão de fosfato salino, um quelante de ions divalentes, uma enzima, como a alginato liase, a microdissecção a laser, esferas solúveis integradas ao hidrogel, etc.

[0029] Em um aspecto vantajoso, a eliminação da cápsula é completa, e a unidade de tecido neural destinada a ser implantada no sistema nervoso de um indivíduo é desprovida de hidrogel.

[0030] De preferência, a camada de matriz extracelular da unidade de tecido neural forma um gel. A camada de matriz extracelular contém uma mistura de proteínas e compostos extracelulares necessários à cultura celular, e mais particularmente à cultura de células neurais. De preferência, a matriz extracelular contém proteínas estruturais como as lamininas que contêm as subunidades al ou a4 ou a5 e βΐ ou β2 e γΐ ou γ3, entactina, vitronectina,

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12/39 colágeno, bem como fatores de crescimento como o TGF-beta e/ou o EGF. Em uma modalidade de realização, a camada de matriz extracelular consiste em, ou contém Matrigel® e/ou Geltrex®.

[0031] A unidade de tecido neural de acordo com a invenção tem a vantagem de conter células neurais organizadas em rede 3D, em cujo interior já existem interações entre as células e a matriz extracelular.

[0032] Em um aspecto vantajoso, as células neurais da unidade de tecido neural formam um aglomerado de células neurais, entre outras de forma ovoide, tubular ou esférica, apresentando, de maneira preferencial, uma menor dimensão compreendida entre 10 pm e 1000 pm mais ou menos 10%, preferencialmente entre 150 pm e 400 pm mais ou menos 10%, ainda mais preferencialmente entre 200 pm e 300 pm mais ou menos 10%. Essas dimensões são particularmente favoráveis à sobrevida dos neurônios no interior da unidade de tecido neural e otimizam a reorganização e a vascularização do enxerto posteriormente à implantação. Por menor dimensão, entendemos a distância minima entre dois pontos situados de um lado e de outro do aglomerado de células.

[0033] De preferência, a unidade de tecido neural de

acordo com a invenção neurais .	contém de	100 a 100.000	células
[0034]	No interior	do tecido	neural,	as	células
neuronals	apresentam vantajosamente	um ou mais	f enó	tipos de

interesse, selecionados em função do uso destinado para a dita unidade de tecido neural. De acordo com a invenção, a unidade de tecido neural implantada contém células neuronals diferenciadas consoante um ou mais fenótipos

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13/39 selecionados e controlados. De preferência, a unidade de tecido neural contém entre 10 e 100% de células neuronals pós-mitóticas do(s) fenótipo(s) de interesse, preferencialmente entre 50 e 100%, mais preferencialmente acima de 90%. As outras células presentes na unidade de tecido neural podem ser células gliais e/ou células neuronals pós-mitóticas com um fenótipo diverso do fenótipo de interesse. Em um aspecto vantajoso, a unidade de tecido neural contém essencialmente células neuronals pósmitóticas de mesmo fenótipo.

[0035] O fenótipo de interesse das células neuronals pós-mitóticas é função da destinação da dita unidade. Logo, em caso de uso na terapia celular, o fenótipo dos neurônios corresponde vantajosamente ao fenótipo das células faltantes gue serão substituídas.

[0036] Com efeito, a unidade de tecido neural de acordo com a invenção pode ser utilizada com vantagens na terapia celular para o tratamento de uma doença neurodegenerativa como o mal de Parkinson, a doença de Huntington, a esclerose lateral amiotrófica (ALS), o mal de Alzheimer ou as lipofuscinoses ceroides neuronals, a exemplo da doença de Batten.

[0037] Desse modo, para o tratamento do mal de Parkinson, a unidade de tecido neural contém beneficamente neurônios dopaminérgicos. De preferência, os neurônios pósmitóticos contidos nessa unidade de tecido neural são essencialmente neurônios dopaminérgicos.

[0038] Por essencialmente, entendemos no contexto da invenção pelo menos 90% das células, preferencialmente pelo menos 95%, ainda mais preferencialmente pelo menos 99%.

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14/39 [0039] Para o tratamento da doença de Huntington, a unidade de tecido neural contém beneficamente neurônios

GABAérgicos. De preferência, os neurônios pós-mitóticos contidos nessa unidade de tecido neural são essencialmente neurônios GABAérgicos.

[0040] A unidade de tecido neural de acordo com a invenção também pode conter células neurais geneticamente modificadas. Desse modo, é possível implantar no sistema nervoso de um indivíduo células neurais nas quais a expressão de um ou mais genes foi inibida ou, ao contrário, aumentada. Também é possível implantar células neurais nas quais um gene heterólogo foi introduzido para inserir no sistema nervoso uma função normalmente absente.

[0041] Essa unidade de tecido neural, contendo células geneticamente modificadas, é de especial interesse no sentido de auxiliar, melhorar ou reparar uma função de cognição e/ou ação, como uma função de cognição e/ou ação faltante ou insuficiente no indivíduo considerado.

[0042] Por exemplo, no tratamento da doença de Huntington, como a causa genética é conhecida (elongação de uma repetição do triplet GAG no interior do gene codificador para a huntigtina), células do paciente podem ser extraídas para preparar as unidades de tecido neural de acordo com a invenção, que contêm os neurônios GABAérgicos nos quais o gene deficiente foi corrigido, antes de realizar a autoenxertia das ditas unidades de tecido neural.

[0043] Para os pacientes acometidos pelo mal de Parkinson, é possível preparar unidades de tecido neural que contenham neurônios dopaminérgicos modificados para

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15/39 expressar canais sensíveis à luz, tais como os canais de rodopsina, no intuito de controlar a atividade do tecido neural enxertado pela simples iluminação, de maneira similar à estimulação cerebral profunda (deep brain stimulation) porém menos invasiva. De maneira geral, o controle da atividade do tecido neural enxertado, sobretudo pela expressão de canais sensíveis à luz, pode ser vantajoso para o conjunto das aplicações contempladas.

