CN111759861B - 线粒体用于制备治疗及/或预防阿尔茨海默氏病的药学组合物的应用 - Google Patents
线粒体用于制备治疗及/或预防阿尔茨海默氏病的药学组合物的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及线粒体的应用，特别是分离的线粒体用于治疗及/或预防阿尔茨海默氏病的应用，及/或分离的线粒体用于降低细胞中β‑淀粉样肽浓度的应用，及/或分离的线粒体用于改善记忆障碍及/或学习能力障碍的应用。
Description
技术领域
本发明涉及线粒体的应用，特别是分离的线粒体用于治疗及/或预防阿尔茨海默氏病的应用，及/或分离的线粒体用于降低细胞中β-淀粉样肽浓度的应用，及/或分离的线粒体用于改善记忆障碍及/或学习能力障碍的应用。
背景技术
阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease；AD)是最常见的一种失智症类型。由于全球罹患阿尔茨海默氏病的人数不断的在增加中且目前还没有一个有效的治疗方式，因此是现今全球所关注的议题之一。根据统计，目前全球已有超过五千万的阿尔茨海默氏病患者，预计到2050年会增加到一亿三千多万人。目前全球用于阿尔茨海默氏病的医疗照护成本约八千多亿美金，可以想像阿尔茨海默氏病所带来的社会成本有多沉重。
现今对于阿尔茨海默氏病的确切成因仍不清楚，但在阿尔茨海默氏病患者的病理脑组织切片中可以观察到斑块(plaques)的形成与神经纤维纠结(neurofibrillarytangles；NFTs)的现象。斑块的产生是由于β-淀粉样肽(β-amyloid peptide；Aβ)无法正常代谢而在脑部堆积所造成的结果。目前研究认为β-淀粉样肽的堆积会导致脑内氧化压力与神经毒性的增加，从而造成脑神经细胞的损伤与坏死。因此，β-淀粉样肽的异常堆积被认为是造成阿尔茨海默氏病的主因。
目前用于缓解阿尔茨海默氏病的药物可分成两种，一是胆碱酯酶抑制剂(cholinesterase inhibitor)，另一是N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂(N-methyl-D-aspartate receptor antagonist,NMDA receptor antagonist)。乙醯胆碱是脑内重要的神经传递分子。在阿尔茨海默氏病患者中的乙醯胆碱浓度下降会造成脑部皮层退化从而引发记忆力衰退的情况产生。因此，在轻度及中度的阿尔茨海默氏病患者的治疗上常会使用胆碱酯酶抑制剂来改善记忆力衰退的情况。常用的乙醯胆碱抑制剂药物有:rivastigmine、donepezil、galantanime等。然而在长期的追踪发现，这些药物的疗效其实相当有限，对于是否真的可以改善阿尔茨海默氏病是存有疑虑的。此外，脑中的NMDA受体可以刺激神经元兴奋，但过度兴奋的神经元会导致神经元死亡。因此，NMDA受体拮抗剂被用于阻断NMDA受体的活化，达到阻断神经元过度兴奋的效果。NMDA受体拮抗剂也常被应用于治疗中度与重度的阿尔茨海默氏病患者上。目前这类药物仅有memantine一种。然而，Schneider等人在2011年发表的研究中指出，并没有足够的证据显示memantine对于阿尔茨海默氏病的治疗能达到减缓的效果。虽然现在陆续推出许多新颖的疗法，例如，干细胞疗法或基因疗法。但这些新颖的疗法目前都还在研究阶段且有安全性与致癌性的疑虑。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种线粒体用于制备治疗及/或预防阿尔茨海默氏病的药学组合物的应用。
本发明于第一方面提供一种分离的线粒体用于制备治疗及/或预防阿尔茨海默氏病的药学组合物的应用。
本发明于第二方面提供一种分离的线粒体用于制备降低一细胞中β-淀粉样肽浓度的药学组合物的应用。
本发明于第三方面提供一种分离的线粒体用于制备改善记忆障碍及/或学习能力障碍的药学组合物的应用。
本发明以下面的实施例予以示范阐明，但本发明不受下述实施例所限制。
附图说明
前面的概述，以及本发明以下的详细描述，在结合附图一起阅读时将可以被更好地理解。为了说明本发明的目的，所附图式示出了一些，但不是所有的，可替代的具体实施例。然而，应该理解的是，本发明并不限于所示的精确安排和手段。这些图式，其被并入并构成说明书的一部分，有助于解释本发明的原理。
图1A、图1B，及图1C所示为唐氏症诱导性全能干细胞衍生的神经元(DS-Neuron)分别与0μg(对照组)、15μg/ml、40μg/ml浓度的线粒体共同培养24小时后的细胞型态。图1D、图1E，及图1F所示为唐氏症诱导性全能干细胞衍生的神经元(DS-Neuron)分别与0μg(对照组)、15μg/ml、40μg/ml浓度的线粒体共同培养48小时后的细胞型态。
