ES2898837T3 - Unidad de tejido neural y uso de dicha unidad para la implantación en el sistema nervioso de un mamífero - Google Patents

Abstract

Unidad de tejido neural para su uso en terapia celular para una implantación en el sistema nervioso de un mamífero humano o no humano, en el que dicha unidad de tejido neural contiene células neuronales posmitóticas diferenciadas que tienen un fenotipo de interés correspondiente al fenotipo de las células defectuosas. a reemplazar, y de células gliales, dichas células están organizadas en una red tridimensional en una matriz extracelular, dicha unidad se obtiene de un microcompartimento celular que comprende una cápsula de hidrogel que rodea una única unidad de tejido neural, dichas células neuronales posmitóticas diferenciadas que se han obtenido a partir de células de mamíferos humanos o no humanos diferenciadas en células neuronales posmitóticas dentro de dicha cápsula de hidrogel y dicha cápsula de hidrogel se retira al menos parcialmente antes del uso de la unidad de tejido neural.

Description

DESCRIPCIÓN

Unidad de tejido neural y uso de dicha unidad para la implantación en el sistema nervioso de un mamífero

La invención se define en las reivindicaciones.

La invención se refiere a una unidad de tejido neural, que comprende una pluralidad de células neuronales posmitóticas y células gliales, organizadas en una red tridimensional (3D) en una matriz extracelular, y al uso de las mismas como una unidad para implantarse en el sistema nervioso de un mamífero. Tal unidad de tejido neural puede usarse en particular para trasplantar células neuronales que tienen un fenotipo de interés en el sistema nervioso de un sujeto, con el fin de tratar una enfermedad neurodegenerativa.

Durante las últimas décadas, las enfermedades neurodegenerativas han sido un gran desafío social, tanto en términos de comprensión de los fenómenos biológicos involucrados como en términos de tratamiento. Cada vez más personas se ven afectadas por estas enfermedades, con consecuencias dramáticas para el paciente y sus familiares y amigos.

El término genérico “enfermedad neurodegenerativa” cubre un gran número de enfermedades, caracterizadas principalmente por una muerte neuronal más rápida que en el envejecimiento normal, que incluye la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington, la esclerosis lateral amiotrófica, etc. El sistema nervioso puede afectarse de diversas formas, lo que da lugar a una variedad de síntomas que incluyen trastornos motores, del equilibrio, conductuales y/o cognitivos.

En la actualidad, las causas y los mecanismos de las enfermedades neurodegenerativas a menudo no se conocen bien, lo que hace que sus tratamientos sean incluso más complejos. Actualmente no existe un tratamiento convincente para curar estas enfermedades.

En los últimos años, las prioridades de desarrollo se han centrado en la terapia celular intracerebral y, más particularmente, en el trasplante de neuronas en las áreas dañadas del cerebro de personas que padecen enfermedades neurodegenerativas. El objetivo de estos trasplantes es reemplazar permanentemente las neuronas destruidas por la enfermedad. Así, se han realizado con éxito trasplantes localizados de células o tejidos embrionarios en varios pacientes con enfermedad de Parkinson. Sin embargo, este enfoque implica el uso de tejido de fetos abortados, lo que plantea problemas éticos y logísticos. Además, muchos laboratorios han recurrido a las células madre humanas pluripotentes inducidas (hIPS) como una posible fuente alternativa de células humanas de alta calidad. La diferenciación efectiva de las células hIPS en neuronas que tienen el fenotipo necesario para reemplazar las neuronas perdidas por los pacientes es un área de investigación muy activa. Sin embargo, las neuronas son células muy frágiles. La inyección de una suspensión de neuronas generalmente da como resultado la muerte de más del 98 % de dichas neuronas por anoikis. Alternativamente, se ha considerado el trasplante de progenitores neuronales, que se sabe que son menos frágiles que las neuronas. Esta solución tampoco es satisfactoria. La diferenciación celular de los progenitores neuronales después de la implantación no está controlada y no es seguro que las células implantadas se diferencien adecuadamente y/o en el tipo neuronal deseado.

Por tanto, existe la necesidad de un sistema de implantación de células neuronales para mejorar la supervivencia de las células implantadas, en particular para reemplazar permanentemente las neuronas alteradas en un paciente con una enfermedad neurodegenerativa.

Resumen de la invención

Mientras trabajaban en el cultivo tridimensional (3D) de células, los inventores descubrieron que es posible mejorar la tasa de supervivencia cuando se manipulan células particularmente frágiles, como las neuronas, si se cultivan y manipulan no como suspensiones celulares, sino como redes celulares tridimensionales. Así, han desarrollado una unidad de tejido neural que comprende células neuronales que tienen un fenotipo de interés, que pueden inyectarse en el sistema nervioso de un paciente, con el fin de integrar en él dichas células neuronales con una tasa de supervivencia muy superior a la obtenida al inyectar una suspensión celular neuronal. La unidad de células neuronales desarrollada comprende células neuronales que están preorganizadas en una red 3D e incluidas en una matriz extracelular, lo cual promueve la integración y la supervivencia de las células en el sistema nervioso después de la inyección. Las células neurales se transfieren al sistema nervioso del hospedero mientras se mantiene la integridad de su entorno local, en particular las interacciones entre las células y con la matriz extracelular desarrollada dentro de la unidad de tejido neural. Además, la unidad de tejido neural de acuerdo con la invención comprende células neuronales posmitóticas cuyo grado de diferenciación puede controlarse perfectamente, al limitar el riesgo de introducir tipos celulares no deseados, responsables en particular del desarrollo de teratomas y crecimientos tumorales. Curiosamente, se encontró que la unidad de tejido neural de acuerdo con la invención es capaz de proyectar axones hacia el tejido del hospedero, lo que promueve una buena integración de las células en dicho tejido del hospedero y produce un beneficio funcional definido.

Así, la invención se refiere a una unidad de tejido neural para su uso en terapia celular para una implantación en el sistema nervioso de un mamífero humano o no humano, dicha unidad de tejido neural contiene células neuronales posmitóticas diferenciadas que tienen un fenotipo de interés correspondiente al fenotipo. de las células defectuosas a reemplazar, y las células gliales, que están organizadas en una red tridimensional en una matriz extracelular, dicha unidad se obtiene a partir de un microcompartimento celular que comprende una cápsula de hidrogel que rodea una única unidad de tejido neural, dichas células neuronales posmitóticas diferenciadas se obtienen a partir de células de mamíferos humanos o no humanos diferenciadas en células neuronales posmitóticas dentro de dicha cápsula de hidrogel y dicha cápsula de hidrogel se retira al menos parcialmente antes del uso de la unidad de tejido neural. Así, la invención se refiere a una unidad de tejido neural para su uso en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa mediante la implantación, en el sistema nervioso de un mamífero humano o no humano con una enfermedad neurodegenerativa, de al menos una unidad de tejido neural que contiene células neuronales posmitóticas diferenciadas en una matriz extracelular, dicha unidad se obtiene de un microcompartimento celular que comprende una cápsula de hidrogel que rodea dicha unidad de tejido neural, y dicha cápsula de hidrogel se extrae al menos parcialmente antes de la implantación de la unidad de tejido neural.

En particular, la invención se refiere a una unidad de tejido neural para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson mediante la implantación, en el sistema nervioso de un mamífero humano o no humano con enfermedad de Parkinson, de al menos una unidad neural que contiene células neuronales posmitóticas diferenciadas en neuronas dopaminérgicas en una matriz extracelular, dicha unidad se obtiene a partir de un microcompartimento celular que comprende una cápsula de hidrogel que rodea dicha unidad de tejido neural, y dicha cápsula de hidrogel se extrae al menos parcialmente antes de la implantación de la unidad de tejido neural.

