CN113801836A

CN113801836A - 提升线粒体功能的培养方法及其使用的组合物

Info

Publication number: CN113801836A
Application number: CN202010548635.0A
Authority: CN
Inventors: 许智凯; 刘思廷; 凃启堂; 郑汉中
Original assignee: National Chung Hsing University
Current assignee: National Chung Hsing University
Priority date: 2020-06-16
Filing date: 2020-06-16
Publication date: 2021-12-17

Abstract

本发明揭露一种提升线粒体功能的培养方法及其使用的组合物，其能够用于调控细胞内线粒体的能量转换及消耗的路径，而具有提升细胞能量转换效率的用途。更进一步来说，通过本发明所揭组合物培养已分离的细胞，能够有效地维持或提升已分离的细胞中的线粒体活性，以达到提升调控细胞能量转换的效率。

Description

提升线粒体功能的培养方法及其使用的组合物

技术领域

本发明有关于一种培养方法及其所使用的组合物，特别指一种提升线粒体功能的培养方法及其使用的组合物。

背景技术

线粒体为细胞内合成腺苷三磷酸(ATP)的场所，能够提供绝大多数细胞活动所需的能量，而由于线粒体产生能量的过程中，同时也会产生自由基，因而被认为除了能够供应细胞能量外，尚与与细胞凋亡、细胞内信号传递、调控细胞生长等相关。

由于线粒体与能量代谢间高度相关，使线粒体在人体健康中扮演着十分重要的角色。具体来说，当线粒体老化，则会提高人体罹患癌症的风险；而当线粒体DNA受损会使人体产生线粒体缺损相关疾病，如线粒体肌病。目前临床上致力于开发线粒体疗法作为治疗与线粒体缺损相关疾病的新兴疗法，而为能够提高线粒体疗法的成功率，要如何在体外提高线粒体的功能与活性为要克服的一大问题。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种提升线粒体功能的培养方法及其使用的组合物，其通过本发明所提供的组合物培养已分离细胞，使细胞内线粒体功能及活性被提升，进而达到调控细胞利用能量或转换的功效。

本发明的另一目的在于提供一种提升线粒体功能的培养方法及其使用的组合物，其能够降低所培养细胞中的氧化自由基浓度，并且能够提高所培养细胞中的线粒体的基础能量、极限能量、储备能量及ATP生成的能力，以达到活化线粒体及提升线粒体功能的功效。

本发明的又一目的在于提供一种提升线粒体功能的培养方法及其使用的组合物，其能够有效提升线粒体储能及调控能量的能力，并使细胞能够具有较高的耗氧能力。

缘是，为能达成上述目的，本发明所揭一种提升线粒体功能的培养方法，其包含有下列步骤：

a.取一已分离且具分化能力的细胞；

b.取一细胞基础培养基，并添加一预定量的生长因子、一预定量的N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine)，得到一培养组合物；

c.将该已分离且具分化能力的细胞培养于该培养组合物。

在本发明的另一实施例中，该已分离且具分化能力的细胞为一干细胞，如脂肪干细胞。

在本发明的一实施例中，该细胞基础培养基为无血清培养基或是任何可以使细胞在体外生长的合成培养基，举例来说，如用以培养角质细胞或上皮细胞的基础培养液(Keratinocyte-SFM)。

在本发明的另一实施例中，该生长因子为表皮细胞生长因子，而该生长因子能够通过基因工程重组而得，或是来自动物细胞。

为能使被培养的细胞耗氧率及能使细胞中线粒体能量储存能力被提升，该生长因子的添加量小于该N-乙酰-L-半胱氨酸的添加量；具体来说，在本发明的一实施例中，在该培养组合物中，该生长因子与该N-乙酰-L-半胱氨酸的比例约为1：2，其中，上述比例非以限制该培养组合物中生长因子与N-乙酰-L-半胱氨酸的添加量或所占重量百分比，如同本发明所属技术领域且具通常知识者所周知者，在科学研究所能接受的误差值内，相近于上述1：2的比例应为本发明所能包含者。

在本发明的另一实施例揭露一种组合物，用于作为提升被培养的线粒体的功能，其包含有一生长因子及一N-乙酰-L-半胱氨酸，其中，该生长因子的含量小于该N-乙酰-L-半胱氨酸的含量。

其中，该生长因子与该-乙酰-L-半胱氨酸的重量比为1:2。

在本发明的一实施例中，该组合物得更包含有细胞基础培养基或是得添加至细胞基础培养基，举例来说，当该组合物中含有基础培养基、生长因子及N-乙酰-L-半胱氨酸时，其组成重量比为99.4％、0.2％及0.4％。