图2A所示为唐氏症诱导性全能干细胞衍生的神经元(DS-Neuron)分别与0μg(对照组)、15μg/ml、40μg/ml浓度的线粒体共同培养24小时后，所述神经元(DS-Neuron)的β-淀粉样肽40的表现量。图2B所示为唐氏症诱导性全能干细胞衍生的神经元(DS-Neuron)分别与0μg(对照组)、15μg/ml、40μg/ml浓度的线粒体共同培养48小时后，所述神经元(DS-Neuron)的β-淀粉样肽40的表现量。所述数据是平均值±标准差(mean±SEM)。相较于对照组，###表示p<0.001。
图3A所示为唐氏症诱导性全能干细胞衍生的神经元(DS-Neuron)分别与0μg(对照组)、15μg/ml、40μg/ml浓度的线粒体共同培养24小时后，所述神经元(DS-Neuron)的β-淀粉样肽42的表现量。图3B所示为唐氏症诱导性全能干细胞衍生的神经元(DS-Neuron)分别与0μg(对照组)、15μg/ml、40μg/ml浓度的线粒体共同培养48小时后，所述神经元(DS-Neuron)的β-淀粉样肽42的表现量。所述数据是平均值±标准差(mean±SEM)。相较于对照组，#表示p<0.05；##表示p<0.01。
图4A及图4B所示分别是不同处理的小鼠通过水迷宫的平均脱逃时间及游泳距离。小鼠随机分成第一组(对照组)、第二组(注射β-淀粉样肽组)、第三组(注射β-淀粉样肽+30μg线粒体组)，以及第四组(注射β-淀粉样肽+60μg线粒体组)。所述数据是平均值±标准差(mean±SEM)。相较于对照组，#表示p<0.05；##表示p<0.01。
图5A、图5B及图5C所示分别是不同处理的小鼠脑内β-淀粉样肽42、β-分泌酶、γ-分泌酶的表现量。小鼠随机分成第一组(对照组)、第二组(注射β-淀粉样肽组)、第三组(注射β-淀粉样肽+30μg线粒体组)，以及第四组(注射β-淀粉样肽+60μg线粒体组)。所述数据是平均值±标准差(mean±SEM)。相较于对照组，#表示p<0.05；##表示p<0.01；###表示p<0.001。
具体实施方式
应当理解的是，前面的一般描述与下面的详细描述都是示例性及说明性的，并非用以限制本发明主张的权利要求。本发明的一个或多个实施例的某些细节阐述于以下说明中。从以下代表性实施例的非穷举的列表中，亦从所附的权利要求中，本发明的其它特征或优点将是显而易见的。
本发明提供一种分离的线粒体用于制备治疗及/或预防阿尔茨海默氏病的药学组合物的应用。本发明並提供一种分离的线粒体用于制备降低一细胞中β-淀粉样肽浓度的药学组合物的应用。本发明更提供一种分离的线粒体用于制备改善记忆障碍及/或学习能力障碍的药学组合物的应用。
由美国卫生与人类服务部食品及药物管理局所发行的“给工业与审视者评估在成人健康志愿者体内进行以治疗为目的的临床试验的安全起始剂量指南”揭露“人类等效剂量”(Human Equivalent Dose,HED)可通过计算下列公式来获得：
HED＝动物剂量(mg/kg)×(动物体重(公斤)/人体重(公斤))0.33。
在某些具体实施例中，小鼠动物实验所使用的剂量是30μg/只及60μg/只(小鼠体重是30mg/只)，以60kg的成年人来计算，人类等效剂量分别是0.0815及0.163(mg/kg)。
在某些具体实施例中，所述线粒体施用于一受试者，所述受试者优选为人类，且施用剂量为至少约0.07mg/kg、约0.08mg/kg、约0.09mg/kg、约0.10mg/kg、约0.11mg/kg、约0.12mg/kg、约0.13mg/kg、约0.14mg/kg、约0.15mg/kg、约0.16mg/kg、约0.17mg/kg、约0.18mg/kg、约0.19mg/kg、约0.20mg/kg、约0.21mg/kg、约0.22mg/kg、约0.23mg/kg、约0.24mg/kg，或约0.25mg/kg一受试者体重。
在某些具体实施例中，所述分离的线粒体是一外源性分离的线粒体。
在某些具体实施例中，所述分离的线粒体分离自一干细胞。在某些优选具体实施例中，所述分离的线粒体分离自一脂肪干细胞。
在某些具体实施例中，所述细胞是一脑神经细胞；所述分离的线粒体降低一脑神经细胞中β-淀粉样肽的浓度。
在某些具体实施例中，所述分离的线粒体可改善阿尔茨海默氏病所造成的记忆障碍及/或学习能力障碍。
在某些具体实施例中，所述药学组合物由一缓冲水溶液以及该分离的线粒体组成，且所述分离的线粒体未被包封。
本发明并提供一种治疗及/或预防阿尔茨海默氏病的方法，包括对一有需要的受试者施用一药学有效量的线粒体。
