JPH07503467A - 細胞を脳に移植する方法及びその治療使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞を脳に移植する方法及びその治療使用関連出願についての説明 本出願は、１９９０年ＩＯ月１９日出願の米国出願第０７１５９９．８０２号の 一部継続出願であり、その内容をすべて参考として引用する。

本発明は、ニューロサイエンス医薬の分野において、細胞を哺乳動物脳に内植あ るいは移植する神経疾患の治療に有効な方法に関する。

に有用薬剤の効能の限界及び深刻な副作用によって挫折してきた。多くのこのよ うな疾患が特定の“ニューロングラスター“又は脳の領域に関与していることか ら、神経細胞又はニューロン様細胞を直接罹患脳領域に移植すると治療効果を生 じることが期待された。細胞移植方法は主にパーキンソン病の研究で重視されて おり、ハンチントン病、アルツハイマー病、てんかんのような重篤な発作疾患、 家族性自律神経失調症及び神経系に対する損傷あるいは外傷を包含する神経系の 他の衰弱疾患からの回復を促進するのに有効である。更に、脳に挿入された神経 伝達物質形質発現に影響する因子の確認は正常な過程の理解を深めかつ染色体異 常の形質発現に起因する出土時欠損を治療上予防又は修正することができる手段 を示すものである。ニューロン又はニューロン様細胞は中枢神経系（ＣＮＳ）、 特に脳に固体組織ブロックあるいは分散細胞として移植することができる。しか しながら、今日では、技術上及び倫理上双方の多くの問題から臨床的に可能な移 植方法の開発を厄介なものにしている。

パーキンソン病はドーパミン作動性悪質線条体ニューロンの選択的損失に起因し 、悪質から線条体への入力損失を生じる。成人副腎髄質及び胎児悪質（ＳＮ）の ようなドーパミンを生産することができる組織の固体移植片は、ドーパミン作動 性細胞を破壊する６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）で処理したラッ胎 児ＳＮの移植片は、また、パーキンソン病棟疾患を生じる神経毒ｌ−メチル−４ −フェニル−１，２，３，４−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）で損傷した霊 長類用の治療として用いられている（Ｒｅｄｍｏｎｄ、　Ｄ、Ｅ、ら、　Ｌａｎ ｃｅｔ　８４９０：１１２５−２７（１９８６））。

５ｔｅｎｅｖｌら（Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　１１４：ｌ−２０（１９７６））に より、胎児ＣＮＳニューロンが次に血管の豊富な供給体に入って良好な結果が得 られることが判明した。実際に、文献を調べると手順の詳細が注意されるならば 胎児脳のほとんど全域からの組織Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８４．　ｐｐ、　＋ ２５−１６５参照）。

胎児組織は異種環境で分化するとともに宿主組織に組込まれる優れた細胞源を供 給する。例えば、胎児ＳＮを６−０ＨＤＡ処理ラツトに移植するとドーパミンを 生産し、アポモルフイネ又はアンフェタミン誘導回転を減少させ、感覚欠損を軽 減し、宿主線条体内にシナプスを作ることが知られている（上記Ｄｕｎｎｅｔｔ ら。

Ｍｏｒｉｓｈａら、　Ｐｅｒｌｏｗら）。移植したニューロンはまた自発的活性 であるので、正常な成人ＳＮニューロンによく似ている（Ｗｕｅｒｔｈｅｌｅ、 　Ｓ、Ｍ、ら、　Ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅｓ。

Ｐａｒｔ　Ｂ、（Ｅ、Ｕｓｄｉｎ　ら、ｅｄｓ、）、　Ａ、Ｒ，Ｌｉ５ｓ、Ｉｎ ｃ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ｐｐ、３３３−３４１）。

胎児神経組織の移植成功とは反対に、成熟ＣＮＳニューロンは移植片での生存が 見られていない（Ｓｔｅｎｅｖｉ、　Ｕ、ら、　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　＋＋４ ：１−２０　（１９７６））、胎児ＣＮＳニューロンか移植手順を生存するか成 人ニューロンはしない理由は、不確実であるがおそらくいくつかの要因に関係し ている。まず、胎児ニューロンは成熟ニス１９７０、　ｐｐ、　３３１−３６９ ）、移植手順は必ず移植片に十分な血液供給か確立されるまで無酸素期間を含ん でいる。第２に、胎児ニューロンは急速な発育相て用いられる場合最もよく生存 するようであり、結合前に標的組織で確かめられている（Ｂｏｅｒ。

Ｇ、Ｊ、ら、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　１５：１０８７−１１０９．　（１ ９８５））。また、胎児組織は、損傷した宿主脳の内部に存在することが知られ る成長（又は“生存“）因子に特に応答するこしかしながら、有望な胎児組織及 び細胞移植片にもかかわらず、当該技術はヒト薬剤において胎児組織を使用する ことに伴う倫理的、道徳的及び法律的問題のために代わりの移植用供与組織源に たよっている。これらの組織源としては、臓器提供者及び培養セルライン由来の 神経及び傍神経細胞を包含する（例えば二Ｇａ５ｈ、Ｄ、Ｍ、ら、　Ｎｅｕｒａ ｌ　Ｇｒａｆｔｉｎｇ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　ＣＮＳ、Ｂｊｏｒ ｋｌｕｎｄ、Ａ、ら、■р刀B Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、　Ａｍ５ｔｅｒｄａａ１９８５．　ｐｐ、　５９５−６０３ ；　Ｇａ５ｈ、Ｄ、Ｍ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２３３：１４Q０−２２ （＋９８６）参照）。

移植方法を用いる初期の臨床実験は長時間持続する効果はもたらさなかったが、 １７：６５−７６　（１９９０）を参照、これを参考として引用する）。しかし ながら、用いられる手術手順には健康な線条体の一部を取り出すとともに胎児副 腎の“かたまり”に置き換える開頭術又は全“間脳“術を必要とした。得られた 治療効果はいくぶん議論の余地があった。しかしながら、既に衰弱した人におい て危険な神経移植術を必要としかつ胎児組織の使用を必要とするため、この方法 は好ましくない。

更に、ヒト実験において（上記Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ；　Ｌｉｎｄｖａｌｌ、　Ｏ ，、Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｌ。

Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ、　Ｐｓｙｃｈｉａｔ、、　１９８９．５ｐｅｃｉａｌ　Ｓ ｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、　ｐｐ、　３９−５４：　ＢａｋａｙAＲ，Ａ、Ｅ、。

Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｎ、　Ａｍｅｒ、　１：８８１−８９５　 （１９９０））　、自家移植片が胎児材料の要求に換えて試みられた。この手順 においては、患者はまず健康な副腎を取り出す最初の開腹手術を受けた。次いで 、この患者は胎児副腎移植片の場合と同様の神経移植術を受けた。副腎摘出術／ 神経移植術双方の外科的罹患率−死亡率は高いことか予想された。最終の治療効 果は３０％はどであることが主張されたが、連続６人で１人はどの低いものであ った。これらの患者に移植した副腎物質が生存した証拠はなかった。

更に、副腎細胞の移植か生存可能な方法でなければならないいくつかの所見が示 されている。副腎髄質は神経櫛由来であり、交感神経ニューロンのように神経成 長因子（ＮＧＦ）に応答して生体内又は生体外で突起を成長させる（Ｕｎｓ　１ ｃｋｅｒ。

翫ら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　’ｉ’５： ３４９８−３５０２　（１９７８））、若いラット由来の副腎髄質の固体移植片 は、６−０ＨＤ処理ラツトの脳で少なくとも５カ月生存し、ドーパミンを生成し 、アポモルフイネ誘導回転を減少させることができる（上記Ｄｕｎｎｅｔｔら： 　Ｆｒｅｅｄ、Ｗ、Ｊ、ら、＾ｎｎ、　Ｎｅｕｒｏｌ、　８：５１０−５１９　 （１９８０）；　Ｆｒｅｅｄ、　Ｗ、ＪAら。

５ｃｉｅｎｃｅ　２２２：９３７−９３９　（１９８３））、これらの所見は、 適切な環境を与えると、副腎髄質細胞がカテコールアミン合成線維を成長する可 能性を存することを示している。

クロム親和細胞のニューロン分化の可能性は、ラット線条体に注入した場合突起 を成長させる解離した副腎クロム親和細胞の移植片によって更に解明されている 。培養した副腎髄質細胞もＮＧＦの存在下に培養すると突起を有するニューロン 様細胞に分化する（上記Ｕｎｓｉｃｋｅｒ）。副腎細胞のこの顕著な形成性は、 形態だけでなく神経伝達物質形質発現にも観察される。バソアクティブインテス ティナルペプチド配列及びモノアミン、セロトニンは副腎髄質細胞内でカテコー ルアミンと同時に存在する（Ｓｃｈｕｌｔｚｂｅｒｇ、　Ｍ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ 、　３：１１６９−］１８６　（１９７８）＋Ｌｕｎｄｂｅｒｇ。