其中，该细胞基础培养基为无血清培养基或是任何可以使细胞在体外生长的合成培养基。

其中，该生长因子可由人工合成，或是分离自动物细胞，例如表皮细胞生长因子。

本发明的有益效果在于：

本发明提供一种提升线粒体功能的培养方法及其使用的组合物，其通过本发明所提供的组合物培养已分离细胞，使细胞内线粒体功能及活性被提升，进而达到调控细胞利用能量或转换的功效。

附图说明

图1为检测以不同培养条件下所培养的细胞，其内线粒体的基础能量的结果。

图2为检测以不同培养条件下所培养的细胞，其内线粒体的ATP生成的结果。

图3为检测以不同培养条件下所培养的细胞，其内线粒体的极限能量的结果。

图4为检测以不同培养条件下所培养的细胞，其内线粒体的储备能量的结果。

具体实施方式

本发明揭露一种提升线粒体功能的培养方法及其使用的组合物，其通过使用具良好抗氧化能力的培养组合物，在培养过程中能够消除培养环境及培养细胞所产出的自由基，达到维持培养细胞活性及能力的功效，更能够进一步调控培养细胞内的线粒体的能量转换及供给路径，以提高线粒体的基础能量、极限能量、储备能量及ATP生成的能力，达到提升细胞能量转换效率及耗氧效率的功效。

更进一步来说，本发明所使用的组合物主要包含有表皮生长因子及N-乙酰-L-半胱氨酸，可用于作为培养添加剂，加入细胞基础培养基中；或是本发明所使用的组合物中可更包含有细胞基础培养基，直接用于作为细胞培养的基质用。

以本发明的一实例来说，本发明所揭培养方法中，将细胞基础培养基中添加一预定量的表皮细胞生长因子及一预定量的N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine)，以获得一培养组合物，其中，N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine)的添加量大于表皮细胞生长因子的添加量。

举例来说，当表皮细胞生长因子在细胞组合物中的添加量为N-乙酰-L-半胱氨酸在细胞组合物中的添加量的一半时，本发明所揭培养组合物能够达到较佳的提升细胞能量转换效率。

所谓细胞基础培养基，指能够用于培养细胞的培养基，而细胞基础培养基中含有能够所培养细胞在体外生长和增殖的营养物质，举例来说，Keratinocyte-SFM用于培养角质细胞或上皮细胞的基础培养基，可另外添加适当的生长因子或血清。在本发明所揭实例中，以Keratinocyte-SFM做为细胞基础培养基，用以培养脂肪干细胞。

所谓生长因子，能添加于细胞基础培养基中，用以调节细胞生长、增殖、分化等，而生长因子可以基因工程重组获得，也可在细胞中取得，举例来说，rEGF为重组表皮细胞生长因子，能够与细胞上表皮生长因子受体结合，进而调控细胞，并诱导细胞分泌生长所需的生长因子，借以达到促进细胞生长、增值与分化的功效。

所谓N-乙酰-L-半胱氨酸，其能够在细胞内外具有良好的抗氧化能力，结构式如下：

其中，N-乙酰-L-半胱氨酸能够通过-氢硫基与与自由基结合而能够消除自由基，而必须加以说明者，虽然N-乙酰-L-半胱氨酸能够消除细胞内的自由基而减少自由基对于细胞的损伤，惟，在过去文献中未揭露N-乙酰-L-半胱氨酸能够调控线粒体能量代谢的路径。

此外，本发明所揭培养组合物除能够作为一产品进行贩售外，更可与其他佐剂、化合物、药物、细胞等搭配使用，而调配比例则依据本发明所属技术领域的通常知识者通过经验及实验而能得到。

以下，为能证实本发明的功效，将兹举一实例并搭配图式做更进一步说明如后。

以下实例中所检测的活性指标，先以叙明如下：

所谓基础能量，指线粒体所产生的能量，计算公式如下：

线粒体基础能量＝线粒体能量+自由基能量消耗

所谓极限能量，指线粒体的最大产能，意即当线粒体遇到突发状况时，所额外制造出的能量值，计算公式如下：

线粒体极限能量＝线粒体遇突发状况所产生的能量-线粒体基础能量

所谓线粒体能量，指线粒体利用的能量。

所谓储存能量，指线粒体保留(欲存)的潜力，计算公式如下：

线粒体储备能量＝线粒体极限能量-线粒体基础能量。

实例一：制备培养组合物

分别购入Keratinocyte SFM培养基、重组表皮细胞生长因子及N-乙酰-L-半胱氨酸，并依据下表一所列的成分及其添加量，制备本发明所揭培养组合物以及一般培养基。