La invención también se refiere a un procedimiento para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, de acuerdo con el cual al menos una unidad de tejido neural que contiene células neuronales posmitóticas diferenciadas en neuronas dopaminérgicas en una matriz extracelular se implanta en el sistema nervioso de un paciente con enfermedad de Parkinson, dicha unidad se obtiene a partir de un microcompartimento celular que comprende una cápsula de hidrogel que rodea dicha unidad de tejido neural, y dicha cápsula de hidrogel se retira al menos parcialmente antes de la implantación de la unidad de tejido neural.

La invención también se refiere a una unidad de tejido neural para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Huntington mediante la implantación, en el sistema nervioso de un mamífero humano o no humano con enfermedad de Huntington, de al menos una unidad de tejido neural que contiene células neuronales posmitóticas diferenciadas en neuronas GABAérgicas en una matriz extracelular, dicha unidad se obtiene a partir de un microcompartimento celular que comprende una cápsula de hidrogel que rodea dicha unidad de tejido neural, y dicha cápsula de hidrogel se extrae al menos parcialmente antes de la implantación de la unidad de tejido neural.

La invención también se refiere a un procedimiento para el tratamiento de la enfermedad de Huntington, de acuerdo con el cual al menos una unidad de tejido neural que contiene células neuronales posmitóticas diferenciadas en neuronas GABAérgicas en una matriz extracelular se implanta en el sistema nervioso de un paciente con enfermedad de Huntington, dicha unidad se obtiene de un microcompartimento celular que comprende una cápsula de hidrogel que rodea dicha unidad de tejido neural, y dicha cápsula de hidrogel se retira al menos parcialmente antes de la implantación de la unidad de tejido neural.

De manera similar, la solicitud divulga una unidad de tejido neural para su uso en la implantación en el sistema nervioso de un mamífero humano o no humano, dicha unidad de tejido neural contiene neuronas modificadas genéticamente. Dichas unidades de tejido neural pueden usarse en particular para ayudar, mejorar o reparar una función cognitiva y/o de acción en un mamífero humano o no humano.

La invención también se refiere a un procedimiento para preparar dicha unidad de tejido neural, destinada a implantarse en el sistema nervioso de un mamífero humano o no humano, dicho procedimiento comprende las etapas que consisten en:

(1) producir microcompartimentos celulares que comprenden, dentro de una cápsula de hidrogel, matriz extracelular y células de mamíferos humanos o no humanos capaces de diferenciarse en células neurales, ventajosamente inmunocompatibles con el mamífero destinado a recibir la unidad de tejido neural;

(2) inducir la diferenciación celular dentro del microcompartimento celular, para obtener células neuronales posmitóticas que tienen al menos un fenotipo de interés;

(3) retirar al menos parcialmente la cápsula de hidrogel con el fin de recuperar las células neuronales como una unidad de tejido neural.

La invención también se refiere a un kit de implantación de la unidad de tejido neural que comprende al menos un microcompartimento celular que comprende al menos una cápsula de hidrogel que envuelve una unidad de tejido neural de acuerdo con la invención, y medios para la extracción al menos parcial de la cápsula de hidrogel.

La invención también se refiere a un kit de implantación de unidades de tejido neural que comprende al menos una unidad de tejido neural de acuerdo con la invención, preferentemente entre 10 y 100 y hasta 1000, dichas unidades de tejido neural se cargan en un dispositivo quirúrgico de implantación capaz de implantar las unidades del tejido neural en el sistema nervioso de un mamífero.

Descripción de las figuras

La Figura 1 es una representación esquemática del protocolo para la preparación de diferentes ratas convertidas en parkinsonianas, ya sean tratadas o no mediante inyección de tejido neural de acuerdo con la invención. Simulados: ratas de control; 6-OHDA: ratas convertidas en parkinsonianas (control negativo); progenitor encapsulado de 6-OHDA (o Pro encaps): ratas convertidas en parkinsonianas que han recibido unidades de tejido neural de acuerdo con la invención, a partir de microcompartimentos celulares en los cuales se han encapsulado células progenitoras neuronales comerciales; 6-OHDA CNO (Organoides Neurales Controlados): ratas convertidas en parkinsonianas que han recibido unidades de tejido neural (que en este ejemplo corresponden a CNO) de acuerdo con la invención, a partir de microcompartimentos celulares en los cuales se han encapsulado células pluripotentes antes de diferenciarse en neuronas, incluidas las neuronas dopaminérgicas;

Las Figuras 2A y 2B representan el protocolo de lesión (2A) y trasplante (2B) aplicado para obtener ratas parkinsonianas y trasplantar los tejidos neuronales de acuerdo con la invención;

La Figura 3 es una micrografía que muestra las proyecciones axonales multimilimétricas de neuronas humanas 6 días después del trasplante de una unidad neural implantable de acuerdo con la invención (en este ejemplo del tipo CNO) en el sistema nervioso central de una rata convertida en parkinsoniana (6-OHDA CNO). Ésta es una imagen confocal de una sección del cuerpo estriado de rata en el área de trasplante, fijada, congelada y cortada con un criostato, revelada por histoquímica con un anticuerpo contra el citoplasma humano (HCM);

Las Figuras 4A-E muestran los resultados obtenidos para las pruebas de conducta realizadas en ratas convertidas en parkinsonianas que han recibido o no un trasplante de unidad de tejido neural de acuerdo con la invención. (4A) prueba del cilindro; (4B) prueba de pasos; (4C) prueba de rotámetro; (4D) prueba de ansiedad. Descripción detallada

La presente invención divulga un procedimiento para la implantación, o trasplante, en el sistema nervioso de un mamífero, de una unidad de tejido neural en la cual las células neurales están organizadas en una red 3D. El trasplante de células neurales en forma de bolas densas promueve su implantación e integración en el sistema nervioso del hospedero. El procedimiento de implantación de acuerdo con la invención, y más generalmente la unidad de tejido neural desarrollada de acuerdo con la invención, está destinada para su uso en un mamífero humano o no humano, y con mayor preferencia en un sujeto humano.

Unidad de tejido neural

La invención proporciona el uso, en lugar de una suspensión de células neuronales, una unidad de tejido neural, para su implantación en el sistema nervioso de un sujeto, con el fin de tratar todo tipo de enfermedades neurodegenerativas y/o para ayudar, mejorar, reparar una función o acción cognitiva en dicho sujeto.

De acuerdo con la invención, la unidad de tejido neural a implantar comprende ventajosamente neuronas posmitóticas diferenciadas y células gliales, tales como astrocitos y/u oligodendrocitos en una matriz extracelular. Las neuronas "posmitóticas" son células neuronales que han perdido la capacidad de dividirse. Las neuronas contenidas en el microcompartimento se diferencian en el sentido de que tienen un fenotipo particular.

De acuerdo con la invención, la cápsula de hidrogel que rodea la unidad de tejido neural se retira al menos parcialmente antes de la implantación en el sistema nervioso del sujeto.

En el contexto de la invención, la "cápsula de hidrogel" se refiere a una estructura tridimensional formada a partir de una matriz de cadenas poliméricas hinchadas por un líquido, preferentemente agua. Ventajosamente, el hidrogel usado es biocompatible, en el sentido de que no es tóxico para las células. Además, la cápsula de hidrogel tiene que permitir la difusión de oxígeno y nutrientes para alimentar las células contenidas en el microcompartimento y permitirles sobrevivir. Por ejemplo, la cápsula de hidrogel contiene alginato. Preferentemente, la cápsula contiene solo alginato. En el contexto de la invención, "alginato" se refiere a polisacáridos lineales formados a partir de p-D-manuronato y a-L-guluronato, sales y derivados de los mismos. Ventajosamente, el alginato es un alginato de sodio, compuesto por 80 % de a-L-guluronato y 20 % de p-D-manuronato, con una masa molecular promedio de 100 a 400 KDa (por ejemplo, PRONOVA™ SLG100) y una concentración total comprendida entre 0,5 % y 5 % en peso.