Kits de implantação de unidades de tecido neural [0044] A invenção propõe adicionalmente um kit de implantação de unidades de tecido neural compreendendo pelo menos um microcompartimento celular contendo uma cápsula de hidrogel que envelopa uma unidade de tecido neural de acordo com a invenção, e meios para a eliminação ao menos parcial da cápsula de hidrogel (hidrólise, dissolução, perfuração e/ou ruptura).

[0045] 0 profissional da área que fará uso da unidade de tecido neural de acordo com a invenção pode então, no momento do uso e em função das necessidades, eliminar ao menos parcialmente a cápsula de hidrogel para obter a ou as unidades de tecido neural prontas para serem implantadas no sistema nervoso de um indivíduo.

[0046] Além disso, o kit de implantação de acordo com a invenção também pode conter um dispositivo de implantação cirúrgica capaz de implantar uma unidade de tecido neural no sistema nervoso de um mamífero.

[0047] A invenção propõe adicionalmente um kit de implantação de unidades de tecido neural compreendendo pelo menos uma unidade de tecido neural de acordo com a invenção, preferencialmente entre 1 e 10.000, mais

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16/39 preferencialmente entre 10 e 1000 unidades de tecido neural carregada(s) em um dispositivo de implantação cirúrgica capaz de implantar a ou as unidades de tecido neural no sistema nervoso de um mamífero. Em um aspecto vantajoso, a quantidade de unidades de tecido neural implantadas é função do tamanho do cérebro hospedeiro e da aplicação.

[0048] As unidades de tecido neural podem ser eventualmente congeladas, antes de serem introduzidas no dispositivo de implantação cirúrgica, e/ou congeladas ao mesmo tempo que o dispositivo de implantação cirúrgica. É claro que é necessária uma etapa de descongelamento antes da implantação das unidades de tecido neural no sistema nervoso do indivíduo.

Método de preparação [0049] A invenção também tem por objeto um método de preparação das unidades de tecido neural capazes de serem implantadas no sistema nervoso de um mamífero. Mais particularmente, a invenção propõe realizar unidades de tecido neural contendo células neuronals pós-mitóticas cujo fenótipo ou fenótipos dependem do uso destinado para as ditas unidades. De acordo com a invenção, é possível realizar microcompartimentos celulares compreendendo uma cápsula de hidrogel que envolve as células neurais, especialmente a partir de células diferenciadas de mamíferos que são submetidas a uma reprogramação antes ou depois da encapsulação, e em seguida são diferenciadas em um ou mais tipos neurais no interior da cápsula de hidrogel. Depois disso, a cápsula é eliminada ao menos parcialmente para possibilitar que as células neurais se implantem no tecido hospedeiro após a enxertia.

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17/39 [0050] De maneira geral, o método de preparação dessa unidade de tecido neural, destinada a ser implantada no sistema nervoso de um mamífero humano ou não humano, de acordo com a invenção inclui as etapas de:

(1) produzir microcompartimentos celulares compreendendo, no interior de uma cápsula de hidrogel, uma matriz extracelular e células de mamífero humano ou não humano, capazes de se diferenciarem em células neurais, vantajosamente imunocompativeis com o mamífero destinado a receber a unidade de tecido neural;

(2) induzir a diferenciação celular no interior do microcompartimento celular, de maneira a obter células neuronals pós-mitóticas que apresentam pelo menos um fenótipo de interesse;

(3) eliminar pelo menos parcialmente a cápsula de hidrogel para recuperar as células neurais sob a forma de unidade de tecido neural.

[0051] Qualquer metodologia de produção de microcompartimentos celulares que contenham no interior de uma cápsula de hidrogel a matriz extracelular e células suscetíveis de originar células neurais pode ser utilizada. Sobretudo, os microcompartimentos podem ser produzidos com o dispositivo microfluidico descrito em Alessandri et al., 2016 (A 3D printed microfluidic device for production of functionalized hidrogel microcapsule for culture and differentiation of human Neuronal Stem Cells (hNSC), Lab on a Chip, 2016, vol. 16, n° 9, p. 1593-1604).

[0052] Em uma modalidade de realização particular, as células encapsuladas são células-tronco pluripotentes, tais como células-tronco pluripotentes induzidas (IPS), ou

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18/39 células-tronco embrionárias (ES). No contexto da invenção, as células-tronco pluripotentes induzidas (CSPI ou IPS), são células-tronco pluripotentes obtidas por reprogramação genética de células somáticas diferenciadas, e com uma morfologia e um potencial de autorrenovação e pluripotência que em parte se assemelham às das células-tronco embrionárias. Essas células são notadamente positivas para os marcadores de pluripotência, como a coloração com fosfatase alcalina e a expressão das proteínas NANOG, SOX2, OCT4 e SSEA3/4. Os métodos que permitem a obtenção de células-tronco pluripotentes induzidas são perfeitamente conhecidos pelo indivíduo versado na técnica e são descritas principalmente nos artigos de Yu et al (Science,

2007, 318 (5858): 1917-1920), Takahashi et al (Cell, 2007, 131(5): 861-872) e Nakagawa et al (Nat Biotechnol, 2008, 26(1): 101-106). No caso das células-tronco embrionárias, as ditas células-tronco pluripotentes são entendidas como células derivadas da massa celular interna do blastócito e que têm a capacidade de conduzir à formação de todos os tecidos do organismo. A pluripotência das células-tronco embrionárias pode ser avaliada pela presença de marcadores como os fatores de transcrição OCT4 e NANOG e os marcadores de superfície como SSEA3/4, Tra-1-60 e Tra-1-81. As células-tronco embrionárias podem ser obtidas sem a destruição do embrião das quais se originam, por exemplo, usando a técnica descrita por Chung et al. (Cell Stem Cell,

2008, 2(2): 113-117). Em uma modalidade de realização particular, e por razões legais ou éticas, as célulastronco são entendidas como células-tronco embrionárias não humanas.

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19/39 [0053] De maneira alternativa, é possivel encapsular as células progenitoras neurais, ou seja, células-tronco já destacadas para a diferenciação celular em células neurais. Em outra modalidade de realização, é possivel encapsular as células diferenciadas, que serão forçadas a se diferenciarem em células neurais por transdiferenciação. Em adição, é possivel encapsular células capazes de formar células gliais, como as células somáticas.

