KR20190106997A - 신경 조직 유닛 및 포유동물의 신경계로의 이식을 위한 이러한 유닛의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인간 또는 비-인간 포유동물의 신경계로의 이식에 사용을 위한 신경 조직 유닛에 관한 것으로서, 상기 신경 조직 유닛은 세포외 매트릭스 내에 분화된 유사분열후 뉴런 세포를 함유하고, 상기 유닛은 신경 조직 유닛을 둘러싼 히드로겔 캡슐을 포함하는 세포 미소구획으로부터 수득되고, 상기 히드로겔 캡슐은 신경 조직 유닛의 사용 전에 적어도 부분적으로 제거된다. 본 발명은 또한 이러한 신경 조직 유닛을 제조하기 위한 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 세포외 매트릭스 내에 3차원 (3D) 네트워크로 조직화된, 다수의 유사분열후 뉴런 세포 및 임의로 신경아교세포를 포함하는 신경 조직 유닛, 및 포유동물의 신경계로 이식되는 유닛으로서 이의 용도에 관한 것이다. 이러한 신경 조직 유닛은 특히 신경퇴행성 질환을 치료하기 위해서, 대상체의 신경계로 관심 표현형을 갖는 뉴런 세포를 이식시키는데 사용될 수 있다.
지난 수십년 동안 신경퇴행성 질환은 관여되는 생물학적 현상의 이해 관점 및 치료 관점에서 주요한 사회적 난제였다. 실제로, 환자 및 환자의 가족과 동료들에게 극적인 결과로서, 점점 더 많은 사람들에게 이들 질환이 발병되고 있다.
일반 용어 "신경퇴행성 질환"은 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅톤병, 근위축성 측색 경화증 등을 포함하여, 주로 정상 노화보다 더 빠른 뉴런 사멸을 특징으로 하는, 매우 많은 질환을 포괄한다. 신경계는 운동, 균형, 행동 및/또는 인지 장애를 포함하는 광범위 증상을 초래하는, 다양한 방식으로 영향을 미칠 수 있다.
현재, 신경퇴행성 질환의 원인 및 기전은 대개 불충분하게 이해되고 있어서, 모든 그들의 치료를 더 복잡하게 만든다. 현재 이들 질환을 치료하기 위한 확실한 치료가 존재하지 않는다.
최근 수년간, 개발 우선순위는 대뇌내 세포 요법, 보다 특히 신경퇴행성 질환을 앓는 사람의 뇌의 손상된 영역으로 뉴런의 그라프팅에 집중되었었다. 이들 이식의 목표는 질환으로 파괴된 뉴런을 영구적으로 대체하는 것이다. 따라서, 배아 세포 또는 조직의 국부 이식이 파킨슨병을 갖는 몇몇 환자에서 성공적으로 수행되었다. 그러나, 이러한 접근법은 유산된 태아로부터 유래된 조직의 사용을 포함하므로, 윤리적이고 논리적인 문제를 제기한다. 또한, 많은 실험실에서 양질 인간 세포의 가능한 대안 공급원으로서 인간 유도 다능성 줄기 (hIPS) 세포로 전환하고 있다. 환자가 상실한 뉴런을 대체하기 위해 필수 표현형을 갖는 뉴런으로 hIPS의 효율적인 분화가 매우 활발한 연구 분야이다. 그러나, 뉴런은 매우 섬세한 세포이다. 뉴런 현탁액의 주입은 일반적으로 아노이키스에 의해 상기 뉴런의 98% 초과의 사멸을 야기시킨다. 대안적으로, 뉴런보다 덜 섬세한 것으로 알려진 뉴런 전구체를 이식하는 것이 고려되었다. 이러한 해법은 너무나 불만족스럽다. 실제로, 이식 이후에 뉴런 전구체의 세포 분화는 통제되지 않고, 이식된 세포가 바람직한 뉴런 유형 및/또는 적절하게 분화되는 것이 확실하지 않다.
그러므로, 특히 신경퇴행성 질환을 갖는 환자에서 변경된 뉴런을 영구적으로 대체시키기 위해서, 이식된 세포의 생존성을 개선시키기 위한 뉴런 세포 이식 시스템에 대한 요구가 존재한다.
세포의 3차원 (3D) 배양에 공을 들이면서, 본 발명자들은 세포 현탁액으로서가 아닌, 3차원 세포 네트워크로서 배양하고 취급함으로써 특히 섬세한 세포 예컨대 뉴런을 취급할 때 생존율을 개선시키는 것이 가능하다는 것을 발견하였다. 그들은 뉴런 세포 현탁액을 주입시 수득된 것보다 훨씬 더 높은 생존율로 상기 뉴런 세포를 환자의 신경계에 통합시키기 위해서, 환자의 신경계에 주입될 수 있는, 관심 표현형을 갖는 뉴런 세포를 포함하는 신경 조직 유닛을 개발하였다. 개발된 신경 세포 유닛은 주입 이후에 신경계에서 세포의 통합 및 생존을 촉진하는, 3D 네트워크로 사전-조직화되고 세포외 매트릭스 내에 내포된 뉴런 세포를 포함한다. 실제로, 신경 세포는 그들의 국부 환경의 무결성, 특히 신경 조직 유닛 내에서 발생된 세포외 매트릭스와 세포 간 상호작용을 유지시키면서 숙주 신경계에 전달된다. 더 나아가서, 본 발명에 따른 신경 조직 유닛은 그의 분화 정도가 완벽하게 제어될 수 있고, 특히 기형종 및 종양 성장의 발생을 담당하는, 원치않는 세포 유형의 도입 위험성을 제한할 수 있는 유사분열후 뉴런 세포를 포함한다. 흥미롭게도, 본 발명에 따른 신경 조직 유닛은 숙주 조직으로 축삭 돌기를 돌출시킬 수 있고, 상기 숙주 조직으로 세포의 양호한 통합을 촉진할 수 있으며, 명확한 기능적 이득을 생성시킬 수 있다는 것이 관찰되었다.
그러므로, 본 발명은 인간 또는 비-인간 포유동물의 신경계로의 이식에서 사용을 위한 신경 조직 유닛에 관한 것이고, 상기 신경 조직 유닛은 세포외 매트릭스 내에 분화된 유사분열후 뉴런 세포를 함유하고, 상기 유닛은 단일 신경 조직 유닛을 둘러싼 히드로겔 캡슐을 포함하는 세포 미소구획으로부터 수득되고, 상기 히드로겔 캡슐은 상기 신경 조직 유닛의 이식 이전에 적어도 부분적으로 제거된다.
따라서, 본 발명은 세포외 매트릭스 내에 분화된 유사분열후 뉴런 세포를 함유하는 적어도 하나의 신경 조직 유닛의, 신경퇴행성 질환을 갖는 인간 또는 비-인간 포유동물의 신경계로의 이식에 의한, 신경퇴행성 질환의 치료에서 사용을 위한 신경 조직 유닛에 관한 것이고, 상기 유닛은 상기 신경 조직 유닛을 둘러싼 히드로겔 캡슐을 포함하는 세포 미소구획으로부터 수득되고, 상기 히드로겔 캡슐은 신경 조직 유닛의 이식 이전에 적어도 부분적으로 제거된다.
특히, 본 발명은 세포외 매트릭스 내에 도파민작동성 뉴런으로 분화되는 유사분열후 뉴런 세포를 함유하는 하나 이상의 뉴런 유닛의, 파킨슨병을 갖는 인간 또는 비-인간 포유동물의 신경계로의 이식에 의한, 파킨슨병의 치료에서 사용을 위한 신경 조직 유닛에 관한 것이고, 상기 유닛은 상기 신경 조직 유닛을 둘러싼 히드로겔 캡슐을 포함하는 세포 미소구획으로부터 수득되고, 상기 히드로겔 캡슐은 신경 조직 유닛의 이식 이전에 적어도 부분적으로 제거된다.
본 발명은 또한 세포외 매트릭스 내에 도파민작동성 뉴런으로 분화되는 유사분열후 뉴런 세포를 함유하는 적어도 하나의 신경 조직 유닛이 파킨슨병을 갖는 환자의 신경계에 이식되는 것에 따라서, 파킨슨병을 치료하기 위한 방법에 관한 것이고, 상기 유닛은 상기 신경 조직 유닛을 둘러싼 히드로겔 캡슐을 포함하는 세포 미소구획으로부터 수득되고, 상기 히드로겔 캡슐은 신경 조직 유닛의 이식 이전에 적어도 부분적으로 제거된다.