La cápsula de hidrogel, en el momento en que se prepara la unidad de tejido neural, protege a las células del entorno externo al tiempo que permite su diferenciación controlada en uno o más tipos neuronales de interés. De acuerdo con la invención, una cápsula de hidrogel rodea una única unidad de tejido neural. Así, cada unidad de tejido neural está rodeada individualmente por una cápsula de hidrogel. Una vez que se han obtenido uno o más tipos de células deseados y el tamaño del tejido neural en la cápsula es suficiente, dicha cápsula se retira al menos parcialmente. "Retirada al menos parcialmente" significa que la cápsula de hidrogel se hidroliza, disuelve, perfora o rompe al menos parcialmente para permitir que al menos los axones de al menos algunas células neurales de dicha unidad salgan de la cápsula. Puede usarse cualquier medio biocompatible, es decir, que no sea tóxico para las células, que permita la hidrólisis, disolución, perforación y/o al menos la ruptura parcial de la cápsula de hidrogel. Por ejemplo, es posible usar tampón fosfato salino, un quelante de iones divalentes, una enzima como alginato liasa, microdisección láser, perlas solubles integradas en el hidrogel, etc.

Ventajosamente, la cápsula se retira por completo, y la unidad de tejido neural destinada a ser implantada en el sistema nervioso de un sujeto queda así desprovista de hidrogel.

Preferentemente, la capa de matriz extracelular de la unidad de tejido neural forma un gel. La capa de matriz extracelular comprende una mezcla de proteínas y compuestos extracelulares necesarios para el cultivo celular, y más particularmente para el cultivo de células neurales. Preferentemente, la matriz extracelular comprende proteínas estructurales, tales como lamininas que contienen subunidades a l o a4 o a5 y p1 o p2 y y1 o y3, entactina, vitronectina, colágeno, así como factores de crecimiento tales como TGF-beta y/o eGf . En una realización, la capa de matriz extracelular consiste en, o contiene, Matrigel® y/o Geltrex®.

La unidad de tejido neural de acuerdo con la invención tiene la ventaja de contener células neurales organizadas en una red 3D en la cual ya existen interacciones entre células y matriz extracelular.

Ventajosamente, las células neurales de la unidad de tejido neural forman un grupo de células neurales, en particular de forma ovoide, tubular o esférica, preferentemente con una dimensión mínima comprendida entre 10 pm y 1000 pm más menos 10 %, con mayor preferencia entre 150 pm y 400 pm más menos 10 %, incluso con mayor preferencia entre 200 pm y 300 pm más menos 10%. Estas dimensiones son particularmente favorables para la supervivencia de las neuronas dentro de la unidad de tejido neural y optimizan la reorganización y vascularización del trasplante después del implante. “Dimensión más pequeña” significa la distancia mínima entre dos puntos a cada lado del grupo de células.

Preferentemente, la unidad de tejido neural de acuerdo con la invención contiene de 100 a 100000 células neurales. Dentro del tejido neural, las células neuronales tienen ventajosamente uno o más fenotipos de interés, seleccionados de acuerdo con el uso al que se destina dicha unidad de tejido neural. De acuerdo con la invención, la unidad de tejido neural implantada comprende células neuronales diferenciadas de acuerdo con uno o más fenotipos seleccionados y controlados. Preferentemente, la unidad de tejido neural comprende entre el 10 y el 100% de células neuronales posmitóticas del fenotipo o fenotipos de interés, con mayor preferencia entre el 50 y el 100 %, incluso con mayor preferencia más del 90 %. Las otras células presentes en la unidad de tejido neural pueden ser en particular células gliales y/o células neuronales posmitóticas cuyo fenotipo es diferente del fenotipo de interés. Ventajosamente, la unidad de tejido neural consta en gran medida de células neuronales posmitóticas que tienen el mismo fenotipo.

El fenotipo de interés de las células neuronales posmitóticas depende del destino de dicha unidad. Así, en el caso de uso en terapia celular, el fenotipo de las neuronas corresponde ventajosamente al fenotipo de las células defectuosas a reemplazar.

La unidad de tejido neural de acuerdo con la invención puede usarse ventajosamente en terapia celular, para el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa, como la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington, la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la enfermedad de Alzheimer o las lipofuscinosis ceroides neuronales, como la enfermedad de Batten.

Así, para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, la unidad de tejido neural contiene ventajosamente neuronas dopaminérgicas. Preferentemente, las neuronas posmitóticas contenidas en dicha unidad de tejido neural son en gran parte neuronas dopaminérgicas.

En el contexto de la invención, "en gran parte" significa al menos el 90 % de las células, preferentemente al menos el 95 %, incluso con mayor preferencia al menos el 99 %.

Para el tratamiento de la enfermedad de Huntington, la unidad de tejido neural contiene ventajosamente neuronas GABAérgicas. Preferentemente, las neuronas posmitóticas contenidas en dicha unidad de tejido neural son en gran parte neuronas GABAérgicas.

La unidad de tejido neural de acuerdo con la invención también puede contener células neurales modificadas genéticamente. Así, es posible implantar, en el sistema nervioso de un sujeto, células neurales en las cuales se ha inhibido o aumentado la expresión de uno o más genes. También es posible implantar células neurales en las cuales se ha introducido un gen heterólogo, para introducir en el sistema nervioso una función que normalmente está ausente.

Tal unidad de tejido neural, que contiene células genéticamente modificadas, es de particular interés para ayudar, mejorar o reparar una función cognitiva y/o de acción, tal como una función cognitiva y/o de acción defectuosa o insuficiente en el sujeto en consideración.

Por ejemplo, en el tratamiento de la enfermedad de Huntington, cuya causa genética se conoce (expansión de las repeticiones del triplete CAG dentro del gen que codifica la huntingtina), es posible extraer células del paciente para preparar unidades de tejido neural de acuerdo con la invención, que comprenden neuronas GABAérgicas en las cuales se ha corregido el gen deficiente, antes de realizar un autotrasplante de dichas unidades de tejido neural. Para los pacientes con enfermedad de Parkinson, es posible preparar unidades de tejido neural que comprendan neuronas dopaminérgicas modificadas para expresar canales sensibles a la luz, como los canales de rodopsina, para controlar la actividad del tejido neural trasplantado mediante iluminación simple, de una manera similar a la estimulación profunda del cerebro, pero menos invasiva. Generalmente, controlar la actividad del tejido neural trasplantado, en particular mediante la expresión de canales sensibles a la luz, puede ser beneficioso para todas las aplicaciones potenciales.

Kits de implantación de unidades de tejido neural

La invención también proporciona un kit de implantación de unidad de tejido neural que comprende al menos un microcompartimento celular que comprende una cápsula de hidrogel que envuelve una unidad de tejido neural de acuerdo con la invención, y medios para la eliminación al menos parcial de la cápsula de hidrogel (hidrólisis, disolución, perforación y/o ruptura).

El médico que necesite utilizar la unidad de tejido neural de acuerdo con la invención puede así, en el momento del uso y de acuerdo con la necesidad, retirar al menos parcialmente la cápsula de hidrogel para obtener la unidad o unidades de tejido neural listas para su implantación en el sistema nervioso del sujeto.

Además, el kit de implantación de acuerdo con la invención también puede contener un dispositivo de implantación quirúrgico capaz de implantar una unidad de tejido neural en el sistema nervioso de un mamífero.