Ｊ、Ｍ、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７６：４０７ ９−４０８２　（１９７９））。これらの種々の表現型の発現は、外因性シグナ ルによって調節される。例えば、エンケファリン及びＶＩＰ発現は、生体内副腎 の脱神経に伴って、ニコチン性遮断薬処理によって又は生体外副腎細胞を支持し た後増大する（Ｔｉｓｃｈｌｅｒ、Ａ、Ｓ、　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ、　３７：Ｉ８ ８＋−１８８６（１９８５））。神経櫛由来のニューロンが正常な発生で発現型 をスイッチすることができることを示す他の実験（Ｂｏｈｎ、　Ｍ、Ｃ，ら、　 Ｄｅｖｅｌ、　Ｂｉｏｌ、　８２：ｌ−１０（１９８１）；Ｊｏｎａｋａｉｔ、 　Ｇ、Ｍ、ら、　Ｄｅｖｅｌ、　Ｂｉｏｌ、　８８：２８８−２９６　（１９８ １））又はミクロの実験操作による他の実験化ｅＤｏｕａｒｉｎ、　Ｎ、Ｍ、　 ５ｃｉｅｎｃｅ　２３１　＋　１５１５−１５２２　（１９８６））と共に採用 されるこれらの所見は、将来には移植前及び／又は後に移植細胞によって発現し た神経伝達物質表現型を調節することが可能であることを示している。

更に組織ブロックに比べて解離した細胞を移植する利点は、移植前に細胞を成長 因子のような種々の物質と予備培養することができること又は分化の特異的パラ メーターを促進する他の細胞又は物質ど同時移植することができることである。

更に、膠細胞は特異的位置作用を有し、ニューロン成長因子を生産する（Ｂａｒ ｂｉｎ。

Ｇ、ら、　Ｄｅｖｅｌ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　７：２９６−３０７（１９８５ ）：Ｓｃｈｕｒｃｈ−Ｒａｔｈｇｅｂ、　Ｙ、ら、　Ｎａｔ浮窒■@２７３： ３０８−３０９　（１９７８）；　Ｕｎｓｉｃｋｅｒ、Ｋ、ら、　Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８１：２２４２|２２４６ （１９８４）；　Ｔｈｉｔａｋｅｒ−Ａｚｍｉｔｉａ、　Ｐ、Ｍ、ら、　Ｂｒａ ｉｎ　Ｒｅｓ、　４９７：８０−８５　（１９８９））。こ黷■A ダリア誘導因子を生産する個々の種類のダリアと共に所望の神経伝達物質を供給 する同時移植細胞がニューロン成長及び移植細胞の所望の分化を促進することを 示している。

成人細胞を脳に移植することによるパーキンソン病の治療が成功しないのは、大 部分層に挿入された際に移植細胞力坏明の理由で成長できないことによるもので ある。脳に直接注入した細胞は約２〜４週間で死滅することは一般に知られてい る（本発明者による未発表の実験でも見られる）（例えばＩｔａｋｕｒａ、　Ｔ 、ら、Ｊ。

Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ、　６８：９５５−９５９　（１９８８）参照）。上記のよ うに有望な成長因子の使用にもかかわらず、移植細胞の生存を長くするために成 長因子を使用する実際の試みは、極めて限定された成功であった。ニューロン成 長因子とクロム親和細胞との使用には更に望ましくない厄介な問題かある。かか る因子は、クロム親和細胞をより多くの内分泌表現型からニューロン表現型に“ 形質転換“するためにたいてい作用し、それによりドーパミンの全分泌物は非常 に少ない。これらの移植細胞が脳内に適切なシナプス結合を確立する確率が非常 に低いために、因子誘導ニューロ二ノ形質転換はドーパミンの十分な量を分泌す ることができない細胞になる。

即ち、移植方法の実行可能性が実験的に確立されているが、本方法は入手可能性 か限定されるとともに政治上非常に重要である胎児組織の使用の要求により厳し く制限される。実質的に、流産した妊娠からのヒト胎児組織の移植は米国におい て禁じられている。即ち、成人組織の脳への満足な移植のために簡便で普通でか つ安全な方法が衰弱する神経疾患の治療に有効であるならば非常に有益である。

この課題の１つの解決方法がＡｅｂｉｓｃｈｅｒと彼の同僚によって試みられて おり、神経組織の断片を封入する選択的に透過できる生体適合性ポリマーを脳に 内植するのに成功した（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ、　Ｐ、ら、　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ 、　４４８：３６４−３６８　（１９８８）；　Ｗｉｎｎ、Ｓ、ＲB ら、　Ｊ、　Ｂｉｏｍｅｄ　Ｍａｔｅｒ　Ｒｅｓ、　２３：３１−４４　（１９ ８９）。選択透過ポリ塩化ビニルアクリルコポリマーＸＩＪ−５０からなるポリ マーカプセルは、封入された組織の宿主細胞による侵入を完全に防止した。透過 性に基づいて抗体とウィルスが同様に排除されることが予想される。ドーパミン 放出ポリマー捧を選択透過ポリマーに封入するとともにラットの脱神経線条体に 挿入すると、実験的に誘導されたパーキンソン病症状が軽減された（Ｗｉｎｎ　 Ｓ、Ｒ，ら、　ＥＸｌｌ、　Ｎｅｕｒａｌ、　１０５：２４４−５０　（１９８ ９）、更に、米国特許第４．８９２．５３８号（Ａｅｂｉ　５ｃｈｅｒら、登録 日１／９／９０）には、ウィルス、抗体及び外部環境に存在する池の有害物質を 排除しなから神経伝達物質を拡散することができる半透膜内に細胞を分泌するこ とを含む神経（五達物質の送達のための患者における内植用細胞培養用具が開示 されている。半透膜はアクリルコポリマー、ポリフッ化ビニリデン、ポリウレタ ン、ポリアルギン酸、セルロースアセタール、ポリスルホン、ポリビニルアルコ ール、ポリアクリロニトリル又はその誘導体もしくは混合物の膜であり、分子ｆ １５０ｋＤまでの溶質を拡散することができる。この用具は神経伝達物質、前駆 体、アゴニスト、断片等を標的領域、特に脳に持続した局所送達によるパーキン ソン病のような神経伝達物質欠損症状の治療に有効であると述べられている。こ の用具は内容物を新しくするか又は補充するように回収され、細胞は免疫応答及 びウィルス感染に対して防御される。

発明の要約 発明者らは、まず生体外細胞を９０μｍ径のガラスピーズのような支持マトリッ クス上で培養することにより、成熟ＣＮＳニューロン又は培養細胞のような細胞 を哺乳動物脳に巧く移植することができるという予期しない発見をした。細胞が 付着するビーズは宿主の脳に定位手術で注入される。そのように注入された細胞 はその生存力が保持されるので、効果的に移植される。種関門前後に移植される 場合でさえ、延長した生存及び生体内生存力を示す。

この方法で移植された場合、ドーパミンを分泌する成人副腎クロム親和細胞は、 パーキンソン病のラットモデルにおいてドーパミンの欠損を修正することができ る。これらの結果は、細胞が長時間生存するだけでなく、機能を持続するととも に治療効果があることを示している。

本発明の目的は、従来の研究の上記欠点を克服するものである。

本発明は、哺乳動物の脳に細胞を移植する方法であって、細胞がマトリックスに 封入されないように好ましくは細胞をマトリックスと共に培養することにより、 細胞を生体外で支持マトリックスの表面に結合させ、その結合した細胞を存する 支持マトリックスを脳に移植する方法を提供するものである。

本方法は、ガラス又は他のシリコン酸化物、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポ リエチレン、ポリアクリルアミド、ポリカーボネート、ポリペンテン、アクリロ ニトリルポリマー、ナイロン、アミラーゼ、ゼラチン、コラーゲン、デキストラ ン及びセルロース（例えばニトロセルロース）のような天然又は変性ポリサッカ ライド、ヒアルウロン酸、細胞外マトリックス、寒天又はマグネタイトで作られ た支持マトリックスを包含する。好ましい支持マトリックスは、多孔性又は非多 孔性ビーズ、特に直径約９０〜約１５０μｍを有するマイクロビーズである。

本発明の方法は、副腎クロム親和細胞のような神経又は傍神経由来の多くの異な った種類の細胞を使用してもよい。生体外で増殖したセルラインも有効である。

線維芽細胞のような神経又は傍神経由来でない細胞も神経ペプチド又は神経伝達 物質又は神経成長因子を生成する酵素又は酵素セットをコードするＤＮＡを移入 した後用いられる。

本発明は、患者における神経疾患の治療方法であって、上記方法に従って疾患を 治療することができる有効数の細胞を移植することを含む方法を包含する。本発 明に従って治療される疾患としては、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハン チントン病、てんかん、家族性自律神経失調症及び外傷性脳損傷が挙げられるが これらに限定されない。

