TWI675678B - 亞丁基苯酞於多巴胺神經前驅細胞移植治療的應用 - Google Patents

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Abstract

一種使用亞丁基苯酞（n-butylidenephthalide，BP）於多巴胺神經前驅細胞移植治療的應用，包括使用亞丁基苯酞（BP）以提升多巴胺神經前驅細胞移植治療之治療效益、以及於多巴胺神經前驅細胞移植治療中併用亞丁基苯酞（BP）與經亞丁基苯酞（BP）處理過之多巴胺神經前驅細胞。前述應用尤其是關於使用亞丁基苯酞（BP）以提升多巴胺神經前驅細胞移植治療於治療巴金森氏症之效益。

Description

亞丁基苯酞於多巴胺神經前驅細胞移植治療的應用
本發明係關於使用亞丁基苯酞（BP）於細胞移植治療之應用，尤其是關於亞丁基苯酞（BP）在多巴胺神經前驅細胞移植治療之應用，包括使用亞丁基苯酞（BP）以提升多巴胺神經前驅細胞移植治療之治療效益，以及於多巴胺神經前驅細胞移植治療中併用亞丁基苯酞（BP）與經亞丁基苯酞（BP）處理過之多巴胺神經前驅細胞。前述應用尤其是關於使用亞丁基苯酞（BP）以提升多巴胺神經前驅細胞移植治療於治療巴金森氏症之效益。
巴金森氏症（Parkinson’s disease）是一種常見的中樞神經退化性疾病，主要病因為多巴胺神經元細胞退化及／或死亡所導致的多巴胺分泌量下降，進而使患者失去運動控制的能力，因此，巴金森氏症的病徵多為肢體動作上的障礙。目前臨床上用以治療巴金森氏症的藥物（例如L-dopa）係透過增加體內多巴胺的含量來控制病情。然而，隨著病程進展，當患者體內的多巴胺神經元死亡達到一定程度，L-dopa或更侵入性的刺激治療方式所能提供的治療效果則相當有限。
因此，業界及相關研究單位皆持續致力於開發可有效治療巴金森氏症的藥物或方法。近年，多巴胺神經前驅細胞移植治療係為巴金森氏症病患帶來治療新契機。所謂「多巴胺神經前驅細胞移植治療」，係透過將多巴胺神經前驅細胞移植到患者腦部，使多巴胺神經前驅細胞在患者腦部分化成多巴胺神經元，藉此達到補充患者體內多巴胺神經元的數目以增加神經軸突生長（neurite outgrowth）的效果。然而，經發現，當多巴胺神經前驅細胞被以細胞團塊之形式移植至患者腦部後，雖可分化成多巴胺神經元，但大部分的多巴胺神經元仍集中於細胞團塊之中、無法移動到細胞團塊外，故無法有效建立新的神經網路，所達到之治療效果仍然有限。
針對上述問題，本案發明人研究發現，在多巴胺神經前驅細胞分化成多巴胺神經元的過程中，於細胞培養環境中加入亞丁基苯酞（BP），可誘使多巴胺神經元移動、促進多巴胺神經元移動到細胞團塊外、幫助快速建立神經連結。因此，亞丁基苯酞（BP）可用於多巴胺神經前驅細胞移植治療中，以促進多巴胺神經前驅細胞在分化成多巴胺神經元後移動到細胞團塊外、幫助快速建立神經連結，達到提升多巴胺神經前驅細胞移植治療之治療效益的效果。
本發明之一目的，在於提供一種提升多巴胺神經前驅細胞移植治療之治療效益的方法，其係包含使用一含有一活性成分之多巴胺神經前驅細胞培養液以處理該多巴胺神經前驅細胞，其中該活性成分係亞丁基苯酞（BP）及／或其醫藥上可接受之鹽。較佳地，該培養液中之活性成分的含量為以亞丁基苯酞（BP）計每毫升培養液約0.5至20微克。舉例言之，前述方法可提升多巴胺神經前驅細胞移植治療於治療巴金森氏症之效益。
本發明之另一目的，在於提供一種組合，其係包含以下組成：（1）一條件培養液（conditional medium），包含一基礎培養液以及一神經誘導因子；以及（2）亞丁基苯酞（BP）及／或其醫藥上可接受之鹽。較佳地，該神經誘導因子係選自以下群組：纖維母細胞生長因子、轉化生長因子抑制劑、肝醣合成酶激酶抑制劑、嘌嗎啡胺（Purmorphamine）、及前述之組合，且其中，該纖維母細胞生長因子係纖維母細胞生長因子-2（Fibroblast growth factor-2，FGF-2）及纖維母細胞生長因子-8b（Fibroblast growth factor-8b，FGF-8b）之至少一者，該轉化生長因子抑制劑係SB-431542，該肝醣合成酶激酶抑制劑係BIO。更佳地，該神經誘導因子係纖維母細胞生長因子-8b（FGF-8b）及嘌嗎啡胺（Purmorphamine）。