La invención también proporciona un kit de implantación de unidad de tejido neural que comprende al menos una unidad de tejido neural de acuerdo con la invención, preferentemente entre 1 y 10000, más preferentemente entre 10 y 1000 unidades de tejido neural cargadas en un dispositivo de implantación quirúrgico capaz de implantar la o las unidades de tejido neural en el sistema nervioso de un mamífero. Ventajosamente, la cantidad de unidades de tejido neural implantadas depende del tamaño del cerebro hospedero y de la aplicación.

Las unidades de tejido neural pueden opcionalmente congelarse antes de introducirse en el dispositivo de implantación quirúrgica y/o congelarse al mismo tiempo que el dispositivo de implantación quirúrgica. Por supuesto, entonces es necesaria una etapa de descongelación antes de que las unidades de tejido neural se implanten en el sistema nervioso del sujeto.

Procedimiento de preparación

La invención también se refiere a un procedimiento para preparar unidades de tejido neural capaces de implantarse en el sistema nervioso de un mamífero. Más específicamente, la invención proporciona la producción de unidades de tejido neural que contienen células neuronales posmitóticas cuyo fenotipo o fenotipos dependen del uso para el que están destinadas dichas unidades. De acuerdo con la invención, es posible producir microcompartimentos celulares que comprenden una cápsula de hidrogel que rodea las células neurales, en particular a partir de células de mamífero diferenciadas que se reprograman antes o después de la encapsulación y luego se diferencian en uno o más tipos neurales dentro de la cápsula de hidrogel. Luego, la cápsula se retira al menos parcialmente para permitir que las células neurales se implanten en el tejido del hospedero después del trasplante.

Generalmente, el procedimiento para preparar dicha unidad de tejido neural, destinada a implantarse en el sistema nervioso de un mamífero humano o no humano, de acuerdo con la invención comprende las etapas que consisten en:

(1) producir microcompartimentos celulares que comprenden, dentro de una cápsula de hidrogel, matriz extracelular y células de mamíferos humanos o no humanos capaces de diferenciarse en células neurales, ventajosamente inmunocompatibles con el mamífero destinado a recibir la unidad de tejido neural;

(2) inducir la diferenciación celular dentro del microcompartimento celular, para obtener células neuronales posmitóticas que tienen al menos un fenotipo de interés;

(3) retirar al menos parcialmente la cápsula de hidrogel con el fin de recuperar las células neurales como una unidad de tejido neural.

Puede usarse cualquier procedimiento para producir microcompartimentos celulares que contengan, dentro de una cápsula de hidrogel, matriz extracelular y células capaces de dar lugar a células neurales. En particular, es posible preparar microcompartimentos mediante el uso del dispositivo de microfluidos que se describe en Alessandri y otros, 2016 (“A 3D printed microfluidic device for production of functionalized hydrogel microcapsules for culture and differentiation of human Neuronal Stem Cells (hNSC),” Lab on a Chip, 2016, vol. 16, núm. 9, págs. 1593-1604).

En una realización particular, las células encapsuladas son células madre pluripotentes, tales como células madre pluripotentes inducidas (IPS) o células madre embrionarias (ES). En el contexto de la invención, las "células madre pluripotentes inducidas" (células IPS) se definen como células madre pluripotentes obtenidas por reprogramación genética de células somáticas diferenciadas y que tienen una morfología y potencial de autorrenovación y pluripotencia parcialmente similares a las de las células madre embrionarias. Estas células son notablemente positivas para los marcadores de pluripotencia, como la tinción con fosfatasa alcalina y la expresión de las proteínas NANOG, SOX2, OCT4 y SSEA3/4. Los procedimientos para obtener células madre pluripotentes inducidas son bien conocidos por un experto en la técnica y se describen en particular en artículos de Yu y otros (Science, 2007, 318 (5858): 1917-1920), Takahashi y otros (Cell, 2007, 131(5): 861-872) y Nakagawa y otros (Nat Biotechnol, 2008, 26(1): 101-106). En el caso de las células madre embrionarias, dichas células madre pluripotentes son células que se derivan de la masa celular interna del blastocisto y que tienen la capacidad de conducir a la formación de todos los tejidos del organismo. La pluripotencia de las células madre embrionarias puede evaluarse por la presencia de marcadores como los factores de transcripción OCT4 y NANOG y marcadores de superficie como SSEA3/4, Tra-1-60 y Tra-1-81. Las células madre embrionarias pueden obtenerse sin destruir el embrión del que se originan, por ejemplo, mediante el uso de la técnica descrita por Chung y otros. (Cell Stem Cell, 2008, 2 (2): 113-117). En una realización particular, y por razones legales o éticas, las células madre se definen como que excluyen las células madre embrionarias humanas.

Alternativamente, es posible encapsular células progenitoras neurales, es decir, células madre que ya participan en la diferenciación celular en células neurales. En otra realización, es posible encapsular células diferenciadas, que se verán obligadas a diferenciarse en células neurales mediante transdiferenciación. También es posible encapsular células capaces de formar células gliales, como las células somáticas.

En otra realización, es posible usar células diferenciadas, las cuales se reprogramarán en células madre pluripotentes antes o después de la encapsulación. Dado que las unidades de tejido neural tienen que implantarse durante mucho tiempo en el sistema nervioso de un paciente, es preferible partir de células inmunocompatibles con dicho sujeto, para evitar cualquier riesgo de rechazo. En una realización particular, las células usadas para preparar las unidades de tejido neural se recolectaron previamente del mamífero humano o no humano en el cual necesita implantarse dicha unidad o unidades de tejido neural.

En todos los casos, una vez obtenidos los microcompartimentos celulares, las células contenidas en ellos tienen que sufrir una diferenciación celular con el fin de diferenciarse en células neuronales de acuerdo con uno o más fenotipos deseados.

Puede usarse cualquier procedimiento usado convencionalmente en cultivo 2D (placa de Petri y otros) para forzar la diferenciación celular, tal como el procedimiento que se describe en Chambers y otros. (“Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling,” Nature Biotechnology 27, 275-280 (2009)), o en Lippmann y otros, (“Defined human pluripotent stem cell culture enables highly efficient neuroepithelium derivation without small molecule inhibitors,” Stem Cells 2014). En una realización particular, el medio de diferenciación contiene 24(S),25-epoxicolesterol, con el fin de mejorar la diferenciación dopaminérgica.

Preferentemente, los microcompartimentos celulares se cultivan durante al menos tres semanas en medio de diferenciación y antes de cualquier extracción de la cápsula de hidrogel.

Generalmente, los microcompartimentos celulares pluripotentes pueden congelarse antes de su uso y descongelarse según sea necesario.

En una realización, es posible inducir la diferenciación celular para forzar a las células dentro del microcompartimiento celular a diferenciarse en células dopaminérgicas (“Generating regionalized neuronal cells from pluripotency, a step-by-step protocol,” Kirkeby y otros. Frontiers in Cellular Neuroscience 2012). Las unidades de tejido neural derivadas de tales microcompartimentos celulares pueden implantarse luego en el sistema nervioso de un sujeto con la enfermedad de Parkinson, con el fin de reemplazar al menos parcialmente las neuronas dopaminérgicas defectuosas de dicho sujeto.

En otra realización, es posible inducir la diferenciación celular para forzar a las células dentro del microcompartimento celular a diferenciarse en células GABAérgicas (“Derivation of striatal neurons from human stem cells,” Viegas y otros. Prog Brain Res 2012). Las unidades de tejido neural derivadas de tales microcompartimentos celulares pueden implantarse luego en el sistema nervioso de un sujeto con corea de Huntington para reemplazar al menos parcialmente las neuronas GABAérgicas defectuosas de dicho sujeto.

