TWI706780B - 粒線體用於製備治療阿茲海默症之醫藥組合物的用途 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於粒線體之用途，特別是粒線體用於治療及/或預防阿茲海默症之用途。

Description

粒線體用於製備治療阿茲海默症之醫藥組合物的用途
本發明係關於粒線體之用途，特別是粒線體用於治療及/或預防阿茲海默症之用途。
阿茲海默症(Alzheimer’s disease; AD)是最常見的一種失智症類型。由於全球罹患阿茲海默症的人數不斷的在增加中且目前還沒有一個有效的治療方式，因此是現今全球所關注的議題之一。根據統計，目前全球已有超過五千萬的阿茲海默症患者，預計到2050年會增加到一億三千多萬人。目前全球用於阿茲海默症的醫療照護成本約八千多億美金，可以想像阿茲海默症所帶來的社會成本有多沉重。
現今對於阿茲海默症的確切成因仍不清楚，但在阿茲海默症患者的病理腦組織切片中可以觀察到斑塊(plaques)的形成與神經纖維糾結(neurofibrillary tangles ; NFTs)的現象。斑塊的產生是由於β類澱粉胜肽(β-amyloid peptide; Aβ)無法正常代謝而在腦部堆積所造成的結果。目前研究認為β類澱粉胜肽的堆積會導致腦內氧化壓力與神經毒性的增加，進而造成腦神經細胞的損傷與壞死。因此，β類澱粉胜肽的異常堆積被認為是造成阿茲海默症的主因。
目前用於緩解阿茲海默症的藥物可分為兩種，一為乙醯膽鹼酶抑制劑(cholinesterase inhibitor)，另一為N-甲基-D-天門冬胺酸受體拮抗劑(N-methyl-D-aspartate receptor antagonist, NMDA receptor antagonist)。乙醯膽鹼為腦內重要的神經傳遞分子。在阿茲海默症患者中的乙醯膽鹼濃度下降會造成腦部皮層退化進而引發記憶力衰退的情況產生。因此，在輕度及中度的阿茲海默症患者的治療上常會使用乙醯膽鹼酶抑制劑來改善記憶力衰退的情況。常用的乙醯膽鹼抑制劑藥物有: rivastigmine、donepezil、galantanime等。然而在長期的追蹤發現，這些藥物的療效其實相當有限，對於是否真的可以改善阿茲海默症是存有疑慮的。此外，腦中的NMDA受體可以刺激神經元興奮，但過度興奮的神經元會導致神經元死亡。因此，NMDA受體拮抗劑被用於阻斷NMDA受體的活化，達到阻斷神經元過度興奮的效果。NMDA受體拮抗劑也常被應用於治療中度與重度的阿茲海默症患者上。目前這類藥物僅有memantine一種。然而，Schneider等人在2011年發表的研究中指出，並沒有足夠的證據顯示memantine對於阿茲海默症的治療能達到減緩的效果。雖然現在陸續推出許多新穎的療法，例如，幹細胞療法或基因療法。但這些新穎的療法目前都還在研究階段且有安全性與致癌性的疑慮。
本發明於第一方面提供一種粒線體用於製備治療及/或預防阿茲海默症之醫藥組合物的用途。
本發明於第二方面提供一種粒線體用於製備降低一細胞中β-類澱粉胜肽濃度之醫藥組合物的用途。
本發明係以下面的實施例予以示範闡明，但本發明不受下述實施例所限制。
應當理解的是，前面的一般描述與下面的詳細描述都是示例性及說明性的，並非用以限制本發明所請之申請專利範圍。本發明的一個或多個實施例的某些細節闡述於以下說明中。從以下代表性實施例之非窮舉的列表中，亦從所附的申請專利範圍中，本發明的其它特徵或優點將是顯而易見的。
本發明提供一種粒線體用於製備治療及/或預防阿茲海默症之醫藥組合物的用途。由美國衛生與人類服務部食品及藥物管理局所發行的“給工業與審視者評估在成人健康志願者體內進行以治療為目的的臨床試驗的安全起始劑量指南”揭露“人類等效劑量” (Human Equivalent Dose, HED)可透過計算下列公式來獲得： HED = 動物劑量(mg/kg) ×(動物體重(公斤)/人體重(公斤)) 0.33。
於某些具體實施例中，小鼠動物實驗所使用之劑量為30 µg/隻及60 mg/隻 (小鼠體重為30 mg/隻)，以60 kg的成年人來計算，人類等效劑量分別為0.0815及0.163 (mg/kg)。