[0054] Em outra modalidade de realização, é possivel utilizar células diferenciadas, que serão reprogramadas em células-tronco pluripotentes antes ou depois da encapsulação. Se as unidades de tecido neural tiverem que permanecer implantadas por longo tempo no sistema nervoso de um paciente, é preferível partir de células imunocompativeis com o dito indivíduo, para evitar qualquer risco de rejeição. Em uma modalidade de execução particular, as células utilizadas para preparar as unidades de tecido neural foram extraídas previamente do mamífero humano ou não humano em que a ou as ditas unidades de tecido neural devem ser implantadas.

[0055] Em qualquer que seja o caso, uma vez obtidos os microcompartimentos celulares, as células nele contidas devem ser submetidas a uma diferenciação celular, para que elas se diferenciem principalmente em células neuronals compatíveis com o um ou mais fenótipos desejados.

[0056] Qualquer metodologia conduzida classicamente em cultura 2D (placa de Petri e outras) para forçar a diferenciação celular pode ser utilizada, como a metodologia descrita em Chambers et ai. (Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual

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20/39 inhibition of SMAD signaling, Nature Biotechnology 27, 275 280 (2009)), ou em Lippmann et al., (Defined human pluripotent stem cell culture enables highly efficient neuroepithelium derivation without small molecule inhibitors, Stem Cells 2014) . Em uma modalidade de execução particular, o meio de diferenciação contém 24 (S),25-Epoxicolesterol, visando estimular a diferenciação dopaminérgica.

[0057] De preferência, os microcompartimentos celulares são cultivados no minimo durante três semanas em meio de diferenciação e antes de qualquer eliminação da cápsula de hidrogel.

[0058] De maneira geral, os microcompartimentos celulares pluripotentes podem ser congelados antes do uso, qualquer que seja ele, e descongelados conforme a necessidade.

[0059] Em um exemplo de realização, é possível induzir uma diferenciação celular para forçar as células, no interior do microcompartimento celular, a se diferenciarem em células dopaminérgicas (Generating regionalized neuronal cells from pluripotency, a step- by-step protocol Kirkeby et al. Frontiers in Cellular Neuroscience 2012) . As unidades de tecido neural provenientes de tais microcompartimentos celulares podem ser então implantadas no sistema nervoso de um indivíduo portador do mal de Parkinson, para substituir pelo menos parcialmente os neurônios dopaminérgicos faltantes do dito indivíduo.

[0060] Em outro exemplo de realização, é possível induzir uma diferenciação celular que force as células, no interior do microcompartimento celular, a se diferenciarem

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21/39 em células GABAérgicas (Derivation of striatal neurons from human stem cells Viegas et al. Prog Brain Res 2012). As unidades de tecido neural oriundas desses microcompartimentos celulares podem em seguida ser implantadas no sistema nervoso de um indivíduo acometido por coréia de Huntington, para substituir pelo menos parcialmente os neurônios GABAérgicos faltantes do dito indivíduo.

[0061] O método de preparação de unidades de tecido neural de acordo com a invenção também pode compreender a etapa suplementar de:

- carregar um dispositivo de implantação cirúrgica com pelo menos uma unidade de tecido neural, preferencialmente entre 10 a 1000, mais preferencialmente entre 10 e 100 unidades de tecido neural.

[0062] Com isso, o dispositivo de implantação está pronto para ser utilizado para enxertar as células neurais no sistema nervoso de um indivíduo.

[0063] De acordo com a invenção, as células neurais sob a forma de unidades de tecido neural podem ser congeladas, antes ou depois da eliminação ao menos parcial da cápsula de hidrogel. Deve ficar claro que as unidades de tecido neural podem ser utilizadas diretamente ao término do método de preparação, sem a necessidade do congelamento prévio.

[0064] Como aspecto vantajoso, o método de preparação de acordo com a invenção inclui uma etapa intermediária de:

- verificar o fenótipo das células neurais contidas na cápsula de hidrogel, depois da etapa de diferenciação celular.

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22/39 [0065] Por exemplo, no caso de unidade (s) de tecido neural que compreendam neurônios dopaminérgicos, é possivel medir a atividade das unidades neurais implantáveis antes da enxertia de maneira não invasiva coletando o sobrenadante do meio de cultura, e conduzindo uma análise por microdiálise acoplada a uma HPLC.

[0066] De maneira mais geral, pode ser vantajoso caracterizar a atividade elétrica de neurônios representativos da amostra através da técnica denominada Patch-Clamp, que se baseia no registro das correntes iônicas que transitam através das membranas celulares.

[0067] Com as unidades de tecido neural sendo vantajosamente cultivadas em lotes, em condições idênticas, também é possivel efetuar análises mais potentes, notadamente por imunocitoquimica, sequenciamento de ARN, e/ou proteômico, em uma amostra representativa da população das unidades do tecido neural considerado, a fim de garantir a qualidade exata da diferenciação. Por exemplo, no caso de unidades de tecido neural que compreendam neurônios dopaminérgicos, é possivel realizar uma análise por imunocitoquimica mirando a Tiroxina Hidroxilase, FOXA2 e/ou NURR1 (Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease Kriks et al 2012) .

[0068] Dessa forma, podemos nos certificar de que os neurônios pós-mitóticos e/ou as células neurais apresentam o ou os fenótipos desejados antes da etapa de implantação no sistema nervoso do indivíduo.

Enxertia de unidade(s) de tecido neural no sistema nervoso de um mamífero humano ou não humano

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23/39 [0069] A invenção propõe ainda um método de implantação, ou de enxertia, de unidade(s) de tecido neural no sistema nervoso de um indivíduo necessitado, sobretudo de um indivíduo humano. Com efeito, as unidades de tecido neural de acordo com a invenção podem ser utilizadas beneficamente no tratamento de doenças neurodegenerativas. No escopo da invenção, o termo tratamento designa um tratamento curativo, sintomático ou preventivo. Conforme aqui utilizado, o termo tratamento de uma doença se refere a qualquer ato concebido para prolongar a qualidade e/ou o tempo de vida dos pacientes. O tratamento pode ser concebido para erradicar a doença, cessar ou retardar a progressão da doença e/ou para favorecer a regressão da doença. O termo tratamento de uma doença também designa qualquer ato concebido para diminuir os sintomas associados à doença. 0 paciente a ser tratado é qualquer mamífero, de preferência um ser humano.