本發明之再一目的，在於提供一種使用一活性成分於製備一藥劑的用途，其中該活性成分係亞丁基苯酞（BP）及／或其醫藥上可接受之鹽，且該藥劑係與經亞丁基苯酞（BP）及／或其醫藥上可接受之鹽處理過之多巴胺神經前驅細胞併用於細胞移植治療中。其中，該處理係以含有亞丁基苯酞（BP）及／或其醫藥上可接受之鹽之多巴胺神經前驅細胞培養液進行，較佳地，該培養液中之亞丁基苯酞（BP）及／或其醫藥上可接受之鹽的含量為以亞丁基苯酞（BP）計每毫升培養液約0.5至20微克。較佳地，該藥劑係以選自以下群組之至少一方式施用：口服投藥、鼻腔投藥、皮質脊髓注射、鞘內注射、腦內注射、靜脈注射、腹腔注射、及皮下注射；該經處理過之多巴胺神經前驅細胞係以選自以下群組之至少一方式施用：皮質脊髓注射、鞘內注射、腦內注射、靜脈注射、腹腔注射、及皮下注射。舉例言之，該藥劑係與該經處理過之多巴胺神經前驅細胞係併用於治療巴金森氏症之細胞移植治療中。
本發明之又一目的，在於提供一種多巴胺神經前驅細胞移植治療方法，其係包含對一有需要之個體投予一有效量之第一部分以及一有效量之第二部分，其中該第一部分係包含亞丁基苯酞（BP）及／或其醫藥上可接受之鹽，該第二部分係經亞丁基苯酞（BP）及／或其醫藥上可接受之鹽處理過之多巴胺神經前驅細胞。較佳地，該第一部分係以選自以下群組之至少一方式施用：口服投藥、鼻腔投藥、皮質脊髓注射、鞘內注射、腦內注射、靜脈注射、腹腔注射、及皮下注射；該第二部分係以選自以下群組之至少一方式施用：皮質脊髓注射、鞘內注射、腦內注射、靜脈注射、腹腔注射、及皮下注射。舉例言之，本發明之多巴胺神經前驅細胞移植治療方法可用於治療巴金森氏症。
本發明之詳細技術內容及部分具體實施態樣，將描述於以下內容中，以供本發明所屬領域具通常知識者據以明瞭本發明之特徵。
以下將描述根據本發明之部分具體實施態樣；惟，在不背離本發明精神下，本發明尚可以多種不同形式之態樣來實踐，不應將本發明保護範圍解釋為限於說明書所陳述者。此外，除非文中有另外說明，於本說明書中（尤其是在後述專利申請範圍中）所使用之「一」、「該」及類似用語應理解為包含單數及複數形式；所謂“個體”是指人類或非人的哺乳動物。
本說明書中所使用之數值範圍（例如5至100）應理解為亦包含在該範圍中的所有有理數以及在該範圍中之任何有理數所組成的範圍，因此，本說明書中所使用之數值範圍係包含介於所列舉之最低值與最高值之間的數值的所有可能組合。
於本文中，所謂「醫藥可接受之鹽」，係包括「所述含有酸性官能基之化合物」與「有機或無機鹼」所形成之「醫藥可接受鹼加成鹽」、以及「所述含有鹼性官能基之化合物」與「有機或無機酸」所形成之「醫藥可接受酸加成鹽」。
其中，該與無機鹼所形成之「醫藥可接受鹼加成鹽」的例子包括，但不限於，鹼金屬鹽（如鈉鹽、鉀鹽）、鹼土金屬鹽（如鈣鹽、鎂鹽）、過渡金屬鹽（如鐵鹽、鋅鹽、銅鹽、錳鹽及鋁鹽）、以及銨鹽。
該與有機鹼所形成之「醫藥可接受鹼加成鹽」的例子包括，但不限於，與甲基胺、二甲基胺、三甲基胺、乙基胺、二乙基胺、三乙基胺、異丙基胺、三丙基胺、三丁基胺、乙醇胺、二乙醇胺、2-二甲基胺乙醇、2-二乙基胺乙醇、二環己基胺、離胺酸鹽、精胺酸鹽、組胺酸鹽、咖啡鹼、海巴胺（hydrabamine）、膽鹼、甜菜鹼、乙烯二胺、葡萄糖胺、甲基葡萄糖胺、可可鹼、嘌呤、哌啶、N-乙基哌啶、四甲基銨化合物、四乙基銨化合物、吡啶、N,N-二甲基苯胺、N-甲基哌啶、N-甲基嗎啉、二環己基胺、二苯甲基胺、N,N-二苯甲基苯乙基胺、1-伊芬胺（1-ephenamine）、N,N-二苯甲基乙烯二胺、聚胺樹脂及其類似物等所形成之鹽。
該與無機酸所形成之「醫藥可接受酸加成鹽」的例子包括，但不限於，與氫溴酸、鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸、過氯酸等所形成之鹽。