於某些具體實施例中，該粒線體施用於一受試者，該受試者較佳為人類，且施用劑量為至少約0.07 mg/kg、約0.08 mg/kg、約0.09 mg/kg、約0.10 mg/kg、約0.11 mg/kg、約0.12 mg/kg、約0.13 mg/kg、約0.14 mg/kg、約0.15 mg/kg、約0.16 mg/kg、約0.17 mg/kg、約0.18 mg/kg、約0.19 mg/kg、約0.20 mg/kg、約0.21 mg/kg、約0.22 mg/kg、約0.23 mg/kg、約0.24 mg/kg，或約0.25 mg/kg一受試者體重。
於某些具體實施例中，該粒線體為一分離的粒線體。於某些具體實施例中，該粒線體為一分離的外源性粒線體。
於某些具體實施例中，該粒線體係分離自一幹細胞。於某些較佳具體實施例中，該粒線體係分離自一脂肪幹細胞。
於某些具體實施例中，該粒線體可改善阿茲海默症所造成的記憶障礙。
本發明提供一種粒線體用於製備降低一細胞中β-類澱粉胜肽濃度之醫藥組合物的用途。
本發明並提供一種治療及/或預防阿茲海默症之方法，包括對一有需要的受試者施用一藥學有效量的粒線體。
本發明進一步提供一種治療及/或預防阿茲海默症之藥學組合物，包含一分離的粒線體及藥學上可接受之載劑。
除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有如本發明所屬技術領域中普通技術人員之一通常所理解的相同含義。在衝突的情況下，以本文件所包括的定義為準。
如本文所用，術語「分離的粒線體」係指一粒線體從其原本所存在的細胞中被萃取出來，處於一非細胞但可維持其活性的環境下。於某些具體實施例中，本發明之分離的粒線體處於一可維持該粒線體活性的緩衝溶液中；於某些具體實施例中，該緩衝溶液含有一蛋白質分解酵素抑制劑。
如本文所用，術語「外源性」係指一切非本體的因素，亦即來自該本體外部，而能對該本體產生作用的因素。因此，“對一有需要的受試者施用一外源性粒線體”表示，對該受試者施用一非來自該受試者本身的粒線體；該粒線體的來源包括，但不限於，同物種(同種)的另一個體以及不同物種(異種)的個體。例如，對一有需要的人類受試者施用一外源性粒線體，該外源性粒線體可來自一不是該受試者的人類、一群不包含該受試者的人類，或是其他物種，例如，小鼠、大鼠、兔、牛、羊、馬、猴、猿等。
本發明所提供的粒線體之用途係為透過降低一細胞中β-類澱粉胜肽濃度，進而治療及/或預防阿茲海默症。β類澱粉胜肽是由β-分泌酶(β-secretase，又稱為β-site amyloid precursor-cleaving enzyme, BACE)以及γ-分泌酶(γ-secretase)對鑲嵌在細胞膜上的類澱粉前趨蛋白(Amyloid Precursor Protein, APP)透過水解作用所切割下來的胜肽，因此若β-分泌酶與γ-分泌酶的表現下降則可以降低β-類澱粉胜肽的表現。β-類澱粉胜肽主要以β-類澱粉胜肽40 (Aβ40，具有40個胺基酸)與β-類澱粉胜肽42 (Aβ42，具有42個胺基酸)這兩種形式存在，其中β-類澱粉胜肽42不容易被分解且容易與其他的類澱粉胜肽在神經細胞外結合而形成沉澱的斑塊。在血中的β-類澱粉胜肽含量往往被用於判斷是否罹患阿茲海默症的早期生物指標。因此β-類澱粉胜肽40與42的表現量、β-分泌酶、γ-分泌酶的表現量常被用來做為研究早期阿茲海默症形成與藥物治療效果的依據及指標。
如本文所用，術語「降低β-類澱粉胜肽濃度」係指相較於未以本發明所提供之粒線體處理的對照而言，以本發明所提供之粒線體處理的受試者腦內的β-類澱粉胜肽的濃度較低。或是，相較於一受試者以本發明所提供之粒線體處理之前其體內的β-類澱粉胜肽的濃度，該受試者以本發明所提供之粒線體處理後其腦內的β-類澱粉胜肽的濃度較低。於某些具體實施例中，術語「降低β-類澱粉胜肽濃度」係指在以誘導β-類澱粉胜肽異常表現的受試者中，相較於未接受粒線體治療之受試者，接受分離的粒線體治療之受試者腦部的β-類澱粉胜肽濃度有下降的情形。
如本文所用，術語「唐氏症誘導性全能幹細胞衍生的神經元(Neurons Derived from Induced Pluripotent Stem Cells of Patients with Down Syndrome，簡稱DS-Neuron) 」係指先從唐氏症(Down syndrome; DS)患者的成體細胞誘導出唐氏症誘導性全能幹細胞(Down Syndrome induced pluripotent stem cell; DS-iPSC)，再從該唐氏症誘導性全能幹細胞(DS-iPSC)所誘導分化出的神經細胞。唐氏症是由於具有三條第21號染色體所造成的疾病。