El procedimiento para la preparación de unidades de tejido neural de acuerdo con la invención también puede comprender la etapa adicional que consiste en:

- cargar un dispositivo de implantación quirúrgica con al menos una unidad de tejido neural, preferentemente entre 10 y 1000, con mayor preferencia entre 10 y 100 unidades de tejido neural.

Así, el dispositivo de implantación está listo para ser utilizado para trasplantar células neurales en el sistema nervioso de un sujeto.

De acuerdo con la invención, es posible congelar las células neurales como unidades de tejido neural antes o después de la eliminación al menos parcial de la cápsula de hidrogel. Por supuesto, las unidades de tejido neural pueden usarse directamente después del procedimiento de preparación, sin congelarlas primero.

Ventajosamente, el procedimiento de preparación de acuerdo con la invención comprende la etapa intermedia que consiste en:

- confirmar el fenotipo de las células neurales contenidas en la cápsula de hidrogel, después del paso de diferenciación celular.

Por ejemplo, en el caso de una o más unidades de tejido neural que contienen neuronas dopaminérgicas, es posible medir de forma no invasiva la actividad de las unidades neurales implantables antes del trasplante si se elimina el sobrenadante del medio de cultivo y se realiza análisis de microdiálisis junto con HPLC.

De forma más general, puede resultar ventajoso caracterizar la actividad eléctrica de las neuronas representativas de la muestra mediante la técnica de fijación en parche de membrana, en base al registro de corrientes iónicas que transitan a través de las membranas celulares.

Dado que las unidades de tejido neural se cultivan ventajosamente en lotes, en condiciones idénticas, también es posible realizar análisis más detallados, en particular mediante inmunocitoquímica, secuenciación de ARN y/o secuenciación proteómica, en una muestra representativa de la población de unidades de tejido neural en consideración, con el fin de garantizar la calidad exacta de la diferenciación. Por ejemplo, en el caso de unidades de tejido neural que contienen neuronas dopaminérgicas, es posible realizar análisis inmunocitoquímicos dirigidos a la tirosina hidroxilasa, FOXA2 y/o NURR1 (“Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease,” Kriks y otros 2012).

Así, es posible verificar que las neuronas posmitóticas y/o las células neurales tienen, de hecho, el fenotipo o fenotipos deseados antes de la etapa de implantación en el sistema nervioso del sujeto.

Trasplante de unidades de tejido neural en el sistema nervioso de un mamífero humano o no humano

La invención también proporciona un procedimiento para implantar, o trasplantar, unidad o unidades de tejido neural en el sistema nervioso de un sujeto, y en particular de un ser humano, que lo necesite. Las unidades de tejido neural de acuerdo con la invención pueden usarse ventajosamente para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. En el contexto de la invención, el término "tratamiento" se refiere a un tratamiento curativo, sintomático o preventivo. Como se usa aquí, el término "tratamiento" de una enfermedad se refiere a cualquier acto destinado a extender la calidad y/o duración de la vida de los pacientes. El tratamiento puede diseñarse para erradicar la enfermedad, detener o retrasar la progresión de la enfermedad y/o promover la regresión de la enfermedad. El término "tratamiento" de una enfermedad también se refiere a cualquier acción destinada a reducir los síntomas asociados con la enfermedad. El paciente a tratar es cualquier mamífero, preferentemente un ser humano.

Generalmente, puede usarse cualquier procedimiento de trasplante de células neurales para implantar las unidades de tejido neural en el sistema nervioso del sujeto. En particular, es posible usar una cánula, como una cánula de vidrio, en la que se han cargado de antemano las unidades de tejido neural.

En una realización particular, la implantación comprende las etapas que consisten en

- anestesiar y/o inmovilizar al sujeto antes de que reciba la unidad o unidades de tejido neural;

- abrir el cráneo del sujeto;

- colocar el dispositivo de implantación que contiene las unidades de tejido neural encima del área de trasplante, por ejemplo mediante el uso de lo que se denomina un dispositivo "estereotáctico";

- insertar el dispositivo de implantación en el área de trasplante;

- inyectar las unidades de tejido neural mientras se retira gradualmente el dispositivo de implantación del área de trasplante.

Ventajosamente, la etapa de inyección está controlada por una bomba de microfluidos y un sistema de motorización para controlar la profundidad de inserción del dispositivo de implantación en el sistema nervioso del sujeto, para proporcionar el espacio necesario para las unidades de tejido neural en dicho sistema nervioso, las cuales se depositan en la trayectoria de retirada del dispositivo de implantación.

En una realización particular, el dispositivo de implantación consta de una cánula de vidrio que tiene un diámetro interior de entre 0,3 y 2 mm, preferentemente 0,4 mm, y un diámetro exterior entre 0,4 y 3 mm, preferentemente 0,55 mm. Ventajosamente, la cánula tiene una punta redondeada o biselada y su superficie está silanizada con un compuesto fluorado, para reducir el riesgo de daño tisular cuando se inserta la cánula y reducir el riesgo de taponamiento por un coágulo de sangre. Las unidades de tejido neural se cargan, por ejemplo, desde el frente, hacia la cánula. La cánula se inserta en posición en el cráneo del sujeto.

Ventajosamente, durante el mismo trasplante, se implantan entre 10 y 40 unidades de tejido neural, cada unidad de tejido neural comprende preferentemente entre 1000 y 10 000 células neurales. Por supuesto, el número de unidades de tejido neural a implantar se ajusta de acuerdo con el sujeto y la enfermedad a tratar y/o la función cognitiva o de acción a modificar. También pueden considerarse varios trasplantes, más o menos distantes en el tiempo. De manera similar, los trasplantes pueden realizarse simultáneamente o durante un corto período de tiempo en diferentes áreas del sistema nervioso del sujeto.

Ejemplos

1. Producción de unidades de tejido neural implantables para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson:

Los progenitores se obtienen de acuerdo con el procedimiento publicado por Kriks y otros. (“Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease,” Kriks y otros 2012), mediante el uso de 24 (S),25-epoxicolesterol (concentración de 1 a 10 ^j M) en cultivos derivados de células madre humanas pluripotentes inducidas, para optimizar la diferenciación en neuronas dopaminérgicas.

Los progenitores así obtenidos se encapsulan de acuerdo con el procedimiento publicado por Alessandri y otros, 2016 (“A 3D printed microfluidic device for production of functionalized hydrogel microcapsules for culture and differentiation of human Neuronal Stem Cells (hNSC),” Lab on a Chip, 2016).

Una vez obtenidos los microcompartimentos celulares que contienen los progenitores, se lleva a cabo lo que se denomina diferenciación “terminal” en neuronas dopaminérgicas de acuerdo con el procedimiento publicado por Kriks y otros (“Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease,” Kriks y otros 2012), nuevamente mediante el uso de 24(S),25-epoxicolesterol (concentración de 1 a 10 mm ).

Se presta especial atención al cambio de medios de cultivo, ya que la proliferación de células en los microcompartimentos celulares aumenta la velocidad a la cual las unidades neurales implantables consumen el medio durante su preparación.

Toda la diferenciación tiene lugar en los microcompartimentos celulares, pero es posible decapsular y volver a encapsular las células, siempre que las células admitan la disociación en suspensión de las células individuales (o hasta un máximo de una semana después de la adición del inhibidor de la gamma secretasa y/o señal de Notch como DAPT, CoumpoundE u otras moléculas que promueven la diferenciación terminal).

Los microcompartimentos celulares así obtenidos después de tres semanas de diferenciación se tratan mediante sucesivos enjuagues en solución de PBS para disolver la cubierta de hidrogel y recuperar las unidades de tejido neural antes de la inyección.

Producción de la cánula de inyección:

Con una cuchilla de cerámica se corta una sección de 5 cm de capilar de borosilicato (diámetro interior: 0,4 mm, diámetro exterior 0,55 mm).