図面の簡単な説明 図１は、ガラスマイクロビーズ上の成人副腎髄質細胞を挿入したラット脳の切片 の顕微鏡写真である。この切片を固定し、セイヨウワサビペルオキシダーゼを用 いてチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）に組織化学的に染色した。暗く染色され た領域がＴＨを含む細胞を示している。染色パターンは、ニードル管か右側の部 分に入っていることを示している。中央の大きな円形の染色領域は、挿入細胞の 大部分を示している。注入細胞は″腺様”パターンを形成し、若干ニードル管の 中に逆に広がっている。（厚さ；２０ミクロン；拡大：１００Ｘ）図２は、ラッ トにおけるアポモルフイネ誘導回転挙動に関するガラスピーズに結合した細胞を 移植する効果を示すグラフである。ラットに対照ビーズ又は副腎クロム親和細胞 もしくは網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞が結合されているビーズを注入した。

図３は、ラット脳に移植された単独で移植したあるいはガラスピーズとインキュ ベートした後移植した細胞の生存を示すグラフである。

図４は、ラット脳に移植した６力月後の解離した生存可能な着色副腎クロム親和 細胞によって囲まれたガラスピーズを示す顕微鏡写真である（拡大：４００Ｘ） 。

好ましい実施ｆＩ！、様の説明 本発明は、哺乳動物脳に通常移植されずかつ生存することができない成人細胞又 は培養細胞を、まず支持マトリックスに結合することにより生存させることがき るという発明者らの予期されない発見に基づくものである。多数の異なった種類 の細胞か本発明に有効である。典型的には、細胞は宿主脳へ欠損物質を供給する その能力に基づいて選択される。欠損物質は、神経伝達物質又はそれがないと神 経疾患又は機能不全を引き起こす神経活性分子である。移植された細胞が宿主に 挿入されると腫瘍にように増殖しないことが重要である。

下記に言及される参考文献は、詳細に引用してもしなくてもとにかくすべて参考 として本明細書に引用する。

“神経又は傍神経由来”は、胎児神経櫛由来の細胞を意味するものである。傍神 経由来細胞の好ましい例は、副腎髄質クロム親和細胞である。哺乳動物副腎髄質 に対する前駆体細胞は神経櫛由来であり、分化のニューロンあるいは内分泌系に 沿って発生する可能性を有する（Ｂｏｈｎ、　Ｍ、Ｃ，ら、Ｉ９８［、上記、　 Ｄｅｖｅｌ、　Ｂｉｏｌ、　８９：２９９−３０８　（１９８２）：　ＩＪｎｓ ｊｃｋｅｒ、　Ｋ、、　Ｄｅｖｅｌｏｐ、　Ｂｉｏｌ、　１０８：２５９−２６ ８　（１９８５j）。ラット、 サル及びヒト副腎髄質由来のクロム親和細胞は、副腎皮質の影響から除がれがっ 神経成長因子（ＮＧＦ）に曝されると、内分泌からニューロン表現型に変化する （Ｎｏｔｔｅｒ、Ｍ、　Ｐ、ら、　Ｃｅ１ｌ　Ｔｉ５ｓ、　Ｒｅｓ、　２４４＋ ６９−７０　（＋９８６）；　Ｓｔｒｏｍｂｅｒｇ、　１．轣A型ム Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　６０：３３５−３４９　（１９８５）；上記Ｕｎｓｉｃ ｋｅｒ、　Ｋ、ら、　＋９７８）、ラット眼の前房に大脳皮質又は海馬組織と同 時移植すると、副腎クロム親和細胞は神経線維を形成して隣接の同時移植脳組織 を神経支配する（Ｏｌｓｏｎ、　Ｌ、Ａ、ら、　Ｅｘｐ、　Ｎｅｕｒａｌ、　７ ０４１４−４２６　（＋９８０））、もう１種の傍神経細胞は、網膜色素上皮細 胞である（Ｓｏｎｇ、　Ｍ−にら、Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｐｈｙｓｉｏｌ、１４８ ：１９６−２０３　（１９９０））。

供与細胞源は、樹立神経セルラインである。多数のニューロンクローンが存在し 、適切な表面レセプター、特異的神経伝達物質、シナプス形成性及び正常ニュー ロンへの形態学的及び生化学的分化能と電気的に活性であることから、発生のモ デル系として広く用いられている。神経ラインはＣＮＳニューロンに見られる遺 伝子発現に対応する驚くべき量の遺伝子情報を発現することができる。かかるｏ ｆ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌｓ、　Ｃ１ａ ｒｋｓｏｎ、　Ｂ、ら、　ｅｄｓ、　、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ窒奄獅■@Ｈａｒｂｏ ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ 、　ｔＪＹ、　１９７４．　ｐｐ、　５８１−５９４）；　oｕｒｏ、Ｄ、Ｇ。

！Ｊａｎａｒｉｎｉ　（１９８２））。

これらの培養細胞の主な利点は、表現型及び遺伝子型を調節するに当たり環境及 び細胞自体を操作する可能性を有することであった。

例えば、ＩＭＲ３２セルライン由来のヒト神経芽細胞腫細胞は、移植後９力月霊 長類の脳において生存するとともにコリン作動性マーカーを発現する（Ｇａｓｈ 。

Ｄ、　Ｍ、ら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３３：１４２０−２２　（１９８６））、 これらの細胞は、生体外で形態学的及び生化学的に分化させるために処理するこ とが好ましく、生存を更に促進するために移植前に永続的に無光分裂させなけれ ばならない（上記ｃａｓｈら；　Ｇｕｐｔａ、＆１．ら。

ＮＧＦと生体外で処理して神経細胞分化を刺激し、次いで抗ミドティック剤に曝 して細胞増殖を阻害するとカテコールアミン神経伝達物質の発現あるいは生存度 に有害な影響を及ぼさずかつ移植後の動作を刺激するのに有効である。従って、 本発明の１実施態様においては、細胞の生存を促進させるとともに悪性の発現を 防止するために、移植前にセルライン細胞は適切な成長又は分化因子で及びアミ ドティック剤と生体外で調節される。

常法を用いて生体外でクローナル細胞の神経細胞表面を試験すると、本発明に従 って使用する適切な細胞を選ぶことができることは当業者に明らかである。正常 な発生及び分化で、ニューロンの細胞表面はＣＮＳにおいてニューロンの移動、 認識及び組込みとみなしている著しい変化を受ける。例えば、マウスＣｌ３００ クローナル神経細胞ラインがプロスタグランジンＥ１及びサイクリックＡＭＰの ようなアンチミドティック剤又は成長モジュレータ−で処理すると、新しい低分 破傷風毒素を結合するＤＮＳ表面ガングリオシドが誘導されている（上ＥＮｏｔ ｔｅｒ。

Ｍ、Ｆ、、１９８６）が、特異的レクチン結合糖タンパクは正常な中枢神経系糖 タンパクと同様であると思われる。更に、神経芽細胞腫細胞上の神経伝達物質及 び神経ペプチドのレセプターをＣＮＳに見られる細胞と同様の方法で修飾するこ とができる（Ｃｏｓｔａ、　Ｌ、　Ｇ、ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｐｈａｒｍａｃ ｏｌ、　９１：３４０７−３４１３　（１９８２）。

もう１つの重要な移植片物質源は、体細胞ハイブリッド形成によって遺伝子操作 した細胞であり、単一ニューロンを不死化することができる。体細胞ハイブリッ ド形成は、種々の遺伝子型でセルラインを作成するばかりでなく分化の種々の表 現型の発現を調節する機序を分析する強力な細胞生物手段である。特定の遺伝子 発現が異なる細胞を融合すると、遺伝子発現を制御する機序を調べることができ るとともに遺伝的に異なるセルラインを作成する速度で染色体の改変が生じる。

分化した細胞の性質を保持するハイブリッド細胞を形成することができる。交換 神経節と神経芽細胞腫細胞の融合から誘導されたハイブリッドはドーパミンを合 成することができ（Ｇｒｅｅｎｅ、　Ｌ、　Ａ、ら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、 　Ａｃａｄ、　Ｓｃｊ、　ＵＳＡ　８２：４９２３−４９２V （１９７５）、一方脳細胞ハイブリッドはコリンアセチルトランスフェラーゼを 発現する（Ｍｉｎｎａ、　Ｊ、Ｄ、ら、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　７９：３７３−３ ８３　（１９７５））、従って、ＣＮＳのドーパミン作動性ニューロンに対する 胎児前駆体は、存糸分裂細胞と融合してゲノムを単一のものに共に取込み、時間 が経つにつれて余分な染色体を消失しかつ新しいハイブリッドラインを生じる。

過度の実験なしにそのような神経又は傍神経ハイブリッド細胞を作成し、ドーパ ミン分泌物のような所望の特性をスクリーンし、移植に最良なものを選択するこ とは当業者の範囲内である。