表一：各培养基的组成

实例二：培养脂肪干细胞

自捐赠者皮下取脂肪约3-5克进行脂肪干细胞分离与培养，完成后，取脂肪干细胞，分为两组，其中一组脂肪干细胞培养于实例一中制备的一般培养基，另一组脂肪干细胞则培养在实例一所制备的培养组合物中；其中，脂肪干细胞的培养流程如下：当脂肪干细胞在培养皿中满度达8成时进行细胞继代；移除培养液后加入磷酸盐缓冲液清洗；移除磷酸盐缓冲液并加入0.25％胰蛋白酶在37℃培养箱内作用3分钟；将细胞自培养皿中拍打下来并加入培养液中和胰蛋白酶的作用，接者将细胞自培养皿中收集至离心管内并进行离心(300g,5min)；移除上清液，加入培养液将细胞回溶并进行细胞计数；以起始为2x10⁴(cells/ml)的浓度在37℃及5％CO₂的细胞培养箱中进行细胞培养；约3-4天进行新的继代培养。

该两组脂肪干细胞培养完成后，分别将各组脂肪干细胞培养于检测盘中，待各组脂肪干细胞长满后，使用海马生物能量测定仪进行线粒体功能检测(耗氧量分析)，检测细胞氧气消耗速率，进而推知各组脂肪干细胞内线粒体的基础能量、ATP能量生成、极限能量及储备能量，结果分别如图1至图4所示；其中，线粒体功能检测步骤如下：

检测细胞内的基础耗氧量(Basal Respiration)。

加入寡霉素(Oligomycin)抑制线粒体产生ATP，此时检测到所减少的耗氧量即为ATP能量生成能力(ATP production)。

接着加入FCCP(点子传递链上的耦合剂)会造成线粒体H+浓度不平衡，进而处使耗氧量快速增加，以评估线粒体的产能极限(Maximal Respiration)。

加入antimycin A或Rotenone(电子传递链抑制剂)，使整个电子传递链的功能完全抑制，以测得非线粒体来源的耗氧量(Non-Mito Respiration)。

将极限能量扣掉基础耗氧量后所得的值即为线粒体储备能量(Spare Capacity)。

由图1至图4所示结果，可知以本发明所揭培养组合物进行培养的脂肪干细胞所测得的氧气消耗速率明显高于以一般基础培养基培养的脂肪干细胞，显示本发明所揭培养组合物确实能够增加线粒体活性，使之能够提升线粒体的基本能量、能量生成效率。

再者，基于通过本发明所揭培养组合物培养的线粒体有较高极限能量，显示本发明所揭培养组合物能够使线粒体能够保存足够的能量，以提高线粒体应变突发情况的能力，降低线粒体因突发状况受损的风险，换言之，本发明所揭培养组合物能够持续维持线粒体健康及活性，并预防线粒体受损的情形发生。

Claims

1.一种提升线粒体功能的培养方法，其特征在于，包含有下列步骤：

步骤a：取一已分离且具分化能力的细胞；

步骤b：取一细胞基础培养基，并添加一预定量的生长因子、一预定量的N-乙酰-L-半胱氨酸，得到一培养组合物；

步骤c：将该已分离且具分化能力的细胞培养于该培养组合物，使细胞内线粒体的能量生成效率及储能效率被提升。

2.如权利要求1所述提升线粒体功能的培养方法，其特征在于，该已分离且具分化能力的细胞为一干细胞。

3.如权利要求1所述提升线粒体功能的培养方法，其特征在于，该细胞基础培养基为无血清培养基。

4.如权利要求1所述提升线粒体功能的培养方法，其特征在于，该生长因子为表皮细胞生长因子。

5.如权利要求1所述提升线粒体功能的培养方法，其特征在于，该生长因子的添加量小于该N-乙酰-L-半胱氨酸的添加量。

6.如权利要求5所述提升线粒体功能的培养方法，其特征在于，该生长因子与该N-乙酰-L-半胱氨酸的比例约为1：2。

7.一种将N-乙酰-L-半胱氨酸用于制备线粒体活性促进剂的用途。

8.如权利要求7所述组合物，其特征在于，该线粒体活性促进剂更包含有一生长因子，且该生长因子的含量小于该N-乙酰-L-半胱氨酸的含量。

9.一种将N-乙酰-L-半胱氨酸用于制备细胞耗氧率促进剂的用途。

10.如权利要求9所述组合物，其特征在于，该细胞耗氧率促进剂更包含有一生长因子，且该生长因子的含量小于该N-乙酰-L-半胱氨酸的含量。