本发明进一步提供一种治疗及/或预防阿尔茨海默氏病的药学组合物，包含一分离的线粒体及药学上可接受的载剂。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有如本发明所属技术领域中普通技术人员的通常所理解的相同含义。在冲突的情况下，以本文件所包括的定义为准。
如本文所用，术语「分离的线粒体」是指一线粒体从其原本所存在的细胞中被提取出来，处于一非细胞但可维持其活性的环境下。在某些具体实施例中，本发明的分离的线粒体处于一可维持所述线粒体活性的缓冲水溶液中；在某些具体实施例中，所述缓冲水溶液含有一蛋白质分解酵素抑制剂。
如本文所用，术语「分离的线粒体未被包封」是指一线粒体从其原本所存在的细胞中被提取出来，处于一非细胞但可维持其活性的环境下，而且未被药物傳遞物質包封。药物傳遞物質包含但不限於脂质体(Liposomes)、脂质双层膜(lipidbilayer)、脂质胶束(lipidmicelles)、脂筏(lipidraft)、网格蛋白包被小泡(clathrin-coatedvesicles)。
如本文所用，术语「缓冲水溶液」或「缓冲溶液」可交换使用且意义相同，是指由弱酸及其盐、弱碱及其盐组成的混合水性溶液，能在一定程度上抵消、减轻外加强酸或强碱对溶液酸碱度的影响，从而保持溶液的pH值相对稳定。在某些具体实施例中，所述缓冲水溶液包含蔗糖、乙二醇四乙酸(ethylene glycol tetraacetic acid,EGTA)，以及N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙磺酸(N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N'-2-ethanesulfonic Acid,HEPES)。在某些具体实施例中，所述缓冲水溶液是指SHE缓冲液，包含0.25M蔗糖、0.5mM乙二醇四乙酸、3mM N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-乙磺酸。
如本文所用，术语「外源性」是指一切非本体的因素，亦即来自所述本体外部，而能对所述本体产生作用的因素。因此，“对一有需要的受试者施用一外源性线粒体”表示，对所述受试者施用一非来自所述受试者本身的线粒体；所述线粒体的来源包括，但不限于，同物种(同种)的另一个体以及不同物种(异种)的个体。例如，对一有需要的人类受试者施用一外源性线粒体，所述外源性线粒体可来自一不是所述受试者的人类、一群不包含所述受试者的人类，或是其他物种，例如，小鼠、大鼠、兔、牛、羊、马、猴、猿等。
本发明所提供的线粒体的应用是通过降低一细胞中β-淀粉样肽浓度，从而治疗及/或预防阿尔茨海默氏病。β-淀粉样肽是由β-分泌酶(β-secretase，又称为β-siteamyloid precursor-cleaving enzyme,BACE)以及γ-分泌酶(γ-secretase)对镶嵌在细胞膜上的类淀粉前趋蛋白(Amyloid Precursor Protein,APP)通过水解作用所切割下来的肽，因此若β-分泌酶与γ-分泌酶的表现下降则可以降低β-淀粉样肽的表现。β-淀粉样肽主要以β-淀粉样肽40(Aβ40，具有40个氨基酸)与β-淀粉样肽42(Aβ42，具有42个氨基酸)这两种形式存在，其中β-淀粉样肽42不容易被分解且容易与其他的类淀粉肽在神经细胞外结合而形成沉淀的斑块。在血中的β-淀粉样肽水平往往被用于判断是否罹患阿尔茨海默氏病的早期生物指标。因此β-淀粉样肽40与42的表现量、β-分泌酶、γ-分泌酶的表现量常被用来做为研究早期阿尔茨海默氏病形成与药物治疗效果的依据及指标。
如本文所用，术语「降低β-淀粉样肽浓度」是指相较于未以本发明所提供的线粒体处理的对照而言，以本发明所提供的线粒体处理的受试者脑内的β-淀粉样肽的浓度较低。或是，相较于一受试者以本发明所提供的线粒体处理之前其体内的β-淀粉样肽的浓度，所述受试者以本发明所提供的线粒体处理后其脑内的β-淀粉样肽的浓度较低。在某些具体实施例中，术语「降低β-淀粉样肽浓度」是指在以诱导β-淀粉样肽异常表现的受试者中，相较于未接受线粒体治疗的受试者，接受分离的线粒体治疗的受试者脑部的β-淀粉样肽浓度有下降的情形。