該與有機酸所形成之「醫藥可接受酸加成鹽」的例子包括，但不限於，與磺酸（如對甲苯磺酸、苯磺酸、甲磺酸、乙磺酸、2-羥基乙磺酸、萘磺酸）、羧酸（如乙酸、丙酸、富馬酸、馬來酸、苯甲酸、水楊酸、琥珀酸）、陰離子胺基酸（如穀胺酸、天門冬胺酸）、羥基酸（如檸檬酸、乳酸、酒石酸、乙醇酸、蘋果酸）、脂肪酸（如己酸、辛酸、癸酸、油酸、硬脂酸）、雙羥萘酸、樹脂酸等所形成之鹽。
於本文中，所謂「以亞丁基苯酞（BP）計」，係指當以BP之醫藥上可接受之鹽作為活性成分時，係以該BP之醫藥上可接受之鹽所能提供之BP的量為基準來返算得到之該鹽用量。
如上述，巴金森氏症主要病因為多巴胺神經元細胞退化及／或死亡所導致的多巴胺分泌量下降，進而使患者失去運動控制的能力，而多巴胺神經前驅細胞移植治療已為巴金森氏症病患帶來治療新契機。目前，用於細胞移植治療的多巴胺神經前驅細胞則多由誘導胚胎幹細胞分化而來；舉例言之，以一基礎培養液對胚胎幹細胞進行培養，並於該培養液中加入纖維母細胞生長因子（例如FGF-2、FGF-8b）、轉化生長因子抑制劑（例如SB-431542）、肝醣合成酶激酶抑制劑（例如BIO）、及／或嘌嗎啡胺（Purmorphamine）等神經誘導因子，可誘使胚胎幹細胞分化成多巴胺神經前驅細胞。
然而，當多巴胺神經前驅細胞被以細胞團塊之形式移植至患者腦部後，雖可分化成多巴胺神經元，但大部分的多巴胺神經元仍集中於細胞團塊之中、無法移動到細胞團塊外，故無法有效建立新的神經網路，治療效果有限。前述可參見例如Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature548, 592-596 (2017)及Predictive Markers Guide Differentiation to Improve Graft Outcome in Clinical Translation of hESC-Based Therapy for Parkinson's Disease. Cell stem cell20, 135-148, (2017)，該文獻之全文併於此處以供參考。
本案發明人研究發現，在多巴胺神經前驅細胞分化成多巴胺神經元的過程中，於細胞培養環境中加入亞丁基苯酞（BP），可誘使多巴胺神經元移動、促進多巴胺神經元移動到細胞團塊外、幫助快速建立神經連結。從而，可使用亞丁基苯酞（BP）於多巴胺神經前驅細胞移植治療中，以促進多巴胺神經前驅細胞在分化成多巴胺神經元後移動到細胞團塊外、幫助快速建立神經連結，達到提升多巴胺神經前驅細胞移植治療之治療效益的效果。
因此，本發明係關於亞丁基苯酞（BP）於提升多巴胺神經前驅細胞移植治療之治療效益及應用，尤其是提升多巴胺神經前驅細胞移植治療於治療巴金森氏症之效益，包括提供提升多巴胺神經前驅細胞移植治療之治療效益的方法及組合。其中，該方法係包含使用一含有亞丁基苯酞（BP）及／或其醫藥上可接受之鹽之多巴胺神經前驅細胞培養液以處理該多巴胺神經前驅細胞，該組合係包含（1）一含有基礎培養液及神經誘導因子之條件培養液、以及（2）亞丁基苯酞（BP）及／或其醫藥上可接受之鹽。
於本發明之提升多巴胺神經前驅細胞移植治療之治療效益的方法中，所謂「使用一含有亞丁基苯酞（BP）及／或其醫藥上可接受之鹽之多巴胺神經前驅細胞培養液以處理該多巴胺神經前驅細胞」係指於進行該處理時，多巴胺神經前驅細胞係存在於多巴胺神經前驅細胞培養液中。此外，於根據本發明方法所使用之多巴胺神經前驅細胞培養液係包含一基礎培養液以及神經誘導因子，其中該基礎培養液可提供多巴胺神經前驅細胞生長所需養分與條件（如酸鹼值等）之必要成分。一般而言，可採用之基礎培養液的例子包括，但不限於，添加有N2補充劑（N2 supplement）之DMEM/F12培養液（Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12）及添加有N2補充劑之神經基礎培養液（Neural Basal Medium）。舉例言之，可使用添加有N2補充劑之DMEM/F12培養液作為基礎培養液，以進行多巴胺神經前驅細胞之處理。