유사하게, 본 발명은 세포외 매트릭스 내에 GABA 작동성 뉴런으로 분화되는 유사분열후 뉴런 세포를 함유하는 적어도 하나의 신경 조직 유닛의, 헌팅톤병을 갖는 인간 또는 비-인간 포유동물의 신경계에 이식에 의한, 헌팅톤병의 치료에서 사용을 위한 신경 조직 유닛에 관한 것이고, 상기 유닛은 상기 신경 조직 유닛을 둘러싼 히드로겔 캡슐을 포함하는 세포 미소구획으로부터 수득되고, 상기 히드로겔 캡슐은 신경 조직 유닛의 이식 이전에 적어도 부분적으로 제거된다.
본 발명은 또한 세포외 매트릭스 내에 GABA 작동성 뉴런으로 분화되는 유사분열후 뉴런 세포를 함유하는 적어도 하나의 신경 조직 유닛을 헌팅톤병을 갖는 환자의 신경계에 이식시키는 것에 따라서, 헌팅톤병을 치료하기 위한 방법에 관한 것이고, 상기 유닛은 상기 신경 조직 유닛을 둘러싼 히드로겔 캡슐을 포함하는 세포 미소구획으로부터 수득되고, 상기 히드로겔 캡슐은 신경 조직 유닛의 이식 이전에 적어도 부분적으로 제거된다.
유사하게, 본 발명은 인간 또는 비-인간 포유동물의 신경계로의 이식에서 사용을 위한 신경 조직 유닛에 관한 것이고, 상기 신경 조직 유닛은 유전자 변형된 뉴런을 함유한다. 이러한 신경 조직 유닛은 특히 인간 또는 비-인간 포유동물에서 인지 및/또는 동작의 기능을 보조하거나, 개선시키거나 또는 회복시키는데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 인간 또는 비-인간 포유동물의 신경계로 이식되도록 의도되는, 이러한 신경 조직 유닛을 제조하기 위한 방법에 관한 것이고, 상기 방법은
(1) 유리하게는 신경 조직 유닛을 수용하고자 하는 포유동물과 면역-적합성인, 신경 세포로 분화될 수 있는 인간 또는 비-인간 포유동물 세포, 및 세포외 매트릭스를 히드로겔 캡슐 내에 포함하는 세포 미소구획을 생성시키는 단계;
(2) 적어도 하나의 유사분열후 관심 표현형을 갖는 뉴런 세포를 수득하기 위해서, 세포 미소구획 내에서 세포 분화를 유도시키는 단계;
(3) 신경 조직 유닛으로서 뉴런 세포를 회수하기 위해서 히드로겔 캡슐을 적어도 부분적으로 제거시키는 단계
로 이루어진 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 신경 조직 유닛을 둘러싼 적어도 하나의 히드로겔 캡슐을 포함하는 적어도 하나의 세포 미소구획, 및 히드로겔 캡슐의 적어도 부분 제거를 위한 수단을 포함하는 신경 조직 유닛 이식 키트에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 적어도 하나의 신경 조직 유닛, 우선적으로 10 내지 100개 및 최대 1000개의 신경 조직 유닛을 포함하는 신경 조직 유닛 이식 키트에 관한 것으로서, 상기 신경 조직 유닛은 포유동물의 신경계로 신경 조직 유닛을 이식시킬 수 있는 수술용 이식 장치에 로딩된다.
도 1은 본 발명에 따른 신경 조직의 주입에 의해 처치되거나 또는 처치되지 않은, 파킨슨병이 발병된 상이한 래트를 제조하기 위한 프로토콜의 개략도이다. 모의군: 대조군 래트; 6-OHDA: 파킨슨병이 발병된 래트 (음성 대조군); 6-OHDA 캡슐화 전구체 (또는 Pro encaps): 시판되는 뉴런 전구체 세포가 캡슐화된 세포 미소구획 유래의, 본 발명에 따른 신경 조직을 수용한 파킨슨병이 발병된 래트; 6-OHDA CNO (Controlled Neural Organoid): 도파민작동성 뉴런을 포함하는 뉴런으로 분화되기 이전에 다능성 세포가 캡슐화된 세포 미소구획 유래의 본 발명에 따른 신경 조직 유닛 (이 실시예에서 CNO에 상응)을 수용한 파킨슨병이 발병된 래트;
도 2A 및 2B는 파킨슨병 래트를 수득하고 본 발명에 따른 뉴런 조직을 이식하기 위해 적용된 병변 (2A) 및 이식 (2B) 프로토콜을 도시한다.
도 3은 파킨슨병이 발병된 래트의 중추 신경계로 본 발명에 따른 이식가능한 신경 유닛 (이 실시예에서는 CNO 유형)의 이식 후 6일에 인간 뉴런의 다중-밀리미터 축삭 돌기 돌출부를 도시한 마이크로그래프이다 (6-OHDA CNO). 이것은 인간 세포질 (HCM)에 대한 항체를 사용한 조직화학으로 밝혀진, 크라이오스태트를 사용해 고정, 냉동 및 절단된, 그라프트 영역 내 래트 선조체의 절편의 공초점 이미지이다;
도 4A-E는 본 발명에 따른 신경 조직 유닛의 그라프트를 갖거나 또는 수용하지 않은 파킨슨병이 발생된 래트에 대해 수행된 행동 검사로 수득된 결과를 도시한다. (4A) 실린더 검사; (4B) 족답 검사; (4C) 로타미터 검사; (4D) 불안 검사.
도 2A 및 2B는 파킨슨병 래트를 수득하고 본 발명에 따른 뉴런 조직을 이식하기 위해 적용된 병변 (2A) 및 이식 (2B) 프로토콜을 도시한다.
도 3은 파킨슨병이 발병된 래트의 중추 신경계로 본 발명에 따른 이식가능한 신경 유닛 (이 실시예에서는 CNO 유형)의 이식 후 6일에 인간 뉴런의 다중-밀리미터 축삭 돌기 돌출부를 도시한 마이크로그래프이다 (6-OHDA CNO). 이것은 인간 세포질 (HCM)에 대한 항체를 사용한 조직화학으로 밝혀진, 크라이오스태트를 사용해 고정, 냉동 및 절단된, 그라프트 영역 내 래트 선조체의 절편의 공초점 이미지이다;
도 4A-E는 본 발명에 따른 신경 조직 유닛의 그라프트를 갖거나 또는 수용하지 않은 파킨슨병이 발생된 래트에 대해 수행된 행동 검사로 수득된 결과를 도시한다. (4A) 실린더 검사; (4B) 족답 검사; (4C) 로타미터 검사; (4D) 불안 검사.
본 발명은 신경 세포가 3D 네트워크로 조직화된 신경 조직 유닛의 포유동물의 신경계로의 이식 또는 그라프팅을 위한 방법을 개시한다. 조밀한 볼의 형태로 신경 세포의 그라프팅은 숙주 신경계로의 그들의 이식 및 통합을 촉진한다. 본 발명에 따른 이식 방법, 및 보다 일반적으로 본 발명에 따라 개발된 신경 조직 유닛은 인간 또는 비-인간 포유동물에서, 및 보다 우선적으로 인간 대상체에서 사용하고자 한다.
신경 조직 유닛
본 발명은 대상체에서 모든 종류의 신경퇴행성 질환을 치료하고/하거나 상기 대상체에서 인지 또는 동작 기능을 보조, 개선, 회복시키기 위해서, 대상체의 신경계로의 이식을 위해 신경 조직 유닛을, 뉴런 세포 현탁액 대신에 사용하는 것을 제안한다.
본 발명에 따라서, 이식시키려는 신경 조직 유닛은 유리하게는 분화된 유사분열후 뉴런 및 신경아교세포, 예컨대 성상세포 및/또는 희소돌기아교세포를 세포외 매트릭스 내에 포함한다.
"유사분열후" 뉴런은 분열하는 능력을 상실한 뉴런 세포이다. 미소구획에 함유된 뉴런은 그들이 특별한 표현형을 갖는다는 의미에서 분화된다.
본 발명에 따라서, 신경 조직 유닛을 둘러싼 히드로겔 캡슐은 대상체의 신경계로의 이식 이전에 적어도 부분적으로 제거된다.