而在第21號染色體上帶有類澱粉前趨蛋白的基因，因此大多數唐氏症患者會具有早發性認知障礙與阿茲海默症。唐氏症患者的腦部容易有β-類澱粉蛋白的形成與堆積，因此唐氏症患者的細胞可用於作為阿茲海默症研究的模型。利用唐氏症患者的成體細胞所誘導出來的唐氏症誘導性全能幹細胞(DS-iPSC)具有分化為神經細胞的能力，進而分化出唐氏症誘導性全能幹細胞衍生的神經元(DS-Neuron)。唐氏症誘導性全能幹細胞衍生的神經元(DS-Neuron)會產生阿茲海默症的重要指標胜肽-β-類澱粉胜肽40與42，進而具有誘發β-類澱粉胜肽40與42的堆積而形成斑塊這種阿茲海默症的病理特徵，故可應用於治療或預防阿茲海默症的藥物篩選之平台。而唐氏症誘導性全能幹細胞衍生的神經元(DS-Neuron)誘導模式下所產生的β-類澱粉蛋白40與42清除與否可以做為被篩選藥物是否具治療及/或延緩阿茲海默症的重要指標。於一具體實施例中，本發明所提供之粒線體可有效降低唐氏症誘導性全能幹細胞衍生的神經元(DS-Neuron)細胞中β-類澱粉蛋白的累積，可進一步用於治療及/或延緩阿茲海默症。
如本文所用，術語「藥學組合物」是指任何製劑，其中本發明的粒線體可以被配製、存儲、保存、改變、給藥，或其組合。如下所述，該製劑可以包括它們的任何藥學上可接受的稀釋劑、佐劑、緩衝劑、賦形劑、載體或組合。在一般情況下，該製劑的組成分係基於給藥的方式和途徑，以及標準藥學實行而被選擇的。
如本文所用，術語「藥學上可接受之載劑」是指任何物質或其組合與本發明的胜肽可以是物理或化學的混合、溶解、懸浮，或以其它方式組合以產生本發明的藥學組合物。
如本文所用，術語「藥學有效量」意指能夠或足以維持或產生所期望的生理結果，包括但不限於，治療、減輕、消除、基本上防止或預防，或其組合，疾病、病症，或其組合。藥學有效量可以包括依序地或同時地施用一個或多個劑量。本發明技術領域的技術人員將知道調節本發明的劑量，以考慮到各種類型的製劑，包括但不限於緩釋製劑。
如本文所用，術語「治療」與「改善」可換使用，意指能夠治療、減少、停止進展、減緩進展、有利地改變、消除，或其組合，疾病、病症的任何方面，或其組合。
如本文所用，術語「預防」意指能基本上防止或預防疾病、病症，或其組合的任何方面的組合物。
如本文所用，術語「受試者」意指任何施與針對本發明的個體。受試者可以是，例如，哺乳動物。受試者可以是人或獸醫動物，不考慮性別、年齡，或他們的任意組合，並且包括胎兒。受試者可以選擇性地受特定疾病、病症或其組合的影響，或具有風險，或其組合。
如本文所用，冠詞「一」、「一個」以及「任何」是指一個或多於一個(即至少一個)的物品的文法物品。例如，「一個元件」意指一個元件或多於一個元件。
本文所使用的「約」、「大約」或「近乎」一詞實質上代表所述之數值或範圍位於20%以內，較佳為於10%以內，以及更佳者為於5%以內。於本文所提供之數字化的量為近似值，意旨若術語「約」、「大約」或「近乎」沒有被使用時亦可被推得。
本發明通過下列的實施例進一步說明，其提供了用於示範而非限制的目的。根據本發明公開內容，本領域中的技術人員應當理解，許多變化可以在所公開的特定具體實施例中產生，且仍然獲得相同或類似的結果而不脫離本發明的精神和範圍。
實施例
實施例一 唐氏症誘導性全能幹細胞衍生的神經元 (Neurons Derived from Induced Pluripotent Stem Cells of Patients with Down Syndrome ) 之製備
1. 來自唐氏症患者的人類誘導型全能幹細胞(Induced Pluripotent Stem Cells of Patients with Down Syndrome, DS-iPSCs)的細胞培養
將來自唐氏症患者的人類誘導型全能幹細胞(DS-iPSCs，由中興大學生命科學系蘇鴻麟教授提供，台灣)培養於無血清培養基Essential 8ä (Life Technology公司，美國)中，並以Matrigelä基質膠(Becton-Dickinson公司，美國)進行貼附培養。接著移除培養液，以杜氏磷酸鹽緩衝液(Dulbecco's phosphate-buffered saline, DPBS，Corning公司，型號：21-031-CV，美國)沖洗細胞2次後，加入細胞剝離用酵素Accutaseä (Merck Millipore公司，美國)於37°C下反應2~5分鐘後，加入培養液以停止反應，並將細胞沖洗下來後打散，以1,000 rpm離心2分鐘，除去上清液，放入含有新鮮的無血清培養基Essential 8ä的培養皿中進行繼代培養約3~5天，且於培養期間每天更換培養液。