本発明によるもう１つの移植用細胞源は、副腎髄質である。この神経櫛由来組織 はパーキンソン病を治療するために臨床試験に含まれていた（背景参照）。成体 サル副腎髄質は、単細胞として少なくとも約３週間生体外で培養することができ る（Ｎｏｔｔｅｒ、　Ｍ、Ｆ、ら、　Ｃｅ１ｌ　Ｔｉ５ｓ、　Ｒｅｓ、　’２４ ４＋６９−７６　（１９８６））、これらの細胞は、上皮標線形態から細胞が微 小管配列を含む多くのニューライト分枝を示すニューロン形態まで表現型改変に よってＮＧＦに応答する。このニューロン表現型は、宿主ＣＮＳにおけるラット 髄質細胞の長期生存及び宿主組織による組込みに重要であると考えられている（ 上記Ｓｔｒｏｍｂｅｒｇ、　Ｌ、ら）。移植された副腎髄質組織は、ラットにお いて点質線条体ドーパミンの消耗に起因する機能欠損を修正するこができる（例 えば上記Ｆｒｅｅｄら、１９８１）。しかしながら、これは移植片からドーパミ ンの拡散により、移植後３〜６力月に減少する現象をもたらすと考えられる。移 植細胞のＮＧＦ処理により、移植片から宿主内に線維発芽後成長が誘導されかつ 長く続く挙動回復（少なくとも１年）が誘導される。実際に、ＮＧＦ処理なしで わずかなりロム親和細胞しかラット（上記Ｆｒｅｅｄら）あるいはアカゲザル尾 状核（Ｍｏｒｉｈｉｓｉａ、　Ｊ、Ｍ、ら、　Ｅｘｐ、　Ｎｅｕｒｏｌ、　８４ ：６４３−６５３　（１９８４）に従来の生存手法を用いて移植されていない。

同様に、網膜色素上皮細胞かドーパミン及び他の因子を分泌し、本発明に従って 脳移植片に用いられる（Ｌｉ、　Ｌ、ら、　ＥＸＩｌ、　Ｅｙｅ　Ｒｅｓ、　４ ７：７７１−７８５　（１９８８）：　Ｌｕｉ。

Ｇ、Ｍ、ら、　Ｐｒｏｃ、Ｉｎｔ’　１．　Ｓｏｃ、　Ｅｙｅ　Ｒｅｓ、　６： １７２　（１９９０）：　Ｌｉ、Ｌ、ら、［ｎｖ、　０ｐｈ狽■≠戟B Ｖｉｓ、　Ｓｃｉ、　３１（Ｓｕｐｐｌ）：５９５（１９９０，ａｂｓｔｒ、　 ２９１５−１３）；同書、　５ｈｅｅｄｌｏ、ＨＪ、ら、　≠ｂ唐狽秩B ２９１６−１４；同書Ｆｅｋｔｏｒｏｖｉｃｈ、　Ｅ、Ｇ、ら（ａｂｓｔｒ、　 ２９１７−１５）：上記Ｓｏｎｇ、　Ｍ−にら）。

本発明に従って哺乳動物脳に移植された細胞は、成長因子を加えずに生存を示し た。しかしながら、本発明の他の実施態様には、生体外で移植前に、生体内で移 植後にあるいはその両方で適切な成長／分化因子で処理したものと組合わせた支 持マトリックスに結合した細胞が移植される。

ニューロン表現型を有するヒト副腎髄質細胞は、少なくとも９週間生体外で維Ｎ ＧＦは、腺状憇からこの変換を誘導する。Ｃ６神経膠腫細胞と同時培養した副腎 髄質細胞は過度のニューライト分枝を示し、神経膠腫細胞と密接に接触する。

有糸分裂を阻害する抗ミドティック剤で処理したこれらの星状膠細胞は、生体外 で交換神経ニューロンを維持するＮＧＦと同様の成長因子を生成することか知ら れている（Ｂａｒｄｅ、　Ｙ、Ａ、、　Ｎａｔｕｒｅ　２７４：８１８　（１９ ７８））。移植したダリア細胞はニューロンの機能回復に重要な役割を果たし、 重要な栄養因子源である（Ｄｏｅｒｉｎｇ、　Ｌ、Ｃ。

ら、Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｌｏｇ、　Ｓｃｉ、　６３：１８３−１９６　（１９８４ ）；　Ｇｖｍｐｌｅ、Ｊ、ら、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　Ｌｅ狽煤A３７： ３０７−３１１　（１９８４））。従って、本発明のもう１つの実施態様は、神 経又は傍神経細胞とダリア細胞を同時培養し、支持マトリックスと同時インキュ ベートし、次いで両種の細胞をもつ支持マトリックスを挿入することを含んでい る。

更に、本発明の実施態様においては、神経又は傍神経由来ではないが神経学的に 興味深い物質を生産するように改変された細胞が用いられる。好ましい種類の細 胞は容易に得られかつ培養されるヒト包皮線維芽細胞であり、本発明の方法を用 いてラット脳に移植すると生存する（実施例ＩＩＩ参照）。本発明に使用する場 合、当該技術において既知の方法を用いて細胞を遺伝的に改変してニューロン成 長因子、神経伝達物質、神経ペプチド又は脳代謝に関与する酵素を発現する（例 えばＧａｇｅ、　Ｆ、　）１．ら、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　２３＋７９５ −８０７　（１９８７）：　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、Ｍ、a、ら。

５ｃｉｅｎｃｅ　２４２：１５７５−１５７８　（＋９８８）：　Ｓｈｉｍｏｈ ａｍａ、　Ｓ、ら、　Ｍｏ１．　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　５F２７１−２７８ （１９８９）　；これらを参考として引用する）。

組換えＤＮＡ技術及び細胞生物学の一般原理を言及している標準比較研究として は、Ｗａｔｓｏｎ、Ｊ、Ｄ、ら、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ 　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅ、　Ｖｏｌｕｍｅｓ　１．　［１゜Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕ ｎｎｉｎｇｓ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、、Ｉｎｃ、、八Ｉｅｎｌｏ　Ｐａ ｒｋ、ＣＡ　（＋９８７）：　Ｄａ窒獅■撃戟B Ｊ、　Ｅ、ら、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、５ｃｉｅｎ ｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｂｏｏｋｓ、Ｉｎｃ、、Ｎ■浴@Ｙｏｕｄ。

ＮＹ　（１９８６）；　Ｌｅｗｉｎ、　Ｂ、Ｍ、、　Ｇｅｎｅｓ　Ｉ［、Ｊｏｈ ｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｎx（１９８５）＋ ０１６、Ｒ，Ｗ、ら、Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅλ１ａｎｉｐｕｌ ａｔｉｏｎ：　Ａｎ　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｇ■獅■狽奄■ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、　２ｎｄ　Ｅｄ、、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃ ａ１ｉｆｏｒｎｉａ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、　bＡ（１９８１）； Ａ　しａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ！、２ｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏ１ｄ 　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏ１ｄ　Ｓ垂窒奄獅■ Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ　（１９８９））及びＡｌｂｅｒｓ、　Ｂ、ら、　Ｍｏ１ ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｅ１１．Qｎｄ Ｅｄ、、　Ｇａｒｌａｎｄ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、　Ｉｎｃ、、　Ｎｅｗ　Ｙ ｏｒｋ、　ＮＹ　（＋９８９）が挙げられ、これらを参考として引用する。

本発明の方法に有効な組換えＤＮＡ分子は、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ合成の種々 の手段又は更に詳細には組換えＤＮＡ技術を使用することにより作製することか できる。このような分子を合成する技術は例えばＷｕ、Ｒ，ら（Ｐｒｏｇ、　Ｎ ｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ。

Ｒｅｓ、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏｌ、　２１：１０１−１４１　（１９７８）） によって開示されている。組換え分子を構築する手順は上記Ｓａｍｂｒｏｏｋら によって詳細に開示されている。

典型的には、問題の遺伝子又は遺伝子群は、ＤＮＡ又は好ましくはｃＤＮＡ（遺 伝子を発現することができる細胞由来）を発現ベクターにクローン化することに より調製された発現ベクターのライブラリーからクローン化される。次いで、そ のライブラリーから神経伝達物質合成酵素のような問題の遺伝子産物を発現する ことかできるものを、遺伝子産物に特異的な抗体と結合する抗体を用いてスクリ ーンする。ＤＮＡ又は好ましくはｃＤＮＡが問題の遺伝子産物を発現することが できる細胞から抽出し及び精製される。精製したｃＤＮＡを断片化（剪断、エン ドヌクレアーゼ消化による等）してＤＮＡ又はｃＤＮＡフラグメントのプールが 作製される。次いで、ユニークなりローン化ＤＮＡ又はｃＤＮＡフラグメントを 各々が含む発現ベクターのライブラリーを作製するために、このプールからのＤ ＮＡ又はｃＤＮＡ断片が発現ベクターにクローン化される。