본 발명의 문맥에서, "히드로겔 캡슐"은 액체, 우선적으로 물에 의해 팽윤된 중합체 사슬의 매트릭스로부터 형성된 3차원 구조체를 의미한다. 유리하게, 사용되는 히드로겔은 세포에 유독하지 않다는 의미에서, 생체적합성이다. 더 나아가서, 히드로겔 캡슐은 미소구획 내에 함유된 세포에게 산소의 확산 및 영양분을 공급할 수 있어야만 하고 그들이 생존할 수 있게 해야만 한다. 예를 들어, 히드로겔 캡슐은 알기네이트를 함유한다. 우선적으로, 캡슐은 오직 알기네이트만을 함유한다. 본 발명의 문맥에서, "알기네이트"는 β-D-만누로네이트 및 α-L-굴루로네이트, 이의 염 및 유도체로 형성된 선형 다당류를 의미한다. 유리하게, 알기네이트는 평균 분자 질량이 100 내지 400 KDa (예를 들어, PRONOVA™ SLG100)이고 총 농도가 0.5 질량% 내지 5 질량%로 포함되는, 80% α-L-굴루로네이트 및 20% β-D-만누로네이트로 구성된 소듐 알기네이트이다.
신경 조직 유닛이 제조될 때, 히드로겔 캡슐은 하나 이상의 관심 뉴런 유형으로 그들의 제어된 분화를 가능하게 하면서 외부 환경으로부터 세포를 보호한다. 본 발명에 따라서, 히드로겔 캡슐은 단일 신경 조직 유닛을 둘러싼다. 따라서, 각각의 신경 조직 유닛은 히드로겔 캡슐에 의해서 개별적으로 둘러싸인다. 하나 이상의 바람직한 세포 유형이 수득되고 캡슐 내 신경 조직의 크기가 충분하면, 상기 캡슐은 적어도 부분적으로 제거된다. "적어도 부분적으로 제거되는"은 상기 유닛의 적어도 일부 신경 세포의 적어도 축삭 돌기가 캡슐을 빠져나갈 수 있도록 히드로겔 캡슐이 적어도 부분적으로 가수분해되거나, 용해되거나, 관통되거나, 또는 파열되는 것을 의미한다. 히드로겔 캡슐의 가수분해, 용해, 관통 및/또는 적어도 부분적인 파열을 가능하게 하는, 즉 세포에 무독성인 임의의 생체적합성 수단이 사용될 수 있다. 예를 들어, 염수 포스페이트 완충액, 2가 이온 킬레이터, 효소 예컨대 알기네이트 리아제, 레이저 현미해부, 히드로겔에 통합된 가용성 비드 등을 사용하는 것이 가능하다.
유리하게, 캡슐은 완전하게 제거되고, 따라서 신경계로 이식시키고자 하는 신경 조직 유닛은 히드로겔이 없다.
우선적으로, 신경 조직 유닛의 세포외 매트릭스 층은 겔을 형성한다. 세포외 매트릭스 층은 세포 배양, 및 보다 특히 신경 세포 배양에 필수적인 단백질 및 세포외 화합물의 혼합물을 포함한다. 우선적으로, 세포외 매트릭스는 구조적 단백질, 예컨대 α1 또는 α4 또는 α5 및 β1 또는 β2 및 γ1 또는 γ3 서브유닛을 함유하는 라미닌, 엔탁틴, 비트로넥티, 콜라겐을 비롯하여 성장 인자 예컨대 TGF-베타 및/또는 EGF를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포외 매트릭스 층은 Matrigel® 및/또는 Geltrex®로 이루어지거나, 또는 그를 함유한다.
본 발명에 따른 신경 조직 유닛은 세포와 세포외 매트릭스 간 상호작용이 이미 존재하는 3D 네트워크로 조직화된 신경 세포를 함유하는 장점을 갖는다.
유리하게, 신경 조직 유닛의 신경 세포는 바람직하게 10%를 더하거나 또는 뺀 10 ㎛ 내지 1000 ㎛, 우선적으로 10%를 더하거나 또는 뺀 150 ㎛ 내지 400 ㎛, 보다 더 우선적으로 10%를 더하거나 또는 뺀 200 ㎛ 내지 300 ㎛를 포함하는 최소 치수를 갖는, 특히 타원형, 관형 또는 구형 형상의, 신경 세포의 클러스터를 형성한다. 이들 치수는 신경 조직 유닛 내에서 뉴런의 생존에 특히 호의적이고 이식 후 그라프트의 재조직화 및 혈관화를 최적화시킨다. "최소 치수"는 세포 클러스터의 양쪽 측면 상의 2개 지점 간 최소 거리를 의미한다.
우선적으로, 본 발명에 따른 신경 조직 유닛은 100개 내지 100,000개의 신경 세포를 함유한다.
신경 조직 내에서, 뉴런 세포는 유리하게는 신경 조직 유닛을 의도하는 용도에 따라서 선택된, 하나 이상의 관심 표현형을 갖는다. 본 발명에 따라서, 이식되는 신경 조직 유닛은 하나 이상의 선택되고 제어된 표현형에 따라서 분화된 뉴런 세포를 포함한다. 우선적으로, 신경 조직 유닛은 관심 표현형(들)의 유사분열후 뉴런 세포를 10 내지 100%, 우선적으로 50 내지 100%, 보다 우선적으로 90% 초과로 포함한다. 신경 조직 유닛에 존재하는 나머지 세포는 특히 그의 표현형이 관심 표현형과 상이한 신경아교세포 및/또는 유사분열후 뉴런 세포일 수 있다. 유리하게, 신경 조직 유닛은 동일한 표현형을 갖는 유사분열후 뉴런 세포로 본질적으로 이루어진다.
유사분열후 뉴런 세포의 관심 표현형은 상기 유닛의 목적에 의존적이다. 따라서, 세포 요법에서 사용하려는 경우에, 뉴런의 표현형은 유리하게는 대체하려는 결함 세포의 표현형에 상응한다.
실제로, 본 발명에 따른 신경 조직 유닛은 유리하게, 신경퇴행성 질환, 예컨대 파킨슨병, 헌팅톤병, 근위축성 측색 경화증 (ALS), 알츠하이머병 또는 뉴런 세로이드-리포푸신증, 예컨대 바텐병의 치료를 위한, 세포 요법에서 사용될 수 있다.
따라서, 파킨슨병의 치료를 위해서, 신경 조직 유닛은 유리하게는 도파민작동성 뉴런을 함유한다. 우선적으로, 이러한 신경 조직 유닛에 함유되는 유사분열후 뉴런은 본질적으로 도파민작동성 뉴런이다.
본 발명의 문맥에서, "본질적으로"는 세포의 적어도 90%, 우선적으로 적어도 95%, 보다 더 우선적으로 적어도 99%를 의미한다.
헌팅톤병의 치료를 위해서, 신경 조직 유닛은 유리하게는 GABA 작동성 뉴런을 함유한다. 우선적으로, 이러한 신경 조직 유닛에 함유된 유사분열후 뉴런은 본질적으로 GABA 작동성 뉴런이다.
본 발명에 따른 신경 조직 유닛은 또한 유전자 변형된 신경 세포를 함유해도 된다. 따라서, 하나 이상의 유전자의 발현이 억제되거나 또는 증가된 신경 세포를 대상체의 신경계에 이식시키는 것이 가능하다. 정상적으로 부재하는 기능을 신경계에 도입시키기 위해서, 이종성 유전자가 도입된 신경 세포를 이식시키는 것이 또한 가능하다.
유전자 변형된 세포를 함유하는 이러한 신경 조직 유닛은 인지 및/또는 동작 기능, 예컨대 고려하는 대상체에서 결함성 또는 불충분한 인지 및/또는 작동 기능을 보조하거나, 개선하거나 또는 회복시키는데서 특히 흥미롭다.
예를 들어, 헌팅톤병의 치료에서, 유전적 원인 (헌팅틴을 코딩하는 유전자 내에서 CAG 트리플렛 반복부의 확장)이 공지되어 있으므로, 상기 신경 조직 유닛의 자가이식을 수행하는 단계 이전에, 결함 유전자를 교정한 GABA 작동성 뉴런을 포함하는 본 발명에 따른 신경 조직 유닛을 제조하기 위해서 환자로부터 세포를 제거하는 것이 가능하다.
파킨슨병을 갖는 환자의 경우에, 심부 뇌 자극과 유사하지만 덜 침윤적인 방식으로, 단순 조사를 통해 그라프트된 신경 조직의 활성을 제어하기 위해서, 감광성 채널, 예컨대 로돕신 채널을 발현하도록 변형된 도파민작동성 뉴런을 포함하는 신경 조직 유닛을 제조하는 것이 가능하다. 일반적으로, 특히 감광성 채널의 발현을 통해서 그라프트된 신경 조직의 활성을 제어하는 것은 모든 잠재적인 적용분야에 이득일 수 있다.