La cara frontal del capilar se redondea con papel de lija de óxido de aluminio de 12 jm y luego fibra óptica de 1 jm.

El vidrio se activa mediante tratamiento con plasma durante 5 minutos, luego se silaniza en la fase gaseosa por deposición de 20 j l de 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctiltridorosilano cerca de la punta colocada en una placa Petri de vidrio sellada.

Después de 30 minutos de reacción, la cánula de inyección está lista y montada en un dispositivo estereotáxico estándar conectado a una jeringa de 10 j l (Hamilton), accionada por una bomba de jeringa (Aparato de Harvard). El brazo de inyección del dispositivo estereotáctico también está motorizado (PI).

Cirugía:

Luego se realiza una cirugía de trasplante neural estándar en una rata. Dicho procedimiento quirúrgico comprende las etapas de acuerdo con las cuales:

1) Se induce el sueño y la anestesia medicados (ketamina) en el animal

2) El animal se coloca con precisión mediante el uso de un equipo estereotáxico.

3) El cráneo del animal se afeita, luego se trata con betadina, luego se abre con un bisturí para quitar la piel del cráneo, luego se usa un micro taladro para formar una ventana en el hueso del cráneo, lo cual permite que la cánula pase a través. Las meninges se extienden con cuidado sin dañar la corteza que aflora justo debajo.

4) La cánula conectada a una jeringa se coloca sobre el área de trasplante mediante el uso de un dispositivo estereotáctico.

5) Las unidades de tejido neural se cargan desde el frente en la cánula (alrededor de 80 cápsulas o de 10000 a 800000 células). El trasplante representa 4 j l en total, o 4 cm de altura en la cánula. Se inyectan dos sitios unilateralmente en la rata, en el cuerpo estriado a una distancia de aproximadamente 1 mm.

6) La cánula se inserta en el cráneo del animal en el primer sitio dentro del estriado ventral. Durante la inyección de 2 jl, la cánula se retira simultáneamente con la inyección mediante un sistema de bomba de microfluidos y control motorizado de la profundidad de la cánula, para liberar el espacio necesario para el trasplante, que así se deposita en la trayectoria de extracción en unos 2 mm.

7) La cánula se deja en el lugar durante un minuto antes de retirarla con cuidado.

8) Luego, el segundo sitio

se implanta mediante el uso de el mismo procedimiento.

9) La piel de la rata se sutura (de tres a cinco puntos) después de enjuagar la herida con betadina.

Resultados del trasplante:

Una vez demostrada la supervivencia al procedimiento de trasplante de neuronas humanas maduras, el animal se sacrifica una semana después de la cirugía para estudiar la supervivencia y la implantación del trasplante mediante inmunocitoquímica en un corte de cerebro cortado con un vibrátomo en la trayectoria del trasplante.

La supervivencia estimada en función del tamaño del trasplante (conocido antes del trasplante) es superior al 84 % ± 33 %, en comparación con la tasa de supervivencia del 2 % obtenida con los procedimientos de trasplante de neuronas dopaminérgicas maduras en suspensión (DM Marchionini y otros, “Interference with anoikis-induced cell death of dopamine neurons: implications for augmenting embryonic graft survival in a rat model of Parkinson's disease.” J Comp Neurol 464, 172-179 (2003).) El fenotipo de las neuronas se conserva (tirosina hidroxilasa positivo). Además, son visibles procesos axonales de varios milímetros, lo que indica que las neuronas comenzaron a integrarse inmediatamente en el cerebro de la rata.

2. Trasplante de unidades de tejido neural que comprenden células neuronales para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson

2.1 - Protocolo quirúrgico

Las ratas (de 7/8 semanas de edad) se alojan en una habitación con temperatura controlada en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas con acceso a alimentos y agua adlibitum.

La Figura 1 resume los diferentes procedimientos realizados en estas ratas para obtener ratas parkinsonianas, a las cuales luego se les aplicará trasplantes de tejido neural de acuerdo con la invención.

Preparación de ratas parkinsonianas

Los animales se dejan en ayunas antes de la cirugía. Se retienen los alimentos, incluidos los suplementos dietéticos y el agua.

Cada animal se coloca en una cámara de anestesia alimentada por un flujo continuo de aire (0,3 L/min) oxígeno (0,3 L/min) e isoflurano al 2 %. Se inyectan xilocaína (7 mg/kg, s.c.), borgal (7,5 %, i.m.) y buprenorfina (0,1 mg/kg, s.c.). Luego, el animal se mantiene bajo anestesia con un anestésico a base de isoflurano administrado por un respirador de volumen controlado. La temperatura central se registra por vía rectal durante la cirugía. Se usan almohadillas térmicas para mantener la temperatura corporal, si es necesario. Se administra un ungüento oftálmico (gel oftálmico lipoico) en cada ojo. El pelaje se corta desde el cráneo hasta el cuello. Después de la pérdida del conocimiento, el animal se coloca en un marco estereotáctico (Kopf) y su cabeza se fija en posición mediante barras para las orejas.

Mediante el uso de una jeringa Hamilton 1702N (Ga22 s/51 mm/PST3) junto con un inyector automático Legato 101 (KD Scientific), las ratas se vuelven pseudo-parkinsonianas mediante una inyección estereotáxica unilateral de 2,5 pl de 6-hidroxidopamina (6-OHDA) (Sigma), 5 mg/ml en NaCl estéril, 0,9 %) con ácido ascórbico al 0,1 % en el haz del prosencéfalo medial (MFB) en las coordenadas -2,8 mm anteroposterior, 2 mm lateral y 8,4 mm dorsoventral de acuerdo con el atlas cerebral de Paxinos y Watson a una velocidad de 1 pl/min (Figura 2A).

Después de la inyección, la aguja se deja en su lugar durante 5 minutos antes de retirarla lentamente del cerebro. Treinta minutos antes de la cirugía, los animales reciben por vía intraperitoneal (i.p.) una inyección de desipramina (25 mg/kg, 5 ml/kg) disuelta en NaCl al 0,9 %, para proteger el sistema noradrenérgico.

Cuando se completa la inyección, la piel se cierra con una sutura. Luego se deja que el animal se recupere de la anestesia.

Trasplantes

La preservación del microambiente de las neuronas maduras a lo largo de todo el procedimiento de trasplante permite la supervivencia y la conexión con el cerebro hospedero.

Un grupo de ratas (progenitores encapsulados en 6-OHDA) recibe un trasplante de unidades de tejido neural de acuerdo con la invención que comprenden células progenitoras de neuronas comerciales (Cellular dynamics icell dopaneurons) encapsuladas y maduradas durante dos semanas in vitro antes de su uso.

Un segundo grupo de ratas (6-OHDA CNO) recibe un trasplante de unidades de tejido neural de acuerdo con la invención que comprende organoides neurales controlados (CNO) producidos y clasificados en el laboratorio.

Las unidades de tejido neural que comprenden células CNO se obtuvieron al encapsular células pluripotentes o células pluripotentes vírgenes en alginato y al diferenciarlas en células progenitoras de neuronas de acuerdo con el protocolo más abajo:

Todo el cultivo se realiza a 37 °C, bajo 5 % de CO2 y saturación de humedad por encima del 95 %. D0-D3 (día 0 a día 3): N2B27 (para 500 ml de medio: 250 ml de medio Neurobasal 250 ml de medio Dmem F12 con glutamax 1 suplemento de N2 1 suplemento de B27 0,5 microM LDN-193189 10 microM SB431542 100 ng/ml Shh (Sonic Hedgehog) 100 ng/ml FGF-8 (Factor de crecimiento de fibroblastos 8) 2 microM de purmorfamina 10 microM 24 (S), 25-epoxicolesterol

D3-D9: N2B27 LDN SB Shh FGF-8 purmorfamina CHIR 24(S),25-epoxicolesterol

D9-D10: N2B27 LDN CHIR 24 (S), 25-epoxicolesterol

D10-D15 o más: N2B27 cAMP AA GDNF BDNF FGF-20 TGFbeta tricostatina CpE 24 (S), 25-epoxicolesterol

Tabla 1: Lista de abreviaturas y acrónimos

Tabla 2: Concentraciones finales

Antes de la inyección de las unidades de tejido neural (progenitores encapsulados de 6-OHDA y CNO de 6-OHDA), las cápsulas de alginato de los microcompartimentos celulares se disuelven simplemente al intercambiar el medio con p Bs .

