TW201610157A - 以粒線體特化細胞治療退化性神經疾病的醫藥組合物 - Google Patents

Abstract

本發明係提供一種經當歸萃取物處理後之粒線體特化細胞。本發明醫藥組合物包含一種粒線體特化細胞，可有效地增加類神經元細胞之比例，達到改善以及治療退化性神經疾病。

Description

以粒線體特化細胞治療退化性神經疾病的醫藥組合物

本發明係有關於一種醫藥組成物，且特別有關於可有效地改善以及治療退化性神經疾病增加活化細胞分化為類神經元細胞之比例的醫藥組成物。

由於經濟發展與醫療衛生的進步，人類的平均壽命逐年攀升，人口結構的老化已是全球趨勢。根據聯合國統計資料顯示，2012年全球人口達70.8億，65歲以上人口占全球的7.9%，已是世界衛生組統(WHO)所定義的高齡化社會(Aging society)。伴隨著高齡化人口的增加，退化性神經疾病的人數亦同樣快速增長，目前全世界至少有400萬人罹患這種疾病。然而退化性神經疾病並非好發於老年人，約一半的患者在60歲以後發病，另一半則於60歲之前發病。神經退化性疾病，是一種大腦和脊髓的細胞神經元細胞退化的疾病狀態，係其神經元突觸或其髓鞘的功能喪失所致，將導致功能障礙、行動不便或死亡。

巴金森氏病是一種較常在老年人出現的神經性疾病，發病年齡以五十至七十九歲最常見。而其病理特徵係中腦的黑質組織內的多巴胺細胞退化死亡，正常黑質組織內約含二十萬個多巴胺神經細胞，多巴胺神經可分泌多巴胺，專司控制運動的協調。這些神經少許的退化，並不會引起任何運動的不協調，但當退化超過50%時，便開始出現輕微症狀，包括肢體顫抖、僵直及動作緩慢。神經退化愈多，則上述症狀會愈嚴重，終至完全需人照顧的病廢狀態；最後可能因呼吸道、泌尿道、褥瘡之感染而死亡。

目前巴金森氏症於發病初期係透過藥物治療供給多巴胺神經多巴胺藥物，以便製造出更多的多巴胺來彌補退化的神經所減少的製造量。早期的巴金森氏症患者，對於多巴藥物的療效反應皆相當不錯。但由於巴金森氏症為一進行性的疾病，多巴胺神經一直在死亡，以至多巴藥物會愈服用愈多，然後藥效愈來愈差，症狀就愈來愈嚴重。許多病患在服用藥物幾年後，便會出現藥物之副作用，包括幻覺、噁心、腸胃不適，甚至全身不白主的肢體舞蹈等。由於藥物治療於後期已無法控制嚴重病患之症狀，因此需以外科手術改善病患生活品質。其中，手術治療則可細分為以下三種形式：(1)燒灼切開術，也就是把腦部某些小區域加熱80度，時間為80秒，使局部的神經細胞失去功能，這些區域包括蒼白球，視丘，及視丘下核等；(2)埋入電極，與燒灼破壞效果類似，其原理係當電極通電後，局部的神經細胞就會失去功能；以及(3)幹細胞治療手術，其原理就是補充退化的多巴胺細胞，便會一直增長，使腦內多巴胺細胞增多，改善巴金森氏症的症狀。

雖然，過去已有文獻揭露可利用移植幹細胞治療巴金森氏症，雖然可以改善帕金森氏症的症狀，然而效果並沒有到達治癒的程度。主要原因包括幹細胞施打到體內之後因免疫反應而存活率不佳以及幹細胞施打到體內之後分化為多巴胺神經元的比例偏低(Cave et al,2014)。

有鑑於上述先前技術所存在之問題，本發明提供一種醫藥組合物，該醫藥組合物包含一粒線體特化細胞(Mitocell)，其中該粒線體特化細胞係為當歸萃取物預先處理脂肪幹細胞，使脂肪幹細胞於體外時就已趨向類神經元細胞的方向用以增加施打到體內之後分化為類神經元細胞的比例。本發明醫藥組合物可有效提高於體內分化為類神經細胞的比例並降低所引起之免疫反應，並達到治療巴金森氏症的目的。