2. 將來自唐氏症患者的人類誘導型全能幹細胞(DS-iPSCs)分化為神經細胞
將上述來自唐氏症患者的人類誘導型全能幹細胞(DS-iPSCs)培養至8-9分滿，以杜氏磷酸鹽緩衝液(DPBS)沖洗細胞2次，加入細胞剝離用酵素Accutaseä於37°C下反應2~5分鐘後，加入培養液以停止反應，並將細胞沖洗下來後打散，以800 rpm離心約2分鐘，除去上清液，將細胞置於含有20% (v/v)替代血清(knock out serum replacement, KSR，Life Technology公司，美國)的DMEM-F12培養基，以無蓋培養皿進行懸浮培養2天，獲得類胚體(Embryonic body)懸浮液。
將懸浮的類胚體置於離心管，待自然沈降後，去除上清液，加入含有BiSF小分子藥物的神經誘導培養基[每500 mL的神經誘導培養基含有：326 mL DMEM培養基(Life Technologies公司，型號：11965-092，美國)、163 mL F12培養基(Life Technologies公司，型號：11765-054，美國)、5 mL N-2添加物(N-2 Supplement，Life Technologies公司，型號：17502-048，美國)、5 mL非必需胺基酸(Life Technologies公司，型號：11140-035，美國)，以及1 mL肝素(1 mg/mL)]，進行懸浮培養2天後，懸浮的類胚體會出現環狀的上皮細胞結構，其中，該小分子藥物含有0.5 μM BIO (Sigma-Aldrich公司，美國)、10 ng/ml纖維母細胞生長因子-2 (fibroblast growth factor-2, FGF-2，Peprotech公司，美國)，以及10 μM SB431542 (Sigma-Aldrich公司，美國)。
再將類胚體進行沈降後，去除上清液，加入含有10 ng/ml纖維母細胞生長因子-2 (FGF-2)的神經基礎培養基[每521 mL的神經基礎培養基含有：500 mL 神經基礎培養基(Life Technologies公司，型號：21103-049，美國)、5 mL N-2添加物(N-2 Supplement，Life Technologies公司，型號：17502-048，美國)、5 mL非必需胺基酸(Life Technologies公司，型號：11140-035，美國)、1 mL肝素(1 mg/mL)，以及10 mL B-27ä添加物(B-27ä Supplement，Life Technologies公司，型號：17504-044，美國)]，進行懸浮培養2天。之後，待類胚體沈降後，以外力或細胞剝離用酵素Accutaseä將類胚體打散，接種於塗覆有1% (v/v) Matrigelä基質膠[溶於DMEM/F12培養液(Gibco公司，型號：11330032，美國)]的培養皿中進行細胞貼附並培養。約2~7天後該類胚體分化為神經構造，即為唐氏症誘導性全能幹細胞衍生的神經元(Neurons Derived from Induced Pluripotent Stem Cells of Patients with Down Syndrome，簡稱DS-Neuron)。
3. 唐氏症誘導性全能幹細胞衍生的神經元(DS-Neuron)的繼代培養
於上述唐氏症誘導性全能幹細胞衍生的神經元(DS-Neuron)生長至8~9分滿時進行繼代培養。首先移除上清培養液，以杜氏磷酸鹽緩衝液(DPBS)沖洗細胞2次後，加入細胞剝離用酵素Accutaseä於37°C下反應2~5分鐘後，加入Neurobasalä培養液(Gibco公司，型號：21103049，美國)以停止反應，並將細胞沖洗下來後打散，以1,000 rpm離心約2分鐘，除去上清液，加入Neurobasalä培養液將細胞濃度調整至1x10 5個細胞/mL，並加入ROCK抑制劑Y-27632 (終濃度為10 µM) (Merck Millipore公司，型號：SCM075，美國)。接著將細胞接種於塗覆有1% (v/v) Matrigelä基質膠(溶於DMEM/F12培養液)的培養皿中，並加入Neurobasalä培養液進行培養。於隔日移除Neurobasalä培養液，並加入含2%(v/v)  B-27ä添加物及10 ng/ml 重組人類纖維母細胞生長因子(recombinant human Fibroblast Growth Factor, rh-FGF，Gibco公司，美國)的Neurobasalä培養液繼續培養。每隔2-3天更換新鮮培養液，直至下次繼代。