如本文所用，术语「唐氏症诱导性全能干细胞衍生的神经元(Neurons DerivedfromInduced Pluripotent Stem Cells of Patients with Down Syndrome，简称DS-Neuron)」是指先从唐氏症(Down syndrome；DS)患者的成体细胞诱导出唐氏症诱导性全能干细胞(Down Syndrome induced pluripotent stem cell；DS-iPSC)，再从所述唐氏症诱导性全能干细胞(DS-iPSC)所诱导分化出的神经细胞。唐氏症是由于具有三条第21号染色体所造成的疾病。而在第21号染色体上带有类淀粉前趋蛋白的基因，因此大多数唐氏症患者会具有早发性认知障碍与阿尔茨海默氏病。唐氏症患者的脑部容易有β-类淀粉蛋白的形成与堆积，因此唐氏症患者的细胞可用于作为阿尔茨海默氏病研究的模型。利用唐氏症患者的成体细胞所诱导出来的唐氏症诱导性全能干细胞(DS-iPSC)具有分化成神经细胞的能力，从而分化出唐氏症诱导性全能干细胞衍生的神经元(DS-Neuron)。唐氏症诱导性全能干细胞衍生的神经元(DS-Neuron)会产生阿尔茨海默氏病的重要指标肽-β-淀粉样肽40与42，从而具有诱发β-淀粉样肽40与42的堆积而形成斑块这种阿尔茨海默氏病的病理特征，故可应用于治疗或预防阿尔茨海默氏病的药物筛选的平台。而唐氏症诱导性全能干细胞衍生的神经元(DS-Neuron)诱导模式下所产生的β-类淀粉蛋白40与42清除与否可以做为被筛选药物是否具治疗及/或延缓阿尔茨海默氏病的重要指标。于一具体实施例中，本发明所提供的线粒体可有效降低唐氏症诱导性全能干细胞衍生的神经元(DS-Neuron)细胞中β-类淀粉蛋白的累积，可进一步用于治疗及/或延缓阿尔茨海默氏病。
如本文所用，术语「药学组合物」是指任何制剂，其中本发明的线粒体可以被配制、存储、保存、改变、给药，或其组合。如下所述，所述制剂可以包括它们的任何药学上可接受的稀释剂、佐剂、缓冲剂、赋形剂、载体或组合。在一般情况下，所述制剂的组成分是基于给药的方式和途径，以及标准药学实行而被选择的。
如本文所用，术语「药学上可接受的载剂」是指任何物质或其组合与本发明的线粒体可以是物理或化学的混合、溶解、悬浮，或以其它方式组合以产生本发明的药学组合物。
如本文所用，术语「药学有效量」是指能够或足以维持或产生所期望的生理结果，包括但不限于，治疗、减轻、消除、基本上防止或预防，或其组合，疾病、病症，或其组合。药学有效量可以包括依序地或同时地施用一个或多个剂量。本发明技术领域的技术人员将知道调节本发明的剂量，以考虑到各种类型的制剂，包括但不限于缓释制剂。
如本文所用，术语「治疗」与「改善」可换使用，是指能够治疗、减少、停止进展、减缓进展、有利地改变、消除，或其组合，疾病、病症的任何方面，或其组合。
如本文所用，术语「预防」是指能基本上防止或预防疾病、病症，或其组合的任何方面的组合物。
如本文所用，术语「受试者」是指任何施与针对本发明的个体。受试者可以是，例如，哺乳动物。受试者可以是人或兽医动物，不考虑性别、年龄，或他们的任意组合，并且包括胎儿。受试者可以选择性地受特定疾病、病症或其组合的影响，或具有风险，或其组合。
如本文所用，冠词「一」、「一个」以及「任何」是指一个或多于一个(即至少一个)的物品的文法物品。例如，「一个元件」是指一个元件或多于一个元件。
本文所使用的「约」、「大约」或「近乎」一词实质上代表所述的数值或范围位于20％以内，优选为于10％以内，以及更优选为于5％以内。于本文所提供的数字化的量是近似值，意旨若术语「约」、「大约」或「近乎」没有被使用时亦可被推得。
本发明通过下列的实施例进一步说明，其提供了用于示范而非限制的目的。根据本发明公开内容，本领域中的技术人员应当理解，许多变化可以在所公开的特定具体实施例中产生，且仍然获得相同或类似的结果而不脱离本发明的精神和范围。
实施例
实施例一 唐氏症诱导性全能干细胞衍生的神经元(Neurons Derived fromInduced Pluripotent Stem Cells of Patients with Down Syndrome)的制备
1.来自唐氏症患者的人类诱导型全能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cellsof Patients with Down Syndrome,DS-iPSCs)的细胞培养
将来自唐氏症患者的人类诱导型全能干细胞(DS-iPSCs，由中兴大学生命科学系苏鸿麟教授提供，台湾)培养于无血清培养基Essential 8TM(Life Technology公司，美国)中，并以MatrigelTM基质胶(Becton-Dickinson公司，美国)进行贴附培养。接着移除培养液，以杜氏磷酸盐缓冲液(Dulbecco's phosphate-buffered saline,DPBS，Corning公司，型号：21-031-CV，美国)冲洗细胞2次后，加入细胞剥离用酵素AccutaseTM(Merck Millipore公司，美国)于37℃下反应2～5分钟后，加入培养液以停止反应，并将细胞冲洗下来后打散，以1,000rpm离心2分钟，除去上清液，放入含有新鲜的无血清培养基Essential 8TM的培养皿中进行传代培养约3～5天，且于培养期间每天更换培养液。
2.将来自唐氏症患者的人类诱导型全能干细胞(DS-iPSCs)分化成神经细胞