“発現ベクター”は、（適切な転写及び／又は翻訳制御配列の存在による）ベク ターにクローン化されたＤＮＡ　（又はｃＤＮＡ）分子を発現することかできか つそのことによりポリペプチド又はタンパク質を生産することができるベクター である。発現ベクターが適切な宿主細胞に導入されるとクローン化配列の発現が 起こる。適切な哺乳動物宿主細胞は、クローン化配列を発現することができる微 乳動物細胞である。ｃＤＮＡを調製する手順及びゲノムライブラリーを作製する 手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記）に開示されている。

その発現か本発明に所望される産物又は産物群をコードするＤＮＡ配列は、連結 のための平滑末端又は互い違い末端、適切な末端を生じる制限酵素消化、適切な 付着末端の挿入、好ましくない結合を避けるためのアルカリ性ホスファターゼ処 理及び適切なりガーゼによる連結を含む慣用の技術に従ってベクターＤＮＡと組 換えられる。このような操作技術は、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋらに開示されており 、当該技術において周知である。

ＤＮＡのような核酸分子は、転写及び翻訳調節情報を含むヌクレオチド配列を含 む場合、ポリペプチドを“発現することができる“と言われ、かかる配列はポリ ペプチドをコードするヌクレオチド配列に“操作的に連鎖される”。操作可能連 鎖は、調節ＤＮＡ配列と発現されるように探索されたＤＮＡ配列を遺伝子発現す ることができるような方法て結合される。遺伝子発現に必要とされる調節領域の 正確な種類は生物毎に異なってよいか、一般には、プロモーター領域を含み、原 核生物においては、プロモーター配列（ＲＮＡ転写を開始する）及びＲＮＡに転 写されるとタンパク質合成の開始をシグナルするＤＮＡ配列の双方を含む。

そのような領域としては、通常、転写及び翻訳の開始に関与する５′非コーディ ング配列、例えばＴＡＴＡボックス、キャップ配列、ＣＡＡＴ配列等か挙げられ る。

場合によっては、タンパク質をコードする遺伝子配列に対する３′非コーデイン グ領域か上記方法によって得られる。この領域は、終結及びポリアデニル化のよ うなその転写終結調節配列を保持することができる。即ち、タンパク質をコード するＤＮＡ配列に自然に相接する３′領域を保持することにより、転写終結シグ ナルか得られる。転写終結ソゲナルか発現宿主の機能において満足に機能しない 場合には、宿主細胞において機能する３′領域に置き換えられる。

２つのＤＮＡ配列（プロモーター領域配列及びコーディング配列のような）は、 ２つのＤＮＡ配列間の結合の種類が（１）フレームシフト突然変異を導入をもた らさない、（２）プロモーター領域配列のコーディング配列転写能を妨害しない 又は（３）コーディング配列のプロモーター領域配列転写能を妨害しない場合に 操作的に連鎖されると言われている。即ち、タンパク質を発現するためには、宿 主細胞によって認識される転写及び翻訳シグナルか必要である。

プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼを結合しかつ“操作的に連鎖された″核酸 配列の転写を促進することができる二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ分子である。本明細 書で用いられる“プロモーター配列”は、ＲＮＡポリメラーゼによって転写され るＤＮＡ又はＲＮＡＮ玉鎖上られるプロモーター配列である。“補足プロモータ ー配列”は、“プロモーター配列”の補足である核酸分子である。従って、−重 鎖“補足プロモーター配列”に隣接したプライマーＤＮＡもしくはＲＮＡ又は“ プロモーター配列”を伸長する際、その伸長が“プロモーター配列”又は“補足 プロモーター配列”に向かって進む場合には機能プロモーターを含む二本鎖分子 が作られる。この機能プロモーターは、“プロモーター配列”を含む二本鎖分子 のその鎖（“補足プロモーター配列”を含む分子のその鎖でない）に操作的に連 鎖される核酸分子を転写する。

本発明の細胞を作製するのに有効なプロモーター配列は、真核あるいはウィルス である。適切なプロモーターは抑制可能であり、好ましくは構成性である。有効 な真核プロモーターとしては、マウスメタロチオネインＩ遺伝子（Ｈａｍｅｒ、 　Ｄ、ら。

Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎ、　１：２７３−２８８　（１９８２）） ：ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ、　Ｓ、、Ｃｅ１ｌ 　３１＋３５５−３６５　（１９８２））：ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎ ｏｉｓｔ。

Ｃ２ら、　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　２９０：３０４−３１０　（＋９ ８１））が挙げられる。特にヒト線維芽細胞に好ましいプロモーターはコラーゲ ンプロモーター（Ｐｒｏｃｋｏｐ、　Ｄ、Ｊ、ら、！胆ＬＪ、　Ｍｅｄ、　３０ １：１３−２３．７７−８５　（＋９７９）：　Ｅｙｒｅ、　Ｄ、Ｒ，，５ｃｉ ｅｎｃｅ　２０７：１３１５−１３２Q（１９８０）： Ｍａｒｔｉｎ、　Ｇ、Ｒ，ら、　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈ、　Ｓｃｉ、　１０ ：２８５−２８７　（１９８５）；これらの文献を参考として弓１用する）であ る。

本発明による当該技術において周知の方法を用いて凍結及び凍結状態で保存した 支持マトリックスに結合あるいは混合した細胞も本発明の範囲内である。マトリ ックス結合細胞は、解凍後、宿主脳に挿入される。

本発明の方法で有効な細胞は、異種（＝非相同、即ち宿主と異なる種由来）、同 種（＝相同、即ち宿主と同じ種の遺伝的に異なるもの由来）又は宿主が提供者と しても働く自家であってもよい。

本発明の目的を達成するために必要とされる細胞数は、患者のサイズ、年齢、体 重、基礎疾患の種類、他の併用治療法等によって変動する。これは、過度の実験 なして当業者によって決定される。成人ヒトにおいては、支持マトリックスに結 合した有効細胞数は、約ｌＸＩＯ２〜約ｌＸｌ０’細胞、好ましくは約５×１０ ２〜約ｌＸｌ０’細胞の範囲である。また、有効な移植細胞量は、ビーズ量に加 えられる細胞量、例えばビーズ１ｍｌ当たり細胞量４０■によって決定される。

支持マトリックスが含むことができる物質としては、生体外インキュベーション 後細胞か接着しかつ細胞が増殖する物質及び毒性反応又は挿入した細胞を破壊す るかあるいは生物活性又は治療活性を妨害する炎症又は神経膠症反応を生じない で哺乳動物脳に挿入することができる物質がある。そのような物質は、合成又は 天然化学物質又は生物由来物質である。マトリックス材料としては、ガラス及び 他のシリコン酸化物、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリフッ 化ビニリデン、ポリウレタン、ポリアルギン酸、ポリスルホン、ポリビニルアル コール、アクリロニトリルポリマー、ポリアクリルアミド、ポリカーボネート、 ポリペンタン、ナイロン、アミラーゼ、ゼラチン、コラーゲン、デキストラン及 びセルロース（例えばニトロセルロース）天然及び変性ポリサッカライド、寒天 及びマグネタイトが挙げられるがこれらに限定されない。再吸収性又は非再吸収 性材料が用いられる。当該技術において周知の細胞外マトリックス材料も意味す る（下記参照）。細胞外マトリックス材料は、市販で入手でき又はそのようなマ トリックスを分泌する細胞を増殖し、分泌細胞を除去し、移植される細胞かマト リックスと相互作用及び接着することにより調製することができる。

本発明の支持マトリックスは、本発明によれば細胞を支持体の表面に結合あるい は被覆されており、密閉された室に封入されず、開示されている封入支持体の排 他能力を与えた生存は疑わしい点でＡｅｂｉｓｃｈｅｒら（上記参照）によって 記載されているものと区別できる。更に、本発明の支持マトリックスは、低分子 量物質は交差するが大きな分子（＞５０ｋＤ）は排除するＡｅｂｉｓｃｈｅｒ用 具の選択透過性のような具体的な透過性の性質を材料がもっことを要求しない。

本発明による支持体に結合すると、移植に用いられる細胞は通常支持体の”外面 ″に存在する。支持体は固形又は多孔性であってもよい。しかしながら、多孔性 支持体でさえ、細胞は干渉膜あるいは他の障壁なしに外部環境と直接接触した状 態にある。従って、本発明によれば、接着する表面が粒子又はビーズ自体の外部 にない多孔性支持材料の内部のびた又は渦の形にあってさえ支持体の“外面”に あるとみなされる。