本發明提供一種粒線體特化細胞之培養基，此培養基包含當歸萃取物。

在本發明一實施例中，其中當歸萃取物包括丁烯基苯酞(butylidenephthalide)。

本發明提供一種粒線體特化細胞之製備方法，其中幹細胞係經過當歸萃取物進行前處理。

本發明更提供一種粒線體特化細胞，其為經當歸萃取物處理之幹細胞。

在本發明一實施例中，其中粒線體特化細胞為一幹細胞。

在本發明一實施例中，其中粒線體特化細胞為一脂肪幹細胞。

在本發明一實施例中，其中粒線體特化細胞之粒線體膜電位的紅綠螢光比為6.5~27。

本發明另提供一種增加類神經元之醫藥組合物，該醫藥組合物包含50%~90%之粒線體特化細胞。

本發明同時提供一種治療退化性神經疾病之方法，其係包含以下步驟：將粒線體特化細胞施打入一個體的腦部。

第1A-1B圖顯示脂肪幹細胞在不同濃度當歸萃取物下的存活率。

第2圖顯示脂肪幹細胞在不同濃度當歸萃取物下的類神經元分泌的Nurr1、BDNF增高，代表脂肪幹細胞呈現分化為神經細胞的命運走向；而SDF1上升則代表幹細胞homing能力增加，而IL-8基因表現下降則代表發炎反應降低。

第3圖A顯示粒線體特化細胞的粒線體之藍綠螢光比降低， 因此粒線體特化細胞(mitocell)之粒線體膜電位已與正常細胞之粒線體膜電位不相同，第3圖B呈現此粒線體特化細胞仍具有幹細胞特性(CD44/CD105)。

第4A-4B圖顯示平衡木測試結果。結果顯示，小鼠在施打脂肪幹細胞及粒線體特化細胞(mitocell)後之小鼠(第3、4組)，明顯增加平衡能力，第4組的效果比第3組的效果好。

第5圖顯示旋轉輪測試結果。結果顯示，在施打脂肪幹細胞及粒線體特化細胞(mitocell)後之小鼠(第3、4組)，可回復小鼠的平衡與協調能力，第4組的效果比第3組的效果好。

第6A-6C圖顯示八通道穿梭箱實驗結果，結果顯示，在施打脂肪幹細胞及粒線體特化細胞(mitocell)後之小鼠(第3、4組)可以明顯看到其行為能力的恢復，第4組的效果比第3組的效果好。

第7圖顯示大腦切片H&E染色結果，結果顯示施打脂肪幹細胞和粒線體特化細胞進入大腦，對神經細胞並無任何毒性及發炎反應。

本發明提供一種製造粒線體特化細胞(mitocell)的方法，以一當歸萃取物處理一幹細胞。

活化活化當歸可透過冷凍乾燥、噴霧乾燥、蒸發或加熱乾燥等程序進行乾燥。在本發明中，當歸可為主根、側根或纖維。當歸可利用一溶劑進行萃取，以獲得當歸萃取物。例如，可使用超臨界流體萃取、水萃取或有機溶劑萃取方法。本發明之當歸萃取物較佳含有丁烯基苯酞(butylidenephthalide)。

本發明所述之“幹細胞”，其係指細胞在未分化或部分分化的狀態下，具有自我更新的特性，並可發育潛能分化成多種細胞類型。“活化細胞”包括胚胎幹細胞或成體幹細胞。成體幹細胞可分離自各種成體組織，包括血液、骨髓、腦、皮膚、胰腺、骨骼肌、心臟肌肉與脂肪。這些成體幹細胞可以根據基因的表達，因子反應性，並在培養形態進行表徵。本發明之幹細胞包括脂肪幹細胞、神經幹細胞、神經嵴幹細胞、間質幹細胞、造血幹細胞、胰幹細胞、造血幹細胞、皮膚幹細胞、胚胎幹細胞、血管內皮幹細胞、肝臟幹細胞、腸上皮幹細胞及生殖幹細胞，較佳為脂肪幹細胞。

本發明粒線體特化細胞之處理方式為將一幹細胞置於一含有本發明當歸萃取物及/或丁烯基苯酞的培養基中培養至少1小時，較佳為2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或24小時以上，更佳為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天以上。