該用以處理多巴胺神經前驅細胞之培養液中之亞丁基苯酞（BP）及／或其醫藥上可接受之鹽的含量，通常為以亞丁基苯酞（BP）計每毫升培養液約0.5至20微克；較佳為以亞丁基苯酞（BP）計每毫升培養液約2至15微克；更佳為以亞丁基苯酞（BP）計每毫升培養液約3至12微克。舉例言之，如後附實施例所示，當以每毫升培養液使用約0.9至19微克的亞丁基苯酞（BP）時（相當於使用約5至100微莫耳濃度之亞丁基苯酞（BP）），可有效地誘使多巴胺神經元移動、促進多巴胺神經元移動到細胞團塊外。
根據本發明所提供之組合，係包含以下組成：（1）一條件培養液（conditional medium），包含一基礎培養液以及一神經誘導因子；以及（2）亞丁基苯酞（BP）及／或其醫藥上可接受之鹽。於該組合中，有關基礎培養液的選用、以及亞丁基苯酞（BP）及／或其醫藥上可接受之鹽的用量範圍，均如上述之說明。
除基礎培養液以外，根據本發明所提供之組合的組成（1）條件培養液可更含有任何可以幫助誘導幹細胞分化成多巴胺神經前驅細胞的神經誘導因子，例如，纖維母細胞生長因子、轉化生長因子抑制劑、肝醣合成酶激酶抑制劑、嘌嗎啡胺（Purmorphamine）、及前述之組合，但不以此為限。較佳地，該纖維母細胞生長因子係纖維母細胞生長因子-2（Fibroblast growth factor-2，FGF-2）及纖維母細胞生長因子-8b（Fibroblast growth factor-8b，FGF-8b）之至少一者，該轉化生長因子抑制劑係SB-431542，該肝醣合成酶激酶抑制劑係BIO。更佳地，該神經誘導因子係纖維母細胞生長因子-8b（FGF-8b）及嘌嗎啡胺（Purmorphamine）。
於根據本發明所提供之組合可以是一套組或一組合物。當根據本發明所提供之組合是一套組，該組成（1）條件培養液與組成（2）亞丁基苯酞（BP）及／或其醫藥上可接受之鹽通常係分開包裝、各自儲存於不同的容納空間（例如塑膠袋、塑膠瓶、玻璃瓶、安瓿（ampoule））中，且可各自分開運送或銷售，亦可組合成套一起配送與銷售。此外，該組成（1）條件培養液的子成分亦可分開包裝、各自儲存。該套組可另包含一使用說明書，以利使用者在使用時，可根據其中所擬定之程序與流程，於現場才混合各成分以進行細胞培養、處理及施用。
舉例言之，當根據本發明所提供之套組中之組成（1）條件培養液的子成分、及組成（2）亞丁基苯酞（BP）及／或其醫藥上可接受之鹽係分開包裝、各自儲存於不同的容納空間，且各自分開運送或銷售時，可將神經誘導因子（例如FGF-2、FGF-8b、SB-431542及BIO等）、以及亞丁基苯酞（BP）及／或其醫藥上可接受之鹽置於-20°C以下的環境下避光保存；將基礎培養液置於-20°C之環境下保存。又例如，當本發明套組之各成分係組合成套以配送與銷售時，可以一內部呈-20°C之避光容器來盛裝前述神經誘導因子、亞丁基苯酞（BP），並以一內部呈-20°C之容器來盛裝基礎培養液。各該容器之形狀、大小並無特殊限制，只要各該容器之容納空間具有與外部之溫度隔絕的功能，使各該成分於一起配送與銷售時不會互相影響保存溫度即可。
在使用根據本發明之套組時，各成分的調配混合順序並無特殊限制。當條件培養液之子成分係分開包裝時，例如可先調配好條件培養液，再與亞丁基苯酞（BP）及／或其醫藥上可接受之鹽混合；亦可先將亞丁基苯酞（BP）及／或其醫藥上可接受之鹽與基礎培養液混合，再與其他子成分混合；或者，可將條件培養液的各子成分與亞丁基苯酞（BP）及／或其醫藥上可接受之鹽同時混合。此外，可直接混合亞丁基苯酞（BP）及／或其醫藥上可接受之鹽與條件培養液或基礎培養液；或者，可先將亞丁基苯酞（BP）及／或其醫藥上可接受之鹽溶解於一溶劑中以提供一亞丁基苯酞（BP）溶液，之後再將該亞丁基苯酞（BP）溶液與條件培養液或基礎培養液混合。其中，可用於溶解亞丁基苯酞（BP）及／或其醫藥上可接受之鹽之溶劑的例子包括，但不限於，二甲基亞碸（DMSO）、乙醇及植物性油。
當根據本發明所提供之組合是一組合物，則該組成（1）條件培養液與組成（2）亞丁基苯酞（BP）及／或其醫藥上可接受之鹽通常係經混合而儲存於相同的容納空間（例如塑膠袋、塑膠瓶、玻璃瓶、安瓿（ampoule））中。