Las configuraciones de inyección son una jeringa o cánula montada en un equipo estereotáctico. Las unidades de tejido neural se cargan en la cánula de inyección por extracción del volumen inyectado (25 CNO ~ 1 j L) en el cuerpo de la cánula.

Para inyectar los 4 puntos de inyección en 2 trayectorias (Figura 2B): Se inyectan 4 j l con progenitores (grupo 3), progenitores encapsulados (progenitor 6-OHDA) o CNO (6-OHDA CNO) en el cuerpo estriado en las siguientes coordenadas: A/P 1,2; M/L -2,6; D/V-5,0 (3 ul) y -4,0 (3 ul); y A/P 0,5; M/L -3,0; D/V-5,0 (3 ul) y -4,0 (3 ul); barra dental -2,4 (Grealish y otros, 2014).

Procedimiento posoperatorio

Se forman cuatro grupos de ratas a partir de ratas inmunocomprometidas (NR o ratas desnudas):

- "Simuladas": ratas no lesionadas

- “6-OHDA”: ratas cuyas neuronas dopaminérgicas del hemisferio derecho han sido eliminadas químicamente, sin trasplante (experimento de control)

- “CNO” o “6-OHDA CNO”: ratas cuyas neuronas dopaminérgicas del hemisferio derecho han sido eliminadas químicamente y trasplantadas al cuerpo estriado derecho con unidades de tejido neural de acuerdo con la invención que comprenden aproximadamente 250000 células.

- "Proencaps" o "progenitores encapsulados en 6-OHDA": ratas cuyas neuronas dopaminérgicas del hemisferio derecho han sido eliminadas químicamente y trasplantadas al cuerpo estriado derecho con unidades de tejido neural de acuerdo con la invención que comprenden aproximadamente 250000 células de iDopaneuronas de Cellular Dynamics maduradas 2 semanas en cápsulas.

Cada animal se observa de cerca y se mantiene caliente hasta que recupera sus reflejos de enderezarse y tragar. Los animales son cuidados por técnicos de experiencia con fácil acceso a apoyo veterinario experimentado.

Si es necesario, se usan otros fármacos para el manejo clínico del animal. Cada fármaco, dosis, vía y lugar de administración se documenta en los registros quirúrgicos.

Las incisiones quirúrgicas se controlan para detectar signos de infección, inflamación e integridad general al menos una vez al día (hasta que las incisiones cicatrizan). Todas las observaciones realizadas y los resultados se documentan en los registros quirúrgicos. Se informa al coordinador del estudio de cualquier anomalía. Se informará al monitor del estudio lo antes posible de cualquier anomalía.

Los controles del estado de los animales se llevan a cabo dos veces al día (de 11 am a 10 pm).

Los animales se evalúan de acuerdo con criterios de trato justo y humano. Se proporciona el apoyo veterinario adecuado si es necesario. Cualquier animal que muestre signos de dolor severo o angustia que probablemente duren, se sacrificará rápidamente. Luego se les somete a una necropsia burda. Además de la necropsia, el cerebro se extrae para histología y se trata como se indica en la sección Eutanasia. Se hacen todos los esfuerzos razonables para aplicar los criterios de trato justo y humano para evitar que un animal sea encontrado muerto.

2.2 - Estudios de conducta

Rotación inducida por anfetaminas (adaptado de Grealish y otros, 2014)

Se consideró que sólo los animales con más de 5 revoluciones por minuto después de la inyección de 6-hidroxidopamina (6-OHDA) en el haz telencefálico mediano habían sufrido una lesión con éxito. Se registró el sesgo rotacional después de la inyección sistémica de anfetamina (2,5 mg/kg, intraperitoneal, Apoteksbolaget) mediante el uso de un sistema automatizado (Omnitech Electronics). La rotación de los animales se registró durante 90 minutos, solo se contaron los giros corporales completos y luego se expresaron en giros netos por minuto, las rotaciones hacia el lado de la lesión (en el sentido de las manecillas del reloj) se cuentan positivamente.

Prueba de pasos

Cada rata se coloca sobre una superficie plana; sus patas traseras se levantan y se sostiene suavemente la cola de modo que solo una pata delantera pueda tocar la mesa. El experimentador hace retroceder a la rata un metro a un ritmo regular. Los movimientos de ajuste contralaterales e ipsilaterales de las patas delanteras se cuentan independientemente en sus respectivas trayectorias. Los datos se presentarán como un porcentaje del movimiento de ajuste mediante el uso de las patas y el cálculo de la relación contralateral/(contralateral ipsilateral).

Prueba de cilindros

La prueba del cilindro se realiza al colocar a cada animal en un cilindro de vidrio y contar el número de toques de las patas ipsilateral y contralateral en la pared del cilindro durante 5 minutos, el resultado se expresa al calcular la relación contralateral/(contralateral ipsilateral), de un máximo de 20 toques.

El actímetro de "campo abierto"

La actividad locomotora espontánea se mide mediante un actímetro fotoeléctrico (Actitrack, Panlab, SL, Barcelona, España). El dispositivo consta de una jaula transparente conectada a una celda fotoeléctrica. Los rayos de luz detectan movimientos y el número total de detecciones de movimiento horizontal de cada rata se registra diariamente durante dos sesiones sucesivas de 10 minutos. Todas las pruebas de actímetro se realizan en una habitación aislada entre las 8 am y la 1 pm. La primera fase de tres días permite la habituación. El cuarto día se considera el día de la prueba. La primera sesión de 10 minutos se considera la habituación diaria. Solo la actividad locomotora registrada durante la segunda sesión de 10 minutos se usa para el análisis de datos.

2.3 - Evaluaciones de estudios post mortem - análisis histológico

Después de finalizados los experimentos, las ratas se sacrifican mediante infusión intracardiaca de paraformaldehído al 4 %, se recogen los cerebros, se congelan en isopentano a -45 °C y se almacenan a -80 °C. Los cerebros infundidos se cortan con un criostato en secciones coronales de 50 |jm.

Validación de la lesión dopaminérgica (DA)

La pérdida de células DA en el sistema nervioso central y la pérdida de fibras DA en el cuerpo estriado se verifican mediante inmunohistoquímica de tirosina hidroxilasa (TH) como se describió anteriormente (Bouali-Benazzouz y otros, 2009). El número de células inmunorreactivas a tirosina hidroxilasa (TH) se obtiene al aplicar el procedimiento de fraccionamiento óptico mediante el uso de un microscopio Leica DM6000B con software Mercator Pro (ExploraNova, versión 7.9.8).

Validación del trasplante

Las secciones de cerebro de rata y los CNO se someten a ensayos inmunohistoquímicos mediante el uso de anticuerpos para analizar la supervivencia celular, la posible proliferación y la maduración fenotípica de los trasplantes (identificados mediante el marcador citoplasmático humano (HCM)) y caracterizados por marcadores DA convencionales (TH, DAT, FOXA2), marcadores pan-neuronales (MAP2, NeuN), serotonina (FOXG1), marcadores proliferativos Ki-67/PCNAy un marcador glial (GFAp específico para humanos).