應注意的是，粒線體特化細胞在經當歸萃取物處理後，仍具有幹細胞的特徵，且在施打至小鼠後，可分化為類神經元細胞。

經當歸萃取物處理之細胞其粒線體活化，但仍具有幹細胞的特性。例如，處理前、後皆仍具有CD44+/CD105+表面標記。

本發明提供一種粒線體特化細胞的製備方法，包括於一培養基培養一幹細胞，其中該培養基含有當歸萃取物。

本發明另提供一種粒線體特化細胞用於製備治療退化性疾病之醫藥組合物之用途，其特徵在於將粒線體特化細胞透過注射方式進入個體腦部。

本發明另提供一種治療退化性神經疾病之醫藥組合物。本發明之醫藥組合物包含粒線體特化細胞，其中該醫藥組合物包含活性劑量為50%~90%之粒線體特化細胞，最 佳活性劑量為80%~90%之粒線體特化細胞。

本發明醫藥組合物可有效地促進腦部神經元細胞的數量及質量，以增加個體的平衡與協調能力。本發明所述之個體為人類或非人類動物(如，小鼠、狗、貓、羊、牛、馬、猴子等)，較佳為人類。

更重要的是，本發明粒線體特化細胞不僅可顯著地提高多巴胺神經元細胞的數量，更重要的是，還可降低施打粒線體特化細胞所產生之免疫反應，且效果顯著優於未經處理之幹細胞。

本發明之醫藥組成物可單獨給藥，或是合併其他神經元退化性神經疾病之治療方法或治療藥物。

綜上所述，本發明之粒線體特化細胞可增加多巴胺神經元細胞，特別於中腦黑質區，具有治療老年神經退化相關疾病，例如，巴金森氏症及阿茲海默症等。此外，本發明之粒線體特化細胞施打入體內所產生之免疫排斥反應比脂肪幹細胞施打入體內所產生之免疫反應低。

【實施例】

1. 粒線體特化細胞(mitocell)之培養及前處理濃度選擇

粒線體特化細胞(mitocell)係將脂肪幹細胞培養於脂肪幹細胞培養液所製備而得，其中脂肪幹細胞培養液包含Keratinocyte-SFM(1X)Liquid(Gibco)、牛垂體提取物(Gibco)、EGF(Gibco)、N-乙醯-L-半胱氨酸(Sigma)、L-抗壞血酸2-磷酸酯鎂水合物(Sigma)、胎牛血清(HyClone)10%)，並含有0、5、10、20、40、80、160與320μg/ml的當歸萃取物，其中所述之丁烯基苯酞。此外，以下所述之粒線體特化細胞均為經當歸萃取物處理後之脂肪幹細胞。

參照第1圖，在培養24小時後，當歸萃取物濃度大於160μg/mL時，粒線體特化細胞的存活率會顯著地下降。在培養48小時後，當歸萃取物濃度大於80μg/mL時， 粒線體特化細胞的存活率會下降。

另外，將脂肪幹細胞培養於0、0.3125、0.625、1.25、2.5、5與20μg/mL的當歸萃取物中，並檢測粒線體特化細胞中Nurr1、BDNF、SDF1、IL-8基因的表現量，用以找出最適合處理的劑量。

參照第2圖，在高濃度(20μg/mL)的當歸萃取物下，Nurr1、BDNF與SDF1基因的表現量增加，但IL-8基因的表現會受到抑制。

參照第3圖，A圖顯示粒線體特化細胞之粒線體藍綠螢光比例改變，因此特化細胞之粒線體的電位能已有明顯改變；B圖顯示由流式細胞儀檢測粒線體特化細胞。發現粒線體特化細胞具有CD44+/CD105+表現，顯示粒線體特化細胞仍具幹細胞特性。經上述試驗後，選擇20μg/mL的當歸萃取物進行後續實驗。