将上述来自唐氏症患者的人类诱导型全能干细胞(DS-iPSCs)培养至8-9分满，以杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)冲洗细胞2次，加入细胞剥离用酵素AccutaseTM于37℃下反应2～5分钟后，加入培养液以停止反应，并将细胞冲洗下来后打散，以800rpm离心约2分钟，除去上清液，将细胞置于含有20％(v/v)替代血清(knock out serum replacement,KSR，LifeTechnology公司，美国)的DMEM-F12培养基，以无盖培养皿进行悬浮培养2天，获得类胚体(Embryonic body)悬浮液。
将悬浮的类胚体置于离心管，待自然沉降后，去除上清液，加入含有BiSF小分子药物的神经诱导培养基[每500mL的神经诱导培养基含有：326mL DMEM培养基(LifeTechnologies公司，型号：11965-092，美国)、163mL F12培养基(Life Technologies公司，型号：11765-054，美国)、5mL N-2添加物(N-2Supplement，Life Technologies公司，型号：17502-048，美国)、5mL非必需氨基酸(Life Technologies公司，型号：11140-035，美国)，以及1mL肝素(1mg/mL)]，进行悬浮培养2天后，悬浮的类胚体会出现环状的上皮细胞结构，其中，所述小分子药物含有0.5μM BIO(Sigma-Aldrich公司，美国)、10ng/ml纤维母细胞生长因子-2(fibroblast growth factor-2,FGF-2，Peprotech公司，美国)，以及10μM SB431542(Sigma-Aldrich公司，美国)。
再将类胚体进行沉降后，去除上清液，加入含有10ng/ml纤维母细胞生长因子-2(FGF-2)的神经基础培养基[每521mL的神经基础培养基含有：500mL神经基础培养基(LifeTechnologies公司，型号：21103-049，美国)、5mL N-2添加物(N-2Supplement，LifeTechnologies公司，型号：17502-048，美国)、5mL非必需氨基酸(Life Technologies公司，型号：11140-035，美国)、1mL肝素(1mg/mL)，以及10mL B-27TM添加物(B-27TM Supplement，Life Technologies公司，型号：17504-044，美国)]，进行悬浮培养2天。之后，待类胚体沉降后，以外力或细胞剥离用酵素AccutaseTM将类胚体打散，接种于涂覆有1％(v/v)MatrigelTM基质胶[溶于DMEM/F12培养液(Gibco公司，型号：11330032，美国)]的培养皿中进行细胞贴附并培养。约2～7天后所述类胚体分化成神经构造，即为唐氏症诱导性全能干细胞衍生的神经元(Neurons Derived from Induced Pluripotent Stem Cells of Patients withDown Syndrome，简称DS-Neuron)。
3.唐氏症诱导性全能干细胞衍生的神经元(DS-Neuron)的传代培养
于上述唐氏症诱导性全能干细胞衍生的神经元(DS-Neuron)生长至8～9分满时进行传代培养。首先移除上清培养液，以杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)冲洗细胞2次后，加入细胞剥离用酵素AccutaseTM于37℃下反应2～5分钟后，加入NeurobasalTM培养液(Gibco公司，型号：21103049，美国)以停止反应，并将细胞冲洗下来后打散，以1,000rpm离心约2分钟，除去上清液，加入NeurobasalTM培养液将细胞浓度调整至1x105个细胞/mL，并加入ROCK抑制剂Y-27632(终浓度为10μM)(Merck Millipore公司，型号：SCM075，美国)。接着将细胞接种于涂覆有1％(v/v)MatrigelTM基质胶(溶于DMEM/F12培养液)的培养皿中，并加入NeurobasalTM培养液进行培养。于隔日移除NeurobasalTM培养液，并加入含2％(v/v)B-27TM添加物及10ng/ml重组人类纤维母细胞生长因子(recombinant human Fibroblast Growth Factor,rh-FGF，Gibco公司，美国)的NeurobasalTM培养液继续培养。每隔2-3天更换新鲜培养液，直至下次传代。
实施例二线粒体的制备