根據本發明，將本發明所提供之組合使用於多巴胺神經前驅細胞移植治療，可誘使多巴胺神經元移動、促進多巴胺神經元移動到細胞團塊外、幫助快速建立神經連結，從而達到提升多巴胺神經前驅細胞移植治療之治療效益的效果。舉例言之，但不以此為限，當使用本發明之組合於多巴胺神經前驅細胞移植治療中時，可先使用一包含基礎培養液、以及FGF-2、FGF-8b、SB-431542、BIO、Purmorphamine等神經誘導因子之條件培養液培養一幹細胞，以誘導該幹細胞分化成多巴胺神經前驅細胞；接著，再將前述條件培養液置換成一包含基礎培養液與亞丁基苯酞（BP）及／或其醫藥上可接受之鹽之條件培養液，繼續培養該多巴胺神經前驅細胞約8至12天；最後再將所獲得之多巴胺神經前驅細胞移植至有需要的個體中。
於根據本發明之使用亞丁基苯酞（BP）及／或其醫藥上可接受之鹽於製備一藥劑的用途中，該藥劑係與經亞丁基苯酞（BP）及／或其醫藥上可接受之鹽處理過之多巴胺神經前驅細胞併用於細胞移植治療中。其中，該處理係以含有亞丁基苯酞（BP）及／或其醫藥上可接受之鹽之多巴胺神經前驅細胞培養液進行，且該培養液中之亞丁基苯酞（BP）及／或其醫藥上可接受之鹽的含量通常為以亞丁基苯酞（BP）計每毫升培養液約0.5至20微克；較佳為以亞丁基苯酞（BP）計每毫升培養液約2至15微克；更佳為以亞丁基苯酞（BP）計每毫升培養液約3至12微克。
根據本發明所提供之藥劑係可呈任何合宜的形式，並無特殊限制，端視所欲之用途而呈對應之合宜劑型。舉例言之，但不以此為限，該藥劑可以口服或非經口服（例如：鼻腔投予、皮質脊髓注射、鞘內注射、腦內注射、靜脈注射、腹腔注射、及皮下注射）之投藥方式施用至個體上。視使用形式及用途而定，可選用合宜之載劑以提供該藥劑，其中該載劑包括賦形劑、稀釋劑、輔助劑、安定劑、吸收延遲劑、崩散劑、增溶劑、乳化劑、抗氧化劑、黏合劑、結合劑、增黏劑、分散劑、懸浮化劑、潤滑劑、吸濕劑等。
以適於口服之劑型為例，可於根據本發明所提供之藥劑中含有任何不會不利影響活性成分（即，亞丁基苯酞（BP）及／或其醫藥上可接受之鹽）之所欲效益的醫藥上可接受之載劑，例如：水、食鹽水、葡萄糖（dextrose）、甘油、乙醇或其類似物、纖維素、澱粉、糖膨潤土（sugar bentonite）、及前述之組合。可利用任何合宜之方法，將該藥劑以適於口服投藥的劑型提供，例如：錠劑（例如糖衣錠）、丸劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、流浸膏劑、溶液劑、糖漿劑、懸液劑、酊劑等。
至於適於皮質脊髓注射、鞘內注射、腦內注射、靜脈注射、腹腔注射、或皮下注射之針劑或點滴劑，則可於根據本發明所提供之藥劑中含有一或多種例如等張溶液、鹽類緩衝液（如磷酸鹽緩衝液或檸檬酸鹽緩衝液）、增溶劑、乳化劑、5%糖溶液、以及其他載劑等成分，以靜脈輸注液、乳劑靜脈輸注液、乾粉注射劑、懸液注射劑、或乾粉懸液注射劑等劑型提供該藥劑。或者，將該藥劑製備成一注射前固體，以可溶於其他溶液或懸浮液中之劑型、或可乳化之劑型提供該注射前固體，並於投予至該有需要之個體前將該注射前固體溶於其他溶液或懸浮液中、或將其乳化，提供所欲之注射劑。
視需要地，可於根據本發明所提供之藥劑中另含有合宜用量之添加劑，例如可提高該藥劑於服用時的口適感及視覺感受之調味劑、調色劑、著色劑等，以及可改善該藥劑的穩定性及儲存性之緩衝劑、保存劑、防腐劑、抗菌劑、抗真菌劑等。此外，該藥劑可視需要另含一或多種其他活性成分，或者與含該一或多種其他活性成分之藥物併用，以進一步加強該藥劑之功效或增加製劑配方的運用靈活性與調配度，只要該其他活性成分對本發明活性成分（即，亞丁基苯酞（BP）及／或其醫藥上可接受之鹽）之效益沒有不利的影響即可。
於根據本發明之用途中，除了施用本發明所提供之藥劑外，亦須對該有需要之個體投予經亞丁基苯酞（BP）及／或其醫藥上可接受之鹽處理過之多巴胺神經前驅細胞，該經處理過之多巴胺神經前驅細胞的投予係可與該藥劑之投予同時或分別進行。其中，該經處理過之多巴胺神經前驅細胞之施用方式並無特殊限制，端視所欲之用途而呈對應之合宜劑型。舉例言之，但不以此為限，該經處理過之多巴胺神經前驅細胞可以呈針劑、細胞輸注劑等劑型，且可藉由皮質脊髓注射、鞘內注射、腦內注射、靜脈注射、腹腔注射、皮下注射等投藥方式施用至個體上。當該經處理過之多巴胺神經前驅細胞係呈針劑、細胞輸注劑等劑型時，可於該等劑型中另含一或多種醫藥上可接受之載劑，例如：生理食鹽水。