2. MPTP誘導帕金森氏症小鼠模型的建立

以八週齡，體重約25公克左右的C57BL/6雄性小鼠作實驗對象。購買來的小鼠分籠後給予數天適應期，避免小鼠因環境不適所造成的緊迫、焦慮而影響實驗進行與結果。進行實驗之前一天，先進行神經行為學觀察分析。手術前10分鐘給予小鼠4%水合氯醛(cholra hydrate)，劑量是1mL/g/kg體重。所使用的小鼠體重大約都在25公克，故每次都會施打0.25毫升。此外，在手術中途給異氟醚(isoflurane)，以維持動物麻醉，避免動物在手術期間甦醒。

將MPTP以生理食鹽水溶解成為7mg/ml的原液使小鼠誘發帕金森氏症，經由換算，每隻小鼠以腹腔注射的方式給予MPTP，一天注射4次，間隔2小時，劑量為20mg/kg。

並以1x10⁶細胞/每隻施打帕金森氏症的實驗組別，如表1所示。

(1)第1組：正對照組，無注射MPTP； (2)第2組：負對照組，注射MPTP誘導帕金森氏症後腦部施打生理食鹽水；(3)第3組：實驗組，注射MPTP誘導帕金森氏症後腦部施打1x10⁶之脂肪幹細胞；(4)第4組：實驗組，注射MPTP誘導帕金森氏症後腦部施打1x10⁶之粒線體特化細胞；

3. 手術前/後神經行為學分析

3.1 平衡木測試

平衡木測試(Beam walking analysis)是用來測量小鼠的平衡能力，將小鼠放至於80cm的平衡木上，記錄小鼠通過平衡木的時間以及後腳滑掉的次數，以反應出小鼠治療過後平衡的狀態。測試時間為60秒，若超過60秒小鼠仍無法通過平衡木，仍以60秒計算。

參照第4a圖，小鼠注射MPTP誘導帕金森氏症(第2組)後，無法完成平衡木測試。在施打脂肪幹細胞及粒線體特化細胞後(第3、4組)，明顯增加小鼠於第2、5天 的平衡能力。

參照第4b圖，小鼠注射MPTP誘導帕金森氏症(第2組)後，其跌倒的次數增加。在施打脂肪幹細胞及粒線體特化細胞後(第3、4組)，明顯降低小鼠跌倒的次數。

由實驗結果發現，相較施打脂肪幹細胞的小鼠(第3組)，施打粒線體特化細胞(第4組)的小鼠具有較佳的治療效果。

3.2 旋轉輪測試

旋轉輪測試(Rotarod analysis)同樣是用來測量小鼠的平衡與協調能力，在測試之前一周，我們將把小鼠放至滾輪上訓練，直至小鼠能夠在滾輪上的時間超過三分鐘，手術後，再利用旋轉輪測試評估小鼠治療之後回復的能力，滾輪的速度為5rpm。

參照第5a、5b圖，小鼠在注射MPTP誘導帕金森氏症(第2組)後，其平衡與協調能力明顯下降。然而，在施打脂肪幹細胞及粒線體特化細胞後(第3、4組)，可回復小鼠的平衡與協調能力，較佳為施打粒線體特化細胞之小鼠(第4組)。

3.1 八通道穿梭箱實驗(Locomotor activity box)

八通道穿梭箱實驗採樣1小時，先將小鼠放進採樣箱等待10至20分鐘使其適應，才開始進行採樣。八通道穿梭箱連接電腦，經由感應顯示並紀錄小鼠在30分鐘期間走動(水平位移)、抬頭或攀爬(垂直位移)，以及整體總位移的數據，之後匯整成excel檔案進行統計分析。

參照第6a、6b、6c圖，小鼠在注射MPTP誘導帕金森氏症(第2組)後，其平衡與協調能力明顯下降。然而，在施打脂肪幹細胞及粒線體特化細胞後(第3、4組)，可回復小鼠的垂直移動次數(第6a圖)、時間(第6b圖)和能力(第6c圖)，較佳為施打粒線體特化細胞之小鼠(第4組)。

採用過量麻醉的犧牲法，給予小鼠腹腔注射其體 重2至3倍的麻醉藥，等待小鼠深度麻醉，用力捏握腳趾不會有反射反應之後，開始利用食鹽水進行灌流，待血液皆沖出後，再用三聚甲醛(paraformaldehyde)灌流至四肢僵硬，進行腦部取出的動作。