實施例二 粒線體的製備
粒線體係自人類脂肪幹細胞(Adipose-derived stem cells, ADSCs)萃取純化而來。在培養皿中將人類脂肪幹細胞培養至細胞數為1x10 8個細胞時，以杜氏磷酸鹽緩衝液(DPBS)進行沖洗，移除DPBS後加入細胞剝離用酵素Accutaseä (Merck Millipore公司，美國)於37°C下反應2~5分鐘後，加入培養液以停止反應，並將細胞沖洗下來後打散，以1,000 rpm離心2分鐘，除去上清液，加入2 ml之SHE緩衝液 [0.25 M蔗糖、0.5 mM 乙二醇四乙酸 (ethylene glycol tetraacetic acid, EGTA)、3 mM N-(2-羥乙基)哌嗪-N’-乙磺酸(N-(2-Hydroxyethyl) piperazine-N’-ethanesulfonic acid, HEPES), pH 7.2；上述藥品皆購自Sigma-Aldrich公司]，於均質器中研磨15次(冰上操作)後以1000 xg離心15分鐘 ，離心後將上清液收集至另一離心管內再以9000 xg離心10分鐘，離心後移除上清液並將沉澱物(粒線體)加入50 ml的SHE緩衝液，並加入蛋白質分解酵素抑制劑，保存於4°C備用。
實施例三 細胞實驗
1. 細胞處理
將上述實施例一得到的唐氏症誘導性全能幹細胞衍生的神經元(DS-Neuron) 以2x10 5個細胞/孔的密度接種於24孔細胞培養盤內，並以含2% (v/v)  B-27ä添加物的Neurobasalä培養液繼續培養16-24小時後，將上述實施例二得到的粒線體以每孔15 µg/ml或40 µg/ml的濃度加入該培養液中，並於4°C下以1,500 xg離心15分鐘，使粒線體沉至培養盤底部。接著於37°C培養箱中使上述唐氏症誘導性全能幹細胞衍生的神經元(DS-Neuron)與粒線體共同培養24或48小時。共同培養後於顯微鏡下觀察細胞型態的改變，並收集各孔細胞的培養液，並以1,000 rpm離心5分鐘，將上清液保存於-80°C，供進一步分析之用。
2. 酵素連結免疫吸附分析法(Enzyme-Linked Immunoadsorbent Assay, ELISA)
以酵素連結免疫吸附分析法(ELISA)進行上述唐氏症誘導性全能幹細胞衍生的神經元(DS-Neuron)的β-類澱粉胜肽40與42之表現量分析。根據商用套組LEGEND MAX™ β‐Amyloid x‐40 ELISA Kit (BioLegend公司，美國)及LEGEND MAX™ β‐Amyloid x‐42 ELISA Kit (BioLegend公司，美國)所附製造商操作手冊進行分析。分析步驟簡述如下：將上述唐氏症誘導性全能幹細胞衍生的神經元(DS-Neuron)與粒線體共同培養後的上清液與反應緩衝液(incubation buffer，BioLegend公司，美國)以1:5的比例進行稀釋；取50 µl上述稀釋液加至LEGEND MAX™ β‐Amyloid x‐40 ELISA Kit及/或LEGEND MAX™ β‐Amyloid x‐42 ELISA Kit所提供的反應盤中，每個樣品三重複，並加入50 µl辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標記的偵測抗體(HRP detection antibody，BioLegend公司，美國)，於4°C下反應16小時後，移除反應物，並以300 µl清洗緩衝液(wash buffer，BioLegend公司，美國)清洗，共5次；接著加入200 µl 3,3',5,5'-四甲基聯苯胺基質(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine, TMB substrate，BioLegend公司，美國)在室溫下避光進行反應40-50分鐘；接著讀取620 nm波長下的吸光值，根據標準蛋白序列稀釋做出的標準曲線，計算各樣品中β-類澱粉胜肽40與42的含量。
3. 統計分析