支持体の構造は、ビーズのように円形が好ましいが、円筒形、楕円形、平らなシ ート又はストリップ状、針又はビン型等であってもよい。支持マトリックスの好 ましい形はガラスピーズである。別の好ましいビーズはポリスチレンビーズであ る。ビーズのサイズは、直径約１０μｍ〜Ｉｃｍ、好ましくは約９０〜約１５０ μｍである。種々のマイクロビーズの説明として、例えばＦｉｓｈｅｒ　Ｂｉｏ ｔｅｃｈＳｏｕｒｃｅ　８７−８８．　Ｆｉｓｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔ山ｃ　Ｃｏ 、、１９８７．　ｐｐ、７２−７５　；Ｓｉｇｍａ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ撃狽浮窒■ Ｃａｔａｌｏｇ、　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｓｔ、　Ｌｏｕｉ ｓ、　＋９９１．　ｐｐ、　１６２−＋６３：Ｖｅｎｔｒｅ■@Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｃａｔａｌｏｇ、　Ｖｅｎｔｒｅｘ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　１９８９参 照、これらの文献を参考として引用する）。ビーズサイズの上限は、移植した細 胞の機能を妨害するか又は取り囲んでいる脳組織に損傷を引き起こす神経膠症の ような宿主の望ましくない反応のビーズ刺激によって指示される。かかる限界は 、当業者によって容易に決定される。

細胞接着、生存及び機能を改良するために、場合によっては固体マトリックスを 当該技術において既知の因子でその外面に被覆すると細胞接着、生存及び機能か 促進される。その因子としては、細胞接着分子、細胞外マトリックス、例えばフ ィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、エラスチン、グリコサミノグリカン又 はプロテオグリカン（上記Ａｌｂｅｒｓ、　Ｂ、、　ｐｐ、８０２−８３４参照 ）又は成長因子、例えばＮＧＦか挙げられる。また、挿入した細胞か付着する固 体マトリックスが多孔質材料で構成される場合には、成長又は生存促進因子又は 因子群がマトリックス材料に取込まれ、生体内に挿入された後、徐々に放出され る。

本発明の別の実施態様においては、ニューロンの再成長又は回収を促進するため に、コラーゲンのような再吸収性マトリックス上で増殖するか又は混合した細胞 を脳以外の神経学的に問題の部位に挿入することができる。例えば、本発明のマ トリックスに接着した細胞をを髄に挿入するか又は視神経の中に又は隣接して挿 入する。

挿入されるべき細胞か増殖するマトリックス材料又は細胞を混合するマトリック ス材料は、挿入された細胞自体の内因性産物であってもよい。即ち、例えば、マ トリックス材料は移植されるべきその細胞によって生産及び分泌される細胞外マ トリックス又は基底膜であってもよい。

本発明の方法は、多くのヒト神経疾患の治療に有効である。パーキンソン病は、 本発明に従ってドーパミン生産細胞を宿主の線条体に挿入することにより治療さ れる。アルツハイマー病は、核基底のコリン作動性細胞の欠損を伴うものである 。

即ち、本発明によれば、アルツハイマー病に罹っている患者又はその危険のある 患者にアセチルコリンを生産する細胞を挿入することができる。

ハンチントン病は、尾状核及び被殻の頭部の肉眼的萎縮があり、通常胴回の中程 度の疾患に伴っている。ハンチントン病に罹っている患者は、神経伝達物質γア ミノ酪酸（ＧＡＢＡ）　、アセチルコリン又はその混合物を生産する細胞を挿入 することにより治療することができる。本発明によれば、かかる細胞を結合する 支持マトリックス材料を尾状核及び被殻に挿入することが好ましい。

てんかんは全く単一の疾患ではなく、むしろ基礎にある異常によって生じる症状 である。当業者は、各てんかん患者が個体にユニークな損傷又はてんかんの病巣 を有することを理解するであろう。かかる病巣は、脳波、コンピューター軸断層 及び磁気共鳴映像のような当該技術において周知の診断法の組合わせを用いて局 在化することができる。てんかんに罹っている患者は、本発明に従ってＧＡＢＡ 生産細胞を罹患部位に結合する支持マトリックス材料を挿入することにより治療 することができる。脳においてグルタミン酸レセプター及びＮＭＤＡレセプター の遮断薬が実験用てんかんを制御するために用いられているので、興奮性アミノ 酸経路を遮断する分子を生産する細胞か本発明に従って用いられる。即ち、スペ ルミジンのようなポリアミンを生産するように本明細書で記載したように修飾し た細胞を正常な量より多く挿入することはてんかんの治療に有効である。

本発明の方法は、本発明の方法の存益な作用を試験することができる任意の哺乳 動物で使用するためのものである。哺乳動物のなかでも１番はヒトであるが、本 発明はそのように限定されるものではなく、動物薬にも適用できる。

ここでは本発明を一般的に記載してきたが、下記実施例によって更に容易に理解 されるであろう。これらは具体的な説明によって示されており、特にことわらな い限り、本発明を限定するものではない。

実施例Ｉ 成体ラット由来の副腎クロム親和細胞を既知の方法に従って調製した（下記実施 例ＩＶ参照；更に［ｎｏｕｅ、　Ｍ、ら、　Ａ、　Ｊ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　２ ５７　（Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、）：Ｃ９０６−９１２（１９８９）参照） 。ネンブタール麻酔で犠牲にし、次いて断頭した後、副腎を摘出した。注意深く マイクロ解剖して、髄質から被膜と皮質物質を除いた。この組織を２又は３片に 切断し、１４０ｍＭＮａＣ１，５ｍＭＫＣｌ、５．２ｍｌＪＭｇＣＬ、５ｍＭＨ ＥＰＥＳ、１０ｎ！１ｌＤ−グルコースを含むｐＨ７，４のカルシウムを含まな い平衡塩類溶液中で０．２％コラ−ゲナーゼとインキュベートした。酵素処理中 、９９．９％Ｃｏｔを吹き込むことにより標品を穏やかに振盪させた。消化後、 組織を上記塩類溶液で３又は４回洗浄し、次いでパスツールピペット中で穏やか に摩砕した。

解離したクロム親和細胞を無血清培養液（Ｖｅｎｔｒｅｘ　ＰＣ１）を含む細胞 培養フラスコに移し、５％Ｃ０２雰囲気中３７℃で一晩培養した。これらの条件 下、細胞は２．３日より多く生存力を保持しなかった。滅菌ガラスピーズ（Ｖｅ ｎｔｒｅｘ、９０ミクロン）をこの培養フラスコに加えた。細胞がビーズに結合 し、実質的にビーズ上に単層を形成した。

生体外調製の２４時間以内に、細胞含存ビーズ懸濁液を１〜５μｌずつ麻酔した 成体ラットの脳に注入した。分析後、細胞が培養中生存しない時には、ライナー 法に従ってチロシンヒドロキシラーゼの免疫細胞化学染色によりめた場合、注入 をとりまく部位に生体内で生存が見られた（図１参照ＸＫ１１ｐａｔｒｉｃｋ、 　Ｄ、Ｌ、ら。

ビーズは、注入自体の典型的なもの以上に壊死損傷を生じなかった。

実施例ＩＩ 実施例■及びＩＶに記載された方法に従って成体モルモットから副腎髄質を摘出 し、実施例Ｉに記載される方法に供した。ガラスマイクロビーズ上の細胞をラッ ト脳に注入した。細胞は、完全に健康な状態で少なくとも２１日間生存した。

免疫拒絶の徴候は明らかでなかった。

実施例ＩＩＩ 培養したヒト包皮線維芽細胞を上記にようにガラスマイクロビーズに結合し、ラ ット脳に注入した。繊維芽細胞に選択的に結合したヒトＩｇＧ、次いでフルオレ セイン結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を用いる免疫蛍光法により局在化した。挿入し たヒト細胞は、完全に健康な状態で少なくとも２１日間生存した。免疫拒絶の徴 候は明らかでなかった。

実施例■ｖ マイクロキャリヤ上で移植された副腎クロム親和細胞は点質線条体ドーパミン作 動性細胞の損傷を修正する 上記で示したマイクロキャリヤに結合した副腎クロム親和細胞が、脳において長 時間生存する能力、生理的機能、即ちドーパミン分泌を行う能力及びドーパミン 系において損傷を修正する能力を試験するために実験を行った。

パーキンソン病の標準動物モデルを用いた。点質線条体ドーパミン作動性ニュー ロンは、６−０ＨＤＡの定位注入で局所的及び選択的に破壊されている。アポモ ルフイネ、ドーパミン作動性アゴニストの注入後、損傷ラットには旋回あるいは 回転挙動が誘導されるが、正常ラットにはない。パーキンソン様症状の治療は、 この回転挙動の減少により評価される。

勲惣 体重１２０−１５０ｇのＴａｃｏｎａから入手した雌のスプラグダウレイラット をＮＹＵ医療センターのベルブ研究所公認動物施設内で飼い、食物と水を任意量 与えた。ラットは、体重＋　８０−２００ｇに達したとき病変した。

点質（ＳＮ）の破壊 選択的神経毒物質、６−０ＨＤ八を定位適用でＳＮに病変を誘導した。ベントパ ルビタールナトリウム、４５　ｍｇ／ｋｇ、　ｉ　、　ｐ、を用いてラットに麻 酔した。コツ型定位固定装置にラットを固定した。右側を損傷させる場合、次の 座標を用いた：吻側尾側：　−４，８圃：背側腹側ニー８．Ｉｎｒｎ；外側内側 ニー１９、−２．０ｉｒｎ；顎バー：　−３，３ｍｍ、。