[0070]	De	maneira	geral,	qualquer	metodologia	de
enxertia	de	células	neurais	pode ser	utilizada	para
implantar	as	unidades	de tecido	neural no	sistema nervoso

do indivíduo. Em especial, é possível utilizar uma cânula, como uma cânula de vidro, que foi previamente carregada com as unidades de tecido neural.

[0071] Em uma modalidade de execução particular, a implantação inclui as etapas de:

Adormecer e/ou imobilizar o indivíduo que receberá a ou as unidades de tecido neural;

Abrir o crânio do indivíduo;

Posicionar o dispositivo de implantação contendo as unidades de tecido neural acima da zona de enxertia,

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24/39 por exemplo, com a ajuda de um aparelho chamado estereotáxico;

Inserir o dispositivo de implantação na zona de enxertia;

Injetar as unidades de tecido neural e retirando progressivamente o dispositivo de implantação da zona de enxertia.

[0072] Como aspecto vantajoso, a etapa de injeção é controlada por um sistema de bomba microfluidica e de motorização que permite controlar a profundidade de inserção do dispositivo de implantação no sistema nervoso do indivíduo, para providenciar o espaço necessário para as unidades de tecido neural no dito sistema nervoso, que são então depositadas na trajetória de recolhimento do dispositivo de implantação.

[0073] Em uma modalidade de execução particular, o dispositivo de implantação consiste em uma cânula de vidro com um diâmetro interno compreendido entre 0,3 e 2 mm, preferencialmente 0,4 mm, e um diâmetro externo compreendido entre 0,4 e 3 mm, preferencialmente 0,55 mm. Como aspecto positivo, a cânula possui uma parte arredondada ou chanfrada na sua extremidade e a sua superfície é silanizada com um composto fluorado, para reduzir os riscos de danos aos tecidos durante a inserção da cânula e os riscos de entupimentos por coágulos sanguíneos. As unidades de tecido neural são carregadas, por exemplo, pela parte anterior, na cânula. A cânula é inserida em posição no crânio do indivíduo.

[0074] Em um aspecto vantajoso, durante uma mesma enxertia, entre 10 e 40 unidades de tecido neural são

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25/39 implantadas, cada unidade de tecido neural compreendendo preferencialmente entre 1.000 e 10.000 células neurais. Deve ficar entendido que o número de unidades de tecido neural que serão implantadas é adaptado com base no indivíduo e na doença a ser tratada e/ou na função de cognição ou de ação a ser modificada. Diversas enxertias, a intervalos de tempo maiores ou menores, também podem ser consideradas. Além disso, enxertias simultâneas ou em curto espaço de tempo podem ser realizadas em diferentes áreas do sistema nervoso do indivíduo.

EXEMPLOS

1. Fabricação de unidades de tecido neural implantáveis para o tratamento do mal de Parkinson:

[0075] Os progenitores são obtidos conforme a metodologia publicada por Kriks et al. (Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease Kriks et al 2012), utilizando o 24 (S),25-Epoxicolesterol (concentração de 1 a 10μΜ) em culturas oriundas de células-tronco induzidas pluripotentes humanas, para otimizar a diferenciação em neurônios dopaminérgicos.

[0076] Os progenitores obtidos são encapsulados obedecendo à metodologia publicada por Alessandri et al., 2016 (A 3D printed microfluidic device for production of functionalized hidrogel microcapsule for culture and differentiation of human Neuronal Stem Cells (hNSC), Lab on a Chip, 2016).

[0077] Uma vez que os microcompartimentos celulares contenham os progenitores obtidos, é efetuada uma diferenciação dita terminal em neurônios dopaminérgicos

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26/39 obedecendo à metodologia publicada por Kriks et al. (Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease Kriks et al 2012), utilizando novamente ο 24 (S),25-Epoxicolesterol (concentração de 1 a ΙΟμΜ).

[0078] Uma atenção particular é dada à troca dos meios de cultura, porque a proliferação de células nos microcompartimentos celulares aumenta a velocidade em que o meio é consumido pelas unidades neurais implantável no curso da sua preparação.

[0079] A diferenciação como um todo ocorre nos microcompartimentos celulares, mas é possível desencapsular e reencapsular as células, desde que as células tolerem a dissociação em suspensão de células únicas (até no máximo uma semana após a adição do inibidor da gama secretase e/ou do sinal Notch como o DAPT, o CoumpoundE ou outras moléculas gue fomentem a diferenciação terminal).

[0080] Os microcompartimentos celulares assim obtidos depois de três semanas de diferenciação são tratados com lavagens sucessivas em uma solução de PBS para dissolver o invólucro de hidrogel e recuperar as unidades de tecido neural antes da injeção.

Fabricação da cânula de injeção:

[0081] Uma seção de capilar de borossilicato (diâmetro interno: 0,4mm, diâmetro externo 0,55mm) de 5cm é seccionada com uma lâmina de cerâmica.

[0082] A face anterior do capilar é arredondada com uma lixa de óxido de alumínio para fibra óptica 12pm e depois Ipm.

[0083] 0 vidro é ativado aplicando um tratamento de

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27/39 plasma por 5 minutos, e em seguida é silanizado em fase gasosa através do depósito de 20 μΐ de 1H,1H,2H,2HPerfluoro-octiltriclorossilano perto da ponta posicionada em uma placa de Petri de vidro hermeticamente fechada.

[0084] Depois de 30 minutos de reação, a cânula de injeção está pronta e é instalada em um dispositivo convencional de estereotaxia conectado a uma seringa 10μ1

(hamilton]	l , motorizada	graças a	um	propulsor de	seringa
(harvard	apparatus).	0 braço	de	injeção do	aparelho
estereotáxico também é	motorizado	(ΡΓ	) .
Cirurgia:
[0085]	Um rato é	então submetido a uma	cirurgia

convencional para a enxertia de neurônios. Essa metodologia cirúrgica inclui as etapas de:

1) Induzir o sono medicamentoso (cetamina) e a anestesia do animal

2) Posicionar precisamente o animal usando uma aparelhagem estereotáxica.