所有的統計分析及多群組之間的比較皆使用GraphPad Prism程式(GraphPad公司，聖地牙哥，加州)，以單因子變異數分析(One-Way Analysis of variance, One-Way ANOVA)加上杜凱氏(Tukey’s)事後檢驗。 p＜0.05值被認為具有統計上的顯著差異。
4. 結果
唐氏症誘導性全能幹細胞衍生的神經元(DS-Neuron)與15 µg/ml或40 µg/ml濃度的粒線體共同培養24或48小時後，於顯微鏡下觀察到的細胞型態分別如圖1B、1C、1E、1F所示。相較於未與粒線體共同培養的對照組的細胞型態(如圖1A、1D所示)，與粒線體共同培養的唐氏症誘導性全能幹細胞衍生的神經元(DS-Neuron)的細胞型態並無改變(如圖1B、1C、1E、1F所示)，表示15 µg/ml或40 µg/ml濃度的粒線體對唐氏症誘導性全能幹細胞衍生的神經元(DS-Neuron)不會產生細胞毒性。
上述唐氏症誘導性全能幹細胞衍生的神經元(DS-Neuron)的β-類澱粉胜肽40與42之表現量分析結果則分別如圖2及圖3所示。如圖2所示，不論與15 µg/ml或40 µg/ml濃度的粒線體共同培養24小時(圖2A)或48小時(圖2B)後，唐氏症誘導性全能幹細胞衍生的神經元(DS-Neuron)的β-類澱粉胜肽40的表現量皆顯著降低( p＜0.001)。另外，圖3所示，不論與15 µg/ml或40 µg/ml濃度的粒線體共同培養24小時(圖3A)或48小時(圖3B)後，唐氏症誘導性全能幹細胞衍生的神經元(DS-Neuron)的β-類澱粉胜肽42的表現量亦皆顯著降低( p＜0.05或 p＜0.01)。由上述結果可知，粒線體可以降低神經元細胞內β-類澱粉胜肽的表現，進而可以被用於阿茲海默症的治療上。
實施例四 動物實驗
1. 試驗動物處理
將24隻未做過試驗的雄性C57B1/6品系小鼠(9週大/25-30 g/隻，購自樂斯科生物科技公司(BioLASCO Co., Ltd，台灣)隨機分為4組，每組6隻，各組小鼠分別進行以下處理： 第一組：於小鼠側腦室內注射磷酸鹽緩衝溶液(PBS)，連續注射14天，並於第15天注射SHE緩衝液(對照組，正常小鼠)； 第二組：每隻小鼠每日以300 pmol β-類澱粉胜肽42於側腦室連續注射14天，使其產生記憶障礙 ，並於第15天於側腦室注射SHE緩衝液 (Aβ1-42處理組，具有阿茲海默症病徵的小鼠)； 第三組：每隻小鼠每日以300 pmol β-類澱粉胜肽42於側腦室連續注射14天，使其產生記憶障礙 ，並於第15天於側腦室注射上述實施例二得到的粒線體30 µg，粒線體注射12天後進行水迷宮實驗(Aβ1-42 + mito 30處理組，具有阿茲海默症病徵的小鼠以30 µg分離的粒線體治療)；以及 第四組：每隻小鼠每日以300 pmol β-類澱粉胜肽42於側腦室連續注射14天，使其產生記憶障礙，並於第15天於側腦室注射上述實施例二得到的粒線體60 µg，粒線體注射12天後進行水迷宮實驗(Aβ1-42 + mito 60處理組，具有阿茲海默症病徵的小鼠以60 µg分離的粒線體治療)。
2. 水迷宮學習模式
取直徑183 cm的塑膠圓形筒作為水池 (水溫25 ± 2 °C)，一圓形平台係放置於水池邊緣的特定位置，且位於水面下，以供試驗小鼠休息站立。添加無毒染劑到水池中，使水變混濁。小鼠必須透過記憶及辨識設置於水池牆上之特殊的視覺線索進行學習。針對記憶與空間學習，試驗動物每天接受3次試驗，訓練程序持續4天。小鼠被放置在以隨機順序等間距圍繞水池圓周的不同起始點，試驗小鼠有60秒鐘可在泳池游泳，若一小鼠無法發現該平台，其會被引導至該平台，且允許其停留在該平台上20秒鐘。將每隻小鼠到達該平台所花費的時間記錄作為通過水迷宮的時間(escape latency)，並記錄每隻小鼠到達該平台所游泳的距離。
3. 生化分析
將各組別試驗小鼠於記憶與空間實驗評估結束後進行犧牲，並偵測Aβ1-42 、β-分泌酶(β-secretase)、γ-分泌酶(γ-secretase)的表現量。以ELISA進行β-類澱粉胜肽42之表現量分析，分析方法如實施例三所述。並以下述方法分別進行β-分泌酶(β-secretase)與γ-分泌酶(γ-secretase)表現量的分析。