將耳朵後面的皮膚橫向剪開，再在頭頂皮膚予以垂直剪開，脖子與頭頂之切口呈T字狀，抓住耳朵將皮膚撕開，露出頭骨，用剪刀在小鼠頸部上方剪開，使頸骨與小腦部份連接處斷裂，小心將刀尖深入顱骨向鼻尖剪開，注意不要傷害到腦部，剪開顱骨後用彎鑷將腦部底下掏空，取出整個腦，並且將鼠腦脫水，之後放置在切腦台上，在這之前切腦台可先放在冰上預涼，如此可使切取腦部切片時不容易破碎。

以鋒利刀片從腦的兩側固定，去除小腦與嗅球部份，將大腦本體切成兩部分，進行OCT(optimal cutting temperature)包埋，而後利用冷凍切片機得到鼠腦切片。

3.4 將取得鼠腦切片以H&E染色，觀察注射脂肪幹細胞和粒線體特化細胞之腦部細胞是否受損或發炎反應，結果顯示腦部細胞無受損及發炎反應發生(第7圖)

所有說明書中所揭示之發明技術特點可以以任意方式組合，說明書中揭示之每一技術特點可以提供相同、等同或相似目的之其他方式替換。因此，除非另有特別說明，文中所有揭示之特點均只是等同或相似特點之一般系列之實例。

由上述可知，熟習此技藝者能輕易地了解本發明之必要特徵，在不脫離其精神與範圍之下能就本發明做許多改變與調整以應用於不同用途與條件。

Claims (15)

1. 一種培養粒線體特化細胞的培養基，其中該培養基包括一當歸萃取物。
2. 如申請專利範圍第1項所述之培養基，其中該當歸萃取物為丁烯基苯酞(butylidenephthalide)。
3. 如申請專利範圍第1項所述之培養基，其中該當歸萃取物之濃度為5~160ug/ul。
4. 如申請專利範圍第1項所述之培養基，其中該當歸萃取物之濃度為20ug/ul。
5. 一種粒線體特化細胞的製備方法，包括於申請專利範圍第1項所述之培養基培養一幹細胞。
6. 如申請專利範圍第5項所述之製備方法，其中該幹細胞係選自由脂肪幹細胞、神經幹細胞、神經嵴幹細胞、間質幹細胞、造血幹細胞、胰幹細胞、造血幹細胞、皮膚幹細胞、胚胎幹細胞、血管內皮幹細胞、肝臟幹細胞、腸上皮幹細胞及生殖幹細胞等所組成之群組。
7. 一種粒線體特化細胞，其中該粒線體特化細胞經當歸萃取物處理之一幹細胞；其中該粒線體特化細胞之粒線體的紅綠螢光比為6.5~27。
8. 如申請專利範圍第7項所述之粒線體特化細胞，其中該幹細胞係選自由脂肪幹細胞、神經幹細胞、神經嵴幹細胞、間質幹細胞、造血幹細胞、胰幹細胞、造血幹細胞、皮膚幹 細胞、胚胎幹細胞、血管內皮幹細胞、肝臟幹細胞、腸上皮幹細胞及生殖幹細胞等所組成之群組。
9. 如申請專利範圍第7項所述之粒線體特化細胞，其中幹細胞其粒線體活性改變，並具有一高度表現細胞特徵，該高度表現細胞特徵係為Nuur1BDNFSDF1。
10. 如申請專利範圍第7項所述之粒線體特化細胞，其中該粒線體特化幹細胞具有一低度表現細胞特徵，該低度表現細胞特徵為IL8。
11. 如申請專利範圍第7項所述之粒線體特化細胞，其中該粒線體活化幹細胞具有一幹細胞表現特徵，該幹細胞表現細胞特徵係為CD44+及CD105+。
12. 一種治療退化性神經疾病之醫藥組成物，包括如申請專利範圍第7項所述之粒線體特化細胞及醫藥上可接受之鹽類。
13. 如申請專利範圍第11項所述之醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含50%~90%之粒線體特化細胞。
14. 如申請專利範圍第11項所述之醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含80%~90%之粒線體特化細胞。
15. 一種粒線體特化細胞用於製備治療退化性疾病之醫藥組合物之用途，其中該粒線體特化細胞係指經當歸萃取物處理之一幹細胞。