3) Raspar o crânio do animal, em seguida o animal é tratado com betadina, depois aberto com um bisturi para afastar a pele do crânio, em seguida uma microperfuradora é utilizada para formar uma fenestração nos ossos do crânio que permite a passagem da cânula. As meninges são afastadas cuidadosamente sem danificar o córtex que aflora exatamente abaixo.

4) Posicionar a cânula conectada a uma seringa com a ajuda de um aparelho estereotáxico acima da zona de enxertia.

5) Carregar a cânula com as unidades de tecido neural pela parte frontal (cerca de 80 cápsulas, 10.000 a

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800.000 células). A enxertia representa 4μ1 no total, ou seja, 4cm de altura da cânula. Dois sítios são injetados unilateralmente do rato, no corpo estriado a cerca de Imm de distância.

6) Inserir a cânula em posição no crânio do animal no primeiro sitio no interior do corpo estriado ventral. Durante a injeção de 2μ1, a cânula é retirada simultaneamente à injeção graças a um sistema de bomba microfluidica e de controle motorizado da profundidade

	da cânula para	liberar o espaço	necessário para	o
	enxerto, que é	então depositado	na trajetória	de
	recolhimento em <	cerca de 2mm.
7)	Manter a cânula	em posição por	um minuto antes	de

retirá-la delicadamente.

8) Em seguida realizar a implantação no segundo sitio, obedecendo ao mesmo procedimento.

9) Suturar a pele do rato (três a cinco pontos) depois de lavar a ferida com betadina.

Resultados da enxertia:

[0086] Como a demonstração consiste na sobrevida ao processo de enxertia dos neurônios matures humanos, o animal é sacrificado depois de uma semana da cirurgia para estudar a sobrevida e a implantação da enxertia por imunocitoquimica em um segmento do cérebro seccionado no vibrátomo na trajetória da enxertia.

[0087] A sobrevida estimada a partir do tamanho dos enxertos (conhecido antes da enxertia) é superior a 84% ± 33%, em comparação à taxa de sobrevida de 2% obtida com as metodologias de enxertia de neurônios maduros dopaminérgicos em suspensão (D. M. Marchionini et al.,

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Interference with anoikis-induced cell death of dopamine neurons: implications for augmenting embryonic graft survival in a rat model of Parkinson's disease. J Comp Neurol 464, 172-179 (2003) .) . O fenótipo dos neurônios é conservado (Tiroxina Hidroxilase positiva). Além disso, processos axonais de diversos milímetros são observados, indicando que os neurônios começaram imediatamente a se integrar ao cérebro do rato.

2. Enxertia de unidades de tecido neural compreendendo células neuronais para o tratamento de Parkinson

2.1 - Protocolo cirúrgico [0088] Ratos (com 7/8 semanas de idade) são alojados em um recinto com temperatura controlada sob um ciclo de luz/escuridão de 12 horas com um acesso ad libitum a água e alimentos.

[0089] A Figura 1 sintetiza as diferentes intervenções praticadas nesses ratos a fim de obter ratos parkinsonianos, os quais em seguida serão submetidos às enxertias de tecido neural de acordo com a invenção. Preparação dos ratos parkinsonianos [0090] Os animais são mantidos em jejum antes da cirurgia. Alimentos, inclusive suplementos alimentares, e água são suspensos.

[0091] Cada animal é colocado em uma câmara de anestesia alimentada com fluxo de ar constante (0,3L / min) + oxigênio (0,3L / min) e 2% de isoflurano. Xilocaina (7 mg / kg, s.c.), borgal (7,5%, i.m.) e buprenorfina (0,1 mg / kg, s.c.) são injetados. O animal é mantido sob anestesia com um anestésico à base de isoflurano administrado por um respirador com regulagem de volume. A temperatura central é

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30/39 registrada por via retal durante a cirurgia. Almofadas aquecidas são utilizadas para manter a temperatura do corpo, se necessário. Uma pomada oftálmica (gel oftálmico lipósico) é administrada aos olhos. Os pelos são cortados do crânio ao pescoço. Depois de perder a consciência, o animal é colocado em um ambiente estereotáxico (Kopf) e a cabeça é firmada em posição por barras de orelha.

[0092] Com uma seringa Hamilton 1702N (Ga22s / 51mm / PST3) acoplada a um injetor automático Legato 101 (KD scientific), os ratos são colocados em estado pseudoparkinsoniano por meio de uma injeção estereotáxica unilateral de 2,5μ1 de 6-hidroxidopamina (6-OHDA) (Sigma, 5mg / ml em NaCl estéril, 0,9%) com 0,1% de ácido ascórbico em MLB (Medial Forebrain Bundle) nas coordenadas -2,8 mm anteroposterior, 2 mm lateral e 8,4 mm dorsoventral segundo o atlas cerebral de Paxinos e Watson a uma vazão de Ιμΐ/min (Figura 2A).

[0093] Depois da injeção, a agulha é deixada no local por 5 minutos antes de ser retirada lentamente do cérebro. Trinta minutos antes da cirurgia, os animais recebem uma injeção i.p. (intraperitoneal) de desipramina (25 mg / kg, 5 ml/kg) dissolvida em NaCl a 0,9%, para proteger o sistema noradrenérgico.

[0094] Depois de concluída a injeção, a pele é fechada com uma sutura. O animal pode então se recuperar da anestesia.

Enxertias [0095] A preservação do microambiente dos neurônios maduros ao longo de todo o procedimento de enxertia possibilita a sobrevida e a conexão com o cérebro

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31/39 hospedeiro .

[0096] Um grupo de ratos (6-OHDA progenitores encapsulados) recebe uma enxertia de unidades de tecido neural de acordo com a invenção compreendendo células progenitoras de neurônios comerciais (Cellular dynamics icell dopaneurons) encapsuladas e amadurecidas por duas semanas in vitro antes do uso.