ネンブタール麻酔を誘導した後、手術用刃の付いたオスタークリッパーを用いて ラットの頭部を剃った。次いで、ラットを定位固定装置に入れ、頭部の位置をほ ぼ決めた。頭蓋内圧中線を３／４インチ吻側−尾側切開した。頭骨を＃ｌｏ小力 の刃を用いて穏やかに削り、頭蓋骨膜を除去した。前項の位置を決め、注入針を この目標のすぐ上に入れた。次いで、定位座標を０点座標として前項のすぐ上の 位置を用いて個々のラットを補正した。ＳＮの右側の一外側の損傷の場合、吻側 −尾側座標は０点値から引き、外側−内側座標は０点値から引いた。これらの補 正のため、ＳＮのすぐ上に針を入れた。

次いで、頭骨に触れるように針を低くし、接触点に鉛筆で印を付けた。次いで、 針をじゃまにならない所に上げ、＃２５３ハンドピースと＃６歯科用のきりを備 えたドレメルフレックスシャフトドリルを用いて頭蓋に穴を開けた。針を再び頭 骨の口に置き、次いで入口内にちょうど入るように穴の中に下げた。この位置の 定位座標を背側−腹側０点として硬膜に針で記録した。次いで背側−腹側値をこ の値から引いて所望の最終座標を得た。次いで針を注入のために補正した背側− 腹側座標に下げた。

０．２■／ｍｌアスコルビン酸を含む等張（０，９％）食塩水の賦形剤中６−０ ＨＤＡを８μｇ／４μｌの濃度で用いた。この薬剤の酸化分解を最少にするため にこの薬品は注入直前に調製し、使用まで氷上で保存した。この薬剤を２３ゲー ジの針に取りつけた潅流ポンプを用いて４μＩの全量が注入されるまでｌμｌ１ 分の速度で注入した。取り出す前に、針を更に５分間正しい場所に保ち、薬剤を 所望の面に浸潤させた。

手術部位をクレーーアダムス９ｍｍ傷クリップを用いて閉じ、ラットを回復させ た。手術後、ラットを加温容器に入れ、麻酔がらさめた後、ベルブ研究所の正常 な部屋に戻した。ラットは、翌日までには正常な挙動を回復した。

挙動試験 ＳＮ損傷の影響を評価するために、ラットをアポモルフイネ誘導し、回転運動典 型を用いた。ラットにアポモルフイネ０．２５■／ｋｇを皮下注射し、ドーパミ ン誘導の常開挙動：なめる、眼瞼の下垂、かじる等の徴候を観察した。開始期の 時間を記録した。ラットの回転運動の開始を観察し、時間を記録した。６−０Ｈ ＤＡ損傷ラツトを含むＳＮに損傷したラットは、アポモルフイネを注入すると器 用な対側回転を示すことが知られている。

アポモルフイネ投与の５分後、回転運動を開始した。完全な３６ｏ０の回転のみ 記録した。回転は２５分分間−た。１分当たりの回転に基づいてラットを評点し た。１分当たりアポモルフイネ誘導回転７未満を示すラットを研究から除いた。

回転挙動が安定するまで１週毎に、通常注入後３又は４週にラットを試験し、更 に２回の試験期間安定なままにした。通常、ラットはこの時アポモルフイネ誘導 回転９〜ｌＯを示し、移植実験の準備をした。

クロム親和細胞の調製 提供ラットをベントパルビタールナトリウム、４５■／ｋｇ、　ｉ、　１１．を 用いて麻酔した。麻酔を誘導した後、無菌の手術場に背に置き、無菌状態で副腎 を摘出した。

腹腔の長さに“ド盟に切開し、皮膚弁を後ろに引っ張った。次いで腹膜を開（九 腎臓を露出した。腎臓とそれに付属する副腎を閉鎖性解剖により周囲の脂肪を除 いた。腎臓／副腎をラットから取り出し、ｐｃ−ｉ培養液（Ｖｅｎｔｒｅｘ）を 含む培養皿に入れた。カプセルを開け、全副腎を腎臓から注意して解剖した。

分離した副腎をＶｅｎｔｒｅｘ　ＰＣ−１補足培養液を含む培養皿に移した。副 腎を小力を用いてできるだけ細かく切り刻んだ。培養液を注意して傾瀉し、ｏ、 １％トリプシン１０，２％フラゲナーゼを含む１０ｍ１のＰＣ−１滅菌完全培地 に置き換えた。

副腎をこの溶液中で空気中５％二酸化炭素の雰囲気中３７℃のインキュベーター で３０分間インキュベートした。

このインキュベーションの後、細胞混合液を１０ｍ１の滅菌プラスチックピペッ トの中を上下に繰り返し流すことにより均一にし、次いで１００μｍのセルシー ブを通過させた。清浄なる液を滅菌試験管に入れ、２００Ｘｇで５分間遠心した 。

上溝を傾瀉し、細胞含有沈降物をＰＣ−１完全培地に再懸濁し、″血清様”因子 を含めた（細胞をマイクロキャリヤ上で培養する場合には３−４ｍ１）。この混 合液を穏やかに振盪し、３７°Ｃインキュベーターに入れた。

細胞のマイクロキャリヤ培養 ピーズ１ｇ当たり１０ｍ１の滅菌蒸留水にビーズを入れ、１２１”ｃまで１５分 間加熱することにより、Ｖｅｎｔｒｅｘガラスマイクロキャリヤ（Ｖｅｎｔｒｅ ｘ、９０−１２０μｍ）を滅菌した。この溶液を室温まで冷却し、水を捨てた。

次いでマイクロキャリヤを少量の培養液に懸濁し、３０分間放置した。培養液を 除去し、ビーズ（約０．２１　ｇ）を前記細胞標品に加えた。得られた混合液を ２時間振盪し、更に４ｍｌの完全ＰＣ−１を加えた。次いで、培養フラスコを５ ％ＣＯｔ雰囲気中３７°Ｃで一晩インキユベートすると細胞がマイクロキャリヤ に接着した。

本方法を用いて本発明者らによって試験した他の種類の細胞としては、ヒト網膜 色素上皮細胞及び包皮線維芽細胞が挙げられる。これらの種類の細胞は宿主動物 脳の生存のみが試験され、４力月まで続ける実験では陽性の結果を得た（実施例 ■参照）。

細胞の移植 定位注入を用いて脳の尾状核／被殻部に細胞を注入した。注入に用いた環体座標 は下記のものを用いた： 吻側尾側ニー３．１４；背側腹側ニー７．４：外側内側：　−Ｓ、　Ｏ、類バー ニー３．３゜前記のように補正値を誘導した。

最初の実験では、２３ゲージ針を注入に用いた。注入中マイクロキャリヤが沈降 し針を塞ぐ傾向がある。この問題は、大きな針を用いて部分的に軽減した。しか しながら、真直ぐな管腔又は斜端針を用いると、脳組織が管腔に入りかつ針を塞 ぐことになる。これは、口を保護する尖端が上に曲がった針を用いて修正された 。この種の針を用いて、細胞を脳に一様に注入することが可能になった。

これらの変更の結果として、定位座標には実際の針の口の修正をその尖端より必 要とした。これは、尖端−口の距離（典型的には１−２ｍｍ）を測定しかつ上で 示した数値を適当に減じることにより行われた。針を適切に入れると、マイクロ キャリヤ接着細胞を含む懸濁液を最終容量２０μｌが注入されるまで４μＩ１分 の速度で注入した。注入される全ビーズ数は注入中の沈降のためいくぶん異なる が、約１７０−２００ビーズであることが算出された。優れた治療応答を得るた めに約１７５ビーズ（各々２−５細胞を保持する）を注入する必要があることが 現在算出されている。この数は、ヒトにおいて５０．０００〜７５．０００ビー ズに推定され、約０．５ｍｌ容量を占める。

細胞移植を受ける動物の回復及び試験 注入後、手術部位をクレー−アダりス９ａｎ傷クリップを用いて閉じ、ラットを 回復した。手術後最初の２時間、ラットを加温容器に維持して麻酔から回復した 。

次いでベルブ研究所内の正常な部屋に戻した。ラットは、翌田こは正常な挙動を 回復した。細胞移植手順に罹病率も死亡率も関係がなかった。

手術の２日後にラットの回転挙動の試験を開始し、１力月間１週毎にその後は１ 力月毎に続けた。ラットを４．５力月まで試験した。ドーパミンを分泌する際の 挿入細胞の満足な機能は、上記一方的６−０ＨＤＡ損傷ラットにおけるアボモル フィネ誘導回転挙動の減少として測定した。