此外，於根據本發明之用途中，該藥劑以及該經亞丁基苯酞（BP）及／或其醫藥上可接受之鹽處理過之多巴胺神經前驅細胞可分別以一日一次、一日多次、數日一次、或數週一次等不同頻率施用，端視投予個體之需求、年齡、體重及健康狀況而異。於該藥劑中，可視實際應用需求，調整本發明活性成分（即，亞丁基苯酞（BP）及／或其醫藥上可接受之鹽）於藥劑中的含量。舉例言之，當以每日口服兩次之方式施用該藥劑，並以每二週腦內注射一次的方式將經亞丁基苯酞（BP）及／或其醫藥上可接受之鹽處理過之多巴胺神經前驅細胞投予至一個體以治療巴金森氏症及／或延緩其發病時，該藥劑之用量，以亞丁基苯酞（BP）計，通常為每次約30毫克／公斤體重至約2,000毫克／公斤體重，較佳為每次約50毫克／公斤體重至約1,000毫克／公斤體重，更佳為每次約100毫克／公斤體重至約500毫克／公斤體重，其中，該單位「毫克／公斤體重」係指每公斤體重個體所須之投藥量。此外，所採用之多巴胺神經前驅細胞的用量，通常為每次約1x10 5個至約5x10 6個多巴胺神經前驅細胞，較佳為每次約1x10 6個至2x10 6個多巴胺神經前驅細胞。
本發明另關於一種多巴胺神經前驅細胞移植治療方法，其係包含對一有需要之個體投予一有效量之第一部分以及一有效量之第二部分，其中該第一部分係包含亞丁基苯酞（BP）及／或其醫藥上可接受之鹽，該第二部分係經亞丁基苯酞（BP）及／或其醫藥上可接受之鹽處理過之多巴胺神經前驅細胞。前述該有需要之個體係指，多巴胺神經元退化、多巴胺神經元退化死亡、及／或多巴胺分泌量不足之個體。其中，有關該第一部分及第二部分之用量範圍及使用條件，係如上述用途之說明。
茲以下列實施例進一步例示說明本發明。其中該等實施例僅提供作為說明，而非用以限制本發明之保護範圍。本發明保護範圍係如後附申請專利範圍所示。
實施例
[ 製備實施例 ]
A. 條件培養液之製備
A-1.以添加有N2補充劑（N2 supplement；購自Gibco公司，產品編號：17502048）之DMEM/F12培養液（Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12；購自Gibco公司，產品編號：11320033）作為基礎培養液，於其中進一步添加BIO（購自Sigma-Aldrich公司，產品編號：B1686）、SB-431542（購自Sigma-Aldrich公司，產品編號：S4317）、FGF-2（購自Peprotech公司，產品編號：100-18B）、Purmorphamine（購自Cayman Chemical公司，產品編號：10009634）、及FGF-8b（購自R&D System公司，產品編號：423-F8）等神經誘導因子，使前述該等神經誘導因子於基礎培養液中的最終濃度分別為BIO（0.5微莫耳濃度（µM））、SB-431542（10微莫耳濃度）、FGF-2（10奈克／毫升（ng/mL））、Purmorphamine（1微莫耳濃度）、及FGF-8b（50 奈克／毫升），以提供一條件培養液。
A-2.比照[製備實施例A-1]製備，但僅於基礎培養液中進一步添加Purmorphamine及FGF-8b，並使前述該等神經誘導因子於基礎培養液中的最終濃度分別Purmorphamine（1微莫耳濃度）及FGF-8b（50奈克／毫升），以提供另一條件培養液。
B. 多巴胺神經前驅細胞之製備
B-1. 胚胎幹細胞之前培養
將胚胎幹細胞（由茂盛醫院提供）培養於含有20%血清替代物（KnockOut Serum Replacement，KSR；購自Gibco公司，產品編號：10828028）之DMEM/F12培養液中，歷時2天，以使細胞成為懸浮球狀。
B-2. 胚胎幹細胞之分化
將[製備實施例B-1]所提供之懸浮球狀胚胎幹細胞培養於[製備實施例A-1]所提供之條件培養液中，歷時2天。接著，移除培養液，再以[製備實施例A-2]所提供之條件培養液繼續培養6天，以獲得一細胞液。