[0097] Um segundo grupo de ratos (6-OHDA CNOs) recebe uma enxertia de unidades de tecido neural de acordo com a invenção compreendendo CNO (Controlled Neural Organoid) produzidos e avaliados no laboratório.

[0098] As unidades de tecido neural contendo as células CNOs foram obtidas encapsulando em alginato células pluripotentes ou células pluripotentes ingênuas e diferenciando essas células em células progenitoras de neurônios obedecendo ao protocolo abaixo:

[0099] Toda a cultura é realizada a 37°C, sob CO₂ a 5%, e saturação de umidade acima de 95% [0100] D0-D3 (dia 0 ao dia 3) : N2B27 (para 500mL de meio: 250mL de meio Neurobasal + 250mL de meio Dmem F12 com glutamaxf 1 complemento N2 + 1 complemento B27 + 0,5microM LDN-193189 + 10 microM SB431542 + 100ng/mL Shh (Sonic Hedgehog)+ lOOng/mL FGF-8 (Fator de crescimento de fibroblastos 8) + 2microM purmorfaminaf 10 microM 24(3),25Epoxicolesterol [0101] D3-D9: N2B27 + LDN + SB + Shh + FGF-8 + purmorfamina + CHIR + 24 (S),25-Epoxicolesterol [0102] D9-D10: N2B27 + LDN + CHIR + 24(S),25Epoxicolesterol [0103] D10-D15 ou mais: N2B27 + AMPc + AA + GDNF + BDNF

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32/39 + FGF-20 + TGFbeta + tricostatina + CpE + 24(3),25Epoxicolesterol

Tabela 1: Lista de abreviações e acrônimos

Abreviação / acrônimo	Descrição
AA	Ácido ascórbico
AMPc	Monofosfato ciclico de adenosina- transdução de sinal intracelular
BDNF	Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro
CHIR	Inibidor GSK3
DMEM	Meio de Eagle Modificado da Dulbecco
DMSO	Sulfóxido de dimetila
ECM	Matriz extracelular
FGF-20	Fator de crescimento de fibroblastos 20
FGF-8	Fator de crescimento de fibroblastos 8
GDNF	Fator neurotrófico derivado de células gliais
hESC	Células-Tronco Embrionárias Humanas
HS415	Linhagem celular ES humana
LDN193189	Inibidor Smadl/8/5/8
NE AA	Aminoácidos não essenciais
PBS	Tampão de fosfato salino

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Abreviação / acrônimo	Descrição
PS	Penicilina / Estreptomicina
RT	Temperatura Ambiente
SB431542	Anti-TGF beta
Shh	Sonic hedgehog
TGFbeta3	Fator de transformação do crescimento do tipo 3

Tabela 2: Concentrações finais

Moléculas pequenas ou fatores de	Concentrações final nas
crescimento	células
AMPc	0,5 mM
Ácido ascórbico AA	200 μΜ
BDNF	10 ng/ml
Chir99021	3 μΜ
Compounds	1 μΜ
FGF-20	5 ng/ml
FGF-8	100 ng/ml
GDNF	10 ng/ml
LDN -193189	0,5 μΜ
purmorfamina	2 μΜ
Inibidor de rock	10 μΜ
SB431542	10 μΜ
Shh	100 ng/ml

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Moléculas pequenas ou fatores de	Concentrações final nas
crescimento	||||||||||||ÍÍeÍiÍÍÍIIIIIIIII|]^
TGFbeta3	1 ng/ml
Tricostatina A	10 μΜ
24(S),25-Epoxicolesterol	10 ng/ml

[0104] Antes da injeção das unidades de tecido neural (6-OHDA progenitores encapsulados e 6-OHDA CNOs), as cápsulas de alginato dos microcompartimentos celulares são dissolvidas apenas trocando o meio com PBS.

[0105] As configurações de injeção são uma seringa ou cânula instalada em um equipamento estereotáxico. A carga das unidades de tecido neural na cânula de injeção é feita por aspiração do volume injetado (25 CNO ~ IgL) no corpo da cânula.

[0106] Para injetar os 4 sitios de injeção em 2 trajetórias (Figura 2B) : 4 μΐ com progenitores (grupo 3), progenitores encapsulados (6-OHDA progenitor) ou CNOs (6OHDA CNOs) são injetados no corpo esfriado nas seguintes coordenadas: A / P +1,2; M / L -2,6; D / V-5,0 (3 ui) e 4,0 (3 ui); e A / P +0,5; M / L -3,0; D / V-5,0 (3 ui) e 4,0 (3 ui); barra de garras -2,4 (Grealish et al., 2014). Procedimento pós-operatório [0107] Quatro grupos de ratos são formados a partir dos ratos imunodeprimidos (RNU ou ratos nus):

Placebo: ratos não lesionados

6-OHDA: ratos cujos neurônios dopaminérgicos do hemisfério direito foram mortos quimicamente, sem enxertia (experiência de controle)

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CNO ou 6-OHDA CNO: ratos cujos neurônios dopaminérgicos do hemisfério direito foram mortos quimicamente, e enxertados no corpo esfriado direito com unidades de tecido neural de acordo com a invenção compreendendo cerca de 250.000 células.

Pro encaps ou 6-OHDA progenitores encapsulados: ratos cujos neurônios dopaminérgicos do hemisfério direito foram mortos quimicamente, e enxertados no corpo esfriado direito com unidades de tecido neural de acordo com a invenção compreendendo cerca de 250 000 células de iDopaneurons da Cellular Dynamics amadurecidos durante 2 semanas em cápsulas.

[0108] Cada animal é observado atentamente e mantido aquecido até recuperar os reflexos de orientação e deglutição. Os animais são deixados aos cuidados de técnicos experientes com fácil acesso a um suporte veterinário especializado.

[0109] Outros medicamentos para o manejo clinico do animal são utilizados em caso de necessidade. Cada medicamento, dose, via e sitio de administração é anotado nos prontuários cirúrgicos.

[0110] As incisões cirúrgicas são monitoradas para detectar sinais de infecção, inflamação e de integridade geral no minimo uma vez por dia (até que as incisões cicatrizem). Todos os resultados e as observações efetuadas são documentados nos prontuários cirúrgicos. O coordenador do estudo é informado de qualquer anomalia. O monitor do estudo é informado, desde que razoavelmente possível, de qualquer anomalia.