組織分析 ラットをベンドパルビタール６０ｍｇ／ｍｇ　ｉ、ｐ、で麻酔した。胸腔を開け て心臓を露出した。２２ゲージの蝶形針を左心室の底部に挿入し、右心房を切断 した。蝶形針を螺動ポンプに取り付広切断した右心房の残る溶液が透明になるま で等面食塩水を心臓にポンプで送った。通常２００−４００ａ＋Ｉの食塩水を必 要とした。

次いで潅流溶液を１％グルタルアルデヒド／１％パラホルムアルデヒド１０．１ Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７，２に変えた。肝臓力泊っぽい色になるまでこの固 定液で潅流を続けた。これにより、約４００ｍ１の潅流液を必要とした。十分な 潅流の後、ラットが硬直した。ラットを潅流装置から取り出し、断頭した。頭部 を２％グルタルアルデヒドの溶液に入れ、２時間浸漬した。この時間の終わりに 、脳を摘出し、ミクロトームで厚さ２６〜２８μｍの凍結切片を作製した。切片 をリン酸塩緩衝食塩水、ｐＨ７，２を含む番号をつけた試験管に移した。切片を 解剖顕微鏡下低い拡大能で試験して次の実験のものを選んだ。

切片を適切に染色し、ゼラチン被覆スライドに取り付けた。顕微鏡スライドをゼ ラチン被覆するために、６００ｍ１蒸留水中３ｇのゼラチン、０．３ｇの硫酸カ リウムクロムを含むろ過液を新たに調製し、スライドをこの溶液に１反別個に浸 漬した。スライドを一晩風乾した。次いて切片をスライドに取り付１ノ、７０％ アルコール、９０％アルコール、９５％アルコール、１００％アルコールで２回 及びキシレンで２回各々５分間浸漬して脱水した。次いでバーマウント液を用い てカバースリップを取り付けた。

垣！ ２グループのラットを損傷対照として用いた。１グループは処理しながった。

第２グループは被殻／尾状核部にビーズで注入した。これらの対照グループは、 共に９−１０回転／分で回転挙動を示した（図２参照）。

副腎クロム親和細胞を含むビーズを脳の同じ領域に注入すると、対照値の約４０ −５０％のレベルまで回転挙動か直ちに減少した。この変化は実質的な治療効果 を表すものである。上記背景の項で述べたような胎児細胞を用いた短期間の実験 で回転に同様の減少か見られたことは注目すべきことである。本発明の用量を用 いたアポモルフイネ攻撃は極端な試験を表すものである。低用量のアポモルフイ ネでは回転は０に減少するが、仮性陽性は更に頻繁になる。

上記で述べた実験の所見は、８匹の対照ラット及び１０匹の処理ラットの結果を 表すものであり、ｐ値０．００１の統計的有意性に要する数値を超えている。

ビーズと培養した後注入した網膜色素上皮を用いて、同様の実験を行った。同様 の又はいくぶん改良された結果が得られ、これはこれらの細胞が高レベルのドー パミンを生産する事実に関係するものである（図２参照）。

これらの実験で見られた第２の効果は、６−０ＨＤＡ損傷ラツトが正常な成長曲 線を維持しないという事実に関係する。ビーズ上の副腎クロム親和細胞又は網膜 色素上皮細胞で挿入したラットは正常な成長曲線を回復する。

移植細胞の効果のないあるいは限られた効果のみ示すラット脳の組織分析は、極 めて少数の細胞が注入されたことを示した。このような非応答ラットでは、注入 座標は不正確であることがわかった。これらの特別なラットの結果を分析から除 くと、細胞移植後の平均回転は移植ラットの場合５．１＋１．２回転／分に対し て非移植対照の場合９±０．５回転／分に減少した。スチューデントのｔ検定を 用いた統計的分析からｐ（ｉｏ、　０５〜０．　ＯＯ１を得、この差異の高レベ ルの統計的有意性を示した。

実験用ラットの脳の組織試験は十分に着色された細胞の明瞭なりラスターを示し 、血管の浸潤又は炎症反応の徴候はなかった。更にＰｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ　Ｒ ｅｓｅａｒｃｈ（Ｏｒａｎｇｅｂｕｒｇ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）のＮａｔｈａｎ 　Ｋ１１ｎｅ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅのＤｒ、　Ｖｉｃｔｏｒ　５ａｐｉｒｓ狽■ 奄獅■■ ってスライドが試験され、これらの所見で一致した。

１０”〜１０７の数の副腎クロム親和細胞（実施例ＩＶのように調製）を５−２ ０μＩ容量のラット脳の被殻−尾状核領域に注入した。１〜１８０日後の種々の 日こ（図３参照）、ラットを犠牲にし、脳を２０−５０μｍの切片に作製した。

切片を４００×で試験し、細胞密度を細胞／顕微鏡視野から算出した。結果は生 存細胞％として表された（注入細胞の％としての生存細胞）。各実験グループは ６ラツトとした。

図３及び４に示される結果は、注入細胞単独（ビーズなし）が２４時間に３０％ しか生存せずに急速に死滅したことを示している。更に、その翌日から先ゆっく りした速度で生存度が減少した。３０〜＋８０日のある日に挿入細胞のすべてか 死滅した。この知見は、脳に移植された細胞の治療効果が２．３力月につれて非 常に減少することを示す多数の文献報告と関連している（例えば上記Ｌｉｅｂｅ ｒｍａｎ　、上記Ｌｉｎｄｖａｌｌ　；上記Ｂａｋａｙ、　Ｒ，Ａ、Ｅ、参照） 。

図３の上の曲線は、実施例ＩＶのようにビーズ上で増殖した後注入した細胞の生 存を示すものである。開始２４時間で急速な細胞減少はなかった。更に、１００ ％近い注入ビーズ接着細胞が１８０日の全試験期間生体内で生存したままであっ た。図４は、副腎クロム親和細胞の移植６力月後のラット脳切片の顕微鏡写真で あり、ビーズ及び隣接領域に接着した濃い着色生存細胞を示している。

同様の結果が、網膜色素上皮細胞（６ラツト）を用いた１８０日の実験で得られ た。更に、同様の結果が２匹のラットに移植したビーズ上のヒト線維芽細胞を用 いた３０日の実験で得られた。

ここで本発明を詳細に記載してきたが、本発明の真意及び範囲を逸脱することな くまた過度に実験することなく、本発明を等価なパラメーター、濃度及び条件の 広い範囲内で行うことができることは当業者に理解されるであろう。

本発明をその個々の実施悪様と関係させて記載してきたが、更に変更することが できることは理解されるであろう。本出願は、一般的には本発明の原理に従い、 本発明が関係する当該技術の範囲内の既知又は慣用の実施範囲内にあるような及 び次の請求の範囲に従って言及される前記の実質的な特徴にあてはまるような本 発明の開示からの逸脱を含む本発明の変更、使用又は適応を包含するものである 。

（（転）画酵母玉

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．哺乳動初の腦に細胞を移植する方法であって、該細胞が支持マトリックスに よって封入されないように該細胞を生体外で該マトリックスの表面に結合させ、 該結合細胞を有する該支持マトリックスを該腦に移植することを含む方法。
2. ２．該支持マトリックスが多孔性又は非多孔性マイクロビーズである請求項１記 載の方法。
3. ３．該マイクロビーズが直径約９０〜約１５０μｍを有する請求項２記載の方法 。
4. ４．該支持マトリックスがシリコン酸化物、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポ リエチレン、ポリカーボネート、ポリペンテン、アクリロニトリルポリマー、ナ イロン、天然ポリサッカライド、変性ポリサッカライド、アミラーゼ、コラーゲ ン、天然セルロース、変性セルロース、寒天、マグネタイト、ヒアルウロン酸及 び細胞外マトリックスからなる群より選ばれた材料で作られる請求項１記載の方 法。
5. ５．該支持マトリックスがシリコン酸化物である請求項４記載の方法。
6. ６．該細胞が神経又は傍神経起原の細胞である請求項１記載の方法。
7. ７．該細胞が副腎クロム親和細胞である請求項６記載の方法。
8. ８．該細胞が網膜色素上皮細胞である請求項１記載の方法。
9. ９．該細胞が生体外で培養されたセルライン由来である請求項１記載の方法。
10. １０．該培養細胞が線維芽細胞である請求項９記載の方法。
11. １１．該培養細胞がタンパク質又はタンパク質群をコードする遺伝物質を移入す ることにより遺伝的に修飾され、該遺伝的に修飾された細胞が神経伝達物質又は ニューロン成長因子を生産することができる請求項９記載の方法。
12. １２．患者における神経疾患の治療方法であって、請求項１記載の方法に従って 該疾患を治療することができる有効数の細胞を該患者の脳に移植することを含む 方法。
13. １３．該疾患がパーキンソン病、アルツハイマー病、ハンテントン病、てんかん 及び外傷性脳損傷からなる群より選ばれる請求項１２記載の方法。