线粒体是自人类脂肪干细胞(Adipose-derived stem cells,ADSCs)提取纯化而来。在培养皿中将人类脂肪干细胞培养至细胞数为1x108个细胞时，以杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)进行冲洗，移除DPBS后加入细胞剥离用酵素AccutaseTM(Merck Millipore公司，美国)于37℃下反应2～5分钟后，加入培养液以停止反应，并将细胞冲洗下来后打散，以1,000rpm离心2分钟，除去上清液，加入2ml的SHE缓冲液[0.25M蔗糖、0.5mM乙二醇四乙酸(ethylene glycol tetraacetic acid,EGTA)、3mM N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-乙磺酸(N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N'-ethanesulfonic acid,HEPES),pH 7.2；上述药品皆购自Sigma-Aldrich公司]，于均质器中研磨15次(冰上操作)后以1000xg离心15分钟，离心后将上清液收集至另一离心管内再以9000xg离心10分钟，离心后移除上清液并将沉淀物(线粒体)加入50μl的SHE缓冲液，并加入蛋白质分解酵素抑制剂，保存于4℃备用。
实施例三 细胞实验
1.细胞处理
将上述实施例一得到的唐氏症诱导性全能干细胞衍生的神经元(DS-Neuron)以2x105个细胞/孔的密度接种于24孔细胞培养盘内，并以含2％(v/v)B-27TM添加物的NeurobasalTM培养液继续培养16-24小时后，将上述实施例二得到的线粒体以每孔15μg/ml或40μg/ml的浓度加入所述培养液中，并于4℃下以1,500xg离心15分钟，使线粒体沉至培养盘底部。接着于37℃培养箱中使上述唐氏症诱导性全能干细胞衍生的神经元(DS-Neuron)与线粒体共同培养24或48小时。共同培养后于显微镜下观察细胞型态的改变，并收集各孔细胞的培养液，并以1,000rpm离心5分钟，将上清液保存于-80℃，供进一步分析使用。
2.酶联免疫吸附测定(Enzyme-Linked Immunoadsorbent Assay,ELISA)
以酶联免疫吸附测定(ELISA)进行上述唐氏症诱导性全能干细胞衍生的神经元(DS-Neuron)的β-淀粉样肽40与42的表现量分析。根据商用试剂盒LEGEND MAXTMβ-Amyloidx-40ELISA Kit(BioLegend公司，美国)及LEGEND MAXTMβ-Amyloid x-42ELISA Kit(BioLegend公司，美国)所附制造商操作手册进行分析。分析步骤简述如下：将上述唐氏症诱导性全能干细胞衍生的神经元(DS-Neuron)与线粒体共同培养后的上清液与反应缓冲液(incubation buffer，BioLegend公司，美国)以1:5的比例进行稀释；取50μl上述稀释液加至LEGEND MAXTMβ-Amyloid x-40ELISA Kit及/或LEGEND MAXTMβ-Amyloid x-42ELISA Kit所提供的反应盘中，每个样品三重复，并加入50μl辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)标记的侦测抗体(HRP detection antibody，BioLegend公司，美国)，于4℃下反应16小时后，移除反应物，并以300μl清洗缓冲液(wash buffer，BioLegend公司，美国)清洗，共5次；接着加入200μl 3,3',5,5'-四甲基联苯氨基质(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine,TMB substrate，BioLegend公司，美国)在室温下避光进行反应40-50分钟；接着读取620nm波长下的吸光度，根据标准蛋白序列稀释做出的标准曲线，计算各样品中β-淀粉样肽40与42的水平。
3.统计分析
所有的统计分析及多群组之间的比较皆使用GraphPad Prism程序(GraphPad公司，圣地牙哥，加州)，以单因素方差分析(One-Way Analysis of variance,One-WayANOVA)加上杜凯氏(Tukey's)事后检验。p<0.05值被认为具有统计上的显著差异。
4.结果
唐氏症诱导性全能干细胞衍生的神经元(DS-Neuron)与15μg/ml或40μg/ml浓度的线粒体共同培养24或48小时后，于显微镜下观察到的细胞型态分别如图1B、1C、1E、1F所示。相较于未与线粒体共同培养的对照组的细胞型态(如图1A、1D所示)，与线粒体共同培养的唐氏症诱导性全能干细胞衍生的神经元(DS-Neuron)的细胞型态并无改变(如图1B、1C、1E、1F所示)，表示15μg/ml或40μg/ml浓度的线粒体对唐氏症诱导性全能干细胞衍生的神经元(DS-Neuron)不会产生细胞毒性。