[0111] Controles sobre o estado dos animais são

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36/39 efetuados duas vezes ao dia (de IlhOO às 22h00).

[0112] Os animais são avaliados segundo os critérios de um tratamento justo e humano. Um suporte veterinário apropriado é fornecido se necessário. Todo animal que apresente sinal de dor ou aflição grave, passível de perdurar, é sacrificado rapidamente por eutanásia. Em seguida são submetidos a uma necropsia superficial. Além da necropsia, o cérebro é retirado para análise histológica e tratado conforme indicado na seção Eutanásia. Todos os esforços razoáveis são envidados para aplicar os critérios de um tratamento justo e humano e para evitar que qualquer animal seja encontrado morto.

2.2 - Estudos comportamentais

Rotação induzida por anfetamina (protocolo adaptado de Grealish et al., 2014) .

[0113] Somente os animais que tivessem mais de 5 voltas por minuto após a injeção de 6-hidroxidopamina (6-OHDA) no nivel do feixe telencefálico mediai foram considerados como tendo sido submetidos a uma lesão bem-sucedida. A tendência da rotação, após uma injeção sistêmica de anfetamina (2,5 mg/kg, por via intraperitoneal, Apoteksbolaget) , foi registrada com o uso de um sistema automatizado (Omnitech Electronics). A rotação dos animais foi registrada durante 90 minutos, apenas as voltas completas do corpo foram computadas e em seguida expressas em voltas liquidas por minuto, as rotações no sentido da lesão (sentido horário) são computadas positivamente.

Prova de marcha [0114] Cada rato é colocado sobre uma superfície plana; suas patas traseiras são erguidas segurando suavemente a

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37/39 cauda para permitir que apenas uma pata dianteira toque a mesa. 0 experimentador puxa o rato para trás por um metro com um ritmo regular. Os movimentos de ajustes das patas dianteiras controlaterais e ipsilaterais são computados independentemente nos seus respectivos trajetos. Os dados serão apresentados em percentual do movimento de ajuste utilizando as patas através do cálculo da relação controlaterais / (controlaterais + ipsilaterais).

Teste do cilindro [0115] 0 teste do cilindro é executado posicionando cada animal em um cilindro de vidro e computando por 5 minutos o número de toques das patas ipsilaterais e controlaterais na parede do cilindro, o resultado é expresso através do cálculo da relação controlaterais / (controlaterais + ipsilaterais), em um máximo de 20 toques.

O actímetro de campo aberto [0116] A atividade locomotora espontânea é medida com um actimetro fotoelétrico (Actitrack, Panlab, S.L., Barcelona, Espanha). O aparelho consiste em uma gaiola transparente ligada a uma célula fotoelétrica. Os feixes luminosos detectam os movimentos, e o número total de detecção do movimento horizontal de cada rato é registrado diariamente em duas sessões sucessivas de 10 minutos. Todos os testes no actimetro são conduzidos em uma peça isolada entre 8 horas e 13 horas. A primeira fase de três dias admite uma tolerância. O quarto dia é considerado como o dia do teste. O primeiro turno de 10 minutos é considerado como a habituação cotidiana. Apenas a atividade locomotora registrada durante a segunda sessão de 10 minutos é aplicada para a análise dos dados.

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2.3 - Avaliações do estudo post-mortem - análise histológica [0117] Ao término das experiências, os ratos são sacrificados por perfusão intracardiaca com paraformaldeido a 4%, os cérebros são coletados, congelados em isopentane a 45°C e conservados a -80°C. Os cérebros perfundidos são seccionados em criostato em seções coronals de 50 pm. Validação da lesão dopaminérgica (DA) [0118] A perda das células DA no sistema nervoso central e a perda das fibras DA no corpo esfriado são verificadas por imunohistoquimica da tiroxina hidroxilase (TH) conforme descrito anteriormente (Bouali-Benazzouz et al., 2009). O número de células imunoreativas à tiroxina hidroxilase (TH) é obtido com a metodologia de fracionamento óptico utilizando um microscópio Leica DM6000B e o software Mercator Pro (ExploraNova, versão 7.9.8).

Validação da enxertia [0119] Os cortes de cérebros de rato e os ONO são submetidos a análises imunohistoquimicas utilizando anticorpos para analisar a sobrevida celular, a proliferação possivel e a maturação fenotipica dos enxertos (identificados com o auxilio do HCM-Human Cytoplasmic Marker) e caracterizados por marcadores DA clássicos (TH, DAT, FOXA2), os marcadores pan-neuronais (MAP2, NeuN), serotoninérgicos (FOXG1), os marcadores proliferativos Ki67/PCNA e um marcador glial (GFAP especifico do homem).

Teste de sobrevida neuronal [0120] Seis ratos CNOs foram sacrificados 6 dias após a enxertia, para avaliar a sobrevida neuronal pós-enxertia.

RESULTADOS

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Resultados dos estudos comportamentais [0121] Os estudos comportamentais demonstram um efeito bastante positivo das enxertias de acordo com a invenção nos ratos enxertados (6Pro-encaps e CNOs) já que uma correção comportamental é obtida em 4 a 6 semanas para a prova de marcha Figura 4B) e o teste do cilindro (Figura 4A) , e em 2 semanas para o teste do rotômetro (Figura 40), ao passo que alguns efeitos demonstrados na literatura com enxertias de progenitores mostram uma melhora comportamental depois de 20 semanas aproximadamente (Kriks et al. 2011, Grealish et al. 2014, Kirkeby et al. 2017, Doi et al. 2014).

[0122] Como esperado, as enxertias de acordo com a invenção, em contrapartida, não surtiram efeito sobre os resultados de ansiedade (Figura 4D).

Resultados histológicos [0123] A análise histológica das enxertias efetuadas nos dois grupos CNO e Pro-encaps mostra a presença de 10 a 15% de neurônios TH mas enxertias. Para fins comparativos, os estudos publicados anteriormente descrevem taxas de neurônios TH depois da enxertia de progenitores de 5% (Kirkeby et al. 2017) ou 6% (Kriks et al. 2011) .