β-分泌酶(β-secretase)表現量的分析：取待測之蛋白質(濃度介於25-200 mg/ml)及序列稀釋後之標準品50 ml至96孔盤內，加入48 ml之2X反應緩衝液(reaction buffer)及2 µl β-分泌酶受質(β-secretase substrate)到每個待測樣品的孔洞中，輕微且均勻的搖晃後在避光環境下於37°C作用1-2小時，反應後放至螢光偵測儀中以335-355 nm波長進行激發，並於495-510 nm波長下偵測吸收光進行判讀，所得之數值與序列稀釋之標準品進行比較後得到待測蛋白質的量(相對螢光單位，relative fluorescence unit, RFU)，此即代表β-分泌酶(β-secretase)的表現量。
g-分泌酶(g-secretase)表現量的分析：取100 ml待測蛋白質與不同濃度的標準品至96孔盤中，於37°C下作用2小時。接著將96孔盤內樣品移除並加入100 ml生物素抗體(biotin-antibody)至每個欲測之孔盤中，於37°C下作用1小時。做用完後將液體吸出並以清洗緩衝液進行沖洗，重複清洗五次後加入90 ml TMB受質，在避光環境中於37°C下作用15-30分鐘，接著加入50 ml終止溶液終止反應，放入螢光偵測儀中偵測450 nm波長之吸光值，並根據標準品濃度進行g-分泌酶(g-secretase)的濃度分析。
4. 統計分析
所有的統計分析及多群組之間的比較皆使用GraphPad Prism程式(GraphPad公司，聖地牙哥，加州)，以單因子變異數分析(One-Way Analysis of variance, One-Way ANOVA)加上杜凱氏(Tukey’s)事後檢驗。 p＜0.05值被認為具有統計上的顯著差異。
5. 結果
5.1 分離的粒線體可改善由 β- 類澱粉胜肽引起的空間學習及記憶的損傷。
本實施例使用由β-類澱粉胜肽誘導的記憶缺失動物模式來分析分離的粒線體對阿茲海默症的影響。圖4A及圖4B分別顯示每組小鼠通過水迷宮的平均逃脫時間及游泳距離。只注射β-類澱粉胜肽的小鼠(第二組)需要較長的逃脫時間以及較長的游泳距離才通過水迷宮。相較於只注射β-類澱粉胜肽的小鼠(第二組)，在注射β-類澱粉胜肽後再分別注射30  µg及60 µg的分離的粒線體處理的小鼠(分別為第三組及第四組)通過水迷宮的平均逃脫時間皆顯著下降( p＜0.05或 p＜0.01)，並可觀察到處理的粒線體濃度增加與小鼠的記憶行為能力的改善成正比。且游泳距離的部分，亦可以觀察到相較於只注射β-類澱粉胜肽的小鼠(第二組)，在注射β-類澱粉胜肽後再分別注射30  µg及60 µg的分離的粒線體處理的小鼠(分別為第三組及第四組)通過水迷宮的游泳距離皆顯著縮短 ( p＜0.05或 p＜0.01)。此結果表示，分離的粒線體改善了由β-類澱粉胜肽引起的記憶障礙小鼠的空間學習能力，且隨著分離的粒線體的濃度增加而增加改善效果。
5.2 施用分離的粒線體可顯著降低小鼠腦內 β- 類澱粉胜肽 42 與 γ- 分泌酶的表現量。
本實施例進一步分析分離的粒線體對小鼠腦內β-類澱粉胜肽42、β-分泌酶 、γ-分泌酶的表現量的影響。圖5A、圖5B、圖5C分別顯示每組小鼠腦內β-類澱粉胜肽42的表現量、β-分泌酶的表現量，以及γ-分泌酶的表現量。只注射β-類澱粉胜肽的小鼠(第二組)腦內β-類澱粉胜肽42、β-分泌酶、γ-分泌酶的表現量最高。相較於只注射β-類澱粉胜肽的小鼠(第二組)，在注射β-類澱粉胜肽後再分別注射30  µg及60 µg的分離的粒線體處理的小鼠(分別為第三組及第四組)腦內β-類澱粉胜肽42與γ-分泌酶的表現量皆顯著下降( p＜0.05或 p＜0.01或 p＜0.001)；而第三組及第四組小鼠腦內β-分泌酶的表現量也隨著分離的粒線體的注射量增加而有下降的趨勢。
由於β-分泌酶及γ-分泌酶對於β-類澱粉胜肽的形成具有重要的作用，且β-類澱粉胜肽的堆積被認為是造成阿茲海默症的主因，因此上述結果表示，分離的粒線體改善了小鼠腦內β-類澱粉胜肽的形成及堆積，進一步改善了阿茲海默症的症狀(記憶障礙)，且隨著分離的粒線體的濃度增加而增加了改善的效果。
上列詳細說明係針對本發明之一可行實施例之具體說明，惟該實施例並非用以限制本發明之專利範圍，凡未脫離本發明技藝精神所為之等效實施或變更，均應包含於本案之專利範圍中。
綜上所述，本案所揭露之技術特徵已充分符合新穎性及進步性之法定發明專利要件，爰依法提出申請，懇請　貴局核准本件發明專利申請案，以勵發明，至感德便。
前面的概述，以及本發明以下的詳細描述，在結合附圖一起閱讀時將可以被更好地理解。為了說明本發明的目的，所附圖式示出了一些，但不是所有的，可替代的具體實施例。然而，應該理解的是，本發明並不限於所示的精確安排和手段。這些圖式，其被併入並構成說明書的一部分，有助於解釋本發明的原理。