上述唐氏症诱导性全能干细胞衍生的神经元(DS-Neuron)的β-淀粉样肽40与42的表现量分析结果则分别如图2及图3所示。如图2所示，不论与15μg/ml或40μg/ml浓度的线粒体共同培养24小时(图2A)或48小时(图2B)后，唐氏症诱导性全能干细胞衍生的神经元(DS-Neuron)的β-淀粉样肽40的表现量皆显著降低(p<0.001)。另外，图3所示，不论与15μg/ml或40μg/ml浓度的线粒体共同培养24小时(图3A)或48小时(图3B)后，唐氏症诱导性全能干细胞衍生的神经元(DS-Neuron)的β-淀粉样肽42的表现量亦皆显著降低(p<0.05或p<0.01)。由上述结果可知，线粒体可以降低神经元细胞内β-淀粉样肽的表现，从而可以被用于阿尔茨海默氏病的治疗上。
实施例四 动物实验
1.试验动物处理
将24只未做过试验的雄性C57B1/6品系小鼠(9周大/25-30g/只，购自乐斯科生物科技公司(BioLASCO Co.,Ltd，台湾)随机分成4组，每组6只，各组小鼠分别进行以下处理：
第一组：于小鼠侧脑室内注射磷酸盐缓冲溶液(PBS)，连续注射14天，并于第15天注射SHE缓冲液(对照组，正常小鼠)；
第二组：每只小鼠每日以300pmolβ-淀粉样肽42于侧脑室连续注射14天，使其产生记忆障碍，并于第15天于侧脑室注射SHE缓冲液(Aβ1-42处理组，具有阿尔茨海默氏病病征的小鼠)；
第三组：每只小鼠每日以300pmolβ-淀粉样肽42于侧脑室连续注射14天，使其产生记忆障碍，并于第15天于侧脑室注射上述实施例二得到的线粒体30μg，线粒体注射12天后进行水迷宫实验(Aβ1-42+mito 30处理组，具有阿尔茨海默氏病病征的小鼠以30μg分离的线粒体治疗)；以及
第四组：每只小鼠每日以300pmolβ-淀粉样肽42于侧脑室连续注射14天，使其产生记忆障碍，并于第15天于侧脑室注射上述实施例二得到的线粒体60μg，线粒体注射12天后进行水迷宫实验(Aβ1-42+mito 60处理组，具有阿尔茨海默氏病病征的小鼠以60μg分离的线粒体治疗)。
2.水迷宫学习模式
取直径183cm的塑胶圆形筒作为水池(水温25±2℃)，一圆形平台被放置于水池边缘的特定位置，且位于水面下，以供试验小鼠休息站立。添加无毒染剂到水池中，使水变混浊。小鼠必须通过记忆及辨识设置于水池墙上的特殊的视觉线索进行学习。针对记忆与空间学习，试验动物每天接受3次试验，训练程序持续4天。小鼠被放置在以随机顺序等间距围绕水池圆周的不同起始点，试验小鼠有60秒钟可在泳池游泳，若一小鼠无法发现所述平台，其会被引导至所述平台，且允许其停留在所述平台上20秒钟。将每只小鼠到达所述平台所花费的时间记录作为通过水迷宫的时间(escape latency)，并记录每只小鼠到达所述平台所游泳的距离。
3.生化分析
将各组别试验小鼠于记忆与空间实验评估结束后进行牺牲，并侦测Aβ1-42、β-分泌酶(β-secretase)、γ-分泌酶(γ-secretase)的表现量。以ELISA进行β-淀粉样肽42的表现量分析，分析方法如实施例三所述。并以下述方法分别进行β-分泌酶(β-secretase)与γ-分泌酶(γ-secretase)表现量的分析。
β-分泌酶(β-secretase)表现量的分析：取待测的蛋白质(浓度介于25-200μg/ml)及序列稀释后的标准品50μl至96孔盘内，加入48μl的2X反应缓冲液(reaction buffer)及2μlβ-分泌酶受质(β-secretase substrate)到每个待测样品的孔洞中，轻微且均匀的摇晃后在避光环境下于37℃作用1-2小时，反应后放至萤光侦测仪中以335-355nm波长进行激发，并于495-510nm波长下侦测吸收光进行判读，所得的数值与序列稀释的标准品进行比较后得到待测蛋白质的量(相对萤光单位，relative fluorescence unit,RFU)，此即代表β-分泌酶(β-secretase)的表现量。
γ-分泌酶(γ-secretase)表现量的分析：取100μl待测蛋白质与不同浓度的标准品至96孔盘中，于37℃下作用2小时。接着将96孔盘内样品移除并加入100μl生物素抗体(biotin-antibody)至每个欲测的孔盘中，于37℃下作用1小时。做用完后将液体吸出并以清洗缓冲液进行冲洗，重复清洗五次后加入90μl TMB受质，在避光环境中于37℃下作用15-30分钟，接着加入50μl终止溶液终止反应，放入萤光侦测仪中侦测450nm波长的吸光度，并根据标准品浓度进行γ-分泌酶(γ-secretase)的浓度分析。
4.统计分析