Prueba de supervivencia neuronal

Se sacrificaron 6 ratas CNO 6 días después del trasplante para evaluar la supervivencia neuronal después del trasplante.

Resultados

Resultados de estudios de conducta

Los estudios de conducta muestran un efecto muy positivo de los trasplantes de acuerdo con la invención en ratas trasplantadas (6Pro-encaps y CNO) ya que se obtiene una corrección de conducta en 4 a 6 semanas para la prueba de pasos (Figura 4B) y la prueba de cilindros (Figura 4A), y en 2 semanas para la prueba de rotámetro (Figura 4C), mientras que los pocos efectos demostrados en la literatura con trasplantes de progenitores muestran una mejora conductual después de aproximadamente 20 semanas (Kriks y otros, 2011, Grealish y otros, 2014, Kirkeby y otros, 2017, Doi y otros, 2014).

Como era de esperar, los trasplantes de acuerdo con la invención, por otro lado, no tienen ningún efecto sobre los resultados de la ansiedad (Figura 4D).

Resultados histológicos

El análisis histológico de los trasplantes realizados en los dos grupos CNO y Pro-encaps muestra la presencia de un 10 a un 15 % de neuronas TH en los trasplantes. A modo de comparación, los estudios publicados anteriormente describen los niveles de neuronas TH después del trasplante de progenitores en aproximadamente un 5 % (Kirkeby y otros, 2017) o un 6 % (Kriks y otros, 2011).

El análisis de supervivencia neuronal muestra que tras 6 días de trasplante se observan proyecciones axonales plurimilimétricas en el cerebro de ratas CNO (Figura 3), lo cual confirma la supervivencia significativa de neuronas tras el trasplante de acuerdo con la invención.

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Unidad de tejido neural para su uso en terapia celular para una implantación en el sistema nervioso de un mamífero humano o no humano, en el que dicha unidad de tejido neural contiene células neuronales posmitóticas diferenciadas que tienen un fenotipo de interés correspondiente al fenotipo de las células defectuosas. a reemplazar, y de células gliales, dichas células están organizadas en una red tridimensional en una matriz extracelular, dicha unidad se obtiene de un microcompartimento celular que comprende una cápsula de hidrogel que rodea una única unidad de tejido neural, dichas células neuronales posmitóticas diferenciadas que se han obtenido a partir de células de mamíferos humanos o no humanos diferenciadas en células neuronales posmitóticas dentro de dicha cápsula de hidrogel y dicha cápsula de hidrogel se retira al menos parcialmente antes del uso de la unidad de tejido neural.

2. Unidad de tejido neural para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la cápsula de hidrogel se retira totalmente antes del uso de la unidad de tejido neural.

3. Unidad de tejido neural para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que las células neurales forman un grupo de células neurales, que preferentemente tienen una dimensión mínima comprendida entre 50 |jm y 500 jm más menos 10 %, preferentemente entre 150 jm y 400 jm más menos 10 %, incluso con mayor preferencia entre 200 jm y 300 jm más menos 10 %, y/o en el que dicha unidad comprende entre 10 y 100 % de células neuronales posmitóticas del fenotipo o de los fenotipos de interés, preferentemente entre 50 y 100 %, con mayor preferencia más del 90 %, y/o en el que dicha unidad contiene entre 100 y 100000 células neurales.

4. Unidad de tejido neural para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa.

5. Unidad de tejido neural para su uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la enfermedad neurodegenerativa se selecciona entre enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Alzheimer y lipofuscinosis ceroides neuronales como la enfermedad de Batten.

6. Unidad de tejido neural para su uso de acuerdo con la reivindicación 4 o 5, en el que dicha unidad de tejido neural contiene neuronas dopaminérgicas, para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, o en el que dicha unidad de tejido neural contiene neuronas GABAérgicas, para el tratamiento de la enfermedad de Huntington.

7. Unidad de tejido neural para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha unidad de tejido neural contiene células neurales modificadas genéticamente.

8. Procedimiento para la preparación de una unidad de tejido neural de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, destinada a implantarse en el sistema nervioso de un sujeto, dicho procedimiento comprende las etapas que consisten en:

(1) producir microcompartimentos celulares que comprenden, dentro de una cápsula de hidrogel, matriz extracelular y células de mamíferos humanos o no humanos capaces de diferenciarse en células neurales, ventajosamente inmunocompatibles con el mamífero destinado a recibir la unidad de tejido neural;

(2) inducir la diferenciación celular dentro del microcompartimento celular, para obtener células neuronales posmitóticas que tienen al menos un fenotipo de interés;

(3) retirar al menos parcialmente la cápsula de hidrogel con el fin de recuperar las células neuronales como una unidad de tejido neural.

9. Procedimiento para la preparación de la unidad de tejido neural de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende la etapa adicional que consiste en:

(4) Cargar un dispositivo de implantación quirúrgica con al menos una unidad de tejido neural, preferentemente al menos 10 a 1000 unidades de tejido neural, con mayor preferencia entre 10 y 100 unidades.

10. Procedimiento para la preparación de una unidad de tejido neural de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, que comprende la etapa adicional que consiste en congelar las células neurales como unidad de tejido neural, antes o después de la retirada al menos parcial de la cápsula de hidrogel.

11. Procedimiento para la preparación de una unidad de tejido neural de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que las células usadas en la etapa (1) se recogieron previamente de un mamífero humano o no humano en el cual se va a implantar dicha unidad de tejido neural.

12. Procedimiento para la preparación de una unidad de tejido neural de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, que comprende la etapa intermedia que consiste en:

- confirmar el fenotipo de las células neurales contenidas en la cápsula de hidrogel, después de la etapa (2) de diferenciación celular.

13. Procedimiento para la preparación de una unidad de tejido neural de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, en el que las células se diferencian en células dopaminérgicas o en células GABAérgicas.

14. Kit de implantación de unidad de tejido neural que comprende al menos un microcompartimento celular que comprende al menos una cápsula de hidrogel que envuelve una unidad de tejido neural que contiene células neuronales posmitóticas diferenciadas que tienen un fenotipo de interés correspondiente al fenotipo de las células defectuosas a reemplazar y de células gliales, dichas células están organizadas en una red tridimensional en una matriz extracelular, dichas células neuronales posmitóticas diferenciadas se obtienen a partir de células de mamíferos diferenciadas en células neuronales posmitóticas dentro de dicha cápsula de hidrogel y medios para la eliminación al menos parcial de la cápsula de hidrogel.

15. Kit de implantación de unidad de tejido neural de acuerdo con la reivindicación 14, que comprende además un dispositivo de implantación quirúrgica capaz de implantar una unidad de tejido neural en el sistema nervioso de un mamífero.

16. Kit de implantación de unidad de tejido neural que comprende al menos una unidad de tejido neural que contiene células neuronales posmitóticas diferenciadas que tienen un fenotipo de interés correspondiente al fenotipo de las células defectuosas a reemplazar y de las células gliales, dichas células están organizadas en una red tridimensional en una matriz extracelular, dicha unidad se obtiene a partir de un microcompartimento celular que comprende una cápsula de hidrogel que rodea una única unidad de tejido neural, dichas células neuronales posmitóticas diferenciadas se obtienen a partir de células de mamíferos diferenciadas en células neuronales posmitóticas dentro de dicha cápsula de hidrogel, y dicha cápsula de hidrogel se extrae al menos parcialmente, preferentemente entre 1 y 10 000, con mayor preferencia entre 10 y 1000 unidades de tejido neural en un dispositivo quirúrgico de implantación capaz de implantar la unidad o las unidades de tejido neural en el sistema nervioso de un mamífero.