신경 조직 유닛 이식
키트
본 발명은 또한 본 발명에 따른 신경 조직 유닛을 둘러싼 히드로겔 캡슐을 포함하는 적어도 하나의 세포 미소구획, 및 히드로겔의 적어도 부분적인 제거 (가수분해, 용해, 관통 및/또는 파열)를 위한 수단을 포함하는 신경 조직 유닛 이식 키트를 제안한다.
따라서 본 발명에 따른 신경 조직 유닛을 사용해야만 하는 의사는 필요에 따라서 사용 시에, 대상체의 신경계로 이식하려고 준비된 신경 조직 유닛(들)을 수득하기 위해 히드로겔 캡슐을 적어도 부분적으로 제거할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 이식 키트는 또한 포유동물의 신경계로 신경 조직 유닛을 이식할 수 있는 수술용 이식 장치를 함유해도 된다.
본 발명은 또한 포유동물의 신경계로 신경 조직 유닛(들)을 이식할 수 있는 수술용 이식 장치에 로딩된 본 발명에 따른 적어도 하나의 신경 조직 유닛, 우선적으로 1 내지 10,000개, 보다 우선적으로 10 내지 1000개의 신경 조직 유닛을 포함하는 신경 조직 유닛 이식 키트를 제안한다. 유리하게, 이식되는 신경 조직 유닛의 분량은 숙주 뇌의 크기 및 적용에 따라 좌우된다.
신경 조직 유닛은 임의로 수술용 이식 장치에 도입시키기 전에 냉동될 수 있고/있거나 수술용 이식 장치와 동시에 냉동될 수 있다. 물론, 이후에 해동 단계가 대상체의 신경계로 신경 조직 유닛을 이식시키기 전에 필요하다.
제조 방법
본 발명은 또한 포유동물의 신경계로 이식시킬 수 있는 신경 조직 유닛을 제조하기 위한 방법에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 그의 표현형(들)이 상기 유닛이 의도하는 용도에 의존적인 유사분열후 뉴런 세포를 함유하는 신경 조직 유닛을 생성시키는 것을 제안한다. 본 발명에 따라서, 특히 캡슐화 이전 또는 이후 리프로그래밍된 후에 히드로겔 캡슐 내에서 하나 이상의 신경 유형으로 분화되는 분화된 포유동물 세포 유래의 신경 세포를 둘러싼 히드로겔 캡슐을 포함하는 세포 미소구획을 생성시키는 것이 가능하다. 이후에 캡슐은 이식 후 숙주 조직으로 신경 세포를 이식시킬 수 있도록 적어도 부분적으로 제거된다.
일반적으로, 본 발명에 따라서 인간 또는 비-인간 포유동물의 신경계로 이식시키고자 하는, 이러한 신경 조직을 제조하기 위한 방법은
(1) 유리하게는 신경 조직 유닛을 수용하도록 의도된 포유동물과 면역-적합성인, 신경 세포로 분화될 수 있는 인간 또는 비-인간 포유동물 세포 및 세포외 매트릭스를 히드로겔 캡슐 내에 포함하는 세포 미소구획을 생성시키는 단계;
(2) 적어도 하나의 관심 표현형을 갖는 유사분열후 뉴런 세포를 수득하기 위해서, 세포 미소구획 내에서 세포 분화를 유도시키는 단계;
(3) 신경 조직 유닛으로서 신경 세포를 회수하기 위해서 히드로겔 캡슐을 적어도 부분적으로 제거시키는 단계
로 이루어진 단계를 포함한다.
히드로겔 캡슐 내에 신경 세포를 야기시킬 수 있는 세포 및 세포외 매트릭스를 함유하는 세포 미소구획을 제조하기 위한 임의의 방법이 사용될 수도 있다. 특히, Alessandri 등, 2016 ("A 3D printed microfluidic device for production of functionalized hydrogel microcapsules for culture and differentiation of human Neuronal Stem Cells (hNSC)", Lab on a Chip, 2016, vol. 16, no. 9, pp. 1593-1604)에 기술된 미세유체 장치로 미소구획을 제조하는 것이 가능하다.
특정한 실시형태에서, 캡슐화된 세포는 다능성 줄기 세포, 예컨대 유도 다능성 줄기 (IPS) 세포, 또는 배아 줄기 (ES) 세포이다. 본 발명의 문맥에서, "유도 다능성 줄기 세포" (IPS 세포)는 배아 줄기 세포의 것과 부분적으로 유사한 다능성 및 자가-재생의 잠재성 및 모폴로지를 갖는 분화된 체세포의 유전자 리프로그래밍에 의해 수득되는 다능성 줄기 세포로서 정의된다. 이들 세포는 특히 다능성 마커, 예컨대 알칼리 포스파타제 염색 및 단백질 NANOG, SOX2, OCT4 및 SSEA3/4의 발현에 양성이다. 유도 다능성 줄기 세포를 수득하기 위한 방법은 당업자에게 충분히 공지되어 있고, 특히 Yu 등 (Science, 2007, 318 (5858): 1917-1920), Takahashi et al. (Cell, 2007, 131(5): 861-872) 및 Nakagawa 등 (Nat Biotechnol, 2008, 26(1): 101-106)의 논문에 기술되어 있다. 배아 줄기 세포의 경우에서, 상기 다능성 줄기 세포는 유기체의 모든 조직의 형성을 야기시키는 능력을 갖는, 배반포의 내부 세포괴로부터 유래되는 세포이다. 배아 줄기 세포의 다능성은 마커 예컨대 전사 인자 OCT4 및 NANOG 및 표면 마커 예컨대 SSEA3/4, Tra-1-60 및 Tra-1-81의 존재에 의해서 평가될 수 있다. 배아 줄기 세포는 예를 들어 Chung 등 (Cell Stem Cell, 2008, 2(2): 113-117)이 설명하는 기술을 사용하여 그들이 기원하는 배아를 파괴하지 않고 수득될 수 있다. 특정한 실시형태에서, 법적 또는 윤리적 이유로, 줄기 세포는 인간 배아 줄기 세포는 배제하는 것으로 정의된다.
대안적으로, 신경 전구체 세포, 즉 신경 세포로의 세포 분화에 이미 관여하는 줄기 세포를 캡슐화시키는 것이 가능하다. 다른 실시형태에서, 전환분화에 의해서 신경 세포로 분화되도록 만들어지게 되는, 분화된 세포를 캡슐화시키는 것이 가능하다. 또한 신경아교세포를 형성할 수 있는 세포, 예컨대 체세포를 캡슐화시키는 것도 가능하다.
다른 실시형태에서, 캡슐화 이전 또는 이후에 다능성 줄기 세포로 리프로그래밍되어지는 분화된 세포를 사용하는 것이 가능하다. 신경 조직 유닛은 환자의 신경계에서 장기간 동안 이식될 수 있어야만 하므로, 임의의 거부 위험성을 피하도록, 상기 대상체와 면역-적합성인 세포로 시작하는 것이 바람직하다. 특정한 실시형태에서, 신경 조직 유닛을 제조하는데 사용되는 세포는 이전에 상기 신경 조직 유닛(들)을 이식시키려는 인간 또는 비-인간 포유동물로부터 수집되었다.
모든 경우에서, 세포 미소구획이 수득되면, 그것이 함유하는 세포는 하나 이상의 바람직한 표현형에 따라서 그들을 뉴런 세포로 분화시키기 위해서 세포 분화를 겪어야만 한다.
세포 분화하게 만드는 2D 배양 (페트리 디쉬 등)에서 통상적으로 사용되는 임의의 방법, 예컨대 Chambers 등 ("Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling", Nature Biotechnology 27, 275 - 280 (2009)), 또는 Lippmann 등 ("Defined human pluripotent stem cell culture enables highly efficient neuroepithelium derivation without small molecule inhibitors", Stem Cells 2014)이 기술한 방법을 사용할 수 있다. 특정한 실시형태에서, 분화 배지는 도파민작동성 분화를 개선시키기 위해서, 24(S),25-에폭시콜레스테롤을 함유한다.
우선적으로, 세포 미소구획은 히드로겔 캡슐의 임의 제거 이전에 분화 배지에서 적어도 3주 동안 배양된다.