所有的统计分析及多群组之间的比较皆使用GraphPad Prism程序(GraphPad公司，圣地牙哥，加州)，以单因素方差分析(One-Way Analysis of variance,One-WayANOVA)加上杜凯氏(Tukey's)事后检验。p<0.05值被认为具有统计上的显著差异。
5.结果
5.1分离的线粒体可改善由β-淀粉样肽引起的空间学习及记忆的损伤。
本实施例使用由β-淀粉样肽诱导的记忆缺失动物模式来分析分离的线粒体对阿尔茨海默氏病的影响。图4A及图4B分别显示每组小鼠通过水迷宫的平均逃脱时间及游泳距离。只注射β-淀粉样肽的小鼠(第二组)需要较长的逃脱时间以及较长的游泳距离才通过水迷宫。相较于只注射β-淀粉样肽的小鼠(第二组)，在注射β-淀粉样肽后再分别注射30μg及60μg的分离的线粒体处理的小鼠(分别是第三组及第四组)通过水迷宫的平均逃脱时间皆显著下降(p<0.05或p<0.01)，并可观察到处理的线粒体浓度增加与小鼠的记忆行为能力的改善成正比。且游泳距离的部分，亦可以观察到相较于只注射β-淀粉样肽的小鼠(第二组)，在注射β-淀粉样肽后再分别注射30μg及60μg的分离的线粒体处理的小鼠(分别是第三组及第四组)通过水迷宫的游泳距离皆显著缩短(p<0.05或p<0.01)。此结果表示，分离的线粒体改善了由β-淀粉样肽引起的记忆障碍小鼠的空间学习能力，且随着分离的线粒体的浓度增加而增加改善效果。
5.2施用分离的线粒体可显著降低小鼠脑内β-淀粉样肽42与γ-分泌酶的表现量。
本实施例进一步分析分离的线粒体对小鼠脑内β-淀粉样肽42、β-分泌酶、γ-分泌酶的表现量的影响。图5A、图5B、图5C分别显示每组小鼠脑内β-淀粉样肽42的表现量、β-分泌酶的表现量，以及γ-分泌酶的表现量。只注射β-淀粉样肽的小鼠(第二组)脑内β-淀粉样肽42、β-分泌酶、γ-分泌酶的表现量最高。相较于只注射β-淀粉样肽的小鼠(第二组)，在注射β-淀粉样肽后再分别注射30μg及60μg的分离的线粒体处理的小鼠(分别是第三组及第四组)脑内β-淀粉样肽42与γ-分泌酶的表现量皆显著下降(p<0.05或p<0.01或p<0.001)；而第三组及第四组小鼠脑内β-分泌酶的表现量也随着分离的线粒体的注射量增加而有下降的趋势。
由于β-分泌酶及γ-分泌酶对于β-淀粉样肽的形成具有重要的作用，且β-淀粉样肽的堆积被认为是造成阿尔茨海默氏病的主因，因此上述结果表示，分离的线粒体改善了小鼠脑内β-淀粉样肽的形成及堆积，进一步改善了阿尔茨海默氏病的症状(记忆障碍)，且随着分离的线粒体的浓度增加而增加了改善的效果。
上列详细说明是针对本发明之一可行实施例的具体说明，惟所述实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本案的专利范围中。
Claims (9)
1.一种分离的线粒体用于制备治疗及/或预防阿尔茨海默氏病的药学组合物的应用，所述药学组合物由一缓冲水溶液以及该分离的线粒体组成，且所述分离的线粒体未被包封；所述阿尔茨海默氏病是由于β-淀粉样肽在脑神经细胞中堆积所造成的。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述分离的线粒体分离自一干细胞。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述分离的线粒体的剂量至少0.07 mg/kg一受试者体重。
4.一种分离的线粒体用于制备降低阿尔茨海默氏病患者脑神经细胞中β-淀粉样肽浓度的药学组合物的应用，所述药学组合物由一缓冲水溶液以及该分离的线粒体组成，且所述分离的线粒体未被包封。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述分离的线粒体分离自一干细胞。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述分离的线粒体的剂量至少0.07 mg/kg一受试者体重。
7.一种分离的线粒体用于制备改善记忆障碍及/或学习能力障碍的药学组合物的应用，所述药学组合物由一缓冲水溶液以及该分离的线粒体组成，且所述分离的线粒体未被包封，且所述记忆障碍及/或学习能力障碍是阿尔茨海默氏病由于β-淀粉样肽在脑神经细胞中堆积所造成的。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述分离的线粒体分离自一干细胞。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述分离的线粒体的剂量至少0.07 mg/kg一受试者体重。
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