圖1A、圖1B，及圖1C所示為唐氏症誘導性全能幹細胞衍生的神經元(DS-Neuron)分別與0 µg (對照組)、15 µg/ml、40 µg/ml濃度的粒線體共同培養24小時後的細胞型態。圖1D、圖1E，及圖1F所示為唐氏症誘導性全能幹細胞衍生的神經元(DS-Neuron)分別與0 µg (對照組)、15 µg/ml、40 µg/ml濃度的粒線體共同培養48小時後的細胞型態。
圖2A所示為唐氏症誘導性全能幹細胞衍生的神經元(DS-Neuron)分別與0 µg (對照組)、15 µg/ml、40 µg/ml濃度的粒線體共同培養24小時後，該神經元(DS-Neuron)的β-類澱粉胜肽40的表現量。圖2B所示為唐氏症誘導性全能幹細胞衍生的神經元(DS-Neuron)分別與0 µg (對照組)、15 µg/ml、40 µg/ml濃度的粒線體共同培養48小時後，該神經元(DS-Neuron)的β-類澱粉胜肽40的表現量。該數據為平均值±標準差(mean ± SEM)。相較於對照組，###表示 p＜ 0.001。
圖3A所示為唐氏症誘導性全能幹細胞衍生的神經元(DS-Neuron)分別與0 µg (對照組)、15 µg/ml、40 µg/ml濃度的粒線體共同培養24小時後，該神經元(DS-Neuron)的β-類澱粉胜肽42的表現量。圖3B所示為唐氏症誘導性全能幹細胞衍生的神經元(DS-Neuron)分別與0 µg (對照組)、15 µg/ml、40 µg/ml濃度的粒線體共同培養48小時後，該神經元(DS-Neuron)的β-類澱粉胜肽42的表現量。該數據為平均值±標準差(mean ± SEM)。相較於對照組，#表示 p＜ 0.05；##表示 p＜ 0.01。
圖4A及圖4B所示分別為不同處理的小鼠通過水迷宮的平均脫逃時間及游泳距離。小鼠隨機分為第一組(對照組)、第二組(注射β-類澱粉胜肽組)、第三組(注射β-類澱粉胜肽+30 µg粒線體組)，以及第四組(注射β-類澱粉胜肽+60 µg粒線體組)。該數據為平均值±標準差(mean ± SEM)。相較於對照組，#表示 p＜ 0.05；##表示 p＜ 0.01。
圖5A、圖5B及圖5C所示分別為不同處理的小鼠腦內β-類澱粉胜肽42、β-分泌酶、γ-分泌酶的表現量。小鼠隨機分為第一組(對照組)、第二組(注射β-類澱粉胜肽組)、第三組(注射β-類澱粉胜肽+30 µg粒線體組)，以及第四組(注射β-類澱粉胜肽+60 µg粒線體組)。該數據為平均值±標準差(mean ± SEM)。相較於對照組，#表示 p＜ 0.05；##表示 p＜ 0.01；###表示 p＜ 0.001。

Claims (11)

  1. 一種分離的粒線體用於製備治療及/或改善學習能力障礙及/或記憶障礙之醫藥組合物的用途，其中該醫藥組合物包含該分離的粒線體，且該分離的粒線體未被包埋在一囊泡中。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該醫藥組合物係用於腦部注射。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該分離的粒線體係分離自一幹細胞。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該分離的粒線體的劑量為至少0.07mg/kg一受試者體重。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該分離的粒線體的劑量為至少15μg。
  6. 一種分離的粒線體用於製備降低一細胞中β-類澱粉胜肽濃度之醫藥組合物的用途，其中該醫藥組合物包含該分離的粒線體，且該分離的粒線體未被包埋在一囊泡中。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之用途，其中該醫藥組合物係用於腦部注射。
  8. 如申請專利範圍第6項所述之用途，其中該分離的粒線體係分離自一幹細胞。
  9. 如申請專利範圍第6項所述之用途，其中該分離的粒線體的劑量為至少0.07mg/kg一受試者體重。
  10. 如申請專利範圍第6項所述之用途，其中該分離的粒線體的劑量為至少15μg。
  11. 如申請專利範圍第6項所述之用途，其中該細胞為一腦神經細胞。
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