일반적으로, 다능성 세포 미소구획은 사용 전에 냉동될 수 있고 필요에 따라서 해동될 수 있다.
예시적인 실시형태에서, 세포 미소구획 내에서 세포를 도파민작동성 세포로 분화되게 만들기 위해서 세포 분화를 유도시키는 것이 가능하다 ("Generating regionalized neuronal cells from pluripotency, a step-by-step protocol" Kirkeby et al. Frontiers in Cellular Neuroscience 2012). 그 다음으로 이러한 세포 미소구획으로부터 유래된 신경 조직 유닛은, 파킨슨병을 갖는 대상체의 신경계로, 상기 대상체의 결함성 도파민작동성 뉴런을 적어도 부분적으로 대체하기 위해, 이식될 수 있다.
다른 예시적인 실시형태에서, 세포 미소구획 내 세포를 GABA 작동성 세포로 분화되게 만들기 위해서 세포 분화를 유도시키는 것이 가능하다 ("Derivation of striatal neurons from human stem cells" Viegas et al. Prog Brain Res 2012). 이후에 이러한 세포 미소구획으로부터 유래된 신경 조직 유닛은 헌팅톤 무도병을 갖는 대상체의 신경계로, 상기 대상체의 결함성 GABA 작동성 뉴런을 적어도 부분적으로 대체하기 위해서, 이식될 수 있다.
본 발명에 따른 신경 조직 유닛을 제조하기 위한 방법은 또한
- 수술용 이식 장치에 적어도 하나의 신경 조직 유닛, 우선적으로 10 내지 1000개, 보다 우선적으로 10 내지 100개의 신경 조직 유닛을 로딩시키는 단계
로 이루어진 추가 단계를 포함할 수 있다.
따라서, 이식 장치는 대상체의 신경계로 신경 세포를 이식시키는데 사용될 준비가 된다.
본 발명에 따라서, 히드로겔 캡슐의 적어도 부분적인 제거 이전 또는 이후에 신경 조직 유닛으로서 신경 세포를 냉동시키는 것이 가능하다. 물론, 신경 조직 유닛은 먼저 냉동시키지 않고, 제조 과정 이후에 직접적으로 사용될 수 있다.
유리하게, 본 발명에 따른 제조 방법은
- 세포 분화 단계 이후에, 히드로겔 캡슐 내에 함유된 신경 세포의 표현형을 확인하는 단계
로 이루어진 중간 단계를 포함한다.
예를 들어, 도파민작동성 뉴런을 함유하는 하나 이상의 신경 조직 유닛의 경우에, 배양 배지로부터 상청액을 제거하고, HPLC와 결합된 미세투석 분석을 수행하여 이식 전에 이식가능한 신경 유닛의 활성을 비침습적으로 측정하는 것이 가능하다.
보다 일반적으로, 세포막을 통해 통과하는 이온 전류의 기록을 기반으로 하는 소위 "팻치-클램프" 기술에 의해서 샘플을 대표하는 뉴런의 전기적 활성을 특징규명하는 것이 유리할 수 있다.
신경 조직 유닛은 유리하게는 동일한 조건 하에서, 뱃치로 배양되고, 또한 보다 상세한 분석법, 특히 면역세포화학, RNA 및/또는 단백질체 시퀀싱을, 분화의 정확한 품질을 보장하기 위해서, 고려되는 신경 조직 유닛의 개체군의 대표적인 샘플에 대해 수행하는 것이 가능하다. 예를 들어, 도파민작동성 뉴런을 함유하는 신경 조직 유닛의 경우에, 티로신 히드록실라제, FOXA2 및/또는 NURR1을 표적으로 하는 면역세포화학 분석을 수행하는 것이 가능하다 ("Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease" Kriks et al. 2012).
따라서 유사분열후 뉴런 및/또는 신경 세포가 사실 대상체의 신경계로 이식되는 단계 이전에 바람직한 표현형(들)을 갖는다는 것을 입증하는 것이 가능하다.
인간 또는 비-인간 포유동물의 신경계로 신경 조직 유닛(들)의 이식
본 발명은 또한 이를 필요로 하는, 대상체, 특히 인간의 신경계로 신경 조직 유닛(들)을 이식하거나, 또는 그라프팅시키기 위한 방법을 제안한다. 실제로, 본 발명에 따른 신경 조직 유닛은 유리하게는 신경퇴행성 질환의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 문맥에서, 용어 "치료"는 치유적, 대증적 또는 예방적 치료를 의미한다. 본 명세서에서 사용시, 용어 질환의 "치료"는 환자의 수명 및/또는 퀄리티를 연장시키고자 의도하는 임의의 행위를 의미한다. 치료는 질환을 박멸하고/하거나, 질환의 진행을 중단 또는 지연시키고/시키거나 질환의 퇴행을 촉진시키도록 디자인될 수 있다. 용어 질환의 "치료"는 또한 질환과 연관된 증상을 감소시키고자 의도하는 임의의 행동을 의미한다. 치료하려는 환자는 임의의 포유동물, 바람직하게 인간이다.
일반적으로, 임의의 신경 세포 이식 방법을 사용하여 대상체의 신경계로 신경 조직 유닛을 이식시킬 수 있다. 특히, 신경 조직 유닛이 사전에 로딩된, 캐뉼라, 예컨대 유리 캐뉼라를 사용하는 것이 가능하다.
특정한 실시형태에서, 이식은
- 신경 조직 유닛(들)을 수용하도록 대상체를 마취시키고/시키거나 고정시키는 단계;
- 대상체의 두개골을 복개시키는 단계;
- 예를 들어 소위 "정위 (stereotactic)" 장치를 사용하여 그라프트 영역 상에 신경 조직 유닛을 함유하는 이식 장치를 위치시키는 단계;
- 이식 장치를 그라프트 영역에 삽입시키는 단계;
- 그라프트 영역으로부터 이식 장치를 점차적으로 제거하면서 신경 조직 유닛을 주입시키는 단계
로 이루어진 단계를 포함한다.
유리하게, 주입 단계는 대상체의 신경계로의 이식 장치의 삽입 깊이를 관리하도록 미세유체 펌프 및 동력화 시스템을 통해 제어되어서, 이식 장치의 회수 궤도에 배치되는 상기 신경계 내에 신경 조직 유닛을 위한 필수 공간이 제공된다.
특정한 실시형태에서, 이식 장치는 0.3 내지 2 mm, 우선적으로 0.4 mm를 포함하는 내경, 및 0.4 내지 3 mm, 우선적으로 0.55 mm의 외경을 갖는 유리 캐뉼라로 이루어진다. 캐뉼라는 유리하게는 원형 또는 탬퍼처리 팁을 갖고 이의 표면은 캐뉼라가 삽입될 때 조직 손상 위험성을 감소시키고 혈액 응고에 의한 막힘 위험성을 감소시키기 위해서 플루오르화 화합물로 실란화된다. 신경 조직 유닛은 예를 들어, 앞쪽으로부터 캐뉼라로 로딩된다. 캐뉼라는 대상체의 두개골 내 위치에 삽입된다.
유리하게, 동일한 이식 동안, 10 내지 40개의 신경 조직 유닛이 이식되고, 각각의 신경 조직 유닛은 우선적으로 1000 내지 10,000개의 신경 세포를 포함한다. 물론, 이식하려는 신경 조직 유닛의 개수는 치료하려는 대상체 및 질환 및/또는 변형시키려는 인지 또는 행동 기능에 따라서 적합화된다. 시간 경과에 따라서, 수 회의 이식이 또한 고려될 수 있다. 유사하게, 그라프트는 대상체의 신경계의 상이한 영역에서 단기간 동안 또는 동시에 수행될 수 있다.
실시예
1. 파킨슨병의 치료를 위한 이식가능한 신경 조직 유닛의 생성:
전구체는 Kriks 등 ("Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease" Kriks et al. 2012)이 공개한 방법에 따라서, 도파민작동성 뉴런으로의 분화를 최적화시키기 위해서 인간 유도 다능성 줄기 세포로부터 유래된 배양에 대해 24(S),25-에폭시콜레스테롤 (1 내지 10 μM의 농도)을 사용하여 수득된다.
이렇게 수득된 전구체는 Alessandri 등, 2016 ("A 3D printed microfluidic device for production of functionalized hydrogel microcapsules for culture and differentiation of human Neuronal Stem Cells (hNSC)", Lab on a Chip, 2016)이 공개한 방법에 따라서 캡슐화된다.