已知Corin為神經管中腦腹側的專一性表面蛋白，因此，係於上述所獲得之細胞液中加入Corin抗體（購自R&D System公司，產品編號：MAB2209），作用15分鐘後，以PBS清洗細胞一次，接著加入帶有螢光之二級抗體（購自Invitrogen公司，產品編號：A21208），作用15分鐘後，以PBS清洗細胞一次，最後，再用PBS將細胞懸浮。以Influx細胞分選儀（購自BD公司）對前述細胞懸浮液進行螢光偵測（如圖1所示，共有39.6%之細胞表現Corin）並分選出帶有螢光訊號的細胞，即為神經管中腦腹側之多巴胺神經前驅細胞。
C. 多巴胺神經前驅細胞之處理
於37℃、5%二氧化碳下，將[製備實施例B-2]所提供之多巴胺神經前驅細胞培養於[製備實施例A-2]所提供之條件培養液中，歷時24小時，接著，將細胞分成六組，並進行以下處理： （1） 對照組：將細胞繼續培養於[製備實施例A-2]所提供之條件培養液中（即，將細胞培養於不含亞丁基苯酞（BP）的培養液中），歷時10天。 （2） 「BP（5）」組、「BP（10）」組、「BP（20）」組、「BP（50）」組、及「BP（100）」組：比照對照組之條件進行，但進一步於各組培養液中添加亞丁基苯酞（BP）（購自Sigma-Aldrich公司，產品編號：W333301），使亞丁基苯酞（BP）於各組培養液中的最終濃度分別為5、10、20、50及100微莫耳濃度。
實施例 1 ：亞丁基苯酞 （ BP ） 對於多巴胺神經前驅細胞之分化能力的影響
為了解亞丁基苯酞（BP）對多巴胺神經前驅細胞分化為多巴胺神經元的影響，係以JuLI TMBr細胞影像分析儀（購自NanoEnTek公司）對[製備實施例C]之對照組細胞的分化過程進行連續拍攝（結果示於圖2），並於將[製備實施例C]之各組細胞培養至第6天時，使用倒立式顯微鏡（購自Nikon公司）拍照並記錄各組細胞之型態（結果示於圖3）。
如圖2所示，對照組細胞（即，未經亞丁基苯酞（BP）處理之多巴胺神經前驅細胞）於培養至第5天時，可觀察到神經分化的現象，培養至第10天時，則可觀察到細胞已分化為具有神經軸突型態的多巴胺神經元。此外，如圖3所示，對照組、「BP（5）」組、「BP（10）」組、「BP（20）」組、「BP（50）」組、及「BP（100）」組，皆能觀察到神經纖維的形成。前述該等結果顯示，亞丁基苯酞（BP）處理並不會對多巴胺神經前驅細胞之正常神經分化造成影響。
實施例 2 ：亞丁基苯酞 （ BP ） 於促進多巴胺神經元移動的效果
為了解亞丁基苯酞（BP）對於多巴胺神經元的影響，係將[製備實施例C]之各組細胞於培養至第10天時進行固定，並以Sox-1（購自Santa Cruz公司，產品編號：SC-17318）、TH（tyrosine hydroxylase；購自Millipore公司，產品編號：MAB152）及DAPI（diamidino-2-phenylindole；購自ThermoFisher Scientific公司，產品編號：D1306）等抗體對各組細胞分別進行螢光染色（其中，Sox-1表現於多巴胺神經前驅細胞，TH表現於多巴胺神經元，DAPI為細胞核染劑），最後，再以正立螢光顯微鏡（購自Nikon公司）觀察多巴胺神經前驅細胞（綠色螢光）、多巴胺神經元（紅色螢光）及細胞核（藍色螢光）。結果分別示於圖4。
如圖4所示，相較於對照組，「BP（5）」組、「BP（10）」組、「BP（20）」組、「BP（50）」組、及「BP（100）」組皆能觀察到多巴胺神經元移動到細胞團塊外的情形，其中又以「BP（50）」組之多巴胺神經元移動的情形最為顯著。前述結果顯示，亞丁基苯酞（BP）確實可有效誘使多巴胺神經元移動，故可用於多巴胺神經前驅細胞移植治療中，以促進多巴胺神經前驅細胞在分化成多巴胺神經元後移動到細胞團塊外、幫助快速建立神經連結，達到提升多巴胺神經前驅細胞移植治療之治療效益的效果。
圖1係顯示以Influx細胞分選儀偵測細胞表面之Corin表現情形的結果圖；
圖2係顯示以JuLI TMBr細胞影像分析儀對未經亞丁基苯酞（BP）處理之多巴胺神經前驅細胞的分化過程進行連續拍攝的照片圖；