[0124] A análise da sobrevida neuronal mostra que, 6 dias após a enxertia, projeções axonais plurimilimétricas são observadas em cérebro de ratos CNOs (Figura 3) , o que confirma a sobrevida significante dos neurônios após uma enxertia de acordo com a invenção.

Claims (20)

REIVINDICAÇÕES
1. (1) produzir microcompartimentos celulares que compreendem no interior de uma cápsula de hidrogel uma matriz extracelular e células de mamífero humano ou não humano, capazes de se diferenciarem em células neurais, vantajosamente imunocompatíveis com o mamífero destinado a receber a unidade de tecido neural;

   1. Unidade de tecido neural para seu uso para uma implantação no sistema nervoso de um mamífero humano ou não humano, em que a dita unidade de tecido neural é caracterizada por conter células neuronals pós-mitóticas diferenciadas, dentro de uma matriz extracelular, a dita unidade sendo obtida a partir de um microcompartimento celular que contém uma cápsula de hidrogel que envolve uma única unidade de tecido neural, e a dita cápsula de hidrogel sendo eliminada ao menos parcialmente antes do uso da dita unidade de tecido neural.
2. (2) induzir a diferenciação celular no interior do microcompartimento celular, de maneira a obter células neuronals pós-mitóticas que apresentam pelo menos um fenótipo de interesse;

   2/5 de células neuronals pós-mitóticas do(s) fenótipo (s) de interesse, preferencialmente entre 50 e 100%, mais preferencialmente mais de 90%.

   2. Unidade de tecido neural para seu uso, de acordo com a reivindicação 1, em que a dita unidade de tecido neural é caracterizada por ser desprovida de hidrogel.
3. (3) eliminar pelo menos parcialmente a cápsula de hidrogel para recuperar as células neuronals sob a forma de unidade de tecido neural.

   3/5

   3. Unidade de tecido neural para seu uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada por as células neurais formarem um aglomerado de células neurais, que apresenta de maneira preferencial uma dimensão menor compreendida entre 50 pm e 500 pm mais ou menos 10%, preferencialmente entre 150 pm e 400 pm mais ou menos 10%, ainda mais preferencialmente entre 200 pm e 300 pm mais ou menos 10%.
4. 4/5

   - congelar as células neurais sob a forma de unidade de tecido, antes ou depois da eliminação ao menos parcial da cápsula de hidrogel.

   (4) carregar um dispositivo de implantação cirúrgica com pelo menos uma unidade de tecido neural, preferencialmente pelo menos 10 a 1000 unidades de tecido neural, mais preferencialmente entre 10 e 100 unidades.

   4. Unidade de tecido neural para seu uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a dita unidade de células neurais é caracterizada por compreender células neuronals e células gliais.
5. 5/5 no sistema nervoso de um mamífero.

   5. Unidade de tecido neural para seu uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a dita unidade caracterizada por compreender entre 10 e 100%

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6. 6. Unidade de tecido neural para seu uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a dita unidade é caracterizada por compreender de 100 a 100.000 células neurais.
7. 7. Unidade de tecido neural para seu uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por se destinar ao tratamento de uma doença neurodegenerativa, como o mal de Parkinson, a doença de Huntington, a esclerose lateral amiotrófica (ALS), o mal de Alzheimer ou as lipofuscinoses ceroides neuronals, como a doença de Batten.
8. 8. Unidade de tecido neural para seu uso, de acordo com a reivindicação 7, em que a dita unidade de tecido neural é caracterizada por compreender neurônios dopaminérgicos, para o tratamento do mal de Parkinson.
9. 9. Unidade de tecido neural para seu uso, de acordo com a reivindicação 7, em que a dita unidade de tecido neural é caracterizada por compreender neurônios GABAérgicos, para o tratamento da doença de Huntington.
10. 10. Unidade de tecido neural para seu uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em a dita unidade de tecido neural é caracterizada por compreender células neurais geneticamente modificadas.
11. 11. Unidade de tecido neural para seu uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por servir para auxiliar, melhorar ou reparar uma função de cognição e/ou ação.

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12. 12. Método de preparação de uma unidade de tecido neural em conformidade com qualquer uma das reivindicações 1 a 11 destinada a ser implantada no sistema nervoso de um indivíduo, sendo que o dito método é caracterizado por compreender as etapas de:
13. 13. Método de preparação de unidades de tecido neural, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por compreender a etapa suplementar de:
14. 14, caracterizado por as células utilizadas na etapa (1) terem sido previamente extraídas de um mamífero humano ou não humano no qual a unidade de tecido neural deve ser implantada.

    14. Método de preparação de uma unidade de tecido neural, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado por compreender a etapa suplementar de:

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15. 15, caracterizado por compreender a etapa intermediária de:

    - verificar o fenótipo das células neurais contidas na cápsula de hidrogel depois da etapa (2) de diferenciação celular.

    15. Método de preparação de uma unidade de tecido neural, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a
16. 16, caracterizado por as células serem diferenciadas em células dopaminérgicas ou em células GABAérgicas.

    16. Método de preparação de uma unidade de tecido neural, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a
17. 17. Método de preparação de uma unidade de tecido neural, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a
18. 18. Kit de implantação de unidades de tecido neural caracterizado por compreender pelo menos um microcompartimento celular que contém pelo menos uma cápsula de hidrogel envelopando uma unidade de tecido neural conforme qualquer uma das reivindicações 1 a 11, e meios para a eliminação ao menos parcial da cápsula de hidrogel.
19. 19. Kit de implantação de unidades de tecido neural, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por compreender adicionalmente um dispositivo de implantação cirúrgica capaz de implantar uma unidade de tecido neural

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20. 20. Kit de implantação de unidades de tecido neural caracterizado por compreender pelo menos uma unidade de tecido neural conforme qualquer uma das reivindicações 1 a 11, preferencialmente entre 1 e 10.000, mais preferencialmente entre 10 e 1.000 unidades de tecido neural em um dispositivo de implantação cirúrgica capaz de implantar a ou as unidades de tecido neural no sistema nervoso de um mamífero.