전구체를 함유하는 세포 미소구획이 수득되면, 소위 도파민작동성 뉴런으로의 "말단" 분화를 Kriks 등 ("Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease" Kriks et al. 2012)이 공개한 방법에 따라서, 다시 24(S),25-에폭시콜레스테롤 (1 내지 10 μM의 농도)을 사용하여 수행한다.
세포 미소구획에서 세포의 증식은 그들의 제조 동안 이식가능한 신경 유닛에 의해서 배지가 소모되는 속도를 증가시키므로, 배양 배지를 교환시키는 것에 특별한 주의를 기울인다.
모든 분화는 세포 미소구획에서 발생되지만, 세포가 단일 세포의 현탁 해리를 지원하는 한 (또는 감마 세크리타제 억제제 및/또는 Notch 신호 예컨대 DAPT, 화합물E 또는 말단 분화를 촉진하는 다른 분자의 첨가 이후 최대 1주일까지), 세포를 탈캡슐화 및 재캡슐화시키는 것이 가능하다.
분화 3주 후에 이렇게 수득된 세포 미소구획은 PBS 용액으로 연속 세정을 통해 처리하여 주입 전에 히드로겔을 용해시켜서 신경 유닛을 회수한다.
주입 캐뉼라의 생성:
보로실리케이트 모세관의 5 cm 절편 (내경: 0.4 mm, 외경: 0.55 mm)을 세라믹 블레이드로 절단한다.
모세관의 전면은 알루미늄 옥시드 연마지를 사용해 12 ㎛로 둥글게 만들고 난 후에 1 ㎛로 광학 섬유에 의해 둥글게 만든다.
유리는 5분 동안 플라스마 처리를 통해 활성화시킨 후에 밀봉된 페트리 디쉬에 위치된 팁 근처에서 20 ㎕의 1H,1H,2H,2H-퍼플루오로옥틸트리클로로실란의 기상 증착에 의해 실란화된다.
30분의 반응 이후에, 주입 캐뉼라가 준비되며, 시린지 펌프 (Harvard Apparatus)에 의해서 전력이 제공되는, 10 ㎕ 시린지 (Hamilton) 연결된 표준 정위 장치 상에 장착된다. 정위 장치의 주입 팔대부가 또한 동력화된다 (PI).
수술:
다음으로 표준 신경 이식 수술이 래트에 대해 수행된다. 이러한 수술 방법은 하기에 따른 단계를 포함한다:
1) 약물 (케타민) 수면 및 마취를 동물에서 유도시킨다.
2) 동물을 정위 장비를 사용하여 정확하게 위치시킨다.
3) 동물의 두개골을 면도한 후에 베타딘을 처리하고 나서, 수술용 칼로 복개하여 두개골로부터 피부를 제거하고, 그 이후에 미세 드릴을 사용해 두개골 뼈에 창을 형성시켜서, 캐뉼라가 통과될 수 있게 한다. 뇌막은 바로 아래에 노출되는 피막을 손상시키지 않고 조심스럽게 펼친다.
4) 시린지에 연결된 캐뉼라는 정위 장치를 사용하여 그라프트 영역 위에 위치시킨다.
5) 신경 조직 유닛은 전면으로부터 캐뉼라로 로딩한다 (약 80개 캡슐 또는 10,000 내지 800,000개 세포). 그라프트는 캐뉼라 내에서 총 4 ㎕이거나, 또는 4 cm 높이를 나타낸다. 단측으로 래트의 2개 부위에서, 약 1 mm의 거리로 선조체에 주입한다.
6) 캐뉼라는 복측 선조체 내 제1 부위에서 동물의 두개골로 삽입한다. 2 ㎕ 주입 동안, 그라프트에 필요한 공간을 확보하여서, 약 2 mm 만큼 회수 궤적에 배치되도록, 캐뉼라 깊이의 동력화 관리 및 미세유체 펌프 시스템을 사용해 주입과 동시에 캐뉼라를 제거한다.
7) 캐뉼라는 조심스럽게 제거하기 전에 1분 동안 제자리에 남겨둔다.
8) 다음으로 제2 부위에서 동일한 절차를 사용하여 이식한다.
9) 래트의 피부는 베타딘으로 상처를 세정한 후에 봉합한다 (3 내지 5 바늘땀).
이식 결과:
성숙한 인간 뉴런의 이식 과정에 대한 생존 입증으로서, 이식 궤적에서 비브라톰을 사용해 절단된 뇌 절편에 대한 면역세포화학을 통해 이식의 생존 및 이식을 연구하기 위해서 수술 후 1주일에 동물을 희생시킨다.
그라프트 크기 (이식 전에 공지)를 기반으로 추산된 생존은 현탁된 성숙한 도파민작동성 뉴런을 그라프팅하기 위한 방법으로 수득된 2% 생존율과 비교하여, 84% ± 33%를 초과한다 (D. M. Marchionini et al., "Interference with anoikis-induced cell death of dopamine neurons: implications for augmenting embryonic graft survival in a rat model of Parkinson's disease. "J Comp Neurol 464, 172-179 (2003).). 뉴런의 표현형은 보존된다 (티로신 히드록실라제 양성). 또한, 수 밀리미터의 축삭 돌기 프로세스가 명확하여, 뉴런이 래트의 뇌로 즉시 통합되기 시작한다는 것을 시사한다.
2. 파킨슨병의 치료를 위한 뉴런 세포를 포함하는 신경 조직 유닛의 이식
2.1 - 수술 프로토콜
래트 (7/8주령)는 자유식으로 사료 및 식수에 접근하는 12시간 명암 주기로 온도-제어실에서 사육된다.
도 1은 파킨슨 증후군 래트를 수득하기 위해 이들 래트에 대해 수행된 상이한 절차를 요약하며, 이들에게 이후에 본 발명에 따른 신경 조직의 그라프트가 적용될 것이다.
파킨슨 증후군
래트의
준비
동물은 수술 전에 단식시킨다. 식이 보충제를 포함하는 사료, 및 식수는 유지시킨다.
각 동물은 공기 (0.3L/분) + 산소 (0.3L/분) 및 2% 이소플루란의 연속 흐름이 공급되는 마취실에 놓여진다. 자일로카인 (7 mg/kg, s.c.), 보갈 (7.5%, i.m.) 및 부프레노르핀 (0.1 mg/kg, s.c.)이 주사된다. 그 다음으로 동물은 부피-조절 호흡기에 의해 투여되는 이소플루란-기반 마취제로 마취 하에 유지시킨다. 중심 온도는 수술 동안 직장으로 기록된다. 필요하면, 가열 패드를 사용하여 체온을 유지시킨다. 안연고제 (리포산 점안겔)를 각각의 눈에 투여한다. 두개골부터 목까지 털을 잘라낸다. 의식 상실 후에, 동물을 정위 프레임 (Kopf)에 위치시키고 귀 고정기를 사용해 그 머리를 제자리에 고정시킨다.
Legato 101 자동 주입기 (KD scientific)와 결합된 해밀톤 1702N 시린지 (Ga22s/51 mm/PST3)를 사용하여, 래트에게 1 ㎕/분의 속도로 Paxinos and Watson brain atlas에 따라 좌표 - 2.8 mm 전-후방향, 2 mm 측방향 및 8.4 mm 배복방향으로 내측전뇌속 (medial forebrain bundle) (MFB)에 2.5 ㎕의 6-히드록시도파민 (6-OHDA) (Sigma, 멸균 NaCl, 0.9% 중 5 mg/mL)과 0.1%의 아스코르브산의 단측 정위 주입을 통해서 가성-파킨슨 증후군을 발병시킨다 (도 2A).
주입 후에, 바늘은 뇌로부터 서서히 제거되기 전에 5분 동안 제자리에 남겨둔다. 수술 전 30분간, 동물은 노르아드레날린 작동성 시스템을 보호하기 위해서, 0.9%의 NaCl에 용해된 데시프라민 (25 mg/kg, 5 mL/kg)의 주사를 복강내로 (i.p.) 투여받는다.
주입이 완료되면, 피부를 봉합사로 밀봉시킨다. 다음으로 동물이 마취에서 회복될 수 있게 한다.
이식
이식 절차 전반에서 성숙한 뉴런의 미세환경을 보존하는 것은 숙주 뇌로의 접속 및 생존을 가능하게 한다.