圖3係顯示以倒立式顯微鏡觀察各組細胞的照片圖，其中，對照組係培養於不含亞丁基苯酞（BP）之條件培養液中6天的多巴胺神經前驅細胞，「BP（5）」組、「BP（10）」組、「BP（20）」組、「BP（50）」組、及「BP（100）」組則係分別培養於亞丁基苯酞（BP）濃度為5、10、20、50及100微莫耳濃度之條件培養液中6天的多巴胺神經前驅細胞；以及
圖4係顯示以正立螢光顯微鏡觀察各組細胞的照片圖，其中，對照組培養於不含亞丁基苯酞（BP）之條件培養液中10天的多巴胺神經前驅細胞，「BP（5）」組、「BP（10）」組、「BP（20）」組、「BP（50）」組、及「BP（100）」組則係分別培養於亞丁基苯酞（BP）濃度為5、10、20、50及100微莫耳濃度之條件培養液中10天的多巴胺神經前驅細胞，且其中，綠色螢光代表多巴胺神經前驅細胞，紅色螢光代表多巴胺神經元，藍色螢光則代表細胞核。

Claims (10)

  1. 一種提升多巴胺神經前驅細胞移植治療之治療效益的方法，其係包含使用一含有一活性成分之多巴胺神經前驅細胞培養液以處理該多巴胺神經前驅細胞，其中該活性成分係亞丁基苯酞(n-butylidenephthalide，BP)及/或其醫藥上可接受之鹽，且其中該多巴胺神經前驅細胞培養液係包含一基礎培養液以及一神經誘導因子，該神經誘導因子係選自以下群組：纖維母細胞生長因子-2(Fibroblast growth factor-2，FGF-2)、纖維母細胞生長因子-8b(Fibroblast growth factor-8b，FGF-8b)、SB-431542、BIO、嘌嗎啡胺(Purmorphamine)、及前述之組合。
  2. 如請求項1之方法，其中該培養液中之活性成分的含量為以亞丁基苯酞(BP)計每毫升培養液約0.5至20微克。
  3. 如請求項1或2之方法，其中係提升多巴胺神經前驅細胞移植治療於治療巴金森氏症之效益。
  4. 一種組合，其係包含以下組成：(1)一條件培養液(conditional medium)，包含一基礎培養液以及一神經誘導因子；以及(2)亞丁基苯酞(BP)及/或其醫藥上可接受之鹽，其中該神經誘導因子係選自以下群組：纖維母細胞生長因子、轉化生長因子抑制劑、肝醣合成酶激酶抑制劑、嘌嗎啡胺(Purmorphamine)、及前述之組合，且其中，該纖維母細胞生長因子係纖維母細胞生長因子-2(FGF-2)及纖維母細胞生長因子-8b(FGF-8b)之至少一者，該轉化生長因子抑制劑係SB-431542，該肝醣合成酶激酶抑制劑係BIO。
  5. 如請求項4之組合，其中該神經誘導因子係纖維母細胞生長因子-8b(FGF-8b)及嘌嗎啡胺(Purmorphamine)。
  6. 一種使用一活性成分於製備一藥劑的用途，其中該活性成分係亞丁基苯酞(BP)及/或其醫藥上可接受之鹽，且該藥劑係與經亞丁基苯酞(BP)及/或其醫藥上可接受之鹽處理過之多巴胺神經前驅細胞併用於細胞移植治療中，且其中該多巴胺神經前驅細胞之處理係於含有纖維母細胞生長因子-2(FGF-2)、纖維母細胞生長因子-8b(FGF-8b)、SB-431542、BIO、及嘌嗎啡胺(Purmorphamine)之至少一種神經誘導因子的培養液中添加BP及/或其醫藥上可接受之鹽而進行。
  7. 如請求項6之用途，其中該處理係以含有亞丁基苯酞(BP)及/或其醫藥上可接受之鹽之多巴胺神經前驅細胞培養液進行，且該培養液中之亞丁基苯酞(BP)及/或其醫藥上可接受之鹽的含量為以亞丁基苯酞(BP)計每毫升培養液約0.5至20微克。
  8. 如請求項6或7之用途，其中該藥劑係與該經處理過之多巴胺神經前驅細胞併用於治療巴金森氏症之細胞移植治療中。
  9. 如請求項6或7之用途，其中該藥劑係以選自以下群組之至少一方式施用：口服投藥、鼻腔投藥、皮質脊髓注射、鞘內注射、腦內注射、靜脈注射、腹腔注射、及皮下注射。
  10. 如請求項6或7之用途，其中該經處理過之多巴胺神經前驅細胞係以選自以下群組之至少一方式施用：皮質脊髓注射、鞘內注射、腦內注射、靜脈注射、腹腔注射、及皮下注射。
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