래트 그룹 (6-OHDA 캡슐화된 전구체)은 사용 전에 시험관내에서 2주 동안 캡슐화되어 성숙화된 시판되는 뉴런 전구체 세포 (Cellular Dynamics iCell DopaNeurons)를 포함하는 본 발명에 따른 신경 조직 유닛의 그라프트를 받는다.
래트의 제2 그룹 (6-OHDA CNO)은 실험실에서 생성시키고 분류된 CNO (Controlled Neural Organoid)를 포함하는 본 발명에 따른 신경 조직 유닛의 그라프트를 받는다.
CNO 세포를 포함하는 신경 조직 유닛은 하기의 프로토콜에 따라서 다능성 세포 또는 나이브 다능성 세포를 알기네이트에 캡슐화시키고 그들을 뉴런 전구체 세포로 분화시켜 수득되었다:
전체 배양은 37℃에서, 5% CO2, 및 95% 이상의 포화 습도 하에 수행된다.
D0-D3 (0일 내지 3일): N2B27 (500 mL의 배지의 경우: 글루타맥스+ 1 N2 보충제 + 1 B27 보충제 + 0.5 μM LDN-193189 + 10 μM SB431542 + 100 ng/mL Shh (소닉 헤지호그)+ 100 ng/mL FGF-8 (섬유아세포 성장 인자 8) + 2 μM 퍼모파민+ 10 μM 24 (S),25-에폭시콜레스테롤을 갖는 250 mL의 신경기초 배지 + 250 mL의 Dmem F12 배지.
D3-D9: N2B27 + LDN + SB + Shh + FGF-8 + 퍼모파민 + CHIR + 24(S),25-에폭시콜레스테롤
D9-D10: N2B27 + LDN + CHIR + 24(S),25-에폭시콜레스테롤
D10-D15 또는 그 이상: N2B27 + cAMP + AA + GDNF + BDNF + FGF-20 + TGF베타 + 트리코스타틴 + CpE + 24(S),25-에폭시콜레스테롤
표 1: 약어 및 두문자어 목록
표 2: 최종 농도
신경 조직 유닛 (6-OHDA 캡슐화된 전구체 및 6-OHDA CNO)의 주입 이전에, 세포 미소구획의 알기네이트 캡슐은 PBS로 배지를 교체하여 간단히 용해시킨다.
주입 구성은 정위 장비 상에 장착된 시린지 또는 캐뉼라이다. 신경 조직 유닛은 캐뉼라 몸체로 주입 부피 (25 CNO ∼ 1 ㎕)를 유출하여 주입 캐뉼라로 로딩된다.
2 궤적 상의 4개 주입 부위에 주입하기 위해서 (도 2B): 전구체 (그룹 3), 캡슐화된 전구체 (6-OHDA 전구체) 또는 CNO (6-OHDA CNO)를 갖는 4 ㎕가 다음의 좌표에서 선조체에 주입된다: A / P +1.2; M / L -2.6; D / V-5.0 (3 ㎕) 및 -4.0 (3 ㎕); 및 A / P +0.5; M / L -3.0; D / V-5.0 (3 ㎕) 및 -4.0 (3 ㎕); 투쓰 바 -2.4 (Grealish et al., 2014).
수술후
절차
4개 그룹의 래트가 면역약화 래트 (NR 또는 네이키드 래트)로부터 형성된다:
- "모의군": 비병변 래트.
- "6-OHDA": 우반구의 그의 도파민작동성 뉴런이 화학적으로 사멸된 래트, 비이식 (실험 대조군).
- "CNO" 또는 "6-OHDA CNO": 그의 우반구 도파민작동성 뉴런이 화학적으로 사멸되고, 대략 250,000개 세포를 포함하는 본 발명에 따른 신경 조직 유닛이 우측 선조체에 그라프트된 래트.
- "Pro encaps" 또는 "6-OHDA 캡슐화된 전구체": 그의 우반구 도파민작동성 뉴런이 화학적으로 사멸되고, 캡슐에서 2주 동안 성숙된 대략 250,000개의 Cellular Dynamics iDopaneurons 세포를 포함하는 본 발명에 따른 신경 조직 유닛이 우측 선조체에 그라프트된 래트.
각각의 동물은 이의 직립 반사 및 연하 반사를 회복할 때까지 면밀하게 관찰하고 따뜻하게 유지시킨다. 동물은 능숙한 수의학적 지원에 쉽게 접근하는 숙련된 테크니션이 보살핀다.
필요하다면 동물의 임상 관리를 위한 다른 약물을 사용한다. 각각의 투여 약물, 용량, 경로 및 부위는 수술 기록에 기록된다.
수술 절개부는 감염 징후, 염증 및 전신 무결성에 대해서 적어도 1일 1회 (절개부가 치유될 때까지) 모니터링된다. 수행된 모든 관찰 및 결과는 수술 기록에 기록된다. 연구 코디네이터는 임의의 이상을 통지받는다. 연구 모니터는 임의의 이상에 대해서 합리적으로 가능한 빨리 통지해야 한다.
동물의 상태에 대한 모니터링은 1일 2회 (11 am ~ 10 pm) 수행된다.
동물은 공정하고 인도적인 치료 기준에 따라 평가된다. 필요하다면 적절한 수의학적 지원이 제공된다. 지속될 것으로 보이는 심한 통증 또는 고통의 징후를 보이는 임의의 동물은 신속하게 안락사시킨다. 그 이후에 그들은 비정밀 검시를 받는다. 검시 이외에도, 조직학을 위해 뇌를 제거하고 안락사 섹션에 표시된 대로 처치된다. 동물이 폐사된 채로 발견되는 것을 방지하기 위해서 공정하고 인도적인 처치 기준을 적용하는 모든 타당한 노력을 기울인다.
2.2 - 행동 연구
암페타민-유도된 회전 ([ Grealish et al., 2014]를 개조) .
중앙 종뇌 다발에 6-히드록시도파민 (6-OHDA)의 주사 이후에 분 당 5회 회전수 초과의 동물만이 성공적으로 병변을 앓는 것으로 간주되었다. 암페타민의 전신 주사 (2.5 mg/kg, 복강내, Apoteksbolaget) 이후 회전 편향성은 자동화 시스템 (Omnitech Electronics)을 사용하여 기록하였다. 동물 회전은 90분 동안 기록되었고, 오직 완전한 신체 회전만을 계측하고 나서 분 당 순 회전수로 표시하였고, 병변의 측면에 대한 회전 (시계방향)은 긍정적으로 계측된다.
족답
검사
각각의 래트를 편평한 표면 상에 놓고; 이의 뒷발들을 꼬리를 조심스럽게 잡고 들어올려서, 테이블에 닿기 전에 오직 하나의 다리만이 허용되게 한다. 실험자가 규칙적인 속도로 1 미터 뒤로 래트를 당긴다. 대측 및 동측으로 앞에서 앞발의 적응 운동은 그들의 개별적인 경로와 독립적으로 계측된다. 데이타는 대측 / (대측 + 동측) 비율을 계산하여 발을 사용한 적응 운동의 백분율로서 표시될 것이다.
실린더 검사
실린더 검사는 각각의 동물을 유리 실린더에 위치시키고, 동측 및 대측 발의 5분간의 실린더 벽 상에서의 접촉수를 계측하여 수행되고, 그 결과는 최대 20회 접촉에 대해서, 대측 / (대측 + 동측) 비율을 계산하여 표시된다.
"오픈 필드"
악티미터
자발적 일반운동 활성도는 광전 악티미터를 사용해 측정된다 (Actitrack, Panlab, S.L., Barcelona, Spain). 장치는 광전 셀에 접속된 투명 케이지로 이루어진다. 광빔은 움직임을 검출하고, 각각의 래트의 수평 이동 검출의 총 횟수는 2회의 연속 10분 세션 동안 날마다 기록된다. 모든 악티미터 검사는 8:00 am 과 1:00 pm 사이에 격리실에서 수행된다. 처음 3-일 기간은 습관화를 가능하게 한다. 4일차는 검사일로서 간주된다. 처음 10분-세션은 매일의 습관화로 간주된다. 제2의 10-분 세션 동안 기록된 일반행동 활성도만이 데이타 분석에 사용된다.
2.3 - 사후 연구 평가 - 조직학적 분석
실험의 종료 이후에, 래트는 4% 파라포름알데히드의 심장내 주입을 통해 희생시키고, 뇌를 수집하여, -45℃에서 이소펜탄 중에 냉동시키고 -80℃에 저장한다. 주입된 뇌는 크라이오스태트를 사용하여 50 ㎛의 관상면 절편으로 절단한다.
도파민작동성
(DA) 병변의 검증
중추 신경계에서 DA 세포의 상실 및 선조체에서 DA 섬유의 상실은 상기에 기술된 바와 같이 티로신 히드록실라제 (TH)의 면역조직화학으로 검증된다 (Bouali-Benazzouz et al., 2009). 티로신 히드록실라제 (TH) 면역반응성 세포의 수는 Mercator Pro 소프트웨어 (ExploraNova, version 7.9.8)와 Leica DM6000B 현미경을 사용하여 광학 분획 방법을 적용하여 수득된다.
그라프트의
검증
래트 뇌 절개부 및 CNO에 대해 그라프트의 세포 생존, 가능한 증식 및 표현형 성숙화 (인간 세포질 마커 (HCM)를 사용하여 확인됨)를 분석하기 위한 항체를 사용하는 면역조직화학 어세이를 수행하고 통상의 DA 마커 (TH, DAT, FOXA2), 범-뉴런 마커 (MAP2, NeuN), 세로토닌 (FOXG1), 증식성 마커 Ki-67 / PCNA 및 신경교 마커 (인간-특이적 GFAP)에 의해 특징규명한다.
뉴런 생존 검사
6마리 CNO 래트는 이식 이후에 뉴런 생존을 평가하기 위해서 이식 후 6일에 희생시켰다.
결과
행동 연구의 결과
전구체 그라프트에 대해 문헌 (Kriks et al. 2011, Grealish et al. 2014, Kirkeby et al. 2017, Doi et al. 2014)에서 입증된 소수의 효과가 약 20주 이후에 행동 개선을 보여주는데 반해, 행동 교정이 족답 검사 (도 4B) 및 실린더 검사 (도 4A)의 경우 4 내지 6주에, 그리고 로타미터 검사 (도 4C)의 경우 2주에 얻어지므로, 행동 연구는 그라프트된 래트 (6Pro-encaps 및 CNO)에서 본 발명에 따른 그라프트의 매우 긍정적인 효과를 보인다.
예상한 대로, 본 발명에 따른 이식은, 다른 한편으로, 불안 결과에 대한 효과를 갖지 않는다 (도 4D).
조직학적 결과
2개의 CNO 및 Pro-encaps 그룹에서 수행된 그라프트의 조직학적 분석은 그라프트에서 10 내지 15% TH 뉴런의 존재를 보여준다. 비교를 위해서, 이전에 공개된 실험은 전구체 이식 이후에 TH 뉴런 수준을 약 5% (Kirkeby et al. 2017) 또는 6% (Kriks et al. 2011)로 설명하고 있다.
뉴론 생존 분석은 이식 6일 이후에, 다수-밀리미터 축삭 돌기 돌출이 CNO 래트의 뇌에서 관찰되어 (도 3), 본 발명에 따른 이식 후에 상당한 뉴런의 생존이 확증된다는 것을 보여준다.
Claims (20)
- 인간 또는 비-인간 포유동물의 신경계로의 이식에 사용을 위한 신경 조직 유닛으로서, 상기 신경 조직 유닛은 세포외 매트릭스 내에 분화된 유사분열후 뉴런 세포를 함유하고, 상기 유닛은 단일 신경 조직 유닛을 둘러싼 히드로겔 캡슐을 포함하는 세포 미소구획으로부터 수득되고, 상기 히드로겔 캡슐은 상기 신경 조직 유닛의 사용 이전에 적어도 부분적으로 제거되는 것인 신경 조직 유닛.
- 제 1 항에 있어서, 상기 신경 조직 유닛은 히드로겔이 없는 것인 신경 조직 유닛.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 신경 세포는 바람직하게 10%를 더하거나 또는 뺀 50 ㎛ 내지 500 ㎛, 우선적으로 10%를 더하거나 또는 뺀 150 ㎛ 내지 400 ㎛, 보다 더 우선적으로 10%를 더하거나 또는 뺀 200 ㎛ 내지 300 ㎛의 최소 치수를 갖는, 신경 세포의 클러스터를 형성하는 것인 신경 조직 유닛.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경 세포 유닛은 신경 세포 및 신경아교 세포를 포함하는 것인 신경 조직 유닛.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유닛은 10 내지 100%, 우선적으로 50 내지 100%, 보다 우선적으로 90% 초과의, 관심 표현형(들)의 유사분열후 뉴런 세포를 포함하는 것인 신경 조직 유닛.
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유닛은 100 내지 100,000개의 신경 세포를 함유하는 것인 신경 조직 유닛.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 신경퇴행성 질환, 예컨대 파킨슨병, 헌팅톤병, 근위축성 측색 경화증 (ALS), 알츠하이머병 또는 뉴런 세로이드-리포푸신증 예컨대 바텐병의 치료를 위한 것인 신경 조직 유닛.
- 제 7 항에 있어서, 상기 신경 조직 유닛은 유리하게는 파킨슨병의 치료를 위해서, 도파민작동성 뉴런을 함유하는 것인 신경 조직 유닛.
- 제 7 항에 있어서, 상기 신경 조직 유닛은 헌팅톤병의 치료를 위해서, GABA 작동성 뉴런을 함유하는 것인 신경 조직 유닛.
- 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경 조직 유닛은 유전자 변형된 신경 세포를 함유하는 것인 신경 조직 유닛.
- 제 10 항에 있어서, 인지 및/또는 동작 기능을 보조하거나, 개선시키거나 또는 회복시키기 위한 것인 신경 조직 유닛.
- 대상체의 신경계로 이식되도록 의도되는 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 신경 조직 유닛의 제조 방법으로서, 상기 방법은
(1) 유리하게는 신경 조직 유닛을 수용하도록 의도되는 포유동물과 면역-적합성인, 신경 세포로 분화될 수 있는 인간 또는 비-인간 포유동물 세포 및 세포외 매트릭스를 히드로겔 캡슐 내에 포함하는 세포 미소구획을 생성시키는 단계;
(2) 적어도 하나의 관심 표현형을 갖는 유사분열후 뉴런 세포를 수득하기 위해서, 세포 미소구획 내에서 세포 분화를 유도시키는 단계;
(3) 신경 조직 유닛으로서 뉴런 세포를 회수하기 위해서 히드로겔 캡슐을 적어도 부분적으로 제거시키는 단계
로 이루어진 단계를 포함하는 것인 제조 방법. - 제 12 항에 있어서,
(4) 적어도 하나의 신경 조직 유닛, 우선적으로 적어도 10개 내지 1000개의 신경 조직 유닛, 보다 우선적으로 10 내지 100개 유닛을 수술용 이식 장치에 로딩시키는 단계
로 이루어진 추가 단계를 포함하는 것인 신경 조직 유닛의 제조 방법. - 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서,
- 히드로겔 캡슐의 적어도 부분적인 제거 이전 또는 이후에, 조직 유닛으로서 신경 세포를 냉동시키는 단계
로 이루어진 추가 단계를 포함하는 것인 신경 조직 유닛의 제조 방법. - 제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (1)에서 사용되는 세포는 신경 조직 유닛을 이식시키려는 인간 또는 비-인간 포유동물로부터 이전에 수집된 것인 신경 조직 유닛의 제조 방법.
- 제 12 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
- 단계 (2)의 세포 분화 이후에, 히드로겔 캡슐 내에 함유된 신경 세포의 표현형을 확인하는 단계
로 이루어진 중간 단계를 포함하는 것인 신경 조직 유닛의 제조 방법. - 제 12 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 도파민 작동성 세포 또는 GABA 작동성 세포로 분화되는 것인 신경 조직 유닛의 제조 방법.
- 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 신경 조직 유닛을 봉입시킨 적어도 하나의 히드로겔 캡슐을 포함하는 적어도 하나의 세포 미소구획, 및 히드로겔 캡슐의 적어도 부분적인 제거를 위한 수단을 포함하는 신경 조직 유닛 이식 키트.
- 제 18 항에 있어서, 포유동물의 신경계로 신경 조직 유닛을 이식시킬 수 있는 수술용 이식 장치를 더 포함하는 것인 신경 조직 유닛 이식 키트.
- 포유동물의 신경계에 신경 조직 유닛(들)을 이식시키도록 적합화된 수술용 이식 장치에서 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 신경 조직 유닛, 우선적으로 1 내지 10,000개, 보다 우선적으로 10 내지 1,000개의 신경 조직 유닛을 포함하는 신경 조직 유닛 이식 키트.
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